CN101720356A - 用于制备甲基丙二酰辅酶a或乙基丙二酰辅酶a的酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离的DNA,其选自下列序列:a)根据SEQ ID NO:01的序列,b)无内含子的序列,其衍生自根据a)的序列并且与根据SEQID NO:01的序列编码相同的蛋白质或肽,c)编码包含根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列,d)与根据a)至c)的序列至少80%同一的序列,e)与根据组a)至d)之一的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列,f)根据组a)至e)之一的序列的衍生物,其通过一个或多个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得,g)在遗传密码简并性范围之内相应于SEQ ID NO:01的序列,h)具有SEQ ID NO:01的中性有义突变的序列,以及i)与根据组a)至h)之一的序列互补的序列。本发明还涉及载体,所述载体用于转化细胞的用途,经转化的细胞,多肽,相对于其野生型而言经基因工程改造的细胞,用于制备经基因工程改造的细胞的方法,通过所述方法获得的经基因工程改造的细胞,所述细胞的用途,以及用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法。
Description
本发明涉及分离的DNA,载体,所述载体用于转化细胞的用途,经转化的细胞,多肽,相对于其野生型而言经基因工程改造的细胞,用于制备经基因工程改造的细胞的方法,通过所述方法获得的经基因工程改造的细胞,所述细胞的用途,以及用于制备有机C3-和/或C4-化合物的方法。
有机C3-和C4-化合物,例如3-羟基丙酸或3-羟基异丁酸(3-HIB),是重要的化学前体,并且例如用于制备药用活性物质或在制备生物可降解的聚合物中用作组分。因此,3-羟基异丁酸例如适合于作为用于合成表卡托普利(Epicaptopril)(一种血管紧张肽转变酶(ACE)的抑制剂,其尤其用于治疗高血压)的前体。3-羟基异丁酸也可以通过脱水而转化为甲基丙烯酸。例如,使用3-羟基异丁酸通过脱水来制备丙烯酸,通过氧化来制备丙二酸,或者通过还原来制备1,3-丙二醇。
现有技术中已知用于制备3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的发酵方法。如此,US 4,618,583描述了一种用于制备3-羟基异丁酸的方法,其中用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或白黄精朊杆菌(Protaminobacter alboflavus)这些种类的微生物将选自异丁酸、甲基丙烯酸、异丁酰氯、异丁酰氯的甲基酯、甲基丙烯酸的甲基酯、甲基丙烯酸的乙基酯、异丁醇、异丁醇的酯、异丁胺、异丁醛、异丁酰胺或其混合物的底物转化为3-羟基异丁酸。WO-A-03/62173、WO-A-02/42418和WO-A-01/16346描述了借助于重组细胞从碳水化合物或甘油来制备3-羟基丙酸的方法,其中利用了不同的代谢途径。
上面所描述的用于制备3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的发酵方法的缺点尤其在于,在发酵溶液中所形成的目标产物的量太少了,以致不能将该发酵溶液用作用于大规模制备基于3-羟基异丁酸或3-羟基丙酸的第二产物(Folgeprodukt)的起始材料。
此外,在现有技术中已知的用于制备3-羟基丙酸或3-羟基异丁酸的方法中,总是使用C6-化合物例如葡萄糖或者C3-化合物例如丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸或甘油,从而这些方法基本上限于使用碳水化合物或甘油作为碳源。然而,对于下列方面存在着日益增长的兴趣:也从C1-或C2-碳源例如二氧化碳、甲烷、甲醇或乙醇来制备有机C3-或C4-化合物。然而,借助于现有技术中已知的方法,不可能以经济上合理的方式如此地从C1-或C2-碳源来合成C3-或C4-化合物。
本发明基于这样的任务,即克服产生自现有技术的缺点。
特别地,本发明基于这样的任务,即提供核酸序列,所述核酸序列编码酶,所述酶当在合适的细胞中过表达时,使得这些细胞能够从合适的碳源,特别是从C1-或C2-碳源,以尽可能大的量产生有机C3-和/或C4-化合物,特别是3-羟基异丁酸或其衍生物。
本发明还基于这样的任务,即提供酶,所述酶与现有技术中已知的酶相比较,在细胞中过表达该酶的情况下,决定性地改善细胞形成3-羟基异丁酸或其衍生物的能力。
此外,本发明还基于这样的任务,即提供细胞,所述细胞能够比现有技术中所描述的细胞更好地,特别是更有效地从合适的碳源,特别是也从C1-或C2-碳源,制备在用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法中作为可能的中间产物的甲基丙二酰辅酶A或乙基丙二酰辅酶A,或者直接制备3-羟基异丁酸或其衍生物。
分离的DNA为解决开头所述的任务作出了贡献,所述分离的DNA选自下列序列:
a)根据SEQ ID NO:01的序列,
b)无内含子的序列,其衍生自根据a)的序列并且与根据SEQ IDNO:01的序列编码相同的蛋白质或肽,
c)编码包含根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列,
d)与根据组a)至c)之一,特别优选地根据组a)的序列至少80%,特别优选地至少90%,更优选地至少95%和最优选地至少99%同一的序列,其中所述序列优选地编码能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A,和任选地也能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的蛋白质或肽,
e)与根据组a)至d)之一,特别优选地根据组a)的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列,其中所述序列优选地编码能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A,和任选地也能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的蛋白质或肽,
f)根据组a)至e)之一,特别优选地根据组a)的序列的衍生物,其通过至少1个碱基,优选地至少2个碱基,更优选地至少5个碱基和最优选地至少10个碱基,然而优选地不多于100个碱基,特别优选地不多于50个碱基和最优选地不多于25个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得,其中所述衍生物优选地编码能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A,和任选地也能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A的蛋白质或肽,
g)在遗传密码简并性范围之内相应于SEQ ID NO:01的序列,
h)具有SEQ ID NO:01的中性有义突变的序列,以及
i)与根据组a)至h)之一,特别优选地根据组a)的序列互补的序列。
令人惊讶地发现,从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌种的细菌中分离的具有根据SEQ ID NO:01的DNA序列的DNA编码这样的多肽(SEQ ID NO:02),所述多肽能够将巴豆酰辅酶A以及丙烯酰辅酶A转化为相应的烷基丙二酰辅酶A化合物(分别为乙基丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A)。由于乙基丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A是例如在缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的降解中或在丙酸的代谢中或在某些细菌的乙基丙二酰辅酶A循环中形成的天然代谢产物,并且因为这些烷基丙二酰辅酶A化合物在上述代谢途径的过程中可以经由相应的半醛而被进一步还原成相应的3-羟基链烷酸(3-Hydroxyalkanoat),所以根据本发明的分离的DNA可被用于制备能够直接形成大量的3-羟基异丁酸(和任选地还有3-羟基丙酸)的重组细菌。此外,如果这些细胞能够使所形成的3-羟基链烷酸聚合形成聚羟基链烷酸(Polyhydroxyalkanoat),那么所述DNA还适合于制备能够产生基于3-羟基异丁酸(或任选地还有3-羟基丙酸)的聚羟基链烷酸的重组细菌。
在本发明的范围内,用已知的方法来测定“核苷酸同一性”以及“氨基酸同一性”。通常,使用具有考虑了专门要求的算法的特殊的计算机程序。用于测定同一性的优选的方法首先在待比较的序列之间产生最大的一致。用于测定同一性的计算机程序包括,但不限于,GCG程序包,该程序包包括:
-GAP(Deveroy,J.等人,Nucleic Acid Research 12(1984),第387页),Genetics Computer Group University of Wisconsin,Medicine(Wi),和
-BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.等人,Journal ofMolecular Biology 215(1990),第403-410页)。BLAST程序可以从国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)以及从其他来源(BLAST Handbuch,Altschul S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894;Altschul S.等人,同上)获得。
本领域技术人员知道,多种计算机程序可供用于计算两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的相似性或同一性。因此,两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以例如通过在GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序之中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法来测定,更确切地说通过使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵,16、14、12、10、8、6或4的缺口权重,和1、2、3、4、5或6的长度权重。本领域技术人员将会认识到,使用不同的参数会导致略微不同的结果,但两个氨基酸序列之间的同一性百分比总体上不会显著不同。通常,采用Blossom 62矩阵,其中使用缺省值(缺口权重:12,长度权重:1)。
在本发明的情况下,根据上述算法的80%的同一性意味着80%同一性。这也适用于更高的同一性。
根据备选项e)的特征“与根据组a)至d)之一,特别优选地根据组a)的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列”是指这样的序列,该序列在优选地严紧的条件下与根据a)至d)之一,特别优选地根据组a)的序列的反义链杂交,或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交。例如,杂交可以于68℃在2×SSC中或者根据Boehringer公司(Mannheim)的地高辛标记试剂盒(Dioxygenin-Labelling-Kit)的实验方案来进行。优选的杂交条件为例如于65℃在7%SDS,1%BSA,1mM EDTA,250mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中温育过夜,然后于65℃用2×SSC,0.1%SDS洗涤。
