CN103509728A - 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法，构建方法如下：a.从类球红细菌中提取基因组DNA；b.用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因；c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；e.将大肠杆菌S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了叶绿素合成基因bchG的工程菌。本发明提供一种通过敲除类球红细菌叶绿素合成基因提高辅酶Q10产量的方法，能将辅酶Q10的合成能力提高约15%，适合辅酶Q10的大规模工业化生产。

Description

生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法。 

背景技术

辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物,不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同,人类和哺乳动物是10个异戊烯单位,故称辅酶Q10（CoQ10）。如式(Ⅰ)所示： 

辅酶Q10是生物细胞呼吸链中的重要递氢体，是一种良好的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗。此外，在治疗坏血病、卜二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。最近，研究者发现CoQ10具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。 

辅酶Q10的制备方法主要有三种，即动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动植物辅酶Q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法技术上比较成熟，主要是以来源较丰富的茄尼醇为原料合成的，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，合成生物活性高的辅酶Q10尚未达到工业 化生产的程度。微生物发酵法合成的辅酶Q10成本低、无光学异构体，生物学活性高，大规模生产应用效果好。 

常用的微生物包括红螺菌，土壤杆菌，类球红细菌，根瘤菌等。其中类球红细菌培养简单，是辅酶Q10高效的生产菌之一。在细菌中，辅酶Q由两部分组成：醌环部分和异戊二烯侧链部分。醌环骨架由分支酸途径合成，前体是对羟基苯甲酸。侧链由异戊二烯途径合成，侧链的长短决定了辅酶Q10的种类的不同。在类球红细菌中，异戊二烯焦磷酸异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）与9分子异戊二烯焦磷酸（IPP）依次在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶及聚十异戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十异戊二烯焦磷酸。十异戊二烯焦磷酸和对羟基苯甲酸缩合形成辅酶Q10的前体物，该前体物的苯环经修饰之后形成目标产物辅酶Q10。 

使用微生物发酵法生产辅酶Q10虽然较为理想，但是成本较高，因此急需一种能够提高产量并降低生产成本的生产方法。目前尚无专利有关于通过叶绿素基因敲除强化类球红细菌辅酶Q10的合成能力。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能显著提高辅酶Q10产量的生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法。 

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案： 

生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，具体步骤如下： 

a.从类球红细菌中提取待敲除基因组DNA； 

b.用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因； 

c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体； 

d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中； 

e.将大肠杆菌S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了叶绿素合成基因bchG的工程菌。 

作为优选，所述的bchG基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。 

作为优选，所述的广宿主质粒为克隆载体pK18mobsacB。 

一株利用上述构建方法得到的工程菌，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides；命名为NHU-ZAA菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；保藏时间：2012年4月13日；保藏编号：CGMCC No.5999。 

应用上述工程菌生产辅酶Q10的方法，具体步骤如下： 

f.挑取所述NHU-ZAA菌株单克隆接种于含10mL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34℃培养23h，获得一级种子； 

g.将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26-34℃，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子； 

h.将二级种子以1%的比例接种至含100mL发酵培养基的500mL中，在26-34℃，200rpm的条件下培养120h，收集菌液；可通过常规方法提取辅酶Q10。 

作为优选，所述的种子培养基每100mL中含有：(NH4)2SO40.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖0.3g，K2HPO40.05g，KH2PO40.05g，MgSO40.1g，FeSO40.01g，CoCl20.003g，MnSO40.0001g，CaCO30.8g，维生素B10.1μg，维生素K0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。 

作为优选，所述的发酵培养基每100mL种含有：(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖4g，KH2PO40.15g，味精0.3g，MgSO40.63g， 玉米浆0.4g，FeSO40.12g，CoCl20.005g，CaCO30.6g，维生素B10.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。 

其中所述类球红细菌可从河边污泥中分离得到；所述大肠杆菌S17-1购自美国模式培养物集存库，编号ATCC47055。 

本发明由于采用了以上技术方案，具有以下显著的技术效果： 

本发明通过敲除叶绿素基因来阻断牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成叶绿素基因的途径，增加了在辅酶Q10侧链合成途径中GFPP的合成量，从而增加辅酶Q10的产量。 

