JP2009065972A - コハク酸の製造方法 - Google Patents
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
Abstract
【課題】コハク酸を効率よく生産することのできる方法を提供する。
【解決手段】ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムから選択される細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法であって、前記細菌が非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であり、該細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を３７〜４５℃で有機原料に作用させることを特徴とする方法。
【選択図】図２
【解決手段】ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムから選択される細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法であって、前記細菌が非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であり、該細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を３７〜４５℃で有機原料に作用させることを特徴とする方法。
【選択図】図２
Description
本発明は、微生物を使用してコハク酸を製造する方法に関するものである。
コリネ型細菌の遺伝子組換え菌を使用してコハク酸などの有用物質を製造する方法が知られている（特許文献１又は２参照）。コリネ型細菌を培養してコハク酸を製造する場合、まず、細菌を好気的条件で増殖させて菌体を取得し、それを静止菌体として用いて有機原料と反応させるという方法がよく使用される。この場合、一般的には、細菌の増殖は２５℃〜３５℃の範囲で行われ、有機原料との反応は３０℃〜３７℃の範囲で行われている。
特許文献３では、コリネ型細菌の乳酸デヒドロゲナーゼ欠損株について、増殖温度および反応温度とコハク酸生産性との関係が解析されており、生育至適温度（増殖温度）の２〜１０℃高い温度でコハク酸生産反応を行うことによりコハク酸の生産性を高めることができることが示されている。特許文献３の実施例２では３０℃で増殖させて得られた菌体を用い、４０℃でコハク酸生産反応を行った例が示されているが、この場合、３０℃で増殖させて得られた菌体を用い、３７℃でコハク酸生産反応を行った実施例１と比較すると糖消費時間が若干長いことがわかる。
また、特許文献２ではピルビン酸カルボキシラーゼが増強するように改変されたコリネ型細菌を使用したコハク酸の製造法も知られているが、そのような株については反応温度とコハク酸生産性との詳細な検討はなされていなかった。
特開平１１−２０６３８５号公報
特開平１１−１９６８８８号公報
特開２００３−２３５５９３号公報
また、特許文献２ではピルビン酸カルボキシラーゼが増強するように改変されたコリネ型細菌を使用したコハク酸の製造法も知られているが、そのような株については反応温度とコハク酸生産性との詳細な検討はなされていなかった。
本発明の課題は、微生物を使用したコハク酸の製造方法において、その生産効率を向上させることにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌においては、反応温度を３７〜４５℃の範囲にするとコハク酸の生産性が良くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムから選択される細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法であって、前記細菌が非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であり、該細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３７〜４５℃で有機原料に作用させることを特徴とする方法。
（２）前記細菌がさらに非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減するように改変された細菌である、（１）の方法。
（３）前記細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３９〜４３℃で有機原料に作用させ
ることを特徴とする（１）または（２）の方法。
（４）前記有機原料がグルコースまたはシュークロースである、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記反応液が、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
（１）ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムから選択される細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法であって、前記細菌が非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であり、該細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３７〜４５℃で有機原料に作用させることを特徴とする方法。
（２）前記細菌がさらに非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減するように改変された細菌である、（１）の方法。
（３）前記細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３９〜４３℃で有機原料に作用させ
ることを特徴とする（１）または（２）の方法。
（４）前記有機原料がグルコースまたはシュークロースである、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記反応液が、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する、（１）〜（５）のいずれかの方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
本発明の方法によれば、コハク酸を効率よく生産することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明に使用される微生物
本発明の方法において使用される微生物は、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）から選択される細菌であって、非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である。
本発明の方法において使用される微生物は、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）から選択される細菌であって、非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌である。
なお、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムは互いに非常に近縁で、性質も類似しており、現在の分類学においては、同一の種に分類されることもある。
本発明に用いる微生物の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer,K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer,K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、PCとも呼ぶ）の活性が増強するように改変された細菌は、例えば、特開平11-196888号公報に記載の方法と同様にして、pc遺伝子をプラス
ミドにより宿主細菌中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってpc遺伝子の発現を増強することもできる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
「PC活性が増強される」とは、PC活性が野生株又は親株等の非改変株に対して、単位菌体重量あたり好ましくは1.5倍以上、より好ましくは3倍以上増加していることをいう。PC活性が増強されたことは、公知の方法（Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]）によりPC活性を測定することによって確認することができる。
ミドにより宿主細菌中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってpc遺伝子の発現を増強することもできる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。
「PC活性が増強される」とは、PC活性が野生株又は親株等の非改変株に対して、単位菌体重量あたり好ましくは1.5倍以上、より好ましくは3倍以上増加していることをいう。PC活性が増強されたことは、公知の方法（Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]）によりPC活性を測定することによって確認することができる。