根据本发明的分离的DNA的衍生物(其根据备选项f),可以通过根据组a)至e)之一的序列的一个或多个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得)特别包括这样的序列,所述序列在其所编码的蛋白质中导致保守氨基酸替换,例如甘氨酸替换为丙氨酸或者天冬氨酸替换为谷氨酸。此类功能中性突变被称为有义突变(sense mutation),并且不会造成多肽活性的根本变化。此外已知,多肽的N-和/或C-末端的变化不会极大地损害其功能,甚至可以稳定该多肽,因而,与之相应地,其中将碱基附加至具有SEQ ID NO:01的序列的3’-末端或5’-末端的DNA序列也被包括在本发明之中。本领域技术人员尤其可以在下列文献中找到关于此的陈述:Ben-Bassat等人(Journal ofBacteriology 169:751-757(1987)),O′Regan等人(Gene 77:237-2511989)),Sahin-Toth等人(Protein Sciences 3:240-247(1994)),Hochuli等人(Bio/Technology 6:1321-1325(1988)),以及已知的遗传学和分子生物学教科书。
为了分离根据本发明的DNA,首先根据F.M.Ausubel等人,″Current Protocols in Molecular Biology″,John Wiley and Sons,New York,1987,从类球红细菌中分离出染色体DNA。在该DNA中鉴定出同源核酸序列,该同源核酸序列编码与来自扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)的巴豆酰辅酶A还原酶基因(ccr基因)78%同一,与来自山丘链霉菌(S.collinus)的ccr基因41%同一,和与来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的ccr基因39%同一的蛋白质。然后,通过使用两种合成的多核苷酸,如在下面的实施例1中更详细地描述的,借助于PCR从类球红细菌中扩增出整个ccr基因。
此外,载体,优选地表达载体,也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述载体包含如上面所定义的具有根据组a)至h)之一的序列的DNA。作为载体,可以考虑通常用于将DNA引入宿主细胞中的本领域技术人员已知的所有载体。优选的载体选自质粒(例如,大肠杆菌(E.coli)质粒pTE13、pTrc99A、pBR345和pBR322)、病毒(例如噬菌体、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、麻疹病毒和反转录病毒)、粘粒或YAC,其中质粒对于作为载体来说是最优选的。
依照根据本发明的载体的一个优选实施方案,具有根据组a)至h)之一的序列的DNA处于可调控的启动子的控制之下,所述启动子适合于在微生物细胞中表达由这些DNA序列所编码的多肽,所述微生物细胞优选地为细菌、酵母或真菌细胞,特别优选地为细菌细胞,最优选地为大肠杆菌细胞。此类启动子的实例例如为trp启动子或tac启动子。
除了启动子外,根据本发明的载体还应当优选地包含核糖体结合位点以及终止子。在此,特别优选的是,将根据本发明的DNA嵌入包含启动子、核糖体结合位点和终止子的载体的表达盒中。除了上述的结构元件之外,所述载体还可以包含本领域技术人员已知的选择基因。
进一步地,上面所描述的载体用于转化细胞的用途以及通过用所述载体进行转化而获得的细胞为解决开头所述的任务作出了贡献。可以用根据本发明的载体进行转化的细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞。在此,可以涉及哺乳动物细胞(例如来自人的细胞),植物细胞,或者微生物例如酵母、真菌或细菌,其中特别优选的是微生物,最优选的是细菌和酵母。
作为细菌、酵母或真菌,以细菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung yon Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ),Braunschweig,Deutschland)中的那些细菌、酵母或真菌是特别合适的。根据本发明合适的细菌属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm中所列出的那些类别,根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm中所列出的那些类别,和根据本发明合适的真菌属于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm中所列出的那些类别。
特别地,依照上面所描述载体的根据本发明的用途的一个特别优选的实施方案,证实了用所述载体转化甲烷营养微生物或甲基营养微生物,优选地甲基营养微生物是有利的。甲基营养微生物能够利用C1-碳化合物,例如甲烷、甲醇或甲胺。作为实例,在此可以提及甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌,例如粘甲基杆菌(Methylobacterium adhaesivum)、噬胺甲基杆菌(Methylobacteriumaminovorans)、水生甲基杆菌(Methylobacterium aquaticum)、二氯甲烷甲基杆菌(Methylobacterium dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、藤泽氏甲基杆菌(Methylobacterium fujisawaense)、西班牙甲基杆菌(Methylobacterium hispanicum)、Methylobacterium isbiliense、葡萄牙矿甲基杆菌(Methylobacterium lusitanum)、嗜中温甲基杆菌(Methylobacterium mesophilicum)、嗜中温假单胞菌(Pseudomonasmesophilica)、嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilum)、足甲基杆菌(Methylobacterium podarium)、耐辐射甲基杆菌(Methylobacterium radiotolerans)、抗放射假单胞菌(Pseudomonasradiora)、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、玫瑰红甲基杆菌(Methylobacterium rhodinum)、甲基杆菌属物种(Methylobacterium sp.)、Methylobacterium suomiense、硫氰酸盐甲基杆菌(Methylobacterium thiocyanatum)、易变甲基杆菌(Methylobacterium variabile)或扎氏甲基杆菌(Methylobacteriumzatmanii),红细菌属(Rhodobacter)的细菌,亚德里亚红细菌(Rhodobacter adriaticus)、亚德里亚红细菌(Rhodobacteradriaticus)、亚德里亚红假单胞菌(Rhodopseudomonas adriatica)、生芽红细菌(Rhodobacter blasticus)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、广海红细菌(Rhodobacter euryhalinus)、广盐小红卵菌(Rhodovulum euryhalinum)、广海红细菌(Rhodobactereuryhalinus)、印度红细菌(Rhodobacter indicus)、红细菌属物种(Rhodobacter sp.)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、类球红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、嗜硫红细菌(Rhodobacter sulfidophilus)或维氏红细菌(Rhodobacterveldkampii),链霉菌属(Streptomyces)的细菌,例如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
根据本发明特别优选的细胞为下列属的那些细胞:棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、红细菌属(Rhodobacter)和梭菌属(Clostridium),其中甲基杆菌属和红细菌属是特别优选的。
这样的多肽也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述多肽具有带有SEQ ID NO:02的氨基酸序列,或者与根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列享有至少50%,优选地至少55%,更优选地至少60%,更加优选地至少65%和最优选地至少70%同一性的氨基酸序列。所述多肽为能够将巴豆酰辅酶A以及丙烯酰辅酶A转化为相应的烷基丙二酰辅酶A化合物(分别为乙基丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A)的酶。这样的多肽可以例如从具有SEQ ID NO:01的DNA序列开始以合成方式来获得,或者通过下列步骤来获得:用合适的包含该核酸序列的载体转化合适的细胞;在所述细胞中表达由该核酸序列所编码的蛋白质;裂解所述细胞以获得细胞提取物;以及,随后借助于本领域技术人员已知的纯化技术,例如借助于HPLC或其他色谱方法来纯化该酶。
这样的细胞也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述细胞相对于其野生型而言如此地经基因工程改造,从而与其野生型相比较,它能够形成更多的乙基丙二酰辅酶A或更多的甲基丙二酰辅酶A(其优选地在用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法中作为中间产物),或者直接形成更多的3-羟基异丁酸或其衍生物。在此,特别优选的是,根据本发明的细胞在确定的时段内,优选地在2小时内,更优选地在8小时内和最优选地在24小时内,所形成的3-羟基异丁酸或其衍生物的量为所述细胞的野生型的至少2倍,特别优选地至少10倍,更优选地至少100倍,更加优选地至少1000倍和最优选地至少10000倍。在此,产物形成的增加可以例如通过下列方式来测定:将根据本发明的细胞和野生型细胞各自分开地在相同的条件(相同的细胞密度、相同的培养基、相同的培养条件)下,在合适的培养基中培养经过确定的时段;随后测定培养基中目标产物(3-羟基异丁酸或其衍生物)的量。
如此处所使用的,术语“3-羟基异丁酸”在此总是描述以这样形式的相应的C4-羧酸,所述形式为C4-羧酸在由相应的微生物形成之后依赖于pH值而呈现的形式。因此,该术语总是包括纯的酸形式(3-羟基异丁酸)、纯的碱形式(3-羟基异丁酸盐)以及由酸的质子化和脱质子化形式所组成的混合物。此外,术语“3-羟基异丁酸”原则上不仅包括(R)-立体异构体而且包括(S)-立体异构体,其中特别优选的是(S)-立体异构体。同样地,关于烷基丙二酰辅酶A中间产物,名称“甲基丙二酰辅酶A”和“乙基丙二酰辅酶A”总是不仅包括(R)-立体异构体而且包括(S)-立体异构体。
术语“3-羟基异丁酸的衍生物”优选地是指聚羟基链烷酸,其基于作为单体的3-羟基异丁酸。
表述“能够形成更多的乙基丙二酰辅酶A和/或甲基丙二酰辅酶A”和表述“能够形成更多的3-羟基异丁酸或其衍生物”也包括这样的情况:经基因工程改造的细胞的野生型完全不能形成乙基丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、3-羟基异丁酸或3-羟基异丁酸的衍生物,或者至少不能形成可检测量的这些化合物;并且在经过基因工程改造之后才能形成可检测量的这些组分。