本发明所提供的通过敲除类球红细菌的叶绿素合成基因的工程菌，具有较高的辅酶Q10合成能力，能够使微生物发酵法生产辅酶Q10的生产能力在原有基础上提高达15%，大规模生产应用效果好，同时具有低污染、对仪器设备要求低、成本低廉的优点，具有很高的工业实用性。 

保藏信息 

保藏名称：类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides；命名为NHU-ZAA菌株； 

保藏时间：2012年4月13日； 

保藏编号：CGMCC No.5999； 

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述： 

实施例1生产辅酶Q10的工程菌的构建方法 

一、从类球红细菌中提取基因组DNA（所用试剂均来自Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒） 

1.吸取0.5-4mL类球红细菌（最多5×109个细菌，所述类球红细菌从河边污泥中分离得到），13500rpm离心1分钟，尽可能吸净上清。 

2.加入100μL EL Buffer，使用tip头吹打均匀。 

3.37℃温育40分钟。 

4.加入100μL RS Buffer,随后加入10μL PK Solution,充分混匀。 

5.于56℃环境中温浴15分钟，然后移出。 

6.加200μL GA Buffer并混合均匀。 

7.于12000rpm离心1分钟。将上清液转移到一个新的1.5mL离心管。 

8.加400μL的BA Buffer，并混合均匀。 

9.将混合液体转移至Spin column。于10000rpm离心1分钟，并弃去接液管中液体。 

10.向Spin column中加入500μL的G Binding Buffer。于10000rpm离心30秒，并弃去接液管中液体。 

11.向Spin column中加入500μL的Wash Buffer。于10000rpm离心30秒，并弃去接液管中液体。 

12.再向Spin column中加入500μL的Wash Buffer。于10000rpm离心30秒，并弃去接液管中液体。 

13.再次将Spin column于10000rpm离心1分钟，并将Spin column转移至一个新的1.5mL离心管。 

14.向Spin column中加入100μL Elution Buffer，并于室温温育1分钟。 

15.于12000rpm离心1分钟，并弃去Spin column。1.5mL离心管中剩余液体即含有基因组DNA。 

二、用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因 

1.设计引物： 

用Primer5引物设计软件设计引物序列： 

30F：GGAATTCGCCCGCTGTCATTCGAGATTG，包含EcoRI酶切位点； 

30R：CGGGATCCGCCGGTCGCACCAGTTGTT，包含BamHI酶切位点。 

32F：CGGGATCCCCGAGGCCGTCCTATTCGTCATT，包含BamHI酶切位点； 

32R：CCCAAGCTTCACATCCTTGCCGTTATCCCAC包含HindIII酶切位点。 

鉴定引物序列为： 

31F：GGAATTCGGTCTCGGTGGGGATCTGGC，包含EcoRI酶切位点； 

31R：CCCAAGCTTCCGCCACCCACTACGAAGACA，包含HindIII酶切位点。 

2.PCR扩增目的基因 

用高保真酶PrimeSTAR（购自大连宝生物公司）扩增，采用标准反应体系：GC缓冲液25μL，水16μL，dNTP混合液4μL，上游引物1.5μL（10uM），下游引物1.5μL（10uM），所述基因组DNA1.5μL，高保真酶PrimeSTAR0.5μL。 

扩增程序为：30个循环，每个循环包含98℃变性10秒，60℃退火5秒，72℃延伸2分钟。 

三、用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体 

1.将PCR产物与质粒进行初次酶切（所用试剂来自AxyPrep PCR清洁试剂盒） 

将PCR产物取出，各加入150μLPCR A，然后均加入离心柱中，取一支空白离心柱加入400μL水，一起13500rpm离心1分钟，加入BUFFER W2700μL，13500rpm离心1分钟，弃清液，再加入W2700μL，再13500rpm离心1分钟。弃清液，再空离1分钟，彻底甩干离心柱。加入34μL Eluent，然后取2支离心管。一支加入PCR产物34μL，另一只加入pK18mobsacB 34μL，EcoRI和BamHI各加入1μL，加入4μL BUFFER。放入37℃水浴酶切1.5小时。 

