JP2008011714A - コハク酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コハク酸を効率よく発酵生産する。
【解決手段】イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することによってコハク酸を製造する。
【選択図】なし
【解決手段】イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することによってコハク酸を製造する。
【選択図】なし
Description
本発明は、コリネ型細菌等の細菌を用いたコハク酸の製造に関するものである。
コハク酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずにコハク酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、コハク酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いたコハク酸の発酵生産などが報告されていたが（例えば、特許文献５参照）、グリオキシル酸回路の酵素であるイソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼを活性化させた細菌を用いてコハク酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
米国特許第５，１４３，８３４号公報
米国特許第５，５０４，００４号公報
特開平１１−１１３５８８号公報
特開平１１−１９６８８８号公報
特開平１１−１９６８８７号公報
International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸の製造方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、グリオキシル酸回路の鍵酵素であるイソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸の生成速度、あるいは、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（２）前記細菌が、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強する
ように改変された細菌である、（１）の方法。
ように改変された細菌である、（１）の方法。
（３）前記細菌が、イソシトレートリアーゼをコードする遺伝子及びマレートシンターゼをコードする遺伝子を、糖類を主な炭素源とする培地において機能するプロモーターの制御下に置くことによって改変された細菌である、（２）の方法。
（４）前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）有機原料が、グルコースまたはシュークロースである（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）（１）〜（７）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸を製造することができる。得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌である。以下、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼをそれぞれICL、MSと表記することがある。
「ICL及びMSの活性が増強した」とは、野生株などの非改変株と比較してこれらの酵素の活性が増強した場合や、通常の培養条件、例えば、糖類を主たる炭素源とする培養条件で培養したときと比較してこれらの酵素の活性が増強した場合を含む。ICL及びMSの活性は、非改変株または通常の培養条件と比較して、単位菌体重量当たり1.5倍以上増強されていることが好ましく、2倍以上増強されていることがより好ましい。
ICLはイソクエン酸をコハク酸とグリオキシル酸に変換する反応を触媒する酵素であり、ICL活性は後述するような Reinscheidらの方法（J.Bacteriology 176 3474,1994）によって、測定することができる。
MSはグリオキシル酸とアセチルＣｏＡからリンゴ酸を生成する反応を触媒する酵素であり、MS活性はDixonらの方法（Biochemical J. 72 3P,1959）によって測定することができる。
本発明の製造方法に用いることのできる細菌は、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌である。以下、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼをそれぞれICL、MSと表記することがある。
「ICL及びMSの活性が増強した」とは、野生株などの非改変株と比較してこれらの酵素の活性が増強した場合や、通常の培養条件、例えば、糖類を主たる炭素源とする培養条件で培養したときと比較してこれらの酵素の活性が増強した場合を含む。ICL及びMSの活性は、非改変株または通常の培養条件と比較して、単位菌体重量当たり1.5倍以上増強されていることが好ましく、2倍以上増強されていることがより好ましい。
ICLはイソクエン酸をコハク酸とグリオキシル酸に変換する反応を触媒する酵素であり、ICL活性は後述するような Reinscheidらの方法（J.Bacteriology 176 3474,1994）によって、測定することができる。
MSはグリオキシル酸とアセチルＣｏＡからリンゴ酸を生成する反応を触媒する酵素であり、MS活性はDixonらの方法（Biochemical J. 72 3P,1959）によって測定することができる。
ICLおよびMSの活性の増強は、遺伝子組換え法、例えば、ICLをコードする遺伝子及びMSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、またはこれらの遺伝子のプロモーターを置換することによって行うことができる。
一方、ICL及びMSは、酢酸や脂肪酸などを培地に添加することで行うことで誘導され、グルコースなどの糖類を主炭素源とした場合は転写レベルでそれらの発現が抑制されることが報告されている（Gerstmeir R. et al. Journal of Biotechnology 104 (2003) 99-1
22）。従って、これらの酵素の活性化は、酢酸若しくは脂肪酸を培地中に添加して菌体を培養することによっても行うことができる。この場合、酢酸若しくは脂肪酸を１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培地に添加することが好ましい。
一方、ICL及びMSは、酢酸や脂肪酸などを培地に添加することで行うことで誘導され、グルコースなどの糖類を主炭素源とした場合は転写レベルでそれらの発現が抑制されることが報告されている（Gerstmeir R. et al. Journal of Biotechnology 104 (2003) 99-1
22）。従って、これらの酵素の活性化は、酢酸若しくは脂肪酸を培地中に添加して菌体を培養することによっても行うことができる。この場合、酢酸若しくは脂肪酸を１ｍＭ〜１Ｍの濃度で培地に添加することが好ましい。
本発明に使用できる細菌の親株は、コハク酸を生産しうるものであれば特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌が好ましく、コリネ型細菌がより好ましい。
バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等が挙げられ、リゾビウム属細菌としては、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などが挙げられる。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する微生物が挙げられる。
バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等が挙げられ、リゾビウム属細菌としては、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などが挙げられる。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する微生物、ブレビバクテリウム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する微生物が挙げられる。