细胞的“野生型”优选地是指这样的细胞,其基因组以如同它自然地通过进化而形成的那种状态存在。该术语不仅用于整个细胞,而且用于单个基因。因此,术语“野生型”特别地不包括这样的细胞或这样的基因,其基因序列已由人借助于重组方法至少部分地进行了改变。
作为细胞,优选的是这样的细胞,它们已经在根据本发明的载体用于转化的用途方面作为优选的细胞被提及。
优选地,根据本发明的细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性,所述酶E1能够催化巴豆酰辅酶A向乙基丙二酰辅酶A的转化以及丙烯酰辅酶A向甲基丙二酰辅酶A的转化。该酶E1由根据备选项a)至h)之一的DNA序列编码,或者具有带有SEQ ID NO:02的根据本发明的多肽序列或下列这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列具有至少50%,优选地至少55%,更优选地至少60%,更加优选地至少65%和最优选地至少70%的同一性,但能够将巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A和任选地还能够将丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。在此,根据本发明的DNA序列可以整合到细胞的基因组中,或者存在于细胞内的载体上。
现在接下来的关于提高细胞中的酶活性的论述不仅适用于提高酶E1的活性,而且适用于下文提及的其活性任选地可以被提高的所有酶。
原则上,可以如此来获得酶活性的增加,即通过增加编码所述酶的基因序列的拷贝数,使用强启动子,或者利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因,以及任选地将这些措施相组合。根据本发明经基因工程改造的细胞例如通过用载体进行转化、转导、接合或这些方法的组合来产生,所述载体包含所期望的基因、该基因的等位基因或其部分和使该基因能够表达的载体。特别地,异源表达通过将所述基因或等位基因整合到细胞的染色体中或染色体外复制型载体中来获得。
DE-A-100 31 999给出了关于提高细胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶活性)的可能性的综述,该文献在此引入作为参考,并且其关于提高细胞中的酶活性的可能性的公开内容构成本发明公开内容的一部分。
上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表达可借助于下列方式来检测:1-和2-维蛋白质凝胶分离,和随后用相应的评价软件来光学鉴定凝胶中的蛋白质浓度。如果酶活性的提高仅基于相应基因的表达的提高,那么可以简单地通过在野生型细胞和经基因工程改造的细胞之间比较1-或2-维蛋白质分离来定量酶活性的提高。用于制备蛋白质凝胶(例如在棒状杆菌的情况下)和用于鉴定蛋白质的常用方法为Hermann等人(Electrophoresis,22:1712.23(2001))所描述的程序。也可以通过下列方式来分析蛋白质浓度:用对于待检测的蛋白质特异的抗体来进行Western-印迹杂交(Sambrook等人,Molecular Cloning:a laboratory manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989),随后用相应的用于浓度测定的软件来进行光学评价(Lohau s和Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39;Lottspeich(1999),AngewandteChemie 111:2630-2647)。DNA结合蛋白的活性可以借助于DNA条带移位分析(也称为凝胶阻滞)来测量(Wilson等人,(2001)Journalof Bacteriology,183:2151-2155)。DNA结合蛋白对于其他基因的表达的影响可以通过各种经充分描述的报道基因分析方法来检测(Sambrook等人,Molecular Cloning:a laboratory manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)。细胞内的酶活性可以通过各种经描述的方法来测定(Donahue等人,(2000)Journal of Bacteriology 182(19):5624-5627;Ray等人,(2000)Journal of bacteriology 182(8):2277-2284;Freedberg等人,(1973)Journal of Bacteriology 115(3):816-823)。如果在后面的论述中,没有说明用于测定特定酶的活性的具体方法,那么优选地借助于下列文献中所描述的方法来测定酶活性的增加以及酶活性的降低:He rmann等人,Electophoresis,22:1712-23(2001);Lohau s等人,Biospektrum 532-39(1998);Lottspeich,Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999);和Wilson等人,Journal of Bacteriology 183:2151-2155(2001)。
如果酶活性的提高是通过内源基因的突变而实现的,那么这样的突变可以或者根据传统方法随机产生,例如通过UV辐射或通过诱发突变的化学药品;或者借助于基因工程方法例如删除、插入和/或核苷酸交换来达到。通过这些突变获得经基因工程改造的细胞。特别地,特别优选的酶突变体还是这样的酶,其不再是反馈可抑制的或者至少与野生型酶相比较而言其反馈可抑制性降低了。
如果酶活性的提高是通过提高酶的表达而实现的,那么就例如增加相应基因的拷贝数,或者使启动子和调控区域或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。同样地,嵌入至结构基因上游的表达盒也起作用。通过诱导型启动子另外还可能在任一时间点处增强表达。此外,也可以给酶基因分派所谓的“增强子”作为调控序列,其通过RNA聚合酶和DNA之间改善的相互作用也导致提高的基因表达。通过用于延长mRNA寿命的措施也可改善表达。此外,通过防止酶蛋白质的降解也可增强酶活性。在此,基因或基因构建体或者存在于具有不同拷贝数的质粒中,或者整合在染色体中并于其中进行扩增。备选地,所涉及的基因的过表达此外还可以通过改变培养基组成和培养条件来达到。本领域技术人员尤其可在Martin等人(Bio/Technology 5,137-146(1987))中,在Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994)),在Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))中,在Eikmanns等人(Gene 102,93-98(1991))中,在EP-A-0472869中,在US4,601,893中,在Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991))中,在Reinscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60,126-132(1994))中,在LaBarre等人(Journalof Bacteriology 175,1001-1007(1993))中,在WO-A-96/15246中,在Malumbres等人(Gene 134,15-24(1993))中,在JP-A-10-229891中,在Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58,191-195(1998))中,以及在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到关于此的指导。与突变一样,上面所描述的措施产生经基因工程改造的细胞。
为了提高各基因的表达,使用例如附加型质粒。合适的质粒特别为在棒状杆菌中进行复制的质粒。众多的已知质粒载体,例如pZ1(Menkel等人,Applied and Environmental Microbiology 64:549-554(1989))、pEKEx1(Eikmanns等人,Gene 107:69-74(1991))或pHS2-1(Sonnen等人,Gene 107:69-74(1991))基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。同样地,也可以使用其他质粒载体,例如基于pCG4(US 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人,FEMSMicrobiology Letters 66:119-124(1990))或pAG1(US 5,158,891)的那些质粒。
此外,这样的质粒载体也是合适的,借助于所述质粒载体可以采用通过整合入染色体中来进行基因扩增的方法,如由Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60:126-132(1994))对于复制或扩增hom-t hrB操纵子所描述的那样。在该方法中,将完整的基因克隆到质粒载体中,后者可以在宿主(通常为大肠杆菌(Escherichia coli))中进行复制,但不能在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行复制。作为载体,例如可以考虑pSUP301(Simon等人,Bio/Technology 1:784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(等人,Gene145:69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation,Madison,Wisconsin,USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman,Journal of Biological Chemistry 269:32678-84(1994))、Blunt(Invitrogen,Groningen,Niederlande)、pEM1(Schrumpf等人,Journal of Bacteriology 173:4510-4516))或pBGS8(Spratt等人,Gene 41:337-342(1986))。随后,包含待扩增的基因的质粒载体通过接合或转化而转移到所期望的谷氨酸棒杆菌菌株中。接合的方法例如在等人,Applied andEnvironmental Microbiology 60:756-759(1994)中进行了描述。转化的方法在例如在Thierbach等人,Applied Microbiology andBiotechnology 29:356-362(1988);Dunican和Shivnan,Bio/Technology 7:1067-1070(1989);和Tauch等人,FEMSMicrobiology Letters 123:343-347(1994)中进行了描述。在借助于“交换(cross-over)”事件进行同源重组后,所得的菌株包含至少两个拷贝的所涉及的基因。
在上文中和在下面的论述中所使用的表述“相对于其野生型而言增加的酶Ex的活性”优选地总是指,各酶Ex的活性增加到至少2倍,特别优选地至少10倍,更优选地至少100倍,更加优选地至少1000倍和最优选地至少10000倍。此外,根据本发明的细胞(其具有“相对于其野生型而言增加的酶Ex的活性”)特别地也包括这样的细胞,所述细胞的野生型不具有该酶Ex的活性或至少不具有可检测的该酶Ex的活性,并且在提高所述酶活性之后(例如通过过表达)才显示出可检测的该酶Ex的活性。在这种情况下,术语“过表达”或者在下面的论述中所使用的表述“表达的提高”也包括这样的情况,即起始细胞例如野生型细胞不具有表达或至少不具有可检测的表达,并且只有通过重组方法才诱导出可检测的酶Ex的表达。
