WO2008119738A1 - Ein enzym zur herstellung von methylmalonyl-coenzym a oder ethylmalonyl-coenzym a sowie dessen verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte DNA, welche ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen: a) eine Sequenz nach SEQ.-ID-Nr.01, b) eine intronfreie Sequenz, die von einer Sequenz nach a) abgeleitet ist und das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ.-ID-Nr.01, c) eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenznach SEQ.-ID-Nr.02 umfasst, d) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach a) bis c) zu mindestens 80% identisch ist, e) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde, f) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e), g) eine Sequenz, die der SEQ.-ID-Nr.01 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, h) eine Sequenz mit neutralen Sinnmutationen der SEQ.- ID-Nr.01, sowie i) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h). Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, die Verwendung dieses Vektors zur Transformation einer Zelle, eine transformierte Zelle, ein Polypeptid, gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte Zellen, ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche gentechnisch veränderte Zelle, die Verwendung dieser Zelle sowie ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder eines Derivates davon.

Description

Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A sowie dessen Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte DNA, einen Vektor, die Verwendung dieses Vektors zur Transformation einer Zelle, eine transformierte Zelle, ein Polypeptid, gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte Zellen, ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche, gentechnisch veränderte Zelle, die Verwendung dieser Zelle sowie ein Verfahren zur Herstellung von organischen C₃- und/oder C₄- Verbindungen .

Organische C3- und C₄-Verbindungen, wie beispielsweise 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure (3-HIB) , sind bedeutende chemische Vorstufen und dienen beispielsweise zur Herstellung von medizinischen Wirkstoffen oder als Komponenten bei der Herstellung biologisch abbaubarer Polymere. So eignet sich 3-Hydroxyisobuttersäure beispielsweise als Vorstufe für die Synthese von Epicaptopril, einem Inhibitor des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE) , welches unter anderem zur Behandlung von Bluthochdruck eingesetzt wird. Auch kann 3-Hydroxyisobuttersäure durch Dehydratisierung zu Methacrylsäure umgesetzt werden. 3-Hydroxypropionsäure wird beispielsweise zur Herstellung von Acrylsäure durch Dehydratisierung, zur Herstellung von Malonsäure durch Oxidation oder aber zur Herstellung von 1, 3-Propandiol durch Reduktion eingesetzt . Fermentative Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. 3-Hydroxypropionsäure sind aus dem Stand der Technik bekannt. So beschreibt US 4,618,583 ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure, bei dem Substrate ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isobuttersäure, Methacrylsäure, Isobutyryl-Chlorid, dem Methyl-Ester des Isobutyryl-Chlorids, Methyl-Ester der Methacrylsäure, dem Ethyl-Ester der Methacrylsäure, Isobutylalkohol, Estern des Isobutylalkohols, Isobutylamin, Isobutylaldehyd, Isobutylamid oder Mischungen hieraus mit Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas aeruginosa oder Protaminobacter alboflavus zu 3-Hydroxyisobuttersäure umgesetzt werden. WO-A-03/62173, WO-A-02/42418 und WO-A-O 1/16346 beschreiben die Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure aus Kohlenhydraten oder Glycerin mittels rekombinanter Zellen, wobei unterschiedliche Stoffwechselwege genutzt werden .

Der Nachteil der vorstehend beschriebenen fermentativen Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. 3-Hydroxypropionsäure besteht unter anderem darin, dass die Menge an gebildetem Zielprodukt in der Fermentationslösung zu gering ist, um diese Fermentationslösung als Ausgangsmaterial für eine großtechnische Herstellung von auf

3-Hydroxyisobuttersäure bzw. 3-Hydroxypropionsäure basierenden Folgeprodukten zu verwenden.

Weiterhin werden bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure oder 3-Hydroxyisobuttersäure stets C_δ-Verbindungen wie Glukose oder aber C3_Verbindungen wie Pyruvat, Phosphoenolpyruvat oder Glycerin eingesetzt, so dass diese Verfahren im wesentlichen auf den Einsatz von Kohlenhydraten oder von Glycerin als Kohlenstoffquellen beschränkt sind. Es besteht jedoch ein zunehmendes Interesse daran, organische C₃- oder C₄-Verbindungen auch aus Ci-oder C₂- Kohlenstoffquellen, wie etwa Kohlendioxid, Methan, Methanol oder Ethanol, herzustellen. Eine solche Synthese von C₃- oder C₄-Verbindungen aus Ci-oder C₂- Kohlenstoffquellen ist jedoch mittels der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren in wirtschaftlich sinnvoller Weise nicht möglich.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.

Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Nukleinsäuresequenz anzugeben, welche für ein Enzym kodiert, welches, wenn es in einer geeigneten Zelle überexpremiert wird, es dieser Zelle ermöglicht, organische C3- und/oder C₄-Verbindungen, insbesondere 3-Hydroxyisobuttersäure oder Derivate davon, in möglichst großen Mengen aus geeigneten Kohlenstoffquellen, insbesondere aus Ci- oder C₂- Kohlenstoffquellen, bereitzustellen.

Auch lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Enzym anzugeben, welches im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Enzymen bei einer Überexpression dieses Enzyms in der Zelle die Fähigkeit der Zelle, 3-Hydroxyisobuttersäure oder Derivate davon zu bilden, entscheidend verbessert.

Der vorliegenden Erfindung lag darüber hinaus die Aufgabe zugrunde, eine Zelle anzugeben, die noch besser, insbesondere noch effizienter als die im Stand der Technik beschriebenen Zellen in der Lage ist, aus geeigneten Kohlenstoffquellen, insbesondere auch aus Ci- oder C₂~Kohlenstoffquellen, Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A als mögliche Zwischenprodukte in einem Verfahren zur Herstellung von

3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivaten, oder aber direkt 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate herzustellen .

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet eine isolierte DNA, welche ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen:

a) eine Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. Ol, b) eine intronfreie Sequenz, die von einer Sequenz nach a) abgeleitet ist und die das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ. -ID- Nr. Ol, c) eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 02 umfasst, d) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis c) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , zu mindestens 80 %, besonders bevorzugt zu mindestens 90 %, darüber hinaus bevorzugt zu mindestens 95 % und am meisten bevorzugt zu mindestens 99 % identisch ist, wobei diese Sequenz

-A- vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, Crotonyl-Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A und gegebenenfalls auch Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A umzusetzen, e) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde, wobei diese Sequenz vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, Crotonyl-Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A und gegebenenfalls auch Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A umzusetzen, f) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion mindestens einer Base, vorzugsweise von mindestens 2 Basen, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 5 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 10 Basen, jedoch vorzugsweise von nicht mehr als 100 Basen, besonders bevorzugt von nicht mehr als 50 Basen und am meisten bevorzugt von nicht mehr als 25 Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , wobei dieses Derivat vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, Crotonyl- Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A und gegebenenfalls auch Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A umzusetzen, g) eine Sequenz, die der SEQ. -ID-Nr. 01 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, h) eine Sequenz mit neutralen Sinnmutationen der SEQ.-

ID-Nr. Ol, sowie i) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) .

Überraschend wurde festgestellt, dass eine aus Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides isolierte DNA mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID. -Nr. Ol ein Polypeptid kodiert (SEQ. -ID-Nr. 02), welches in der Lage ist, sowohl Crotonyl-Coenzym A als auch Acrylyl- Coenzym A zu den entsprechenden Alkylmalonyl-Coenzym A- Verbindungen (Ethylmalonyl-Coenzym A bzw. Methylmalonyl-Coenzym A) umzusetzen. Da Ethylmalonyl- Coenzym A und Methylmalonyl-Coenzym A natürliche StoffWechselprodukte sind, welche beispielsweise beim Abbau des Valins, des Leucins oder des Isoleucins oder beim Metabolismus des Propanoates oder im Ethylmalonyl- Coenzym A-Zyklus bestimmter Bakterien gebildet werden und weil diese Alkylmalonyl-Coenzym A-Verbindungen über die entsprechenden Semialdehyde im Verlaufe der vorstehend genannte Stoffwechselwege zu den entsprechenden 3-Hydroxyalkanoaten weiterreduziert werden können, kann die erfindungsgemäße isolierte DNA genutzt werden, um rekombinante Bakterien herzustellen, welche in der Lage sind, direkt große Mengen an 3-Hydroxyisobuttersäure (und gegebenenfalls auch 3-Hydroxypropionsäure) zu bilden. Wenn die Zellen darüber hinaus in der Lage wären, die gebildeten 3-Hydroxyalkanoate unter Bildung von

Polyhydroxyalkanoaten zu polymerisieren, so würde sich diese DNA darüber hinaus eignen, um rekombinante Bakterien herzustellen, die auf 3-Hydroxyisobuttersäure (oder gegebenenfalls auch auf 3-Hydroxypropionsäure) basierende Polyhydroxyalkanoate herstellen können.

Die „Nukleotid-Identität" und auch die „Aminosäure- Identität" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich

GAP (Deveroy, J. et al . , Nucleic AcId Research 12 (1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und

BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Blology 215 (1990), Seiten 403-410. Das BLAST-Programm kann erhalten werden vom National Center For Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al., vorstehend).

Der Fachmann ist sich bewusst, dass verschiedene Computerprogramme für die Kalkulation der Ähnlichkeit bzw. Identität zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zur Verfügung stehen. So kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- Sequenzen z.B. durch den Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) Algorithmus bestimmt werden, der in das GAP Programm im GCG Software-Paket (erhältlich über http://www.gcg.com), und zwar entweder unter Verwendung einer Blossom 62-Matrix oder einer PAM250-Matrix, einer gap weight von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und einer length weight von 1, 2, 3, 4, 5, oder 6. Der Fachmann wird anerkennen, dass die Verwendung unterschiedlicher Parameter zu leicht unterschiedlichen Ergebnissen führen wird, dass aber die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- Sequenzen insgesamt nicht signifikant unterschiedlich sein wird. Üblicherweise wird die Blossom 62-Matrix unter Anwendung der Voreinstellungen (gap weight: 12, length weight: 1) genutzt.

