CN108795968A - 一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法 - Google Patents

一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法 Download PDF

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CN108795968A CN201710304477.2A CN201710304477A CN108795968A CN 108795968 A CN108795968 A CN 108795968A CN 201710304477 A CN201710304477 A CN 201710304477A CN 108795968 A CN108795968 A CN 108795968A
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谭高翼
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戴昌华
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East China University of Science and Technology
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Abstract

本发明公开了一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。本发明首先通过实验证明接合转移法并不合适一株类球红细菌辅酶Q10的高产菌株，而电转化方法适用于此高产菌株。通过实验结果表明：本发明的电转化方法不仅适用于该高产菌株，对其他类球红细菌的野生型菌株也同样有效。并以此方法出发，构建了多株过表达重组菌株，证实了此法的有效性和可重复性。

Description

一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法。
背景技术
类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一类球形的革兰氏阴性菌，可天然合成具抗氧化功能的醌类物质辅酶Q10。为了进一步提高辅酶Q10的产量，非常有必要通过分子改造的手段优化辅酶Q10的合成途径。
目前，研究者主要应用双亲接合转移的方法对类球红细菌野生型菌株进行遗传操作，但是双亲接合转移法并不适用于所有类球红细菌菌株。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种类球红细菌的转化方法。
本发明提供的类球红细菌的转化方法包括如下步骤：
(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；
所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7-9.3；
(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。
在本发明的具体实施例中，所述类球红细菌感受态细胞的OD值为8.0。
上述方法中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：(0.75-1.50)μL。在本发明的具体实施例中，所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：1.50μL；所述外源质粒为重组质粒pBBR1MCSK-idi或pBBR1MCSK-rs4253；
所述重组质粒pBBR1MCSK-idi为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列1所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列1所示的DNA片段依次由启动子、RBS、类球红细菌idi基因和终止子组成，类球红细菌idi基因为序列1第298-831位；
所述重组质粒pBBR1MCSK-rs4253为将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列2所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间得到的质粒，其中，序列2所示的DNA片段依次由启动子、RBS、rs4253基因和终止子组成，rs4253基因为序列2第293-1492位。
上述方法中，所述培养的方法为将类球红细菌株接种于培养基中培养至OD值为0.58-0.70。在本发明的具体实施例中，所述培养的方法包括如下步骤：
1)从平板上挑取一个类球红细菌株JDW-610的菌落至5mL新鲜PYG培养基中，在32℃，220rpm摇箱中培养，直至对数生长期；
2)以适当比例转接对数期的菌液至10mL新鲜PYG培养基中，接种后OD值约为0.1；
3)在32℃，220rpm摇箱中过夜培养，直至OD值达到0.60。
上述方法中，所述电击转化的电压为(0.8-1.8)kV，具体为0.8kV、0.9kV、1.0kV、1.1kV、1.2kV、1.25kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV和1.8kV；所述电击转化的时间为5ms。
上述方法中，所述洗涤和重悬的方法包括如下步骤：用水洗涤所述菌体，得到洗涤后菌体；再用甘油水溶液重悬所述洗涤后菌体，得到重悬后菌体，即为类球红细菌感受态细胞。
上述方法中，所述水为去离子水；所述洗涤的次数为2次；所述甘油水溶液的体积分数为10％。
上述方法中，所述电击转化后还包括复苏培养的步骤；所述复苏培养的条件为32℃，150rpm复苏2小时。
上述方法中，所述类球红细菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides JDW-610或野生型类球红细菌Rhodobacter sphaeroides(CGMCC编号为1.3368)。
本发明的另一个目的是提供上述重组菌。
本发明的最后一个目的是提供上述重组菌的新用途。
本发明提供了上述重组菌在生产辅酶Q10中的应用。
本发明首先通过实验证明接合转移法并不合适一株类球红细菌辅酶Q10的高产菌株，而电转化方法适用于此高产菌株。通过实验结果表明：本发明的电转化方法不仅适用于该高产菌株，对其他类球红细菌的野生型菌株也同样有效。并以此方法出发，构建了多株过表达重组菌株，证实了此法的有效性和可重复性。
附图说明
图1为pBBR1MCSK-idi质粒图谱。
图2为转化子菌落PCR验证。1-21泳道的PCR模板为随机挑取的平板上生长的不同转化子；C指示的PCR模板为类球红细菌高产菌株质粒pBBR1MCSK-idi(阳性对照)；水为阴性对照。