相应地,下面所使用的表述“降低的酶Ex的活性”优选地是指,降低为至少0.5倍,特别优选地至少0.1倍,更优选地至少0.01倍,更加优选地至少0.001倍和最优选地至少0.0001倍的活性。特定酶的活性的降低可以例如通过定向突变,通过添加竞争性或非竞争性抑制剂,或者通过本领域技术人员已知用于降低特定酶的表达的其他措施来实现。
依照根据本发明的细胞的第一种变化形式,除了增加的酶E1的活性外,该细胞还具有增加的下述酶E2至E8中至少一种酶的活性:
-酶E2,其催化两个乙酰辅酶A单元转化为乙酰乙酰辅酶A;
-酶E3,其催化乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基丁酸酯;
-酶E4,其催化3-羟基丁酸酯转化为巴豆酰辅酶A;
-酶E5,其催化乙基丙二酰辅酶A转化为甲基琥珀酰辅酶A;
-酶E6,其催化甲基琥珀酰辅酶A转化为中康酰辅酶A;
-酶E7,其催化中康酰辅酶A转化为β-甲基苹果酰辅酶A;
-酶E8,其催化β-甲基苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和丙酰辅酶A。
在此,根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞,在所述细胞中除了酶E1的活性外,下列酶或酶组合的活性也是增加的:E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E2E3、E2E4、E2E5、E2E6、E2E7、E2E8、E3E4、E3E5、E3E6、E3E7、E3E8、E4E5、E4E6、E4E7、E4E8、E5E6、E5E7、E5E8、E6E7、E6E8、E7E8和E2E3E4E5E6E7E8。在此,原则上可能的并且也优选的是,使用其野生型已经具有一种前述酶活性或任选地已经具有所有前述酶活性的细胞,例如类球红细菌,然后在该野生型中通过重组方法只提高酶E1的活性,或者除此之外另外还提高酶活性E2至E8中的一种酶活性、多种酶活性或所有酶活性。原则上,也可以使用这样的细胞,所述细胞的野生型不具有上述酶活性E1至E8中的任一种,并且然后在所述细胞中借助于重组方法来提高所有这些活性。
在这种情况下,特别优选的是,
酶E2为β-酮硫解酶(EC 2.3.1.9),
酶E3为乙酰乙酰辅酶A还原酶(EC 1.1.1.36),
酶E4为烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17),
酶E5为乙基丙二酰辅酶A变位酶(EC 5.4.99.2),
酶E6为甲基琥珀酰辅酶A脱氢酶,
酶E7为中康酰辅酶A水合酶,和
酶E8为β-甲基苹果酰/L-苹果酰辅酶A裂合酶。
优选地,酶E2由选自下列的基因编码:acat1、acat2、loc484063、loc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、mgc83664、kat-1、erg10、ygeF、atoB、fadAx、phbA-1、phbA-2、atoB-2、pcaF、pcaF-2、phb-A、bktB、phaA、tioL、thlA、fadA、paaJ、phbAf、pimB、mmgA、yhfS、thl、vraB、thl、mvaC、thiL、paaJ、fadA3、fadA4、fadA5、fadA6、cg112392、catF、sc8f4.03、thiL1、thiL2、acaB1、acaB2、acaB3或acaB4,其中,acat1、acat2、atoB和phbA以及来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
优选地,酶E3由选自下列的基因编码:phbB、fabG、phbN1、phbB2或cg112444,其中,phbB以及来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
优选地,酶E4由选自下列的基因编码:echS1、ehhadh、hadha、echs1-prov、cg4389、cg4389、cg6543、cg6984、cg8778、ech-1、ech-2、ech-3、ech-4、ech-5、ech-6、ech-7、FCAALL.314、fcaall.21、fox2、eci1、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、echA1、echA2、echA3、echA4、echA5、echA6、echA7、echA8、echA9、echA9、echA 10、echA11、echA12、echA13、echA14、echA15、echA16、echA17、echA18、echA19、echA20、echA21、fad-1、fad-2、fad-3、fad-4、fad-5、dcaE、hcaA、fadJ、rsp0671、rsp0035、rsp0648、rsp0647、rs03234、rs03271、rs04421、rs04419、rs02820、rs02946、paaG1、paaG2、paaG3、ech、pksH、ydbS、eccH1、eccH2、pimF、fabJ1、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cgl0919、scf41.23、scd10.16、sck13.22、scp8.07c、stbac16h6.14、sc5f2a.15、sc6a5.38、hbd-1、hbd-2、hdb-3、hdb-4、hdb-5、hdb-6、hdb-7、hdb-8、hdb-9、hdb-10、paaF-1、paaF-2、paaF-3、paaF-4、paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt,其中,来自类球红细菌的相应基因是特别优选的。
酶E5的合适的基因选自mut、mutA、mutB、sbm、sbmA、sbmB、sbm5、bhbA、mcmA、mcmA1、mcmA2、mcmB、mcm1、mcm2、mcm3、icmA、meaA1和meaA2,其中,来自类球红细菌的相应基因在此仍是特别优选的。
酶E6、E7和E8的优选的基因特别为来自类球红细菌的关于这些酶的基因。
酶E2至E8的上述基因以及其他基因的核苷酸序列的实例尤其还可以从KEGG数据库、NCBI数据库或EMBL数据库获取。
依照根据本发明的细胞的第一种变化形式的第一个特别的实施方案(其中酶E1的活性以及任选地还有酶E2至E8中的一种酶、多种酶或所有酶的活性被提高),所述细胞另外还具有提高的下述酶E9至E12中一种或多种酶的活性:
-酶E9,其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A;
-酶E10,其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸;
-酶E11,其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛;
-酶E12,其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
在此,根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞,在所述细胞中除了酶E1的活性以及活性E2至E8中的一种或多种活性外,下列酶或酶组合的活性也是增加的:E9、E10、E11、E12、E9E10、E9E11、E9E12、E10E11、E10E12、E11E12、E9E10E11、E9E10E12、E9E11E12、E10E11E12和E9E10E11E12,其中,组合E9E10E11E12是最优选的。
在这种情况下,特别优选的是,
酶E9为丙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.3),
酶E10为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.17),
酶E11为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1),和
酶E12为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
原则上,可以考虑使用四个相互独立的酶E9至E12,或者使用酶复合物,凭借所述酶复合物,能够进行上面由酶E9至E12产生的反应中的至少两种反应。特别地,在此应当提及这样的酶复合物,其不仅催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸,而且催化随后甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛。
酶E9的合适的基因选自pccA、pccB、accD1、accD、rs03236、accB、accC、pycA、ygjD、yngE、pcc、accA2、accD1、accD2、accD3、accD4、accD5、accD6、bccA1、pccB1、pccB4、pccB5、cgl10707、cg110708、cg112870、dtsR、dtsR1、dtsR2、scd10.12、scd10.13、mccB和mmdA,其中,pccA和pccB是特别优选的。
优选地,酶E10由aox1基因编码。来自大鼠肝脏的甲基丙二酰辅酶A水解酶例如描述于Kovachy等人,″Recognition,isolation,andcharacterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme Ahydrolase″,J.Biol.Chem.258(1983),第11415-11421页。
优选地,酶E11由选自下列的基因编码:acat1、acat2、loc484063、loc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、mgc83664、kat-1、erg10、ygeF、atoB、fadAx、phbA-1、phbA-2、atoB-2、pcaF、pcaF-2、phb-A、bktB、phaA、tioL、thlA、fadA、paaJ、phbAf、pimB、mmgA、yhfS、thl、vraB、thl、mvaC、thiL、fadA3、fadA4、fadA5、fadA6、cg112392、catF、sc8f4.03、thiL1、thiL2、acaB1、acaB2、acaB3或acaB4,其中acat1、acat2和atoB是特别优选的。