Eine Identität von 80 % gemäß dem vorstehenden Algorithmus bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 80 % Identität. Das gleiche gilt für höhere Identitäten.

Das Merkmal „Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde" gemäß Alternative e) weist auf eine Sequenz hin, die unter vorzugsweise stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei 68°C in 2 x SSC oder nach dem Protokoll des Dioxygenin- Labelling-Kits der Firma Boehringer (Mannheim) durchgeführt werden. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind z. B. Inkubation bei 65°C über Nacht in 7 % SDS, 1 % BSA, 1 mM EDTA, 250 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) und nachfolgendes Waschen bei 65°C mit 2 X SSC; 0,1 % SDS.

Zu den Derivaten der erfindungsgemäßen isolierten DNA, welche gemäß Alternative f) durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrere Basen einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) erhalten werden können, gehören insbesondere solche Sequenzen, welche in dem Protein, welches sie kodieren, zu konservativen Aminosäureaustauschen, wie z. B. dem Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure führen. Solche funktionsneutralen Mutationen werden als Sinnmutationen

(sense mutations) bezeichnet und führen zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Polypeptids. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Polypeptids dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder dieses sogar stabilisieren können, so dass dementsprechend auch DNA-Sequenzen, bei denen am 3' -Ende oder am 5'- Ende der Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 01 Basen angefügt sind, von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al . (Journal of Bacteriology 169:751-757

(1987)), bei O'Regan et al . (Gene 77:237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al . (Protein Sciences 3:240-247

(1994)), bei Hochuli et al . (Bio/Technology 6:1321-1325

(1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie . Zur Isolierung der erfindungsgemäßen DNA wurde zunächst die chromosomale DNA aus Rhodobacter sphaeroides gemäß F. M. Ausubel et al . , „Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, New York, 1987, isoliert. Eine homologe Nukleinsäuresequenz wurde in dieser DNA identifiziert, welche für ein Protein kodiert, welches zu 78 % identisch ist zum Crotonyl- Coenzym A-Reduktase-Gen (ccr-Gen) aus Methylobacterium extorquenz, zu 41 % identisch zum ccr-Gen aus 5. collinus und zu 39 % identisch zum ccr-Gen aus 5. coelicolor. Unter Verwendung zweier synthetischer Polynukleotide wurde dann, wie im Beispiel 1 nachfolgend genauer beschrieben, das gesamte ccr-Gen aus Rhodobacter sphaeroides mittels PCR amplifiziert .

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Vektor, vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend eine DNA mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie vorstehend definiert. Als Vektoren kommen alle dem Fachmann bekannten Vektoren in Betracht, die üblicherweise zum Einschleusen von DNA in eine Wirtzelle eingesetzt werden. Bevorzugte Vektoren sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmide, wie etwa die E. coli- Plasmide pTE13, pTrc99A, pBR345 und pBR322, Viren, wie etwa Bakteriophagen, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, Masernviren und Retroviren, Cosmide oder YACs, wobei Plasmide als Vektoren am meisten bevorzugt sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vektors liegt die DNA mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, welcher zur Expression des von diesen DNA-Sequenzen kodierten Polypeptids in der Zelle eines Mikroorganismus, vorzugsweise einer Bakterien-, Hefe- oder Pilzelle, besonders bevorzugt einer Bakterienzelle, am meisten bevorzugt einer E. coli-Zelle, geeignet ist. Beispiele für solche Promotoren sind etwa der trp-Promotor oder der tac-Promotor .

Der erfindungsgemäße Vektor sollte neben einem Promotor vorzugsweise eine Ribosomenbindungsstelle sowie einen Terminator umfassen. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße DNA in eine

Expressionskassette des Vektors umfassend den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und den Terminator eingebaut ist. Neben den vorstehend genannten strukturellen Elementen kann der Vektor des Weiteren dem Fachmann bekannte Selektionsgene umfassen.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leisten weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Vektors zur Transformation einer Zelle sowie die durch Transformation mit diesem Vektor erhaltene Zelle. Die Zellen, welche mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert werden können, können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen) , um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind. Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter

http : //www. dsmz . de/species/bacteria .htm

aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter

http : //www. dsmz . de/species/yeasts .htm

aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter

http : //www. dsmz . de/species/fungi .htm

aufgeführt sind.

Insbesondere kann es sich gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des vorstehend beschriebenen Vektors als vorteilhaft erweisen, einen methanotrophen oder methylotrophen Mikroorganismus, vorzugsweise einen methylotrophen Mikroorganismus, mit dem Vektor zu transformieren. Methylotrophe Mikroorganismen sind in der Lage, Ci-Kohlenstoffverbindungen, wie zum Beispiel Methan, Methanol oder Methylamine, zu verwerten. Als Beispiele seien hier genannt Bakterien der Gattung Methylobacterium, wie etwa Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium aminovorans, Methylobacterium aquaticum, Methylobacterium dichloromethanicum, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium fujisawaense, Methylobacterium hispanicum, Methylobacterium isbiliense, Methylobacterium lusitanum, Methylobacterium mesophilicum, Pseudomonas mesophilica , Methylobacterium organophilum, Methylobacterium podarium, Methylobacterium radiotolerans, Pseudomonas radiora, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium rhodinum, Methylobacterium sp. , Methylobacterium suomiense, Methylobacterium thiocyanatum, Methylobacterium variabile oder Methylobacterium zatmanii, Bakterien der Gattung Rhodobakter, Rhodobacter adriaticus, Rhodobacter adriaticus, Rhodopseudomonas adriatica , Rhodobacter blasticus, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter euryhalinus, Rhodovulum euryhalinum, Rhodobacter euryhalinus, Rhodobacter indicus, Rhodobacter sp., Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus oder Rhodobacter veldkampii, Bakterien der Gattung Streptomyces, wie etwa oder Streptomyces coelicolor.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia , Zymomonas, Yarrowia , Methylobacterium, Ralstonia , Rhodobacter und Clostridium, wobei Methylobacterium und Rhodobacter besonders bevorzugt sind. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Polypeptid, welches die Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 02 oder eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zur Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID- Nr.: 02 besitzt. Bei dem Polypeptid handelt es sich um ein Enzym, welches in der Lage ist, sowohl Crotonyl- Coenzym A als auch Acrylyl-Coenzym A zu den entsprechenden Alkylmalonyl-Coenzym A-Verbindungen (Ethylmalonyl-Coenzym A bzw. Methylmalonyl-Coenzym A) umzusetzen. Ein solches Polypeptid kann beispielsweise auf synthetischem Weg, ausgehend von der DNA-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 01 oder durch Transformation einer geeigneten Zelle mit einem geeigneten Vektor umfassend diese Nukleinsäure-Sequenz, Expression des von dieser Nukleinsäure-Sequenz kodierten Proteins in der Zelle, Lyse der Zelle unter Erhalt eines Zellextrakts und anschließende Aufreinigung des Enzyms mittels dem Fachmann bekannten Aufreinigungstechniken, beispielsweise mittels HPLC oder anderen chromatographischen Verfahren, erhalten werden.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch eine Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Ethylmalonyl- Coenzym A oder mehr Methylmalonyl-Coenzym A, vorzugsweise als Zwischenprodukte in einem Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivaten, oder aber direkt mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate zu bilden vermag. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens lOmal, darüber hinaus bevorzugt mindestens lOOmal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens l.OOOmal und am meisten bevorzugt mindestens lO.OOOmal mehr

3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate) im Nährmedium bestimmt wird.

Der Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure", wie er hierin verwendet wird, beschreibt dabei stets die entsprechende C₄-Carbonsäure in derjenigen Form, in der sie nach Bildung durch die entsprechenden Mikroorganismen in Abhängigkeit vom pH-Wert vorliegt. Der Begriff umfasst somit stets die reine Säureform (3-Hydroxyisobuttersäure) , die reine Basenform (3-Hydroxyisobutyrat) sowie Mischungen aus protonierter und deprotonierter Form der Säure. Weiterhin umfasst der Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure" grundsätzlich sowohl das (R)- als auch das (S) -Stereoisomer, wobei das (S) -Stereoisomer besonders bevorzugt ist. Auch im Zusammenhang mit den Alkylmalonyl-Coenzym A- Zwischenprodukten ist mit der Bezeichnung „Methylmalonyl-Coenzym A" und „Ethylmalonyl-Coenzym A" stets sowohl das (R)- als auch das (S) -Stereoisomer umfasst .

Unter dem Begriff „Derivat der 3-Hydroxyisobuttersäure" werden vorzugsweise Polyhydroxyalkanoate verstanden, welche auf 3-Hydroxyisobuttersäure als Monomer basieren .

Die Formulierungen „mehr Ethylmalonyl-Coenzym A und/oder Methylmalonyl-Coenzym A zu bilden vermag" und die Formulierung „mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate zu bilden vermag" umfassen auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt kein Ethylmalonyl-Coenzym A, kein Methylmalonyl-Coenzym A, keine 3-Hydroxyisobuttersäure oder keine Derivate der 3-Hydroxyisobuttersäure, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können.

Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.

Als Zellen sind diejenigen Zellen bevorzugt, die bereits im Zusammenhang mit der Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors zur Transformation einer Zelle als bevorzugte Zellen genannt wurden.