图3为类球红细菌重组菌株发酵效价。过表达菌株为过表达idi基因的类球红细菌重组菌株；对照菌株为类球红细菌JDW-610。
图4为类球红细菌高产菌株pBBR1MCSK-rs4253质粒的电转化验证。泳道1为DNA分子标准；泳道2-23为不同转化子；C为质粒pBBR1MCSK-rs4253。
图5为类球红细菌野生型菌株pBBR1MCSK-idi质粒的电转化验证。泳道1为DNA分子标准；泳道2-7为不同转化子；阳性克隆的PCR产物的理论值同图2。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的Milli-Q超纯水、10％甘油为高温高压灭菌后备用；若干只50-mL玻璃试管、牙签、枪头(1mL、200μL)均为高温高压灭菌后干燥备用。
下述实施例中的PYG培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Glucose 1g/L，Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，pH 7.2。
下述实施例中的种子培养基和发酵培养基配方均为：葡萄糖20g，硫酸铵5g，味精5g，玉米浆粉7g，硫酸镁7g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠3g，硫酸亚铁2g，硫酸锰0.4g，氯化钴0.008g，水1L，pH 6.5。
下述实施例中的类球红细菌JDW-610的分类命名为类球红细菌Rhodobactersphaeroides，该菌株于2010年2月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4497。在授权公告号为CN102154182B的专利“一种辅酶Q10生产的固料母种发酵培养的方法”中公开过。
实施例1、类球红细菌高产菌株JDW-610的转化方法(重组质粒pBBR1MCSK-idi)
一、重组质粒的构建
将pBBR1MCS载体(派瑞金(北京)生物科技有限公司，货号：014891515)中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列1所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间，得到重组质粒pBBR1MCSK-idi。序列1所示的DNA片段依次由启动子、RBS、类球红细菌idi基因和终止子组成。其中，类球红细菌idi基因为序列1第298-831位。
二、类球红细菌高产菌株JDW-610的电转化方法
1、类球红细菌高产菌株JDW-610感受态细胞的制备
(1)从平板上挑取一个JDW-610菌株的菌落至5mL新鲜PYG培养基中，在32℃，220rpm摇箱中培养，直至对数生长期。
(2)以适当比例转接对数期的菌液至10mL新鲜PYG培养基中，接种后OD值约为0.10。
(3)在32℃，220rpm摇箱中过夜培养，直至OD值达到0.60。
(4)收集全部菌体，并用去离子水洗涤两次。
(5)用750μL 10％(体积分数)的甘油水溶液重悬步骤3获得的菌体，即为类球红细菌高产菌株电转化感受态细胞(OD值约为8.0)。
2、重组质粒电转化感受态细胞
将500ng重组质粒pBBR1MCSK-idi加至步骤1获得的类球红细菌高产菌株电转化感受态细胞中，质粒和感受态细胞的配比为1ng：1.50μL，并将适量细胞移至0.1cm电转杯(Bio-Rad)中，然后分别采用如下电压：0.8kV、0.9kV、1.0kV、1.1kV、1.2kV、1.25kV、1.3kV、1.4kV、1.5kV、1.6kV、1.7kV和1.8kV进行电击转化(电转仪型号：BTX ECM 399,HarvardApparatus,Holliston,USA；该电转仪仅需调节电压)，电转时间为5ms，分别得到重组菌pBBR1MCSK-idi/JDW-610。
3、电转后培养
(1)分别将步骤2获得的重组菌pBBR1MCSK-idi/JDW-610移至420μL PYG液体培养基中，32℃，150rpm复苏2小时。
(2)复苏后，将菌液均匀涂布于PYG平板上，32℃培养5天左右。
(3)用无菌牙签挑取长出的克隆在新的含有适当抗生素的PYG平板上划线，同时进行菌落PCR验证。
三、重组菌的鉴定
从电转化平板上随机挑取了21个单菌落(转化子)，采用idi-Forward(5’AAGCTTATGACGGAAATGGTTCCCGC-3’)和1MCS2937-Forward(5’-TCGCAGTCGGCCTATTGGTTA-3’)进行菌落PCR验证。同时以水作为阴性对照，重组质粒pBBR1MCSK-idi作为阳性对照。若PCR产物大小为1129bp(理论值，C)，则该克隆为阳性。
结果如图2所示，从图中可以看出：21个转化子的PCR产物大小均与理论值(C)大小一致。选取的21个克隆全部为阳性克隆。证明已成功将重组质粒pBBR1MCSK-idi导入类球红细菌高产菌株JDW-610的细胞中，且不同的电压条件下进行电转化也均获得了阳性克隆。说明本发明的电转化操作方法的有效性和高效性。
四、重组菌的发酵培养
将经鉴定为阳性的重组菌(过表达idi基因的类球红细菌重组菌株，过表达菌株)的单克隆接种至种子培养基，在200rpm，32℃条件下培养一天，得到种子液；种子液转接至发酵培养基中，在200rpm，32℃条件下发酵培养两天，得到发酵液。同时以野生型类球红细菌JDW-610为对照菌株。发酵液经萃取后进行HPLC分析，与标准品的峰面积对比后分别得到待测样品中辅酶Q10的含量值。HPLC参数如下：1.色谱柱：Hypersil ODS 4.6mm×150mm，5μm，不锈钢柱；2.检测波长：275nm；3.流动相：色谱乙醇/色谱甲醇＝35/65；4.流速：1.1mL/min；5.柱温：35℃；6.进样量：20μL。
结果如图3所示。过表达菌株和对照菌株中辅酶Q10的效价分别为101mg/L和164mg/L。
实施例2、类球红细菌高产菌株JDW-610的转化方法(重组质粒pBBR1MCSK-rs4253)
一、重组质粒的构建
将pBBR1MCS载体中的氯霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，且将序列2所示的DNA片段插入pBBR1MCS载体的KpnI和SacI多克隆位点间，得到重组质粒pBBR1MCSK-rs4253。序列2所示的DNA片段依次由启动子、RBS、rs4253基因和终止子组成。其中，rs4253基因为序列2第293-1492位。
二、类球红细菌高产菌株JDW-610的电转化方法
按照实施例1的步骤二中的电转化方法，将重组质粒pBBR1MCSK-rs4253转化类球红细菌株JDW-610中。
三、重组菌的鉴定
从电转化平板上随机挑取了22个单菌落(转化子)，采用1MCS2937-Forward(5’-TCGCAGTCGGCCTATTGGTTA-3’)和rs4253-Forward(5’-ATGGCCCGGATCGCAACCGACATTC-3’)进行菌落PCR验证。同时以水作为阴性对照，重组质粒pBBR1MCSK-rs4253作为阳性对照。若PCR产物大小为1796bp(理论值，C)，则该克隆为阳性。