上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233 AB-41（FERM BP-1498）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6872、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC31831、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株、及びその変異株MJ-233 AB-41株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムMJ-233株及びMJ-233 AB-41株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
ICL遺伝子およびMS遺伝子を用いて、ICL活性およびMS活性が増強するように改変する場合、用いることのできる遺伝子は、それぞれ、ICL活性またはMS活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ICL遺伝子は配列番号９の塩基番号４７１−１７６６の塩基配列、MS遺伝子は配列番号１３の塩基番号４６８−２６８４に示す塩基配列を有するブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株由来の遺伝子を挙げることができる。また、これらの遺伝子は、ICL活性またはMS活性を有するタンパク質をコードするものである限り、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズす
るDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、ICL遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列と９０%以上、好ましくは９５%以上、より好ましくは９９%以上の相同性を有し、ICL活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよく、MS遺伝子は、配列番号１４のアミノ酸配列と９０%以上、好ましくは９５%以上、より好ましくは９９%以上の相同性を有し、MS活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
るDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、ICL遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列と９０%以上、好ましくは９５%以上、より好ましくは９９%以上の相同性を有し、ICL活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよく、MS遺伝子は、配列番号１４のアミノ酸配列と９０%以上、好ましくは９５%以上、より好ましくは９９%以上の相同性を有し、MS活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のICL遺伝子およびMS遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のICL遺伝子およびMS遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いて、それぞれICL活性およびMS活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
ICLおよびMSの活性を高めるためには、例えば、上記のようなDNAを宿主微生物で機能しうるプラスミドに発現可能に組込み、宿主微生物に導入すればよい。なお、ICL遺伝子とMS遺伝子は別々のプラスミドを用いて導入してもよいし、同一プラスミドに両遺伝子を搭載して導入してもよい。
ICL遺伝子およびMS遺伝子を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。コリネ型細菌に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
ICL遺伝子およびMS遺伝子を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。コリネ型細菌に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
ICL遺伝子およびMS遺伝子を、上記したようなコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（FERM BP-1497）を形質転換することにより、ICL遺伝子およびMS遺伝子の発現が増加したコリネ型細菌が得られる。
形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
また、ICLおよびMSの活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＩＣＬ遺伝子およびＭＳ遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。
また、ICLおよびMSの活性の増強は、宿主染色体上でICL遺伝子およびMS遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。プロモーター置換の方法としては、例えば、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69-73）が挙げられる。
レビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（FERM BP-1497）を形質転換することにより、ICL遺伝子およびMS遺伝子の発現が増加したコリネ型細菌が得られる。
形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
また、ICLおよびMSの活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でＩＣＬ遺伝子およびＭＳ遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。
また、ICLおよびMSの活性の増強は、宿主染色体上でICL遺伝子およびMS遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。プロモーター置換の方法としては、例えば、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69-73）が挙げられる。
上記組み換えプラスミドによる導入または染色体上への相同組換えにおいて、ICL遺伝子およびMS遺伝子を発現させるためのプロモーター、または染色体上のICL遺伝子およびMS遺伝子のプロモーターを置換するために使用するプロモーターは、宿主細菌で機能しうるものであれば特に制限されないが、嫌気的条件下で転写活性が抑制されないプロモーターが好ましく、例えば、大腸菌で用いられるtacプロモーターや、trcプロモーターなどが挙げられる。また、糖類を主炭素源として菌体を培養する場合は、該条件下で機能するプロモーターを用いることができ、例えば、フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＦＢＡ）のプロモーター（例えば、配列番号９の塩基番号１−４６０）を用いることができる。
このように、プロモーターを適宜選択することによって、ICL遺伝子およびMS遺伝子の発現量の調節が可能である。
以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、ICLおよびMSの活性増強を達成することができる。
このように、プロモーターを適宜選択することによって、ICL遺伝子およびMS遺伝子の発現量の調節が可能である。
以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、ICLおよびMSの活性増強を達成することができる。
本反応においては、ICLおよびMSの活性増強に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDHともよぶ）活性が低減化するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ここで、「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化された」とは、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較してラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は、ラクテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減化した変異株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。LDH活性が低減化されICL遺伝子およびMS遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をICL遺伝子およびMS遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変操作とICLおよびMSの活性増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。