Die erfindungsgemäße Zelle weist vorzugsweise im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität des Enzyms Ei auf, welches die Umsetzung von Crotonyl- Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A sowie von Acrylyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A zu katalysieren vermag. Dieses Enzym Ei wird von einer DNA-Sequenz gemäß einer der Alternativen a) bis h) kodiert oder weist die erfindungsgemäße Polypeptid-Sequenz mit der SEQ. -ID- Nr. 02 auf oder eine Aminosäure-Sequenz, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zur Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 02 aufweist, die jedoch in der Lage ist, Crotonyl-Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A und gegebenenfalls auch Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl- Coenzym A umzusetzen. Dabei kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz in das Genom der Zelle integriert sein oder auf einem Vektor im Inneren der Zelle vorliegen.

Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann. Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.

Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat- Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym- Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.

Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2- dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2-dimensionalen

Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele beispielsweise bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung

(Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Die Wirkung von DNA-bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reportergen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989). Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden

(Donahue et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al . (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al . , Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al . , Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) und Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) beschriebenen Methoden.

Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV- Bestrahlung oder durch mutationsauslösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion (en) , Insertion (en) und/oder

Nukleotidaustausch (e) . Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp-Enzym vermindert feedback- inhibierbar sind.

Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m- RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifiziert . Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137- 146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41

(1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428- 430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98

(1991)), in EP-A-O 472 869, im US 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al .

(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO- A-96/15246, bei Malumbres et al . (Gene 134, 15-24

(1993), in JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer

(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.

Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology 64: 549- 554 (1989)), pEKExl (Eikmanns et al . , Gene 107: 69- 74 (1991)) oder pHS2-l (Sonnen et al . , Gene 107: 69- 74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl . Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 (US 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66: 119-124 (1990)) oder pAGl (US 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidevektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli) , nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)), pKlδmob oder pK19mob (Schäfer et al . , Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM- T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)), pCR Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEMl (Schrumpf et al . , Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)) oder pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . , Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al . , Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al . , FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.

Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x" ist vorzugsweise stets eine um einen Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms E_x zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms E_x" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms E_x zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des Enzyms E_x induziert wird.

Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms E_x" wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, durch Zugabe von kompetitven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression eines bestimmten Enzyms erfolgen.

Gemäß einer ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle weist diese, neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms Ei auch eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der nachfolgenden Enzyme E2 bis Eg auf: eines Enzyms E₂, welches die Umsetzung von zwei

Acetyl-Coenzym A-Einheiten zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E₃, welches die Umsetzung von

Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyrat katalysiert; eines Enzyms E₄, welches die Umsetzung von

3-Hydroxybutyrat zu Crotonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E₅, welches die Umsetzung von

Ethylmalonyl-Coenzym A zu Methylsuccinyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E₆, welches die Umsetzung von

Methylsuccinyl-Coenzym A zu Mesaconyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E₇, welches die Umsetzung von

Mesaconyl-Coenzym A zu Mesaconyl-Coenzym A zu ß-Methylmalyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von ß-Methylmalyl-Coenzym A zu Glyoxylat und Propionyl-

Coenzym A katalysiert.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen, neben der Aktivität des Enzyms Ei, die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₂E₃, E₂E₄, E₂E₅, E₂E₆, E₂E₇, E₂E₈, E₃E₄, E₃E₅, E₃E₆, E₃E₇, E₃E₈, E₄E₅, E₄E₆, E₄E₇, E₄E₈, E₅E₆, E₅E₇, E₅E₈, E₆E₇, E₆E₈, E₇E₈ und E₂E₃E₄E₅E₆E₇E₈. Dabei ist es grundsätzlich möglich und auch bevorzugt, eine Zelle einzusetzen, deren Wildtyp bereits eine oder gegebenenfalls bereits alle der vorstehenden Enzymaktivitäten aufweist, wie beispielsweise Rhodobacter sphaeroides, und in diesem Wildtyp dann entweder nur die Aktivität des Enzyms Ei oder, zusätzlich dazu, eine der, mehrere der oder alle Enzymaktivitäten E₂ bis E₈ durch rekombinante Methoden zu erhöhen. Grundsätzlich kann aber auch eine Zelle eingesetzt werden, deren Wildtyp keine der vorstehend genannten Enzymaktivitäten Ei bis Eg aufweist, und in der dann alle diese Aktivitäten mittels rekombinanter Methoden erhöht werden.

In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym

E₂ eine ß-Kethothiolase (EC 2.3.1.9),

E₃ Acetoacetyl-Coenzym A-Reduktase (eine EC 1.1.1.36),

E₄ eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17),

E₅ eine Ethylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2),

Ee eine Methylsuccinyl-Coenzym A-Dehydrogenase,

E₇ eine Mesaconyl-Coenzym A-Hydratase, und

Eg eine ß-Methylmalyl/L-Malyl-Coenzym A-Lyase

ist .

Das Enzym E₂ wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus acatl, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat- 1, erglO, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, thl, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiLl, thiL2, acaBl, acaB2, acaB3 oder acaB4 kodiert, wobei acatl, acat2, atoB und phbA sowie das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt sind. Das Enzym E3 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phbB, fabG, phbNl, phbB2 oder cgll2444 kodiert, wobei phbB besonders sowie das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt sind.

Das Enzym E₄ wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus echSl, ehhadh, hadha, echsl- prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echAβ, echA7, echA8, echA9, echA9, echAlO, echAl 1, echA12, echA13, echA14, echA15, echAlβ, echA17, echAlδ, echA19, echA20, echA21, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, dcaE, hcaA, fadJ, rspO671, rsp0035, rspO648, rspO647, rsO3234, rsO3271, rsO4421, rsO4419, rs02820, rsO2946, paaGl, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccHl, eccH2, pimF, fabJl, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cglO919, scf41.23, scdlθ.16, sckl3.22, scp8.07c, stbaclβhβ .14, sc5f2a.l5, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 und crt kodiert, wobei das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt ist.

Geeignete Gene für das Enzym E₅ sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmAl, mcmA2, mcmB, mcml, mcm2, mcm3, icmA, meaAl und meaA2, wobei auch hier das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt ist. Bevorzugte Gene für die Enzyme Ee, E₇ und Eg sind insbesondere die Gene für diese Enzyme aus Rhodobacter sphaeroides .

Beispiele für Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene sowie weiterer Gene für die Enzyme E₂ bis Eg können unter anderem auch der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.

Gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Aktivität des Enzyms Ei sowie gegebenenfalls auch die Aktivität eines der, mehrerer der oder alle Enzyme E₂ bis E₈ erhöht ist, weist diese zusätzlich eine erhöhte Aktivität eines oder mehrerer der folgenden Enzyme Eg bis Ei₂ auf:

eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von

Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms Ei₀, welches die Umsetzung von

Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von

Methylmalonat zu Methylmalonat-Semialdehyd katalysiert; eines Enzyms E₁₂, welches die Umsetzung von

Methylmalonat-Semialdehyd zu

3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert .

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen, neben der Aktivität des Enzyms Ei sowie einer oder mehrerer der Aktivitäten E₂ bis E₈ die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert i st : E₉ , E₁₀ , E₁₁ , E₁₂ , E₉E₁₀ , E₉E₁₁ , E₉E₁₂ , E_{1 O}E₁₁ , E_{1 O}E₁₂ , E₁₁E₁₂ , E₉E_{1 O}E₁₁ , E₉E_{1 O}E₁₂ , E₉E₁₁E₁₂ , E_{1 O}E₁₁E₁₂ und E₉E₁₀E₁₁E₁₂ , wobei die Kombination E₉E₁₀E₁₁E₁₂ am mei sten bevorzugt i st .

In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym

E₉ eine Propionyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.3), E₁O eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase

(EC 3.1.2.17) , E₁₁ eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine

Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und E₁₂ eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase

(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-

Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)

ist .

Denkbar ist grundsätzlich der Einsatz von vier voneinander unabhängigen Enzymen E₉ bis E₁₂, oder aber der Einsatz eines Enzymkomplexes, bei welche in der Lage ist, mindestens zwei der vorstehend durch die Enzyme E₉ bis E₁₂ bewirkten Reaktionen durchzuführen. Insbesondere seien hier Enzymkomplexe genannt, welche sowohl die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat als auch die anschließende welches die Umsetzung von Methylmalonat zu Methylmalonat- Semialdehyd katalysieren.

Geeignete Gene für das Enzym E₉ sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pccA, pccB, accDl, accD, rsO3236, accB, accC, pycA, ygjD, yngE, pcc, accA2, accDl, accD2, accD3, accD4, accD5, accDβ, bccAl, pccBl, pccB4, pccB5, cgll0707, cgll0708, cgll2870, dtsR, dtsRl, dtsR2, scdl0.12, scdl0.13, mccB und mmdA, wobei pccA und pccB besonders bevorzugt sind.

Das Enzym Eio wird vorzugsweise vom aoxl-Gen kodiert. Die Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase aus der Leber der Ratte ist beispielsweise in Kovachy et al . , „Recognition, isolation, and characterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme A hydrolase", J. Biol . Chem. 258 (1983), Seiten 11.415-11.421 beschrieben.

Das Enzym En wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus acatl, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-

1, erglO, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, thl, mvaC, thiL, fadA3, fadA4, fadA5, fadAβ, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiLl, thiL2, acaBl, acaB2, acaB3, acaB4 oder kodiert, wobei acatl, acat2 und atoB besonders bevorzugt sind.

Geeignete Gene für das Enzym E₁₂ sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cgl5093, cgl5093, cg4747, mwL2.23, tl3kl4.90, fl9bl5.150, hibA, ygbJ, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCMl.40c, ehhahd, hadh2, hadhsc, hsdl7B4, Ioc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech- 8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-

2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rsO4421, rsO2946, rsO5766, bbsD, bbsC, fadBl, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbacl9f3.11, sci35.13, scbacδdl .10c, sc5f2a.l5, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadCβ, had und paaH. Weitere geeignete 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenasen sind beispielsweise in Bannerjee et al . (1970), J. Biol. Chem, 245, Seiten 1.828 bis 1.835, Steele et al .