2.电泳 

1）制备1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20mL1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。冷却到65℃左右加入GelGreen染色剂3μL。 

2）胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。 

3）加样：在点样板上分别将实验例三第一步中酶切的PCR产物和质粒与上样缓冲液混合，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于1X。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入10μL DNA marker-D作为对照。 

4）电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。 

5）电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察,显示900bp处有明显条带。证实叶绿素基因的PCR扩增成功。 

3.割胶回收（所用试剂来自AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒） 

1）割下对应条带的胶。 

2）将胶放入1.5mL离心管中，计算凝胶重量。（需提前记录离心管重量）该重量作为一个凝胶体积（100mg=100μL）。再加入3个凝胶体积的BUFF DE-A，混合后75℃加热融化，约6-8分钟，期间间断混合。再加入0.5个BUFFER DE-A体积的BUFFER DE-B，混合均匀。 

3）将上述混合液转入DNA制备管。13500rpm离心1分钟，弃滤液。加入500μL BUFFER W1，13500rpm离心30秒，弃滤液。加700μL BUFFER W2,13500rpm离心30秒，弃滤液。再加700μL BUFFER W2,13500rpm离心1分钟，弃滤液。然后再13500rpm离心1分钟。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25μL Eluent，室温静置1分钟，13500rpm离心1分钟洗脱DNA。 

4.T4连接酶连接，构建初步质粒 

取步骤三3中的割胶回收产物5.5μL,pK18mobsacB质粒3μL，T4连接酶0.5μL，T4连接酶BUFFER 1μL混合，22℃水浴连接30分钟。 

5.PCR产物与质粒进行二次酶切（所用试剂来自AxyPrep PCR清洁试剂盒） 

取出PCR产物，各加入150μLPCRA，然后均加入离心柱中，取一支空白离心柱加入400μL水，一起13500rpm离心1分钟，加入BUFFER W2700μL,13500rpm离心1分钟，弃清液，再加入W2700μL，再13500rpm离心1分钟。弃清液，再空离1分钟，彻底甩干离心柱。加入34μL Eluent，然后取2支离心管。一支加入PCR产物34μL，另一只加入pK18mobsacB 34μL,HindIII和BamHI各加入1μL，加入4μL BUFFER。放入37℃水浴酶切1.5小时。 

6.电泳 

1）制备1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖置于锥形瓶中，加入20mL 1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。冷却到65℃左右加入GelGreen染色剂3μL。 

2）胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。 

3）加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入10μL DNA marker-D作为对照。 

4）电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。 

5）电泳完毕后，取出凝胶，在紫外灯下观察，显示900bp处有明显条带。证实叶绿素基因的PCR扩增成功。 

7.割胶回收（所用试剂来自AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒） 

1）割下对应条带的胶。 

2）将胶放入1.5mL离心管中，计算凝胶重量。（需提前记录离心管重量）该重量作为一个凝胶体积（100mg=100μL）。再加入3个凝胶体积的BUFF DE-A，混合后75℃加热融化，约6-8分钟,期间间断混合。再加入0.5个BUFFER DE-A体积的BUFFER DE-B，混合均匀。 

3）将混合液转入DNA制备管。13500rpm离心1分钟，弃滤液。加入500μL BUFFER W1，13500rpm离心30秒，弃滤液。加700μLBUFFER W2,13500rpm离心30秒，弃滤液。再加700μL BUFFER W2,13500rpm离心1分钟，弃滤液。然后再13500rpm离心1分钟。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25μL Eluent，室温静置1分钟，13500rpm离心1分钟洗脱DNA。 

8.T4连接酶连接，构建最终基因敲除质粒 

取DNA纯化产物5.5μL，初步质粒3μL，T4连接酶0.5μL，T4连接酶BUFFER 1μL混合，22℃水浴连接30分钟。构建最终基因敲除质粒。 

9.质粒鉴定 

在其余条件相同的前提下采用4组不同的引物搭配进行PCR反应：31F和31R，30F和31R，31F和32R，30F和32R。前三组组合均为阴性反应，第四组为阳性反应，证明基因敲除质粒构建成功。 