酶E12的合适的基因选自hibadh、cg15093、cg15093、cg4747、mwL2.23、t13k14.90、f19b15.150、hibA、ygbJ、mmsB、garR、tsar、mmsB-1、mmsB-2、yfjR、ykwC、ywjF、hibD、glxR、SCM1.40c、ehhahd、hadh2、hadhsc、hsd17B4、loc488110、had、mgC81885、hadh2-prov、cg3415、cg7113、ech-1、ech-8、ech-9、a rd-1、yfcX、fadB、faoA、fadB2x、hbd-1、hbd-2、hbd-3、hbd-4、hbd-5、hbd-6、hbd-7、hbd-8、hbd-9、hbd-10、fadJ、rs04421、rs02946、rs05766、bbsD、bbsC、fadB1、fadB2、fadB5、hbdA、pimF、fabJ-1、fabJ、scbac19f3.11、sci35.13、scbac8d1.10c、sc5f2a.15、sc6a5.38、fadC2、fadC4、fadC5、fadC6、had和paaH。其他合适的3-羟基异丁酸脱氢酶例如描述于下列文献中:Bannerjee等人,(1970),J.Biol.Chem,245,第1828至1835页;Steele等人,(1992),J.Biol.Chem.,267,第13585至13592页;Harris等人,(1988),J.Biol.Chem.,263,第327至331页;Harris等人,Biochim.Biophys.Acta,1645(1),第89至95页;Hawes等人,(2000),Methods Enzymol.,324,第218至228页;Harris等人,J.Biol.Chem.,275(49),第38780至38786页;Rougraff等人,(1988),J.Biol.Chem.,263(1),第327至331页;Robinson等人,J.Biol.Chem.,225,第511至521页;Hawes等人,(1995),Biochemistry,34,第4231至4237页;HasegawaJ.(1981),Agric.Biol.Chem.,45,第2805至2814页;Hawes等人,(1996),FEBS Lett.,389,第263至267页;Hawes等人,(1996),Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism,Plenum Press,New York,第395至402页;Adams等人,(1994),Structure,2,第651至668页;Zhang等人,(1999),Biochemistry,38,第11231至11238页;Mirny等人,(1999),J.Mol.Biol.,291,第177至196页;和Lokanath等人,(2005),J Mol Biol.。这些出版物的公开内容在此引入作为参考,并且构成本发明公开内容的一部分。
依照根据本发明的细胞的第一种变化形式的一个特别优选的实施方案(其中酶活性E9至E12中的一种或多种酶活性被提高),酶E11由选自下列序列的DNA序列编码:
A)根据SEQ ID NO:03的序列,
B)无内含子的序列,其衍生自根据A)的序列并且与根据SEQ IDNO:03的序列编码相同的蛋白质或肽,
C)编码包含根据SEQ ID NO:04的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列,
D)与根据组A)至C)之一,特别优选地根据组A)的序列至少80%,特别优选地至少90%,更优选地至少95%和最优选地至少99%同一的序列,其中所述序列优选地编码能够将甲基丙二酸以及丙二酸分别转化为相应的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白质或肽,
E)与根据组A)至D)之一,特别优选地根据组A)的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列,其中所述序列优选地编码能够将甲基丙二酸以及丙二酸分别转化为相应的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白质或肽,
F)根据组A)至D)之一,特别优选地根据组A)的序列的衍生物,其通过至少1个碱基,优选地至少2个碱基,更优选地至少5个碱基和最优选地至少10个碱基,然而优选地不多于100个碱基,特别优选地不多于50个碱基和最优选地不多于25个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得,其中所述衍生物优选地编码能够将甲基丙二酸以及丙二酸分别转化为相应的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白质或肽,
G)在遗传密码简并性范围之内相应于SEQ ID NO:03的序列,以及
H)具有SEQ ID NO:03的中性有义突变的序列。
上面所描述的核酸序列为来自Sulfolobus tokodaii的关于甲基丙二酰辅酶A还原酶或丙二酰辅酶A还原酶的基因,它们能够特别有效地将甲基丙二酸或丙二酸转化为相应的半醛。该酶不仅实行酶E10的活性,而且实行酶E11的活性。
依照根据本发明的细胞的第一种变化形式的一个特别优选的实施方案,所述细胞因而相比于其野生型而言至少具有增加的酶E1和E11的活性,其中,酶E1由根据备选项a)至h)之一的DNA序列编码,和酶E11由根据备选项A)至H)之一的DNA序列编码。在这种情况下,如果这两种酶的活性的增加是以这样的方式达到的,即具有SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:04的多肽,或者与根据SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:04的氨基酸序列具有至少50%,优选地至少55%,更优选地至少60%,更加优选地至少65%和最优选地至少70%同一性的氨基酸序列在细胞中过表达,那么这是优选的。在此,这两种DNA序列可以整合到细胞的基因组中,或者存在于细胞内的载体上。
依照根据本发明的细胞的第一种变化形式的第二个特别的实施方案(其中酶E1的活性以及任选地还有酶E2至E8中的一种酶、多种酶或所有酶的活性被提高),所述细胞另外还具有提高的下述酶E13和E12中一种或多种酶的活性:
-酶E13,其催化丙酰辅酶A转化为甲基丙二酸半醛;
-酶E12,其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
在此,根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞,在所述细胞中除了酶E1的活性以及活性E2至E8中的一种或多种活性外,下列酶或酶组合的活性也是增加的:E12、E13和E12E13,其中,组合E12E13是最优选的。
在这种情况下,特别优选的是,
酶E13为甲基丙二酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.27),和
酶E12为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
优选地,酶E13的合适的基因选自aldh6a1、cg17896、t22c12.10、ald6、putA1、mmsA、mmsA-1、mmsA-2、mmsA-3、mmsA-4、msdA、iolA和iolAB,其中,mmsA是特别优选的。
优选地,酶E12的合适的基因为已经在上文中在根据本发明的细胞的第一种变化形式的第一个特别的实施方案方面被提及的那些。
酶E12和E13的上述基因的核苷酸序列尤其还可以从KEGG数据库获取。
此外,在根据本发明的细胞的第一种变化形式方面,优选的是使用这样的细胞,所述细胞能够特别良好地通过丝氨酸循环来利用C1-碳源。在此,开头已经提及的甲基营养微生物和甲烷营养微生物仍是特别优选的。
依照根据本发明的细胞的第二种变化形式,除了增加的酶E1的活性外,所述细胞还具有增加的下述酶E14、E15和E10至E12中至少一种酶的活性:
-酶E14,其催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶A,
-酶E15,其催化β-丙氨酰辅酶A转化为丙烯酰辅酶A,
-酶E10,其催化甲基丙二酰辅酶A转化为甲基丙二酸,
-酶E11,其催化甲基丙二酸转化为甲基丙二酸半醛,
-酶E12,其催化甲基丙二酸半醛转化为3-羟基异丁酸。
在此,根据本发明特别优选的细胞为这样的细胞,在所述细胞中除了酶E1的活性外,下列酶或酶组合的活性也是增加的:E14、E15、E10、E11、E12、E14E15、E14E10、E14E11、E14E12、E15E10、E15E11、E15E12、E10E11、E10E12、E11E12和E14E15E10E11E12。在此,原则上可以使用已经能够形成特别大量的丙烯酰辅酶A的细胞。
在这种情况下,特别优选的是,
酶E14为辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)或辅酶A合成酶,优选地辅酶A转移酶,
酶E15为β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶(EC 4.3.1.6),
酶E10为甲基丙二酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.17),
酶E11为醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)或醛氧化酶(EC 1.2.3.1),和
酶E12为3-羟基异丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.31)或3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)。
优选的具有辅酶A转移酶活性的酶E14为来自埃氏巨球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的那些,以及来自大肠杆菌的那些。作为编码辅酶A转移酶的DNA序列的实例,在此可提及在WO-A-03/062173中标称为SEQ ID NO:24的来自埃氏巨球菌的序列。其他优选的酶为那些在WO-A-03/062173中所描述的辅酶A转移酶的变体。
具有β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶活性的合适的酶E15例如为来自丙酸梭菌的那些。编码这样的酶的DNA序列可以例如从丙酸梭菌中获得,如在WO-A-03/062173的实施例10中所描述的那样。编码来自丙酸梭菌的β-丙氨酰辅酶A铵裂合酶的DNA序列在WO-A-03/062173中被指定为SEQ ID NO:22。
酶E10至E12的合适的基因已经在根据本发明的细胞的第一种变化形式方面提及了,在此,在第二种变化形式方面也优选的是,上文所描述的来自Sulfolobus tokodaii的基因是特别优选地作为酶E11的基因。
此外,在根据本发明的方法的第二种变化形式方面,如果除了酶E1的活性、酶E2至E8中一种或多种酶的活性以及酶E14、E15和E9至E12中一种或多种酶的活性提高外,所述细胞还具有下列特性中的至少一种特性,优选地两种特性,那么这可以是有利的:
-相比于其野生型而言增加的酶E16a或酶E16b(然而优选的是E16a)的活性,所述酶E16a催化丙酮酸转化为草酰乙酸,所述酶E16b催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸,以及
-增加的酶E17的活性,所述酶E17催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。
酶E16a优选地为羧化酶,特别优选地为催化丙酮酸转化为草酰乙酸的丙酮酸羧化酶(EC-编号6.4.1.1)。在这方面特别优选的丙酮酸羧化酶为在″A novel methodology employing Corynebacteriumglutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant.″,Ohnishi J等人,Applied Microbiology andBiotechnology,Vol.58(2),第217-223页(2002)中所描述的那些突变体。在该突变中,第458位处的氨基酸脯氨酸被丝氨酸替代。该出版物关于制备丙酮酸羧化酶突变体的可能性的公开内容在此引入作为参考,并且构成本发明公开内容的一部分。
酶E17优选地为脱羧酶,特别优选地为谷氨酸脱羧酶或天冬氨酸脱羧酶,其中1-天冬氨酸-1-脱羧酶(EC-编号4.1.1.11)是最优选的,其由panD基因编码。天冬氨酸脱羧酶催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。尤其已从大肠杆菌中(FEMS Microbiology Letters,143,第247-252页(1996),″Photorhabdus luminescens subsp.Laumondii,Mycobacterium bovis subsp.Bovis″)以及从众多的其他微生物中克隆出了天冬氨酸脱羧酶的基因(panD基因),并进行了测序。特别地,来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的核苷酸序列在DE-A-19855313中进行了描述。原则上,可以使用具有任何想得到的来源的panD基因,不论来自细菌、来自酵母还是来自真菌都是无关紧要的。此外,还可以使用panD基因的所有等位基因,特别是还有由于遗传密码简并性或通过功能中性有义突变而产生的那些等位基因。除了来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸脱羧酶外,根据本发明特别优选的天冬氨酸脱羧酶还为大肠杆菌突变体DV9(Vallari和Rock,Journal of Bacteriology,164,第136-142页(1985))。该出版物关于上述突变体的公开内容在此引入作为参考,并且构成本发明公开内容的一部分。