(1992), J. Biol. Chem._r 267, Seiten 13.585 bis 13.592, Harris et al . (1988), J. Biol. Chem., 263, Seiten 327 bis 331, Harris et al . , Biochim. Biophys. Acta, 1645 (1), Seiten 89 bis 95, Hawes et al . (2000), Methods Enzymol., 324, Seiten 218 bis 228, Harris et al., J. Biol. Chem., 275 (49), Seiten 38.780 bis 38.786, Rougraff et al . (1988), J. Biol. Chem., 263(1), Seiten 327 bis 331, Robinson et al . , J. Biol. Chem., 225, Seiten 511 bis 521, Hawes et al . (1995), Biochemistry, 34, Seiten 4.231 bis 4.237, Hasegawa J.

(1981), Agric. Biol. Chem., 45, Seiten 2.805 bis 2814, Hawes et al . (1996), FEBS Lett . , 389, Seiten 263 bis 267, Hawes et al . (1996), Enzymology andMolecular Biology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York, Seiten 395 bis 402, Adams et al . (1994), Structure, 2, Seiten 651 bis 668, Zhang et al . (1999), Biochemistry, 38, Seiten 11.231 bis 11.238, Mirny et al . , (1999), J. Mol. Biol., 291, Seiten 177 bis 196 und Lokanath et al .

(2005), J Mol Biol., beschrieben. Die Offenbarung dieser Druckschriften wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der eine oder mehrere der Enzymaktivitäten E₉ bis E_i2 erhöht ist, wird das Enzym En von einer DNA-Sequenz kodiert, welche ausgewählt ist aus folgenden Sequenzen:

A) einer Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 03,

B) einer intronfreien Sequenz, die von einer Sequenz nach A) abgeleitet ist und die das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ. -ID- Nr. 03,

C) einer Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 04 umfasst,

D) einer Sequenz, die mit einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis C) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , zu mindestens 80 %, besonders bevorzugt zu mindestens 90 %, darüber hinaus bevorzugt zu mindestens 95 % und am meisten bevorzugt zu mindestens 99 % identisch ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl Methylmalonat als auch Malonat zu den entsprechenden Semialdehyden, Methylmalonat-Semialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd, umzusetzen,

E) einer Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis D) , besonders bevorzugt nach Gruppe A) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde, wobei diese Sequenz vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl Methylmalonat als auch Malonat zu den entsprechenden Semialdehyden, Methylmalonat-Semialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd, umzusetzen, F) einem durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion mindestens einer Base, vorzugsweise von mindestens 2 Basen, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 5 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 10 Basen, jedoch vorzugsweise von nicht mehr als 100 Basen, besonders bevorzugt von nicht mehr als 50 Basen und am meisten bevorzugt von nicht mehr als 25 Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis D) , besonders bevorzugt nach Gruppe A) , wobei dieses Derivat vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl Methylmalonat als auch Malonat zu den entsprechenden Semialdehyden, Methylmalonat- Semialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd, umzusetzen,

G) einer Sequenz, die der SEQ. -ID-Nr. 03 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, sowie

H) einer Sequenz mit neutralen Sinnmutationen der SEQ. -ID-Nr. 03.

Bei der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenz handelt es sich um das Gen für eine Methylmalonyl- Coenzym A-Reduktase bzw. Malonyl-Coenzym A-Reduktase aus Sulfolobus tokodaii, welche besonders effektiv Methylmalonat oder Malonat zu den entsprechenden Semialdehyden umzusetzen vermag. Dieses Enzym verwirklicht sowohl die Aktivität des Enzyms Eio als auch die des Enzyms En.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle weist diese demnach im Vergleich zu ihrem Wildtyp zumindest eine gesteigerte Aktivität der Enzyms Ei und En auf, wobei das Ei von einer DNA-Sequenz gemäß einer der Alternativen a) bis h) und das Enzym En von einer DNA- Sequenz gemäß einer der Alternativen A) bis H) kodiert wird. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn die gesteigerte Aktivität dieser beiden Enzyme dadurch erzielt wird, dass die Polypeptide mit SEQ. -ID-Nr. 02 und der SEQ. -ID-Nr. 04 oder aber dass Aminosäure- Sequenzen, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zu den Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 02 bzw. SEQ. -ID- Nr. 04 aufweisen, in der Zelle überexpremiert werden. Dabei können diese beiden DNA-Sequenzen in das Genom der Zelle integriert sein oder auf einem Vektor im Inneren der Zelle vorliegen.

Gemäß einer zweiten besonderen Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Aktivität des Enzyms Ei sowie gegebenenfalls auch die Aktivität eines der, mehrerer der oder alle Enzyme E₂ bis E₈ erhöht ist, weist diese zusätzlich eine erhöhte Aktivität eines oder mehrerer der folgenden Enzyme E_i3 und E₁₂ auf:

eines Enzyms E_i3, welches die Umsetzung von

Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonat-Semialdehyd katalysiert; eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von

Methylmalonat-Semialdehyd zu

3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert . Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen, neben der Aktivität des Enzyms Ei sowie einer oder mehrerer der Aktivitäten E₂ bis Eg die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E₁₂, E₁₃ und Ei₂Ei₃, wobei die Kombination Ei₂Ei₃ am meisten bevorzugt ist.

In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym

E13 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase

(EC 1.2.1.27) , und Ei₂ eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase

(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-

Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)

ist .

Geeignete Gene für das Enzym E₁₃ sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldhβal, cgl7896, t22cl2.10, aldβ, putAl, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, iolA und iolAB, wobei mmsA besonders bevorzugt ist.

Geeignete Gene für das Enzym E₁₂ sind vorzugsweise diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit der ersten besonderen Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle genannt wurden.

Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für die Enzyme E₁₂ und E₁₃ können unter anderem auch der KEGG-Datenbank entnommen werden. Es ist im Zusammenhang mit der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle weiterhin bevorzugt, solche Zellen einzusetzen, welche besonders gut in der Lage sind, über den Serin-Zyklus Ci-Kohlenstoffquellen zu verwerten. Hier sind wiederum insbesondere die bereits eingangs genannten methylotrophen und methanotrophen Mikroorganismen bevorzugt.

Gemäß einer zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle weist diese, neben der gesteigerten Aktivität des Enzyms Ei auch eine gesteigerte Aktivität mindestens eines der nachfolgenden Enzyme Ei₄, Ei₅ und Eio bis Ei₂ auf :

eines Enzyms Ei₄, welches die Umsetzung von Beta- Alanin zu Beta-Alanyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms Ei₅, welches die Umsetzung von Beta- Alanyl-Coenzym A zu Acrylyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms Ei₀, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Methylmalonat zu Methylmalonat-Semialdehyd katalysiert; eines Enzyms E_i2, welches die Umsetzung von Methylmalonat-Semialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert .

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen, neben der Aktivität des Enzyms Ei, die Aktivität folgender Enzyme oder

Enzymkombinationen gesteigert ist: Ei₄, Ei₅, Ei₀, En, E_i2, Ei₄Ei₅, Ei₄Ei_O, Ei₄En, Ei₄Ei₂, Ei₅Ei_O, Ei₅En, Ei₅Ei₂, EioEn, E10E12, E11E12 und E14E15E10E11E12. Dabei ist es grundsätzlich möglich, eine Zelle einzusetzen, die bereits in der Lage ist, besonders große Mengen an Acrylyl-Coenzym A zu bilden, einzusetzen.

In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym

Ei₄ eine Coenzym A-Transferase (EC 2.8.3.1) oder

Coenzym A-Synthetase, vorzugsweise eine Coenzym A-

Transferase, E15 eine Beta-Alanyl-Coenzym A-Ammonium-Lysase

(EC 4.3.1.6), Eio eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase

(EC 3.1.2.17) , En eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine

Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und Ei₂ eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase

(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-

Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)

ist .

Bevorzugte Enzyme Ei₄ mit einer CoA-Transferaseaktivität sind diejenigen aus Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Clostridium kluyveri und auch aus Escherichia Coli. Als Beispiele für eine eine CoA- Transferase codierende DNA-Sequenz sein an dieser Stelle die in der WO-A-03/062173 mit der SEQ ID NO: 24 bezeichnete Sequenz aus Megasphaera elsdenii genannt. Des Weiteren bevorzugte Enzyme sind diejenigen Varianten der CoA-Transferase, die in der WO-A- 03/062173 beschrieben werden. Geeignete Enzyme Ei₅ mit einer Beta-Alanyl-Coenzym A- Ammonium-Lyase-Aktivität sind beispielsweise diejenigen aus Clostridium propionicum. DNA-Sequenzen, welche für ein solches Enzym kodieren, können beispielsweise aus Clostridium propionicum, wie im Beispiel 10 der WO-A- 03/062173 beschrieben, erhalten werden. Die DNA- Sequenz, welche für die Beta-Alanyl-Coenzym A-Ammonium- Lyase aus Clostridium propionicum kodiert, ist in der WO-A-03/062173 als SEQ ID NO: 22 angegeben.

Geeignete Gene für die Enzyme Ei₀ bis E_i2 wurden bereits im Zusammenhang mit der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle genannt, wobei es auch im Zusammenhang mit der zweiten Variante bevorzugt ist, als Gen für das Enzym En das vorstehend beschriebene Gen aus Sulfolobus tokodaii besonders bevorzugt ist.