また、本発明に用いる細菌は、ICLおよびMSの活性増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、PCとも呼ぶ）の活性が増強するように改変された細菌であってもよい。「PC活性が増強される」とは、PC活性が野生株又は親株等の非改変株に対して好ましくは1.5倍以上、より好ましくは3倍以上増加していることをいう。このような細菌は、例えば、ICLおよびMS遺伝子の発現増強されたコリネ型細菌に、PC遺伝子を導入することにより得ることができる。なお、PC遺伝子の導入とICLおよびMS活性増強のための改変操作はい
ずれの操作を先に行ってもよい。
ずれの操作を先に行ってもよい。
PC遺伝子の導入は、例えば、特開平11-196888号公報に記載の方法と同様にして、PC遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより行うことができる。具体的なＰＣ遺伝子遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のPC遺伝子（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）などを用いることができる。
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の細菌又は動植物由来のPC遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す細菌または動植物由来のPC遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の細菌又は動植物由来のPC遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す細菌または動植物由来のPC遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによっても製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールおよびシュークロースが好ましく、特にグルコースおよびシュークロースが好ましい。
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されな
いが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
いが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。
反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より回収（分離・精製）することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーによりコハク酸を分離・精製することができる。
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
＜ｐＴＺ４と和合性を有するコリネ型細菌発現ベクターの構築＞
（Ａ）ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＴＺ４（コリネ型細菌用ベクター：特開2005-95169）と共存可能なコリネ型細菌用ベクターは、ｐＴＺ４と和合性を示す複製領域を持つプラスミドベクターｐＣ２（Plasmid 36, 62（1996））のカナマイシン耐性遺伝子をストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって構築した。
ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（大腸菌Ｔｎ７）の取得は、同遺伝子を有する植物形質転換用バイナリーベクターpLAN421（Plant Cell Reports 10 286 (1991)）を鋳型としたPCRによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、（配列番号１および配列番号２で示した合成ＤＮＡ）、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で６０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、０．８％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、９３７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ２を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩで切断後、クレノウフラグメント（Klenow Fragment：宝バイオ製）により両末端を平滑化したＤＮＡ断片の末端を、上記で調製したストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンをＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号１
および配列番号２の合成DNA をプライマーとした上記PCRによって解析した結果、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、これをｐＣ３と命名した。
次に、ｐＣ３を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｖｕIIで切断して調製したＤＮＡ断片をクレノウフラグメントにて末端を平滑化し、これにｐBglIIリンカー（宝バイオ製：CAGATCTG）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素BglIIにて切断されるプラスミドを選抜し、これをｐＣ３.１と命名した。
（Ａ）ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＴＺ４（コリネ型細菌用ベクター：特開2005-95169）と共存可能なコリネ型細菌用ベクターは、ｐＴＺ４と和合性を示す複製領域を持つプラスミドベクターｐＣ２（Plasmid 36, 62（1996））のカナマイシン耐性遺伝子をストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって構築した。
ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（大腸菌Ｔｎ７）の取得は、同遺伝子を有する植物形質転換用バイナリーベクターpLAN421（Plant Cell Reports 10 286 (1991)）を鋳型としたPCRによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、（配列番号１および配列番号２で示した合成ＤＮＡ）、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で６０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、０．８％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、９３７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ２を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩで切断後、クレノウフラグメント（Klenow Fragment：宝バイオ製）により両末端を平滑化したＤＮＡ断片の末端を、上記で調製したストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンをＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号１
および配列番号２の合成DNA をプライマーとした上記PCRによって解析した結果、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、これをｐＣ３と命名した。