四、重组载体转化至大肠杆菌S17-1中 

1.制备大肠杆菌S17-1感受态细胞： 

1)挑取大肠杆菌S17-1单菌落接种至5mL的LB液体培养基中，37℃震荡培养一个晚上。 

2)取1mL培养物接种至50mL LB液体培养基中（2%的接种量），37℃震荡培养2-3小时。 

3)将培养物转移至提前预冷的50mL的离心管中，冰上放置20min，使培养物冷却至0℃。 

4)4℃，4000rpm离心10min，弃上清，加入预冷的CaCl₂ 15mL，用枪打匀，不留小块。 

5)4℃，4000rpm离心10min，弃上清，加入预冷的CaCl₂ 15mL，用枪打匀，不留小块，冰浴30min。 

6)2000rpm，4℃，离心7min，弃上清。 

7)加2mL预冷的CaCl₂，悬浮细胞，分装100μL每管，即得大肠杆菌S17-1感受态，-80℃保存。 

2.基因敲除质粒转化到大肠杆菌S17-1 

取出大肠杆菌S17-1感受态2管，冰浴10分钟后加入步骤三所得基因敲除质粒。冰浴20分钟，热击90秒，冰浴5分钟，加入600μL LB液体培养基。37℃培养45分钟后5000rpm离心5分钟，弃300μL上清液，将剩余液体涂布到卡那平板上。 

五、接合转移 

a.接种所述类球红细菌。 

b.第二天晚上接种已转化的大肠杆菌S17-1阳性克隆。 

c.第三天早上转接大肠杆菌S17-1，每管5mL LB培养基加入100μL菌液，并加入5μL卡那霉素，放入37℃摇床培养。培养3-4小时。 

d.取4mL上述类球红细菌菌液和2mL大肠杆菌菌液，分装至2mL离心管中，每管1mL。 

e.5000rpm离心5分钟。 

f.各弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。 

g.5000rpm离心5分钟。 

h.各弃上清，加入1mL新鲜LB培养基，轻轻重悬菌体。 

i.按类球红细菌和大肠杆菌的比例为100：10，100：20，100：50，100：100的比例混匀菌液。 

j.将混合液浇注于滤膜中心区域。 

k.将LB平板小心移至32℃培养箱中培养过夜。 

l.用镊子将滤膜转移至2mL离心管中。 

m.用700μL LB液体培养基将滤膜上的菌体冲洗下来并吹散。 

分装涂布到含氨苄霉素（100mg/mL）和卡那霉素（50mg/mL）的平板培养基上，其中氨苄霉素浓度为100mg/mL，卡那霉素浓度为50mg/mL，每板350μL菌液。放入32℃培养箱中培养72小时。平板培养基每100mL中含有：酵母提取物0.8g，FeSO40.01g，K2HPO40.13g，CoCl2 0.003g，NaCl 0.2g，MnSO4 0.0001g，MgSO4 0.025g， 葡萄糖0.3g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，琼脂粉1.5g；pH调节为7.2 

六、叶绿素基因敲除菌株的筛选及鉴定 

1.挑取一个单克隆至5mL琥珀酸液体培养基中，32℃培养2天。 

2.取菌液稀释成1：10，1：100，1：1000的浓度梯度分别涂到不含氨苄霉素和卡那霉素的葡萄糖平板培养基上。32℃培养3-5天。 

3.然后将菌落影印到含氨苄霉素和卡那霉素的LB平板培养基上。筛选出在含氨苄霉素和卡那霉素的LB平板培养基上无法生长的菌落，即为叶绿素基因敲除菌株NHU-ZAA。 

实施例2应用工程菌生产辅酶Q10的方法 

一级种子：挑取NHU-ZAA菌株单克隆接种于含10mL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在30℃培养23h。 

二级种子：将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在30℃，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子。 

发酵培养：将二级种子以1%的比例接种至含100mL发酵培养基的500mL中，在30℃，200rpm的条件下培养120h。收集菌液。 

其中，种子培养基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.25g，玉米浆0.05g，酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖0.3g，K₂HPO₄ 0.05g，KH₂PO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄ 0.01g，CoCl₂ 0.003g，MnSO₄0.0001g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，CaCO₃0.8g；pH调节为7.2。 