Im Zusammenhang mit der zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn die Zelle neben der Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei, der Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E₂ bis E₈ und der Aktivität eines oder mehrere der Enzyme Ei₄, Ei₅ und Eg bis Ei₂ mindestens eine, vorzugsweise beide der folgenden Eigenschaften aufweist :

eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei_6a welches die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert oder eines Enzyms Ei6b, welches die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat katalysiert, vorzugsweise jedoch eines Enzyms Ei_6a, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert, sowie

eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei₇, welches die Umsetzung von Aspartat zu Beta-Alanin katalysiert,

Bei dem Enzym Ei_6a handelt es sich vorzugsweise um eine Carboxylase, besonders bevorzugt um eine Pyruvat- Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1), welche die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert. Eine in diesem Zusammenhang besonders bevorzugte Pyruvat-Carboxylase ist diejenige Mutante, die in „A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome Information to generate a new L-lysine-producing mutant." , Ohnishi J et al . , Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217-223 (2002) beschrieben ist. Bei dieser Mutation wurde die Aminosäure Prolin an Position 458 durch Serin ersetzt. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der Möglichkeiten zur Herstellung von Pyruvat-Carboxylase-Mutanten wird hiermit als Referent eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.

Bei dem Enzym E_i7 handelt es sich vorzugsweise um eine Decarboxylase, besonders bevorzugt um eine Glutamat- Decarboxylase oder eine Aspartat-Decarboxylase, wobei eine 1-Aspartat-l-Decarboxylase (EC-Nummer 4.1.1.11) am meisten bevorzugt ist, welche von dem panD-Gen kodiert wird. Die Aspartat-Decarboxylase katalysiert die Umsetzung von Aspartat zu Beta-Alanin. Gene für die Aspartat-Decarboxylase (panD-Gene) unter anderem aus Escherichia coli (FEMS Microbiology Letters, 143, Seiten 247-252 (1996)), „Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii, Mycobacterium bovis subsp. Bovis") sowie aus zahlreichen anderen Mikroorganismen wurden bereits kloniert und sequenziert. Insbesondere die Nukleotidsequenz des panD-Gens aus Corynebacterium glutamicum ist in der DE-A-198 55 313 beschrieben. Grundsätzlich können panD-Gene jeder nur denkbaren Herkunft, gleichgültig ob aus Bakterien, Hefen oder Pilzen, verwendet werden. Weiterhin können alle Allele des panD-Gens verwendet werden, insbesondere auch diejenigen, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben. Eine neben der Aspartat-Decarboxylase aus Corynebacterium glutamicum erfindungsgemäß besonders bevorzugte Aspartat-Decarboxylase ist die Escherichia coli-Mutante DV9 (Vallari und Rock, Journal of Bacteriology, 164, Seiten 136-142 (1985)). Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der vorstehend genannten Mutante wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.

Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei, welches von einer DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie eingangs definiert, kodiert wird oder welches die Aminosäure- Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 02 oder eine Aminosäure- Sequenz, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zur Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 02 besitzt, in einer Zelle. Vorzugsweise erfolgt die Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei dadurch, dass die DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , vorzugsweise a bis f) als exogene DNA-Sequenz in eine Zelle eingeführt und anschließend die Expression des Polypeptids, welches von dieser DNA-Sequenz kodiert wird, initiiert wird.

Gegebenenfalls umfasst das Verfahren weiterhin die Erhöhung der Aktivität eines oder mehrerer der Aktivitäten E2 bis Ei₇, insbesondere auch die Erhöhung des Enzyms En, welches von einer DNA-Sequenz nach einer der Gruppen A) bis H) , wie eingangs definiert, kodiert wird oder welches die Aminosäure-Sequenz mit der SEQ.- ID-Nr. 04 aufweist oder eine Aminosäure-Sequenz, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zur Aminosäure- Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 04 besitzt, in einer Zelle.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch eine gentechnisch veränderte Zelle, welche erhältlich ist durch das vorstehend beschriebene Verfahren.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin die Verwendung der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung von Ethylmalonyl-Coenzym A oder Methylmalonyl-Coenzym A, vorzugsweise als Zwischenprodukte für die Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure, oder aber direkt zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivaten .

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von deren Derivaten, umfassend die Verfahrensschritte:

in Kontakt bringens der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Zelle mit einem Nährmedium beinhaltend eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Kohlenhydrate, Glycerin, Kohlendioxid, Methan, Methanol, Lipide, L-Valin oder L-Glutamat, unter Bedingungen, unter denen aus der Kohlenstoffquelle 3-Hydroxyisobuttersäure gebildet wird;

Aufreinigung der so erhaltenen 3-Hydroxyisobuttersäure oder des Derivates davon.

Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch- Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch- Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der vorstehend genannten Produkte mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte

Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel {„Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" , Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methode for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Aminosäuren wie L- Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere Monosacchariden, Oligosacchariden oder Polysacchariden, wie dies in US 6,01,494 und US 6,136,576 beschrieben ist, von C₅-Zuckern oder von Glycerin .

Insbesondere dann, wenn als Zellen solche Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, über den Serin-Zyklus Ci-Kohlenstoffquellen zu nutzen, ist es bevorzugt, dem Nährmedium Kohlenstoffquellen wie Methanol oder Methan zuzusetzen. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden .

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei mehr als 20°C, vorzugsweise bei mehr als 30⁰C, sie kann auch mehr als 40⁰C betragen, wobei vorteilhafterweise eine Kultivierungstemperatur von 95°C, besonders bevorzugt 90⁰C und am meisten bevorzugt 80⁰C nicht überschritten wird.

Diese Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure kann durch jedes dem Fachmann bekannte Reinigungsverfahren erfolgen. So können beispielsweise Sedimentations-, Filtrations- oder Zentrifugationsverfahren eingesetzt werden, um zunächst die Zellen vom Nährmedium abzutrennen. Aus dem von Zellen befreiten, 3-Hydroxyisobuttersäure-haltigen Nährmedium kann die 3-Hydroxyisobuttersäure durch Extraktion, Destillation oder Ionen-Austausch isoliert werden.

Die Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus der Nährlösung erfolgt gemäß einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kontinuierlich, wobei es in diesem Zusammenhang weiterhin bevorzugt ist, auch die Fermentation kontinuierlich durchzuführen, so dass der gesamte Prozess von der enzymatischen Umsetzung der Edukte unter Bildung von 3-Hydroxyisobuttersäure bis zur Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus dem Nährmedium kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zur kontinuierlichen Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus dem Nährmedium wird diese kontinuierlich über eine Vorrichtung zur Abtrennung der bei der Fermentation eingesetzten Zellen, vorzugsweise über einen Filter mit einer Ausschlussgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt, in dem eine Fest- /Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Zellen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend das von den Zellen teilweise befreite Nährmedium einer Ultrafiltrations- oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen .

Das hinsichtlich seines 3-Hydroxyisobuttersäur-Anteils angereicherte Fermentationserzeugnis wird nach der Abtrennung der Zellen einer vorzugsweise mehrstufigen Trennanlage zugeführt. In dieser Trennanlage sind mehrere hintereinander geschaltete Trennstufen vorgesehen, aus denen jeweils Rückführ-Leitungen ausmünden, die zum zweiten Fermentationstank zurückgeführt sind. Weiterhin führen aus den jeweiligen Trennstufen Ableitungen heraus. Die einzelnen Trennstufen können nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehrosmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten. In der Regel handelt es sich um Membran-Trenneinrichtungen in den einzelnen Trennstufen. Die Auswahl der einzelnen Trennstufen ergibt sich aus Art und Umfang der Fermentations- Nebenprodukte und Substratreste.

Die Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren und Beispiele näher erläutert. Es zeigt die Figur 1 die durch die Crotonyl-Coenzym A Reduktase/Carboxylase aus Rhodobacter sphaeroides katalysierten Reaktionen.

Es zeigt die Figur 2 den Ethylmalonyl-Coenzym A- Stoffwechselweg in Rhodobacter sphaeroides .

Es zeigt die Figur 3 eine besondere Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Crotonyl-Coenzym A Reduktase/Carboxylase die Umsetzung von Crotonyl-Coenzym A zu Ethylmalonyl- Coenzym A katalysiert und in der das nachfolgend gebildete Propionyl-Coenzym A über Methylmalonat und Methylmalonat-Semialdehyd zur 3-Hydroxyisobuttersäure umgesetzt wird.

Es zeigt die Figur 4 eine andere besondere Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Crotonyl-Coenzym A Reduktase/Carboxylase die Umsetzung von Crotonyl- Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A katalysiert und in der das nachfolgend gebildete Propionyl-Coenzym A über Methylmalonat-Semialdehyd zur 3-Hydroxyiso-buttersäure umgesetzt wird.

Es zeigt die Figur 5 eine besondere Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Crotonyl-Coenzym A Reduktase/Carboxylase die Umsetzung von Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl- Coenzym A katalysiert.

Es zeigt die Figur 6 die Vektorkarte des im Beispiel 2 eingesetzten Expressionsplasmids . Bei spiele

1. Isolierung von genomischer DNA aus R. sphaeroidesi

Zur Isolierung der erfindungsgemäßen DNA wurde zunächst die chromosomale DNA aus Rhodobacter sphaeroides gemäß F. M. Ausubel et al . , „Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, New York, 1987, isoliert. In dieser DNA eine homologe Nukleinsäuresequenz wurde identifiziert, welche für ein Protein kodiert, welches zu 78 % identisch ist zum Crotonyl-Coenzym A-Reduktase-Gen

(ccr-Gen) aus Methylobacterium extorquenz, zu 41 % identisch zum ccr-Gen aus 5. collinus und zu 39 % identisch zum ccr-Gen aus 5. coelicolor. Unter Verwendung der synthetischen Polynukleotide 5'- GGAGGCAACCATGGCCCTCGA-CGTGCAGAG-3 ' (forward primer; Λ/coI-Schnittstelle am Start-Codon ist unterstrichen) und 5'-GAGACTTGCGGATCCCTC-CGATCAGGC- CTTGC-3' (reverse primer; BamHI-Schnittstelle nach einem Stopp-Codon ist unterstrichen) und der isolierten DNA aus Rhodobacter sphaeroides als Templat wurde das ccr-Gen mittels PCR (Mullis et al . , CoId Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, Seiten 263-273, 1986) amplifiziert . Zur Anwendung gelangte eine präparative PCR, bei der Pfu- Polymerase (Pfunds, Genaxxon) verwendet wurde. Die Pfu-Polymerase enthält eine 3 '-5' Exonuklease

(„proofreading") Funktion. Dabei wurden 32 Zyklen mit jeweils 45 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 55°C und 3 Minuten bei 72°C durchgeführt. Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Thermocycler (Biometra, Göttingen) .