用于制备经基因工程改造的细胞的方法为解决开头所述的任务作出了进一步的贡献,所述方法包括提高细胞中酶E1的活性的步骤,所述酶E1由如开头所定义的根据组a)至h)之一的DNA序列编码,或者所述酶E1具有带有SEQ ID NO:02的氨基酸序列,或与根据SEQ IDNO:02的氨基酸序列享有至少50%,优选地至少55%,更优选地至少60%,更加优选地至少65%和最优选地至少70%同一性的氨基酸序列。优选地,酶E1的活性的提高通过下列方式来实现:将根据组a)至h)之一,优选地组a)至f)之一的DNA序列作为外源DNA序列引入细胞中,然后起始由该DNA序列所编码的多肽的表达。
任选地,所述方法进一步包括提高细胞中活性E2至E17中的一种或多种活性,特别是还有提高酶E11的活性,所述酶E11由如开头所定义的根据组A)至H)之一的DNA序列编码,或者所述酶E11具有带有SEQID NO:04的氨基酸序列,或与根据SEQ ID NO:04的氨基酸序列享有至少50%,优选地至少55%,更优选地至少60%,更加优选地至少65%和最优选地至少70%同一性的氨基酸序列。
经基因工程改造的细胞也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述细胞是通过上面所描述的方法而获得的。
此外,上面所描述的根据本发明的细胞的用途也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述用途为用于制备乙基丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A(其优选地作为用于制备3-羟基异丁酸的中间产物),或者直接用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物。
此外,用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法也为解决开头所述的任务作出了贡献,所述方法包括下列步骤:
-在从碳源形成3-羟基异丁酸的条件下,使上面所描述的根据本发明的细胞与包含碳源例如碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、脂质、L-缬氨酸或L-谷氨酸的培养基相接触;
-纯化如此获得的3-羟基异丁酸或其衍生物。
可以以分批方法(分批培养)或补料分批方法(给料方法)或重复补料分批方法(重复给料方法),使根据本发明的经基因工程改造的细胞连续地或不连续地与培养基相接触并因此进行培养,以便产生上述的产物。还可以考虑半连续的方法,如在GB-A-1009370中所描述的。关于已知的培养方法的概括描述在Chmiel的教科书(″Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik″(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(″Bioreaktoren und periphereEinrichtungen″,Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)中。
待使用的培养基必须以合适的方式满足各菌株的要求。关于各种微生物的培养基的描述包含在American Society for Bacteriology的手册″Manual of Methods for General Bacteriology″(WashingtonD.C.,USA,1981)中。
作为碳源,可以使用碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素,油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油,脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸,醇类例如甘油和甲醇,烃类例如甲烷,氨基酸例如L-谷氨酸或L-缬氨酸,或者有机酸例如乙酸。这些物质可以单独地或者作为混合物来进行使用。特别优选的是使用碳水化合物,特别是单糖、寡糖或多糖(如在US 6,01,494和US 6,136,576中所描述的),使用C5-糖,或者使用甘油。
再则,特别地,当使用能够通过丝氨酸循环来利用C1-碳源的这样的细胞作为细胞时,优选的是,向培养基中添加诸如甲醇或甲烷的碳源。
作为氮源,可以使用有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素,或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独地或者作为混合物来进行使用。
作为磷源,可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。此外,培养基还必须包含金属盐例如硫酸镁或硫酸铁,它们是生长所必需的。最后,除了上面所述的物质外,还可以使用必需的生长物质例如氨基酸和维生素。另外,可以向培养基中添加合适的前体。所述材料可以以单次添加的形式补充给培养物或者在培养期间以合适的方式供料给培养物。
关于培养物的pH控制,可以以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫形成,可以使用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性,可以向培养基中添加合适的具有选择作用的物质例如抗生素。为了维持有氧条件,向培养物中输入氧或含氧气体混合物例如空气。
培养温度通常高于20℃,优选地高于30℃,它还可以高于40℃,其中不超过95℃,特别优选地不超过90℃和最优选地不超过80℃的培养温度是有利的。
3-羟基异丁酸的纯化可以通过本领域技术人员已知的任何纯化方法来进行。因而,为了首先将细胞与培养基分开,可以例如使用沉降、过滤或离心方法。可以通过萃取、蒸馏或离子交换从去除了细胞的含3-羟基异丁酸的培养基中分离出3-羟基异丁酸。
依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案,连续地从营养液中纯化出3-羟基异丁酸,其中,在这方面进一步优选的是,也连续地进行发酵,从而下列整个过程可以连续地进行:反应物的酶促转化,从而形成3-羟基异丁酸;以及从培养基中纯化出3-羟基异丁酸。为了从培养基中连续地纯化出3-羟基异丁酸,将培养基连续地引导通过用于分离在发酵中所使用的细胞的装置,优选地通过具有20至200kDa的排阻大小的过滤器,在其中发生固/液分离。还可以设想使用离心机、合适的沉降装置或这些装置的组合,其中特别优选的是,首先通过沉降来分离出至少一部分细胞,随后将从中部分地去除了细胞的培养基输送至超滤或离心装置。
在分离出细胞之后,将在其3-羟基异丁酸比例方面经富集的发酵产品输送至优选地多步骤的分离设备。在该分离设备中,设置有多个相继衔接的分离阶段,从这些分离阶段中各自汇出被引回至第二个发酵罐的回输管路。此外,从各个分离阶段中引出排出管路。单个分离阶段可以根据电渗析、反渗透、超滤或纳米过滤的原理进行工作。通常,在单个分离阶段中涉及膜分离设备。基于发酵副产物和底物残留物的类型和规模来选择单个分离阶段。
现在,借助于非限制性的附图和实施例来更详细地说明本发明。
图1显示了由来自类球红细菌的巴豆酰辅酶A还原酶/羧化酶催化的反应。
图2显示了类球红细菌中的乙基丙二酰辅酶A代谢途径。
图3显示了根据本发明的细胞的第一种变化形式的一个特别的实施方案,其中巴豆酰辅酶A还原酶/羧化酶催化巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A,并且其中随后形成的丙酰辅酶A经由甲基丙二酸和甲基丙二酸半醛而转化为3-羟基异丁酸。
图4显示了根据本发明的细胞的第一种变化形式的另一个特别的实施方案,其中巴豆酰辅酶A还原酶/羧化酶催化巴豆酰辅酶A转化为乙基丙二酰辅酶A,并且其中随后形成的丙酰辅酶A经由甲基丙二酸半醛而转化为3-羟基异丁酸。
图5显示了根据本发明的细胞的第二种变化形式的一个特别的实施方案,其中巴豆酰辅酶A还原酶/羧化酶催化丙烯酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。
图6显示了在实施例2中所使用的表达质粒的载体图谱。
实施例
1.从类球红细菌中分离基因组DNA
为了分离根据本发明的DNA,首先根据F.M.Ausubel等人,″Current Protocols in Molecular Biology″,John Wiley and Sons,New York,1987,从类球红细菌中分离出染色体DNA。在该DNA中鉴定出同源核酸序列,该同源核酸序列编码与来自扭脱甲基杆菌的巴豆酰辅酶A还原酶基因(ccr基因)78%同一,与来自山丘链霉菌的ccr基因41%同一,和与来自天蓝色链霉菌的ccr基因39%同一的蛋白质。通过使用合成的多核苷酸5′-GGAGGCAACCATGGCCCTCGA-CGTGCAGAG-3′(正向引物;在起始密码子处的NcoI切割位点用下划线标出)和5′-GAGACTTGCGGATCCCTC-CGATCAGGC-CTTGC-3′(反向引物;在终止密码子后的BamHI切割位点用下划线标出)以及作为模板的来自类球红细菌的分离的DNA,借助于PCR来扩增ccr基因(Mullis等人,ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.,51,第263-273页,1986)。使用制备性PCR,其中采用Pfu聚合酶(Pfunds,Genaxxon)。Pfu聚合酶包含3′-5′外切核酸酶(“校正”)功能。在此,进行32个循环,其中每个循环为95℃45秒,55℃30秒,和72℃3分钟。在循环变温器(Biometra,)上进行PCR。
2.制备表达载体
分离在实施例1中获得的PCR产物,并如在Kovach等人,″Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCScarrying different antibiotic-resistance cassettes″,Gene,166,第175-176页(1995)中所描述的,克隆入pBBR1MCS-2表达载体中。为此,将在实施例1中于纯化后获得的DNA片段和表达载体pBBR1MCS-2用酶Xho1I和HindIII进行限制酶切消化,然后进行连接。然后,用该表达载体转化感受态类球红细菌细胞。
3.CCR的表达和纯化
为了在大肠杆菌中异源表达CCR以及纯化CCR,将所述基因克隆入表达载体pET3d中,从而获得质粒pTE13:通过使用寡核苷酸ccr-fw(5′-GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAGAG-3′;NcoI识别序列用下划线标出)和ccr-rev(5′-GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTTGC-3′;BamHI识别序列用下划线标出)经PCR来扩增类球红细菌ccr基因,其中使用类球红细菌菌株2.4.1(DSMZ 158)的染色体DNA作为模板。将该PCR产物作为NcoI/BamHI片段连接到用NcoI/BamHI切割的载体pET 3d(Merck,Deutschland)中,从而获得质粒pTE13。用pTE13转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,并在200升的发酵罐(80升/分钟的空气流;搅拌器转速300rpm)中于37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中进行培养。在OD578=0.75时,用0.5mM异丙基硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)进行诱导。将细胞培养3.5小时,然后收获细胞并贮存在液氮中直至进一步处理。