次に、ｐＣ３を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｖｕIIで切断して調製したＤＮＡ断片をクレノウフラグメントにて末端を平滑化し、これにｐBglIIリンカー（宝バイオ製：CAGATCTG）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素BglIIにて切断されるプラスミドを選抜し、これをｐＣ３.１と命名した。
（Ｂ）マルチクローニングサイトの導入
大腸菌プラスミドpT7Blue（Novagen社）を鋳型としてLacZマルチクローニングサイトを含むα−ペプチド遺伝子を配列番号３および配列番号４で示す合成DNAをプライマーとしたPCRにより調製した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、５７７７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３．１を制限酵素PstＩおよびHpaＩで切断後、クレノウフラグメント（Klenow Fragment：宝バイオ製）により末端を平滑化したDNA断片を、上記で調製したα−ペプチドの遺伝子断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドDNAは、挿入したLacZマルチクローニングサイトに由来するEcoRVの切断部位を有することが確認され、これをpC3.14と命名した（図１に構築手順を示す）。
大腸菌プラスミドpT7Blue（Novagen社）を鋳型としてLacZマルチクローニングサイトを含むα−ペプチド遺伝子を配列番号３および配列番号４で示す合成DNAをプライマーとしたPCRにより調製した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、５７７７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３．１を制限酵素PstＩおよびHpaＩで切断後、クレノウフラグメント（Klenow Fragment：宝バイオ製）により末端を平滑化したDNA断片を、上記で調製したα−ペプチドの遺伝子断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドDNAは、挿入したLacZマルチクローニングサイトに由来するEcoRVの切断部位を有することが確認され、これをpC3.14と命名した（図１に構築手順を示す）。
＜イソシトレートリアーゼ活性化プラスミドの構築＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（
５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（
５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
（Ｂ）フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター断片の調製
フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．４５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．４５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
（Ｃ）イソシトレートリアーゼ遺伝子断片の調製
イソシトレートリアーゼ遺伝子断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号７および配列番号８）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
イソシトレートリアーゼ遺伝子断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号７および配列番号８）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
（Ｄ）クロスオーバーＰＣＲによるフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター断片とイソシトレートリアーゼ遺伝子断片の結合とベクターへの挿入
上記（Ｂ）および（Ｃ）でそれぞれ調製したＤＮＡ断片を混合した試料を鋳型とし、配列番号５および配列番号８に記載のＤＮＡプライマーを用いたクロスオーバーＰＣＲによって両断片を結合した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で２分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
このようにして調製したＤＮＡ断片をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した後、ＢａｍＨＩリンカー（宝バイオ製）をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。次いで、制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＢａｍＨＩ切断末端を持つフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびイソシトレートリアーゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子断片を調製した。
ｐＭＪＰＣ１（特開2005-95169）を制限酵素ＫｐｎIで切断後、Klenow Fragment（宝バイオ製）で末端を平滑化した後、ｐＢａｍＨIリンカー（宝バイオ製：CGGATCCG）をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。次いで、これをＢａｍＨＩで処理した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝バイオ製）で末端を脱リン酸化処理した後、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約６．４ｋｂの断片をゲルからQIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて回収した。
このようにして調製したベクター断片と、上記で調製したＢａｍＨＩ切断末端を持つフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびイソシトレートリアーゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍLカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーを液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ処理した結果、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を生じるクローンを選抜し、これをｐＩＣＬ２．０と命名した（図２に構築手順を示す）。
ｐＩＣＬ２．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９、１０に記載する。
上記（Ｂ）および（Ｃ）でそれぞれ調製したＤＮＡ断片を混合した試料を鋳型とし、配列番号５および配列番号８に記載のＤＮＡプライマーを用いたクロスオーバーＰＣＲによって両断片を結合した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で２分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
このようにして調製したＤＮＡ断片をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化した後、ＢａｍＨＩリンカー（宝バイオ製）をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。次いで、制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、ＢａｍＨＩ切断末端を持つフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびイソシトレートリアーゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子断片を調製した。
ｐＭＪＰＣ１（特開2005-95169）を制限酵素ＫｐｎIで切断後、Klenow Fragment（宝バイオ製）で末端を平滑化した後、ｐＢａｍＨIリンカー（宝バイオ製：CGGATCCG）をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。次いで、これをＢａｍＨＩで処理した後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（宝バイオ製）で末端を脱リン酸化処理した後、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約６．４ｋｂの断片をゲルからQIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて回収した。