结果如图4所示，从图中可以看出：21个转化子的PCR产物大小与理论值(C)大小一致。选取的22个克隆中21个为阳性克隆。证明已成功将重组质粒pBBR1MCSK-rs4253导入类球红细菌高产菌株JDW-610的细胞中。说明本发明的电转化操作方法的有效性和高效性。
实施例3、野生型类球红细菌株的转化方法
按照实施例1的步骤二中的电转化方法，将重组质粒pBBR1MCSK-idi转化野生型类球红细菌Rhodobacter sphaeroides(CGMCC编号为1.3368)中，得到重组菌pBBR1MCSK-idi/2.4.1。并按照实施例1的步骤三中的方法对重组菌pBBR1MCSK-idi/2.4.1进行PCR鉴定。
电转后培养数天后平板上长出红色菌落，PCR鉴定结果如图5所示。从图中可以看出：5个转化子的PCR产物大小与理论值(C)大小一致。选取的6个克隆中5个克隆为阳性克隆。证明已成功将重组质粒pBBR1MCSK-idi导入野生型类球红细菌株的细胞中。说明本发明的电转化操作方法的有效性和高效性。
对比例、类球红细菌高产菌株JDW-610的双亲结合转化法
参照文献“Lu W,Ye L,Lv X,Xie W,Gu J,Chen Z,Zhu Y,Li A,YuH.Identification and elimination of metabolic bottlenecks in the quinonemodification pathway for enhanced coenzyme Q10production in Rhodobactersphaeroides.Metab Eng 2015；29:208-16”中的双亲接合转移方法将重组质粒pBBR1MCSK-idi转化类球红细菌JDW-610。具体步骤如下：
1、类球红细菌JDW-610接种于LB培养基，32℃，200rpm，培养2-3天；将含有待转化质粒(重组质粒pBBR1MCSK-idi)的S17大肠杆菌在添加有卡那霉素的LB培养基中培养过夜；
2、吸取350μl过夜培养的大肠杆菌转接至新鲜LB培养基，培养至OD600达0.5左右；
3、各取1ml的供体和受体细菌，4000rpm离心5min，弃上清；
4、各用1ml新鲜培养基非常轻缓地重悬菌体；4000rpm离心5min，弃上清；
5、再各用1mI新鲜培养基非常轻缓地重悬菌体；4000rpm离心5min，弃上清；
6、用100μl新鲜培养基非常轻缓地重悬菌体；
7、按照不同比例混合两种细菌，并将混合后的菌液点在平板上事先灭好的0.22μm滤膜上；
8、32℃静置培养平板上的混合菌液1天，使其发生接合转移；
9、刮下滤膜上的菌答，用800μl新鲜培养基重悬，涂布至含有卡那霉素和萘啶酮酸两种抗生素(卡那霉素25mg/L，萘啶酮酸2.5mg/L)的LB固体培养基上；
10、32℃静置培养平板3天以上，直至平板上有小的红色菌落出现为止；
11、将红色菌落挑出(会沾有少量的未杀死的大肠杆菌)，用新鲜培养基重悬，稀释后涂布至双抗的LB平板上，32℃静置培养平板3天以上，直至平板上有单独的红色菌落出现为止；
12、若11后平板上仍有大肠杆菌生长，则重复步骤11。
结果表明：接合转移法未得到类球红细菌的接合子菌落，说明双亲接合转移法对类球红细菌株JDW-610进行接合转移无效。
序列表
<110>华东理工大学 内蒙古金达威药业有限公司
<120>一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法
<160>2
<210>1
<211>1136bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tttgcagcat ggctcttgcg ccctgtcgca cccccgccgc aggcccggcg ccgcccgcgc 60
caccggcccc ggaatcgccc aaagatgcgt ctggaacacc tgttttcact gggattttgc 120
gcccccgggg gtggccgaat ttgccgcagt gtaagcccga ctttacactt gatcgccgac 180
acttgggctc ccatagtgcg tctcacgagg tcggatcaca gacggtccgg cagcgggggg 240
gcgctgagac ggggctcgaa cttaaccgag agaagctaaa ggaggactaa caagcttatg 300
acggaaatgg ttcccgcctg ggtcgagggc cggctgatgc cggtcgagaa gctggaggcg 360
caccagcgcg gcctgcgtca catggcgatc tcggtctttg tcatggccgg cgaggcggtg 420
ctgatccagc gccgcgcggc cggcaagtat cacacgcccg gcctctgggc gaatacctgc 480
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gtgggcaacg ggctgaccga gcatgaggtg gtcgacatct tcgtggccga ggcgccctcg 660
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acttgggctc ccatagtgcg tctcacgagg tcggatcaca gacggtccgg cagcgggggg 240
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gatcgcaacc gacattctcg tctccggcgg aggggtggcc ggcctgacgg ccgccgccgc 360
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cgacatctcc gaacagccct tcggctggaa cctcccgaac tggcttttgc ggcgcgagat 660
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ggtcctcacc cgcgagagcg aggcgctcgt caccctctcc gacggcaccc gcgtcgcggc 780
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gatccgatcc cgcaaaagcg gcctttgact ccctgcaagc ctcagcgacc gaatatatcg 1560
gttatgcgtg ggcgatggtt gttgtcattg tcggcgcaac tatcggtatc aagctgttta 1620
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ttca 1804