酶的纯化在4℃下通过DEAE色谱法和亲和层析以两步来进行。将9g冷冻的大肠杆菌细胞重悬浮在两倍体积的补充有0.1mg/l DNA酶I的缓冲液A(20mM TriS-HCl,pH 7.9)中。借助于在137MPa下两次通过弗氏压碎器来使悬浮液变碎,然后在100,000g下离心1小时。将15ml上清液(1.6g总蛋白质)以2.5ml/分钟的流速加载至30ml DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Amersham Biosciences)(事先用60ml缓冲液A进行平衡)上。然后,用90ml缓冲液A洗涤所述柱,接着用135ml含有50mM KCl的缓冲液A进行洗涤。195ml的总体积,用在缓冲液A中的100mM KCl来洗脱下活性。汇集活性级分,脱盐,并经Amicon YM 10膜(Millipore,Bedford,MA)通过超滤而浓缩至20ml的体积。将1.5ml如此获得的浓缩液(17mg总蛋白质)以0.5ml/分钟的流速加载至10ml Cibacron blue 3GAAgarose 3000CL柱(Sigma-Aldrich)上,该柱事先已用20ml缓冲液A进行了平衡。该柱用22ml缓冲液A洗涤两次,接着用37ml含有100mM KCl的缓冲液A和37ml含有200mM KCl的缓冲液A进行洗涤。以30ml的总体积,用在缓冲液A中的500mM KCl洗脱下活性。汇集活性级分,脱盐,并经Amicon YM 10膜(Millipore,Bedford,MA)通过超滤而浓缩至1.5ml的体积。将蛋白质(7.5mg)在50%甘油中贮存于-20℃。
4.CCR的活性的检测
通过在360nm处监测依赖于巴豆酰-CoA的NADPH的氧化,采用分光光度法来测定CCR的活性。(εNADPH=3400M-1cm-1)。使用壁层厚度为0.1cm的比色杯。反应混合物(0.2ml)包含100mM Tris-HCl(pH 7.9)、4mM NADPH、2mM巴豆酰-CoA和1-5μg纯化的CCR。通过添加33mM KHCO3或NaHCO3来起动反应。关于在实施例3中所获得的酶的巴豆酰-CoA转化所测得的比活性为103U mg-1(巴豆酰-CoA)。通过改变NaHCO3(0.4-66.6mM)或巴豆酰-CoA(0.125-2.0mM)的浓度来测定巴豆酰-CoA和NaHCO3的Km值。通过将[14C]碳酸氢盐掺入(酸稳定的)乙基丙二酰-CoA中来测定NADPH的Km值。反应混合物(0.33ml)包含100mM Tris-HCl(pH 7.9)、3mM巴豆酰-CoA、3mMNaHCO3、64kBq ml-1NaH14CO3和7μg纯化的CCR。通过添加NADPH(0.125-5mM)来起动反应。在不同的时间点处,通过将50μl反应混合物转移到50μl 1.5M HClO4中来终止反应。将样品摇动过夜以除去未掺入的14CO2,并且通过闪烁测量法来测定掺入的14C的量。可以测得下列Km值:巴豆酰-CoA(0.4mM);NADPH(0.7mM);HCO3 -(14mM,pH 7.9);乙基丙二酰-CoA(0.2mM)。
此外,还用丙烯酰-CoA代替巴豆酰-CoA作为底物来测定了CCR的活性。在此,CCR催化下面的反应:
丙烯酰-CoA+NADPH+CO2→(2S)-甲基丙二酰-CoA-+NADP+。
测试混合物(0.12ml)包含80mM Tris·HCl(pH 7.8)、30mMNaHCO3、4.3mM NADPH和5-10μg重组CCR。通过添加1.3mM丙烯酰-CoA来起动反应。在360nm和30℃下在0.1cm厚的比色杯中测量吸收的变化。
关于丙烯酰-CoA的转化,测得了大约45U mg-1的比活性。
在放射性测试中测量丙烯酰-CoA的表观Km值,其中对14CO2向丙烯酰-CoA中的掺入进行定量。在此,使丙烯酰-CoA的量发生变化,并通过闪烁法来测定相对的掺入速率。
测试混合物(0.12ml)包含80mM Tris·HCl(pH 7.8)、30mMNaHCO3、100kBq H14CO3、5.2mM NADPH和5-10μg重组ccr。通过添加0.07-2.2mM丙烯酰-CoA来起动反应。在30℃下,在不同的时间点后(10-120秒),从反应混合物中取出25μl样品,向其中掺500μl 5%TCA,并在12小时的“振荡”后(以除去未固定的14CO2)在闪烁计数器中进行测量。测得Km(丙烯酰-CoA):0.47mM。
5.用于在大肠杆菌中产生3-HIB的重组代谢途径
为了用重组大肠杆菌细胞将C源甘油转化为3-HIB,将7种不同酶的基因克隆到一系列表达载体中。为此采用Duet载体(Merck,Deutschland)。这是具有四种表达载体的系统,这些表达载体都是彼此相容的,而且具有不同的抗生素抗性标记。
具体而言,为了将甘油转化为3-HIB,将编码下列酶的基因克隆到表达载体中:
1.来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶(EC 4.2.1.30)(GD)。该酶催化甘油的依赖于腺苷酰钴胺素的脱水而形成3-HPA(3-羟基丙醛)。它由3个亚基(GD-α、GD-β和GD-γ)组成,这些亚基在肺炎克雷伯氏菌中由处于一个操纵子中的3个基因(gldA、gldB和gldC)编码。
2.来自肺炎克雷伯氏菌的再活化因子。由于甘油使依赖于腺苷酰钴胺素的甘油脱水酶失活,因此为了将甘油转化为3-HPA,另外还需要再活化因子的活性。来自肺炎克雷伯氏菌的用于甘油脱水酶的再活化因子由基因gdrA和gdrB编码。
3.来自大肠杆菌的醛脱氢酶AldH。为了将3-HPA转化为3-羟基丙酸(3-HP),扩增大肠杆菌aldH基因。
4.来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙酰-CoA合酶(Pcs)(由基因pcs编码)。丙酰-CoA合酶催化3-HP转化为丙酰-CoA。它为三功能酶,并且包含三个功能结构域。酰基-CoA合成酶(ACS)结构域催化3-HP激活为3-羟基丙酰-CoA。在这之后,Pcs的烯酰-CoA水合酶(ECH)结构域催化脱水为丙烯酰-CoA。最后,Pcs的烯酰-CoA还原酶(ECR)结构域催化丙烯酰-CoA的依赖于NADPH的还原而形成丙酰-CoA。然而,该反应对于所描述的计划而言是不相关的,因为在此中间产物丙烯酰-CoA会立即进一步地被下一个酶(巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶,见下文)转化。
5.来自类球红细菌的巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶(酶E1)(Ccr)(由基因ccR编码)。Ccr的主要活性是将巴豆酰-CoA还原羧化为乙基丙二酰-CoA。然而,该酶显示出宽的底物特异性,并非常有效地将丙烯酰-CoA转化为甲基丙二酰-CoA。
6.来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰-CoA还原酶(Mcr,E10和E11)(由基因mcr编码)。Mcr优先催化依赖于NADPH的丙二酰-CoA的还原而形成丙二酸半醛。然而,它还显示出以甲基丙二酰-CoA作为底物的副活性,并将其转化为甲基丙二酸半醛。
7.来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的3-羟基异丁酸脱氢酶(E12)(3-HIB-DH)(由基因MmsB编码)。该酶催化甲基丙二酸半醛依赖于NADPH地可逆地转化为3-羟基异丁酸(3-HIB)。
在下文中详细地描述了用于上面所描述的酶的异源过表达的克隆策略。
用于过表达甘油脱水酶再活化因子(GDRF)的质粒pACYCDuet-KpGDRF的构建
首先,借助于PCR来扩增基因gdrA(异名ORF4)和gdrB(异名ORF2b),它们编码肺炎克雷伯氏菌GDRF的两个亚基。使用肺炎克雷伯氏菌菌株DSM2026的染色体DNA作为模板。
使用下面的寡核苷酸来扩增gdrA:orf4fw(5′-TGA AGA TCC TAGGAG GTT TAA ACA TAT GCC GTT AAT AGC CGG GAT TG-3′)和orf4Salrv(5′-TAT ATA GTC GAC TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG-3′;SalI识别序列用下划线标出)。
使用下面的寡核苷酸来扩增gdrB:orf2bPcifw(5′-TAT ATA ACATGT CGC TTT CAC CGC CAG GC-3′;PciI识别序列用下划线标出)和orf2brv(5′-CAT ATG TTT AAA CCT CCT AGG ATC TTC AGT TTC TCT CACTTA ACG GCA GG-3′)。
随后,将所获得的PCR产物通过交叉PCR(Crossover-PCR)而融合在一起。
为此,使用下面的寡核苷酸:orf2bNcofw(5′-TAT ATA CCA TGGCGC TTT CAC CGC CAG GC-3′;NcoI识别序列用下划线标出)和orf4Salrv(5′-TAT ATA GTC GAC TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG-3′;SalI识别序列用下划线标出)。
根据制造商的说明书,借助于Qiagen,Hilden的QIAquick-PCR纯化试剂盒来纯化PCR产物(2220bp),并连接到载体pCR-BluntII-TOPO中,从而获得pCR-BluntII-Topo-KpGDRF载体。根据制造商Invitrogen Corporation,Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒)的说明书来进行连接以及随后转化到大肠杆菌细胞中。
然后,通过用PciI和SalI消化pCR-BluntII-Topo-KpGDRF而将GDRF序列从该载体中切出,并连接到用NcoI和SalI切割的pACYC-Duet表达载体中,从而获得pACYCDuet-KpGDRF(6142bp)。
用于过表达肺炎克雷伯氏菌甘油脱水酶(GD)和大肠杆菌醛脱氢酶AldH的质粒pAS50_Ec_aldH的构建
肺炎克雷伯氏菌GD的三个亚基天然地组织在一个操纵子中(基因gldA、gldB和gldC)。借助于PCR来扩增它们,其中仍使用肺炎克雷伯氏菌DSM2026的染色体DNA作为模板。
使用下面的寡核苷酸来进行扩增:KpGDNdefw(5′-TAT ATA CAT ATGAAA AGA TCA AAA CGA TTT GCA GTA CTG G-3′;NdeI识别序列用下划线标出)和KpGDSalrv(5′-TAT ATA GTC GAC TTA GCT TCC TTT ACG CAGCTT ATG C-3′;SalI识别序列用下划线标出)。
将扩增产物连接到载体pCR-BluntII-TOPO中,从而获得pCR-BluntII-Topo-KpGD载体。根据制造商Invitrogen Corporation,Carlsbad(Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒)的说明书来进行连接以及随后转化到大肠杆菌细胞中。
用XbaI(通过Klenow补平而使成为平端)和NdeI从载体pCR-BluntII-Topo-KpGD中切出GD编码片段,并连接到用NdeI和EcoRV切割的pET-Duet表达载体中,从而获得质粒pAS50(8161bp)。