このようにして調製したベクター断片と、上記で調製したＢａｍＨＩ切断末端を持つフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびイソシトレートリアーゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍLカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーを液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ処理した結果、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を生じるクローンを選抜し、これをｐＩＣＬ２．０と命名した（図２に構築手順を示す）。
ｐＩＣＬ２．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９、１０に記載する。
＜マレートシンターゼ活性化プラスミドの構築＞
（Ａ）マレートシンターゼ遺伝子断片の調製
マレートシンターゼ遺伝子断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で２分３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
（Ａ）マレートシンターゼ遺伝子断片の調製
マレートシンターゼ遺伝子断片の取得は実施例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.AP005276）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）を用いたＰＣＲによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で２分３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．３ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて行った。
（Ｂ）クロスオーバーＰＣＲによるフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーター断片とイソシトレートリアーゼ遺伝子断片の結合とベクターへの挿入
実施例２の（Ｂ）および上記（Ａ）でそれぞれ調製したＤＮＡ断片を混合した試料を鋳型とし、配列番号５および配列番号１２に記載のＤＮＡプライマーを用いたクロスオーバーＰＣＲによって両断片を結合した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で３分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
このようにして調製したフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびマレートシンターゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子断片をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化し、これを実施例１で構築したｐＣ３．１４を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理して調製したＤＮＡ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、これをｐＭＳ２．０と命名した（図３に構築手順を示す）。
ｐＭＳ２．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３、１４に記載する。
実施例２の（Ｂ）および上記（Ａ）でそれぞれ調製したＤＮＡ断片を混合した試料を鋳型とし、配列番号５および配列番号１２に記載のＤＮＡプライマーを用いたクロスオーバーＰＣＲによって両断片を結合した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー PTC-200（MJResearch社製）を用い、９４℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で３分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（SeaKem GTG agarose：FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、QIAQuick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。
このようにして調製したフルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびマレートシンターゼ遺伝子からなるキメラ遺伝子断片をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝バイオ製）により５'末端をリン酸化し、これを実施例１で構築したｐＣ３．１４を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理して調製したＤＮＡ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて結合した。
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、これをｐＭＳ２．０と命名した（図３に構築手順を示す）。
ｐＭＳ２．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列および推測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３、１４に記載する。
＜グリオキシル酸回路活性化株の作製＞
（Ａ）ｐＩＣＬ２．０およびｐＭＳ２．０の導入
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株（ＬＤＨ遺伝子が破壊された株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡはｐＩＣＬ２．０およびｐＭＳ２．０を用いて形質転換した大腸菌ＭＪ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Vol. 144, p. 181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨと命名した。
（Ａ）ｐＩＣＬ２．０およびｐＭＳ２．０の導入
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株（ＬＤＨ遺伝子が破壊された株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡはｐＩＣＬ２．０およびｐＭＳ２．０を用いて形質転換した大腸菌ＭＪ１１０株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Vol. 144, p. 181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｂ）ＩＣＬ活性の測定
上記（Ｂ）で得られた形質転換株をグルコース２％、カナマイシン25mg/L及びストレプトマイシン10mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液10mlを集菌後、５ｍＭのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）10mlで２回洗浄し、4.5Mのグルセロール及び5mMのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）２ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をバイオラプター（コスモバイオ製）で破砕し、10,000g、15分間の遠心分離を行なった後に上清を分離した。得られた上清については更に40,000rpm、
６０分の超遠心分離を行い、超遠心後の上清を用いてイソシトレートリアーゼ活性を測定した。