Claims (10)

1.一种类球红细菌的转化方法，包括如下步骤：
(1)将类球红细菌接种于培养基中进行培养，收集菌体；将所述菌体依次进行洗涤和重悬后，得到类球红细菌感受态细胞；
所述类球红细菌感受态细胞的OD值为7.7-9.3；
(2)将外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞混合，得到细胞混合物，将所述细胞混合物进行电击转化，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述外源质粒与所述类球红细菌感受态细胞的配比为1ng：(0.75-1.50)μL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述培养的方法为将类球红细菌株接种于培养基中培养至OD值为0.58-0.70。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述电击转化的电压为(0.8-1.8)kv；
或，所述电击转化的时间为5ms。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述洗涤和重悬的方法包括如下步骤：用水洗涤所述菌体，得到洗涤后菌体；再用甘油水溶液重悬所述洗涤后菌体，得到重悬后菌体，即为类球红细菌感受态细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述水为去离子水；
或，所述洗涤的次数为2次；
或，所述甘油水溶液的体积分数为10％。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述电击转化后还包括复苏培养的步骤；
或，所述复苏培养的条件为32℃，150rpm复苏2小时。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述类球红细菌为类球红细菌Rhodobacter sphaeroides JDW-610或野生型类球红细菌Rhodobacter sphaeroides。
9.权利要求1-8中任一所述的重组菌。
10.权利要求1-8中任一所述的重组菌在生产辅酶Q10中的应用。
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