随后,扩增大肠杆菌aldH基因。为此,使用大肠杆菌K12的染色体DNA作为模板,使用寡核苷酸1228_ald_fp(5′-AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG-3′;NdeI识别序列用下划线标出)和1228_ald_rp(5′-AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGCTTATCCAGATG-3′;NdeI识别序列用下划线标出)作为PCR引物。在凝胶上来纯化PCR扩增产物,然后通过NdeI消化连接到质粒pAS50的NdeI位点中,从而获得质粒pAS50_Ec_aldH(9666bp)。
用于过表达橙色绿屈挠菌丙酰-CoA合酶(Pcs)以及类球红细菌巴豆酰-CoA羧化酶/还原酶(CCR)的质粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs的构建
从pTE13(参见实施例3)中,将ccr基因再次作为NcoI/BamHI片段转克隆到质粒pCDFDuet-1(Merck,Deutschland)的NcoI/BamHI切割位点中,从而获得质粒pCDFDuet-1_Rs_ccr。
然后,用寡核苷酸1228_Cau_pcs_fp(71)(5′-AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC-3′;NdeI识别序列用下划线标出)和1228_Cau_pcs_rp(74)(5′-AAGACGTCCTACCGCTCGCCGGCCGTCC-3′;AatII识别序列用下划线标出)通过PCR扩增出橙色绿屈挠菌pcs基因,其中使用橙色绿屈挠菌菌株OK-70-fl(DSM 636)的染色体DNA作为模板。在通过凝胶提取进行纯化后,通过NdeI/AatII消化将扩增产物连接到经相应切割的载体pCDFDuet-1_Rs_ccr中,从而获得质粒pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs(10472bp)。
用于过表达Sulfolobus tokodaii丙二酰-CoA还原酶(Mcr)以及嗜热栖热菌3-羟基异丁酸脱氢酶(3-HIB-DH)的质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg的构建
首先,通过基因合成来制备在谷氨酸棒杆菌的密码子使用方面经适应调整的S.tokodaii基因mcr的变体(St_mcr_oCg)。在GeneArt公司(Deutschland)进行合成,并且以质粒pGA4_MMCoAR_ST(SEQ IDNO:5)的形式提供人工基因St_mcr_oCg。使用pGA4_MMCoAR_ST DNA作为PCR模板,以便用寡核苷酸1228_MMCoAR_fp(5′-AACCATGGGCCGCACCCTGAAGG-3′;NcoI识别序列用下划线标出)和1228_MMCoAR_rp(5′-AAGGATCCTTACTTTTCGATGTAGCCCTTTTCC-3′;BamHI识别序列用下划线标出)来扩增人工基因St_mcr_oCg。在通过凝胶提取进行纯化后,用NcoI/BamHI消化扩增产物,并连接到质粒pCOLADuet_1(Merck,Deutschland)的相应切割位点中,从而获得质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg。
同样地,通过基因合成(GeneArt,Deutschland)提供了在谷氨酸棒杆菌的密码子使用方面经适应调整的嗜热栖热菌基因MmsB(编码3-HIB-DH)的变体,即以质粒pGA4_3HIBDH_TT(SEQ ID NO:6)的形式。使用pGA4_3HIBDH_TT作为PCR模板,以便用寡核苷酸1228_Tth_HIBDH_fp(5′-AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG-3′;NdeI识别序列用下划线标出)和1228_Tth_HIBDH_rp(5′-AAAAGATCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC-3′;BglII识别序列用下划线标出)来扩增人工基因Tth_HIBDH_oCg。在凝胶提取后,用NdeI/BglII切割扩增产物,并连接到质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg的NdeI/BglII切割位点中,从而获得质粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg(5620bp)。
然后,根据制造商的方案,将4种质粒pACYCDuet-KpGDRF、pAS50_Ec_aldH、pCDFDuet-1_Rs_ccR_Cau_pcs和pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg共转化到商购可得的通过化学方法成为感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Merck,Deutschland)中。在补充有氨苄青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和链霉素(25μg/ml)的LB琼脂上进行选择。
6.在大肠杆菌中表达质粒的诱导
将在实施例5中所描述的携带有质粒的大肠杆菌菌株在经修饰的M9培养基(6.8g/l Na2HPO4x 2H2O;3g/l KH2PO4;0.5g/l NaCl;1g/l NH4Cl;1.25g/l酵母提取物;1%v/v甘油;15mg/l CaCl2x2H2O;250mg/l MgSO4x 7H2O;1%v/v Gibco MEM维生素溶液;41.9g/l MOPS)中进行培养。该培养基补充有氨苄青霉素(25μg/ml)、氯霉素(17μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)和链霉素(25μg/ml)。于37℃在温控摇床上进行整个培养(预培养和主培养)。首先,将菌株在5ml培养基中培养过夜。然后,从过夜培养物中,以1∶20的比例将20ml培养基接种到100ml的带挡板的瓶中,并继续进行培养。当达到大约0.8的OD600时,添加6μM钴胺素和1μM IPTG,并继续培养4小时。在该时间点,取出2.5ml细胞悬浮液,并贮存于-20℃直至进行分析。
可以借助于离子色谱法(IC)和电导检测来进行3-HIB的检测和定量。为此,在室温下解冻2.5ml的样品,并离心(10分钟,13,200rpm)。使用喷雾过滤器(Spritzenfilter)(孔径大小0.44μm)来纯化上清液。用具有自动进样器的Metrohm Compact IC 761进行测量。流动相:8mM NaOH。柱:Dionex AS15 4x250mm,前置柱AG15 4x50mm。柱温:25℃。流速:1.4ml/分钟。注射体积:10μl。
Claims (18)
1.分离的DNA,其选自下列序列:
a)根据SEQ ID NO:01的序列,
b)无内含子的序列,其衍生自根据a)的序列并且与根据SEQ ID NO:01的序列编码相同的蛋白质或肽,
c)编码包含根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列,
d)与根据a)至c)的序列至少80%同一的序列,
e)与根据组a)至d)之一的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列,
f)根据组a)至e)之一的序列的衍生物,其通过一个或多个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得,
g)在遗传密码简并性范围之内相应于SEQ ID NO:01的序列,
h)具有SEQ ID NO:01的中性有义突变的序列,以及
i)与根据组a)至h)之一的序列互补的序列。
2.载体,其包含权利要求1中所定义的根据组a)至h)之一的DNA序列。
3.根据权利要求2的载体用于转化细胞的用途。
4.经转化的细胞,其通过用根据权利要求2的载体进行转化而获得。
5.分离的多肽,其具有带有SEQ ID NO:02的氨基酸序列,或者当在SEQ ID NO:02中删除、插入、置换至多10个氨基酸或将至多10个氨基酸附加至带有SEQ ID NO:02的氨基酸序列的C-或N-末端时而获得的氨基酸序列。
6.细胞,所述细胞相对于其野生型而言如此地经基因工程改造,从而与其野生型相比较,它能够形成更多的3-羟基异丁酸或其衍生物。
7.根据权利要求6的细胞,其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E1的活性,所述酶E1由权利要求1中所定义的根据组a)至h)之一的DNA序列编码。
8.根据权利要求6或7的细胞,其中所述细胞包含具有权利要求1中所定义的根据组a)至h)之一的DNA序列的外源DNA。
9.根据权利要求7或8的细胞,其中所述细胞具有相比于其野生型而言增加的酶E11的活性,所述酶E11由根据组A)至H)之一的DNA序列编码:
A)根据SEQ ID NO:03的序列,
B)无内含子的序列,其衍生自根据A)的序列并且与根据SEQ ID NO:03的序列编码相同的蛋白质或肽,
C)编码包含根据SEQ ID NO:04的氨基酸序列的蛋白质或肽的序列,
D)与根据组A)至C)之一,特别优选地根据组A)的序列至少80%同一的序列,
E)与根据组A)至D)之一,特别优选地根据组A)的序列的反义链杂交或者在考虑遗传密码简并性的情况下将能够与之杂交的序列,
F)根据组A)至D)之一,特别优选地根据组A)的序列的衍生物,其通过至少一个碱基的置换、添加、倒位和/或删除而获得,
G)在遗传密码简并性范围之内相应于SEQ ID NO:03的序列,或者
H)具有SEQ ID NO:03的中性有义突变的序列。
10.根据权利要求4和6-9中之一的细胞,其中所述细胞属于类球红细菌这一种类。
11.用于制备经基因工程改造的细胞的方法,其包括提高细胞中酶E1的活性的步骤,所述酶E1由权利要求1中所定义的根据组a)至h)之一的DNA序列编码,或者所述酶E1具有带有SEQ ID NO:02的氨基酸序列,或与根据SEQ ID NO:02的氨基酸序列享有至少50%同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11的方法,其中所述方法另外还包括提高细胞中酶E11的活性的步骤,所述酶E11由权利要求9中所定义的根据组A)至H)之一的DNA序列编码,或者所述酶E11具有带有SEQ ID NO:04的氨基酸序列,或与根据SEQ ID NO:04的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。
13.根据权利要求11或12的方法,其中所述细胞属于类球红细菌这一种类。
14.根据权利要求11或12的方法,其中E1或E11活性的提高通过增加编码这些酶的基因的拷贝数,特别是通过分别增加权利要求1或9中所定义的核酸序列的拷贝数来实现。
15.经基因工程改造的细胞,其通过根据权利要求11-14之一的方法而获得。
16.根据权利要求15的细胞,其中所述细胞相比于其野生型而言具有增加的编码酶E1和任选地酶E11的基因的拷贝数,特别是增加的权利要求1或9中所定义的核酸序列的拷贝数。
17.根据权利要求4、6-10以及15和16中之一的细胞用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的用途。
18.用于制备3-羟基异丁酸或其衍生物的方法,其包括下列步骤:
-在从碳源形成3-羟基异丁酸或其衍生物的条件下,使根据权利要求4、6-10、15和16中之一的细胞与包含碳源例如碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、脂质、L-缬氨酸或L-谷氨酸的培养基相接触;
-纯化如此获得的3-羟基异丁酸或其衍生物。
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