2. Herstellung eines Expressionsvektors

Das im Beispiel 1 erhaltene PCR-Produkt wurde isoliert und in einen pBBRlMCS-2-Expressionsvektor, wie bei Kovach et al, „Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS carrying different antibiotic-resistance cassettes" , Gene, 166, Seiten 175-176 (1995) beschrieben, kloniert. Dazu wurde das nach Aufreinigung im Beispiel 1 erhaltene DNA-Fragment und der Expressionsvektor pBBRlMCS-2 einer Restriktion mit den Enzymen Xholl und Hindlll unterworfen und dann ligiert. Anschließend wurden kompetenter Rhodobakter sphaeroides-Zellen mit dem Expressionsvektor transformiert .

3. Expression und Aufreinigung der CCR

Zur heterologen Expression in E. coli und Aufreinigung der CCR wurde das Gen unter Erhalt von Plasmid pTE13 in den Expressionvektor pET3d kloniert: Das R. sphaeroides ccr-Gen wurde unter Verwendung der Oligonukleotide ccr-fw (5'- GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAGAG-3 ' ; Ncol- Erkennungssequenz unterstrichen) und ccr-rev (5'- GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTTGC-3 ' ; BamHI- Erkennungssequenz unterstrichen) durch PCR amplifiziert, wobei chromosomale DNA des Stammes R. sphaeroides 2.4.1 (DSMZ 158) als Template eingesetzt wurde. Das PCR-Produkt wurde als Ncol /BamHI-Fragment in den mit Ncol /BamHI- geschnittenen Vektor pET3d (Merck, Deutschland) ligiert, wobei das Plasmid pTE13 erhalten wurde. Kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen wurden mit pTE13 transformiert und bei 37°C in LB Medium mit 100 μg/ml Ampicill in einem 200 Liter Fermenter (80 l/min Luftstrom; Rührerdrehzahl 300 rpm) kultiviert. Bei OD₅₇₈ = 0.75 wurde mit 0,5 mM Isopropylthio-Galaktopyranosid (IPTG) induziert. Die Zellen wurden für 3,5 h kultiviert, anschliessend geerntet und bis zur weiteren Aufarbeitung inflüssigem Stickstoff gelagert. Die Aufreinigung des Enzyms erfolgte bei 4°C in zwei Schritten durch DEAE Chromatografie und Affinitätschromatographie. 9 g gefrorene E. coli Zellen wurden im zweifachen Volumen Puffer A (20 mM TriS-HCl, pH 7,9) supplementiert mit 0,1 mg/1 DNase I resuspendiert. Die Suspension mittels zweifacher Passage durch eine French Press bei 137 MPa aufgeschlossen und anschließend 1 h bei 100.000 x g abzentrifugiert . 15 ml Überstand (1,6 g Gesamtprotein) wurden mit einer Flussrate von 2,5 ml/min auf eine 30 ml DEAE-Sepharose Fast Flow Säule (Amersham Biosciences) (zuvor äquilibriert mit 60 ml Puffer A) geladen. Die Säule wurde dann mit 90 ml Puffer A gewaschen, anschliessend mit 135 ml Puffer A mit 50 mM KCl. Aktivität wurde mit 100 mM KCl in Puffer A in einem Gesamtvolumen von 195 ml eluiert. Aktive Fraktionen wurden gepoolt, entsalzt, und über eine Amicon YM 10 Membran (Millipore, Bedford, MA) durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 20 ml aufkonzentriert . 1,5 ml des so erhaltenen Konzentrats (17 mg

Gesamtprotein) wurden mit einer Flussrate von 0,5 ml/min auf eine 10 ml Cibacron blue 3GA Agarose 3000 CL Säule (Sigma-Aldrich) geladen, die zuvor mit 20 ml Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde zweimal mit 22 ml Puffer A gewaschen, gefolgt von 37 ml Puffer A mit 100 mM KCl und 37 ml Puffer A mit 200 mM KCl. Aktivität wurde mit 500 mM KCl in Puffer A in einem Gesamtvolumen von 30 ml eluiert. Aktive Fraktionen wurden gepoolt, entsalzt, und über eine Amicon YM 10 Membran

(Millipore, Bedford, MA) durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 1,5 ml aufkonzentriert . Das Protein

(7,5 mg) wurde in 50% Glycerin bei -20⁰C gelagert.

4. Nachweis der Aktivität der CCR

Die Aktivität der CCR wurde spektrophotometrisch ermittelt, indem die Crotonyl-CoA abhängige Oxidation von NADPH bei 360 nm verfolgt wurde. (SNADPH = 3.400 M^"1 cm^"1) . Es wurde eine Küvette mit einer Schichtdicke von 0,1 cm eingesetzt. Der Reaktionsmix (0,2 ml) enthielt 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 4 mM NADPH, 2 mM Crotonyl-CoA, und 1-5 μg aufgereinigte CCR. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 33 mM KHCO₃ oder NaHCO₃ gestartet. Die ermittelte spezifische Aktivität für die Umsetzung von Crotonyl-CoA des in Beispiel 3 erhaltenen Enzyms lag bei 103 U mg^"1 (Crotonyl-CoA) Die K_m Werte für Crotonyl-CoA und NaHCO₃ wurden durch Variation der Konzentration an NaHCO₃ (0,4- 66,6 mM) oder Crotonyl-CoA (0,125-2,0 mM) ermittelt. Der K_m Wert für NADPH wurde durch Einbau von [¹⁴C] Bicarbonat in (säurestabiles) Ethylmalonyl-CoA ermittelt. Der Reaktionsmix (0,33 ml) enthielt 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 3 mM Crotonyl-CoA, 3 mM NaHCO₃, 64 kBq ml^"1 NaH¹⁴CO₃, und 7 μg aufgereinigte CCR. Die Reaktion wurde durch Zugabe von von NADPH (0,125-5 mM) gestartet. Sie wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt, indem 50 μl des Reaktionsmixes in 50 μl 1,5 M HClO₄ überführt wurden. Die Proben wurden über Nacht geschüttelt, um nicht-eingebautes ¹⁴Cθ2 zu entfernen, und die Menge an inkorporiertem ¹⁴C wurde durch Szintillationsmessung bestimmt. Folgende K_m Werte konnten bestimmt werden: Crotonyl-CoA (0.4 mM) ; NADPH (0.7 mM) ; HCO₃ ^" (14 mM, pH 7.9); Ethylmalonyl-CoA (0.2 mM) .

Desweiteren wurde die Aktivität der CCR mit Acrylyl-CoA anstelle von Crotonyl-CoA als Substrat bestimmt. Dabei katalysiert die CCR die folgende Reaktion :

Acrylyl-CoA + NADPH + CO₂ ~> (25) -Methylmalonyl-CoA^" + NADP⁺.

Der Testmix (0.12 ml) enthielt 80 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaHCO₃, 4.3 mM NADPH und 5-10 μg rekombinante CCR. Gestartet wurde die Reaktion durch Zugabe von 1.3 mM Acrylyl-CoA. Gemessen wurde die Absorptionsänderung bei 360 nm und 30⁰C in einer 0.1 cm starken Küvette.

Für die Umsetzung von Acrylyl-CoA wurde eine spezifische Aktivität von bzw. 45 U mg ^~λ ermittelt. Der apparente iζ_^-Wert für Acrylyl-CoA wurde in einem radioaktiven Test gemessen, bei dem der Einbau von ¹⁴Cθ2 in Acrylyl-CoA quantifiziert wurde. Dabei wurde die Menge an Acrylyl-CoA variiert und die relative Einbaurate durch Szintillation bestimmt. Der Testmix (0.12 ml) enthielt 80 mM Tris-HCl (pH 7.8), 30 mM NaHCO₃, 100 kBq H¹⁴CO₃, 5.2 mM NADPH und 5-10 μg rekombinante ccr. Gestartet wurde die Reaktion durch Zugabe von 0.07 - 2.2 mM Acrylyl- CoA. Nach verschiedenen Zeitpunkten bei 30⁰C (10- 120 sec.) wurden 25 μl Proben aus dem Reaktionsansatz entnommen, mit 500 μl 5% TCA versetzt und nach 12 h „Ausschütteln" (zum Entfernen des nicht-fixierten ¹⁴Cθ2) im Szintillationszähler vermessen. Es wurde ein K_m (Acrylyl-CoA) : 0,47 mM ermittelt.

5. Rekombinanter Stoffwechselweg zur Produktion von 3-HIB in E. coli

Zur Umsetzung der C-Quelle Glycerin zu 3-HIB mit rekombinanten E. coli-Zellen wurden die Gene für sieben verschiedene Enzyme in eine Reihe von Expressionsplasmiden kloniert. Dazu wurden die Duet-Vektoren (Merck, Deutschland) genutzt. Hierbei handelt es sich um ein System von vier Expressionsvektoren, die alle miteinander kompatibel sind und zudem unterschiedliche Antibiotikaresistenzmarker aufweisen . Im Einzelnen wurden für die Umsetzung von Glycerin zu 3-HIB die Gene kodierend für folgende Enzyme in Expressionsvektoren kloniert: 1. Glycerol Dehydratase (EC 4.2.1.30) (GD) aus Klebsiella pneumoniae. Das Enzym katalysiert die Adenosylcobalamin-abhängige Dehydratisierung von Glycerin zu 3-HPA (3-Hydroxypropionaldehyd) . Es besteht aus 3 Untereinheiten (GD-alpha, GD-beta und GD-gamma) , die in K.pneumoniae von 3 Genen (gldA, gldB und gIdC) in einem Operon kodiert vorliegen.