发酵培养基每100mL种含有：(NH₄)₂SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖4g，KH₂PO₄ 0.15g，味精0.3g，MgSO₄ 0.63g，玉米浆0.4g， FeSO₄ 0.12g，CoCl₂ 0.005g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg，CaCO₃ 0.6g；pH调节为7.2。 

实验例应用HPLC检测未敲除叶绿素基因的菌株与所述NHU-ZAA菌株生产辅酶Q10产量的对比，见表1： 

表1菌株改造前后辅酶Q10产量对比 

由上表得，改造后菌株的辅酶Q10产量由2500mg/L增长至2850mg/L。 

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。 

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江新和成股份有限公司、上虞新和成生物化工有限公司

<120> 生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> Unknown

<223> 人工序列

<400> 1

gtgcccgagccgcgcgcgctgctcgagctgatccagcccatcacctggttcccgccgatc   60

tgggcctatctctgcggcacggtctcggtggggatctggcccggcgagaaatggccgctg   120

gtcctcctcgggatggtgctggcaggccccttggtctgcggcatgagccaggccgcgaac   180

aactggtgcgaccggcatgtggatgccgtgaacgagccggaccggccgatcccctcgggg  240

cgcatccccgggcgctgggggctctatatcgcactcctcatgaccgtgctctcgctcgcc    300

gtgggctggatgttgggcccctggggcttcggcgccaccgtcttcggcgtgctcgcggcc  360

tgggcctattcggtcgagccgatccgcctcaagcggtcgggctggtgggggccgggcctt  420

gtcgcgctctgctacgagggcctaccttggttcacgggcgcggccgtcctgtcggcggga  480

gcgccgagcttcttcatcgtgaccgtggcgctgctctatgccttcggcgcgcatggcatc    540

atgacgctcaacgatttcaaggcgctcgagggcgaccgccagcacggcgtgcgctcgctg  600

ccggtggtgctcgggcccgaggtggccgcgaagctcgcctgcaccgtcatggcgctggcg  660

cagatcctcgtcatcacgctcctcgtcatctggggcaagcccatccatgcgggcatcatc   720

accgcgctgctcgtggcccagctgttcgcgatgcgcgtgctgctgcgcgatccggcgggc  780

aagtgcccctggtataacggcaccggcgtcacgctctatgtgctgggcatgatggtcgcg   840

gccttcgccatccgcgggctggaggtgctgccgtga  876

Claims (7)

1.一种生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

从类球红细菌中提取基因组DNA；

用聚合酶链式反应扩增出bchG的同源基因；

用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；

重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；

将大肠杆菌S17-1与所述类球红细菌接合转移，即得敲除了叶绿素合成基因bchG的工程菌。

2.根据权利要求1所述的生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于，所述的bchG基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于，所述广宿主质粒为克隆载体pK18mobsacB。

4.一株利用如权利要求1-3任一所述的构建方法得到的工程菌，其特征在于，该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides；命名为NHU-ZAA菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年4月13日；保藏编号：CGMCC No.5999。

5.利用如权利要求4所述的工程菌生产辅酶Q10的方法，其特征在于，具体步骤如下：

挑取所述NHU-ZAA菌株单克隆接种于含10mL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34℃培养23h，获得一级种子；

将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26-34℃，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子；

将二级种子以1%的比例接种至含100mL发酵培养基的500mL中，在26-34℃，200rpm的条件下培养120h，收集菌液；菌液中提取辅酶Q10。

6.利用如权利要求5所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述的种子培养基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.25g，玉米浆 0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K₂HPO₄ 0.05g，KH₂PO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄ 0.01g，CoCl₂ 0.003g，MnSO₄ 0.0001g，CaCO₃ 0.8g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。

7.利用如权利要求5所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述的发酵培养基每100mL种含有：(NH₄)₂SO4 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH₂PO₄ 0.15g，味精 0.3g，MgSO₄ 0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO₄ 0.12g，CoCl₂ 0.005g，CaCO₃ 0.6g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。