酵素活性の測定は50mM MOPS-NaOH (pH7.3)、5mM DTT、 15mM MgCl2 、1mM EDTA、 5mM isocitrate、 0.2mM NADH、18U lactate dehydrogenase (pig heart isoenzyme Ｉ)および上記酵素抽出液を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Ｕは、１分間に１μモルのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨのＩＣＬ比活性は０．７０９Ｕ/mg-蛋白質であった。なお親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むA培地を用いて同様に培養した菌体では、ＩＣＬ活性は０．０４４５Ｕ/mg-蛋白質であり、増強株では約１６倍にＩＣＬ活性が増加していることが確認された。
上記（Ｂ）で得られた形質転換株をグルコース２％、カナマイシン25mg/L及びストレプトマイシン10mg/Lを含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液10mlを集菌後、５ｍＭのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）10mlで２回洗浄し、4.5Mのグルセロール及び5mMのMgCl2を含む５０ｍＭ Hepes/NaOH緩衝液（pH7.5）２ｍｌに再度懸濁させた。懸濁液をバイオラプター（コスモバイオ製）で破砕し、10,000g、15分間の遠心分離を行なった後に上清を分離した。得られた上清については更に40,000rpm、
６０分の超遠心分離を行い、超遠心後の上清を用いてイソシトレートリアーゼ活性を測定した。
酵素活性の測定は50mM MOPS-NaOH (pH7.3)、5mM DTT、 15mM MgCl2 、1mM EDTA、 5mM isocitrate、 0.2mM NADH、18U lactate dehydrogenase (pig heart isoenzyme Ｉ)および上記酵素抽出液を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Ｕは、１分間に１μモルのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨのＩＣＬ比活性は０．７０９Ｕ/mg-蛋白質であった。なお親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むA培地を用いて同様に培養した菌体では、ＩＣＬ活性は０．０４４５Ｕ/mg-蛋白質であり、増強株では約１６倍にＩＣＬ活性が増加していることが確認された。
＜菌体反応（炭酸マグネシウム中和反応）＞
１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ、２％ストレプトマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例４（Ａ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。但し、対象株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を培養する場合は、ストレプトマイシンおよびカナマイシンを添加しなかった。
得られた全培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ６６０の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌおよび基質溶液（グルコース：２００ｇ、炭酸マグネシウム：１９４ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％二酸化炭素ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で５時間又は２４時間反応させた後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した。
反応５時間では、培地中のグルコースは残存しており、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の反応液中のコハク酸濃度が２２．５ｇ／Ｌであったの対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株では２５．９ｇ／Ｌのコハク酸を蓄積していた。ＩＣＬおよびＭＳを活性化した株のコハク酸生産性が約１５％向上していた。
また、反応２４時間では、残存グルコース濃度は１ｇ／Ｌ未満であり、分析したコハク酸濃度から計算されるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株の対糖収率は、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株に対して７．２％増大していた。
これらの結果から、ＩＣＬおよびＭＳの活性化は、コハク酸の生産性および収率を向上させる顕著な効果があることが明らかになった。
１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ、２％ストレプトマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例４（Ａ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。但し、対象株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を培養する場合は、ストレプトマイシンおよびカナマイシンを添加しなかった。
得られた全培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ６６０の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌおよび基質溶液（グルコース：２００ｇ、炭酸マグネシウム：１９４ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％二酸化炭素ガス、８０％窒素雰囲気下、３５℃で５時間又は２４時間反応させた後、上述の条件で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した。
反応５時間では、培地中のグルコースは残存しており、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の反応液中のコハク酸濃度が２２．５ｇ／Ｌであったの対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株では２５．９ｇ／Ｌのコハク酸を蓄積していた。ＩＣＬおよびＭＳを活性化した株のコハク酸生産性が約１５％向上していた。
また、反応２４時間では、残存グルコース濃度は１ｇ／Ｌ未満であり、分析したコハク酸濃度から計算されるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＩＣＬ／ＭＳ／ΔＬＤＨ株の対糖収率は、親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株に対して７．２％増大していた。
これらの結果から、ＩＣＬおよびＭＳの活性化は、コハク酸の生産性および収率を向上させる顕著な効果があることが明らかになった。
Claims (8)
- イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強した細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させてコハク酸を生成させ、該コハク酸を回収することを特徴とするコハク酸の製造方法。
- 前記細菌が、イソシトレートリアーゼ及びマレートシンターゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項１に記載の方法。
- 前記細菌が、イソシトレートリアーゼをコードする遺伝子及びマレートシンターゼをコードする遺伝子を、糖類を主な炭素源とする培地において機能するプロモーターの制御下に置くことによって改変された細菌である、請求項２に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が、非改変株に比べて１０％以下に低減化するように改変された細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれるいずれかの細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 有機原料が、グルコースまたはシュークロースである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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