2. Reaktivierungsfaktor aus K. pneumoniae. Da Adenosylcobalamin-abhängige Glycerol-Dehydratäsen durch Glycerin inaktiviert werden, ist zusätzlich für die Umsetzung von Glycerin zu 3-HPA die Aktivität eines Reaktivierungsfaktors erforderlich. Der Reaktivierungsfaktor für die Glycerin Dehydratase aus K. pneumoniae wird von den Genen gdrA und gdrB kodiert.

3. Aldehyd Dehydrogenase AIdH aus E. coli. Zur Umsetzung von 3-HPA zu 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) wurde das E. coli aldH-Gen amplifiziert .

4. Propionyl-CoA Synthase (Pcs) aus Chloroflexus aurantiacus (kodiert durch das Gen pcs) . Die Propionyl-CoA Synthase katalysiert die Umsetzung von 3-HP zu Propionyl-CoA. Es handelt sich um ein trifunktionelles Enzym und behinhaltet drei funktionelle Domänen. Die Acyl-CoA Synthetase (ACS) -Domäne katalysiert die Aktivierung von 3-HP zum 3-Hydroxypropionyl-CoA. Daran anschliessend folgt die Dehydratisierung zum Acrylyl-CoA, katalysiert durch die Enoyl-CoA Hydratase (ECH) - Domäne der Pcs. Die Enoyl-CoA Reduktase (ECR)- Domäne der Pcs katalysiert schliesslich die NADPH- abhängige Reduktion des Acrylyl-CoA zum Propionyl- CoA. Diese Reaktion ist für das beschriebene Vorhaben allerdings irrelevant, weil hier das Zwischenprodukt Acrylyl-CoA gleich durch das nächste Enzym (Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase, s.u.) weiter umgesetzt wird.

5. Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase

(Enzym Ei) (Ccr) aus Rhodobacter sphaeroides (kodiert durch das Gen ccR) . Die Hauptaktivität der Ccr liegt in der reduktiven Carboxylierung von Crotonyl-CoA zu Ethylmalonyl-CoA. Das Enzym zeigt aber eine breite Substrat-Spezifität und setzt sehr effizient Acrylyl-CoA zu Methylmalonyl-CoA um

6. Malonyl-CoA Reduktase (Mcr, Ei₀ und En) aus Sulfolobus tokodaii (kodiert durch das Gen mcr. Die Mcr katalysiert präferentiell die NADPH-abhängige Reduktion von Malonyl-CoA zu Malonat-Semialdehyd. Sie zeigt aber auch eine Nebenaktivität mit Methylmalonyl-CoA als Substrat und setzt dieses zu Methylmalonat-Semialdehyd um.

7. 3-Hydroxyisobutyrat Dehydrogenase (E_i2) (3-HIB-DH) aus Thermus thermophilus (kodiert durch das Gen MmsB) . Dieses Enzym katalysiert die NADPH- abhängige, reversible Umsetzung von Methylmalonat- Semialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure (3-HIB)

Die Klonierungsstrategie zur heterologen Überexpression der oben beschriebenen Enzyme wird im Folgenden detailliert beschrieben. Konstruktion von Plasmid pACYCDuet-KpGDRF zur

Überexpression des Glycerin Dehydratase-

Reaktivierungsfaktors (GDRF) .

Zunächst wurden die Gene gdrA (Synonym ORF4) und gdrB (Synonym ORF2b) , welche die zwei

Untereinheiten des K. pneumoniae GDRF kodieren, mittels PCR amplifiziert . Als Matrize wurde chromosomale DNA vom Stamm K. pneumoniae DSM2026 verwendet .

Zur Amplifizierung von gdrA wurden folgende

Oligonukleotide eingesetzt: orf4fw (5'-TGA AGA TCC TAG GAG GTT TAA ACA TAT GCC

GTT AAT AGC CGG GAT TG-3') und orf4Salrv (5'-TAT ATA GTC GAC TTA ATT CGC CTG ACC

GGC CAG-3'; Sali Erkennungssequenz unterstrichen).

Zur Amplifizierung von gdrB wurden folgende

Oligonukleotide eingesetzt: orf2bPcifw (5'-TAT ATA ACA TGT CGC TTT CAC CGC CAG

GC-3 ' ; Pcil-Erkennungssequenz unterstrichen) und orf2brv (5'-CAT ATG TTT AAA CCT CCT AGG ATC TTC AGT

TTC TCT CAC TTA ACG GCA GG-3 ' ) .

Die erhaltenen PCR-Produkte wurden nachfolgend durch Crossover-PCR miteinander fusioniert.

Dafür wurden folgende Oligonukleotide eingesetzt: orf2bNcofw (5'-TAT ATA CCA TGG CGC TTT CAC CGC CAG

GC-3'; Λfcol-Erkennungssequenz unterstrichen) und orf4Salrv (5'-TAT ATA GTC GAC TTA ATT CGC CTG ACC

GGC CAG-3'; Sall-Erkennungssequenz unterstrichen)

Das PCR-Produkt (2220 bp) wurde mittels des

QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt und in den Vektor pCR-Bluntll-TOPO unter Erhalt des pCR-Bluntll-Topo-KpGDRF-Vektors ligiert. Die Ligation und anschließende Transformation in E. coli Zellen erfolgt nach den Angaben des Herstellers Invitrogen Corporation, Carlsbad (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit) .

Die GDRF-Sequenz wurde anschließend durch Verdau von pCR-Bluntll-Topo-KpGDRF mit Peil und Sali aus dem Vektor herausgeschnitten und in den mit Ncol und Sali geschnittenen pACYC-Duet-

Expressionsvektor unter Erhalt von pACYCDuet-KpGDRF (6142 bp) ligiert.

Konstruktion von Plasmid pAS50 Ec aldH zur

Überexpression der K. pneumoniae Glycerol

Dehydratase (GD) und der E. coli Aldehyd

Dehydrogenase AIdH.

Die drei Untereinheiten der K. pneumoniae GD sind natürlicherweise in einem Operon organisiert (Gene gldA, gldB und gldC) . Sie wurden mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize wieder chromosomale

DNA von K. pneumoniae DSM2026 verwendet wurde.

Folgende Oligonukleotide wurden für die

Amplifizierung eingesetzt:

KpGDNdefw (5'-TAT ATA CAT ATG AAA AGA TCA AAA CGA

TTT GCA GTA CTG G-3 ' ; Ndel-Erkennungssequenz unterstrichen) und

KpGDSalrv (5'-TAT ATA GTC GAC TTA GCT TCC TTT ACG

CAG CTT ATG C-3'; Sall-Erkennungssequenz unterstrichen)

Das Amplifikat wurde in den Vektor pCR-Bluntll-

TOPO unter Erhalt des pCR-Bluntll-Topo-KpGD-Vektors ligiert. Die Ligation und anschließende

Transformation in E. coli Zellen erfolgte nach den Angaben des Herstellers Invitrogen Corporation, Carlsbad (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit) . Das die GD kodierende Fragment wurde mit Xbal (geblunted durch Klenow fill in) und Ndel aus dem Vektor pCR-Bluntll-Topo-KpGD herausgeschnitten und in einen mit Ndel und EcoRV geschnittenen pET-Duet- Expressionsvektor unter Erhalt des Plasmids pAS50 (8161bp) ligiert.

Nachfolgend wurde das E. coli aldH-Gen amplifiziert . Hierfür wurde chromosomale DNA von E. coli K12 als Templat eingesetzt, als PCR-Primer wurden die Oligonukleotide 1228 ald fp (5'- AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG-3 ' ; Ndel- Erkennungssequenz unterstrichen) und 1228_ald_rp (5'-

AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGCTTATCCAGATG- 3'; Ndel-Erkennungssequenz unterstrichen) eingesetzt. Das PCR-Amplifikat wurde übers Gel gereinigt und anschliessend durch Ndel-Verdau in die Ndel site von Plasmid pAS50 ligiert, wobei das Plasmid pAS50_Ec_aldH (9666 bp) erhalten wurde.

Konstruktion von Plasmid pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs zur Überexpression der Chloroflexus aurantiacus Propionyl-CoA Synthase (Pcs) sowie der Rhodobacter sphaeroides Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase (CCR) .

Aus dem pTE13 (vgl. Beispiel 3) wurde das ccr-Gen erneut als Ncol/BamHI-Fragment in die Ncol/BamHI- Schnittstellen des Plasmids pCDFDuet-1 (Merck, Deutschland) umkloniert, wobei das Plasmid pCDFDuet-1 Rs ccr erhalten wurde. Nachfolgend wurde das C. aurantiacus pcs-Gen mit den Oligonukleotiden 1228_Cau_pcs_fp (71) (5'- AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC-3 ' ; Ndel- Erkennungssequenz unterstrichen) und 1228_Cau_pcs_rp(74) (5'-

AAGACGTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCC-3 ' ; Äatll- Erkennungssequenz unterstrichen) durch PCR amplifiziert, wobei chromosomale DNA des Stammes C. aurantiacus OK-70-fl (DSM 636) als Template verwendet wurde. Das Amplifikat wurde nach Aufreinigung durch Gelextraktion über Ndel/Aatll- Verdau in den entsprechend geschnittenen Vektor pCDFDuet-l_Rs_ccr ligiert, wobei das Plasmid pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs (10472 bp) erhalten wurde .

Konstruktion von Plasmid pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg zur Überexpression der Sulfolobus tokodaii Malonyl-CoA Reduktase (Mcr) sowie der Thermus thermophilus 3- Hydroxyisobutyrat Dehydrogenase (3-HIB-DH) Durch Gen-Synthese wurde zunächst eine an die Codon-Usage von Corynebacterium glutamicum angepasste Variante des 5. tokodaii Gens mcr hergestellt (St_mcr_oCg) . Die Synthese erfolgte bei der Firma GeneArt, Deutschland, und das artifizielle Gen St_mcr_oCg wurde in Form des Plasmids pGA4_MMCoAR_ST (SEQ. -ID-Nr 5) bereitgestellt. pGA4_MMCoAR_ST DNA wurde als PCR- Template eingesetzt, um das artifizielle Gen St_mcr_oCg mit den Oligonukleotiden 1228_MMCoAR_fp (5 ' -AACCATGGGCCGCACCCTGAAGG-3 ' ; Ncol- Erkennungssequenz unterstrichen) und 1228_MMCoAR_rp (5 ' -AAGGATCCTTACTTTTCGATGTAGCCCTTTTCC-S ' ; BamHI- Erkennungssequenz unterstrichen) zu amplifizieren . Nach Aufreinigung durch Gelextraktion wurde das Amplifikat mit Ncol/BamHI verdaut und in die entsprechenden Schnittstellen des Plasmids pCOLADuet_l (Merck, Deutschland) ligiert, wobei das Plasmid pCOLADuet St mcr oCg erhalten wurde. Eine an die Codon Usage von Corynebacterium glutamicum angepasste Variante des T. thermophilus Gens MmsB (kodierend eine 3-HIB-DH) wurde ebenfalls durch Gensynthese (GeneArt, Deutschland) bereitgestellt, und zwar in Form des Plasmids pGA4_3HIBDH_TT (SEQ. -ID-Nr 6). pGA4_3HIBDH_TT wurde als PCR-Template eingesetzt, um das artifizielle Gen Tth_HIBDH_oCg mit den Oligonukleotiden 1228_Tth_HIBDH_fp (5'-

AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG-S ' ; Ndel- Erkennungssequenz unterstrichen) und 1228_Tth_HIBDH_rp (5'-

AAAΛGΛTCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC-3 ' ; BgIII- Erkennungssequenz unterstrichen) zu amplifizieren . Nach Gel-Extraktion wurde das Amplifikat mit Ndel/BgIII geschnitten und in die Ndel/Bglll- Schnittstellen des Plasmids pCOLADuet St mcr oCg ligiert, wobei das Plasmid pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg (5620 bp) erhalten wurde.

Die 4 Plasmide pACYCDuet-KpGDRF, pAS50_Ec_aldH, pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs und pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg wurden nachfolgend gemäß Herstellerprotokoll in kommerziell erhältliche, chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) -Zellen (Merck, Deutschland) co- transformiert. Die Selektion erfolgte auf LB-Agar supplementiert mit Ampicillin (25 μg/ml) , Chloramphenicol (17 μg/ml), Kanamycin (15 μg/ml) und Streptomycin (25 μg/ml) .

6. Induktion der Expressionsplasmide in E. coli

Die in Beispiel 5 beschriebenen, plasmidtragenden E. coli-Stämme wurden in modifiziertem M9-Medium (6,8 g/l Na₂HPO₄ x 2H₂O; 3 g/l KH₂PO₄; 0,5 g/l NaCl; 1 g/l NH₄Cl; 1,25 g/l Hefeextrakt; 1% v/v Glycerin; 15 mg/1 CaCl₂ x 2H₂O; 250 mg/1 MgSO₄ x 7H₂O; 1% v/v Gibco MEM Vitamin Solution; 41,9 g/l MOPS ) kultiviert. Das Medium wurde mit Ampicillin (25 μg/ml), Chloramphenicol (17 μg/ml), Kanamycin (15 μg/ml) und Streptomycin (25 μg/ml) supplementiert. Die gesamte Kultivierung (Vor- und Hauptkulturen) erfolgte auf einem temperierbaren Schüttler bei 37⁰C. Zunächst wurden die Stämme in 5 ml Medium über Nacht kultiviert. Nachfolgend wurden 20 ml Medium im 100 ml Schikanekolben im Verhältnis 1:20 aus der Übernachtkultur beimpft und weiter kultiviert. Bei Erreichen von OD600 ca 0,8 wurden 6 μM Cobalamin und 1 μM IPTG zugegeben und 4 Stunden weiter inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 2,5 ml Zellsuspension abgenommen und bis zur Analyse bei -20 ⁰C gelagert.

Der Nachweis und Quantifizierung von 3-HIB kann mittels Ionenchromatografie (IC) und Leitfähigkeitsdetektion erfolgen. Hierfür werden 2,5 ml Proben bei Raumtemperatur aufgetaut und abzentrifugiert (10 min 13.200 rpm) . Der Überstand wird über einen Spritzenfilter (Porengrösse 0,44 μm) gereinigt. Die Messung erfolgt mit einem Metrohm Compact IC 761 mit Autosampier. Mobile Phase: 8 mM NaOH. Säule: Dionex AS15 4 x 250 mm, Vorsäule AG15 4 x 50 mm. Säulentemperatur: 25 ⁰C. Flussrate: 1,4 ml/min. Injektionsvolumen: 10 μl .

Claims

Patentansprüche

1. Eine isolierte DNA, welche ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen: a) eine Sequenz nach SEQ. -ID-Nr. Ol,

b) eine intronfreie Sequenz, die von einer Sequenz nach a) abgeleitet ist und das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ.- ID-Nr. Ol,

c) eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenz nach SEQ.- ID-Nr. 02 umfasst,

d) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach a) bis c) zu mindestens 80% identisch ist,

e) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde,

f) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) ,

g) eine Sequenz, die der SEQ. -ID-Nr. 01 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, h) eine Sequenz mit neutralen Sinnmutationen der SEQ. -ID-Nr. Ol, sowie

i) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) .

2. Ein Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie im Anspruch 1 definiert.

3. Die Verwendung des Vektors nach Anspruch 2 zur Transformation einer Zelle.

4. Eine transformierte Zelle, erhältlich durch Transformation mit einem Vektor nach Anspruch 2.

5. Ein isoliertes Polypeptid, welches die Aminosäure- Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 02 oder eine Aminosäure-Sequenz, die erhalten wird, wenn höchstens 10 Aminosäuren in der SEQ. -ID-Nr. 02 deletiert, insertiert, substituiert oder aber an das C- und/oder N-terminale Ende der Aminosäure- Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 02 angefügt sind, aufweist .

6. Eine Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder deren Derivate zu bilden vermag.

7. Die Zelle nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei aufweist, welches von einer DNA- Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie im Anspruch 1 definiert, kodiert wird.

Die Zelle nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zelle eine exogene DNA mit einer DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie im Anspruch 1 definiert, beinhaltet .

Zelle nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms En aufweist, welches von einer DNA- Sequenz nach einer der Gruppen A) bis H) kodiert wird:

A) einer Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 03,

B) einer intronfreien Sequenz, die von einer Sequenz nach A) abgeleitet ist und die das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ. -ID-Nr. 03,

C) einer Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ.- ID-Nr. 04 umfasst,

D) einer Sequenz, die mit einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis C) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , zu mindestens 80 % identisch ist,

E) einer Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis D) , besonders bevorzugt nach Gruppe A) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde,

F) einem durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion mindestens einer Base erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen A) bis D) , besonders bevorzugt nach Gruppe A) ,

G) einer Sequenz, die der SEQ. -ID-Nr. 03 innerhalb der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder

H) einer Sequenz mit neutralen Sinnmutationen der SEQ. -ID-Nr. 03.

10. Die Zelle nach einem der Ansprüche 4 und 6 bis 9, wobei die Zelle der Gattung Rhodobacter sphaeroides ist .

11. Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei, welches von einer DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis h) , wie im Anspruch 1 definiert, kodiert wird oder welches die Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID-

Nr. 02 aufweist oder eine Aminosäure-Sequenz, die eine Identität von mindestens 50 % zur Aminosäure- Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 02 besitzt, in einer Zelle.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Verfahren zusätzlich den Schritt der Erhöhung der Aktivität des Enzyms En, welches von einer DNA-Sequenz nach einer der Gruppen A) bis H) , wie im Anspruch 9 definiert, kodiert wird oder welches die Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 04 aufweist oder eine Aminosäure-Sequenz, die eine Identität von mindestens 50 % zur Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 04 besitzt, in einer Zelle umfasst.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Zelle der Gattung Rhodobacter sphaeroides ist.

14. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Erhöhung der Aktivität Ei bzw. En durch Erhöhung der Kopienzahl der für diese Enzyme kodierenden Gene, insbesondere durch Erhöhung der Kopienzahl der in den Ansprüchen 1 bzw. 9 definierten Nukleinsäuresequenzen, erfolgt.

15. Eine gentechnisch Veränderte Zelle, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14.

16. Die Zelle nach Anspruch 15, wobei die Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine erhöhte Kopienzahl der für die Enzyme Ei und gegebenenfalls En kodierenden Gene, insbesondere eine erhöhte Kopienzahl der in den Ansprüchen 1 bzw. 9 definierten Nukleinsäuresequenzen, aufweist.

17. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 10 und 15 und 16 zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von deren Derivaten.

8. Ein Verfahren zur Herstellung von

3-Hydroxyisobuttersäure oder von deren Derivaten, umfassend die Verfahrensschritte in Kontakt bringen der Zelle nach einem der Ansprüche 4, 6 bis 10, 15 und 16 mit einem Nährmedium beinhaltend eine Kohlenstoffquelle, beispielsweise Kohlenhydrate, Glycerin, Kohlendioxid, Methan, Methanol, Lipide, L-Valin oder L-Glutamat, unter Bedingungen, unter denen aus der Kohlenstoffquelle

3-Hydroxyisobuttersäure oder ein Derivat davon gebildet wird;

Aufreinigung der so erhaltenen 3-Hydroxyisobuttersäure oder des Derivates davon .