pc遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のpc遺伝子（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）を用いることが
できる。
さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム以外のコリネ型細菌、または他の微生物又は動植物由来のpc遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のpc遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
できる。
さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム以外のコリネ型細菌、または他の微生物又は動植物由来のpc遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のpc遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
上述したようなpc遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば宿主細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、宿主細菌内でpc遺伝子の高発現が可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組換えプラスミドにおいて、pc遺伝子を発現させるためのプロモーターはpc遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良いが、例えば、tacプロモーターや、trcプロモーター、ＴＺ４プロモーターなどが挙げられる。
コリネ型細菌に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
コリネ型細菌に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
本発明の細菌は、上記PC活性の増強に加えて、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDHともよぶ）
活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
LDH活性が低減するように改変された細菌は、例えば、特開平１１−２０６３８５号公
報に記載されている相同組換えによる方法、あるいは、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等によって染色体上のLDH遺伝子を破壊すること
によって構築することができる。なお、「LDH活性が低減された」とは、非改変株と比較
してLDH活性が低下していることをいう。LDH活性は完全に消失していてもよい。LDH活性
が低下したことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりLDH活性を測定することによって確認することができる。
活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
LDH活性が低減するように改変された細菌は、例えば、特開平１１−２０６３８５号公
報に記載されている相同組換えによる方法、あるいは、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等によって染色体上のLDH遺伝子を破壊すること
によって構築することができる。なお、「LDH活性が低減された」とは、非改変株と比較
してLDH活性が低下していることをいう。LDH活性は完全に消失していてもよい。LDH活性
が低下したことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりLDH活性を測定することによって確認することができる。
さらに、本発明の細菌は、上記PC活性の増強、または、PC活性の増強およびLDH活性の
低下に加えて、アセテートキナーゼ（以下、ACKとも呼ぶ）、ホスフォトランスアセチラ
ーゼ（以下、PTAとも呼ぶ）、ピルベートオキシダーゼ（以下、POXBとも呼ぶ）およびア
セチルCoAハイドロラーゼ（以下、ACHとも呼ぶ）からなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
低下に加えて、アセテートキナーゼ（以下、ACKとも呼ぶ）、ホスフォトランスアセチラ
ーゼ（以下、PTAとも呼ぶ）、ピルベートオキシダーゼ（以下、POXBとも呼ぶ）およびア
セチルCoAハイドロラーゼ（以下、ACHとも呼ぶ）からなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
PTAとACKはいずれか一方を活性低下させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
「PTA活性」とは、アセチルCoAにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「PTA活性が低減するように改変された」とは、PTA活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。PTA活性は非改変株と比較して、単位菌体
重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。また、PTA活性は完全に消失していてもよい。PTA活性が低下したことは、Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969)）により、PTA活性
を測定することによって確認することができる。
「PTA活性」とは、アセチルCoAにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「PTA活性が低減するように改変された」とは、PTA活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。PTA活性は非改変株と比較して、単位菌体
重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。また、PTA活性は完全に消失していてもよい。PTA活性が低下したことは、Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969)）により、PTA活性
を測定することによって確認することができる。
「ACK活性」は、アセチルリン酸とADPから酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACK活性が低減するように改変された」とは、ACK活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ACK活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下
に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。また、ACK活性は完全に消失していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACK活性を測定することによって確
認することができる。
に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。また、ACK活性は完全に消失していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACK活性を測定することによって確
認することができる。
なお、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムに分類されるものも含む）においては、Microbiology. 1999 Feb;145 (Pt 2):503-13に記載されているように、両酵素はｐｔａ−ａｃｋオペロン（GenBank Accession No. X89084）にコードされているため、pta遺伝子を破壊した場合は、PTA及びACKの両酵素の活性を低下させる
ことができる。
ことができる。
PTAおよびACKの活性低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってこれらの遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、特開2006-000091号公報に開
示された方法に従って行うことができる。pta遺伝子およびack遺伝子としては、上記GenBank Accession No. X89084の塩基配列を有する遺伝子のほか、宿主染色体上のpta遺伝子
およびack遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有する遺伝子を用いることもでき
る。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
示された方法に従って行うことができる。pta遺伝子およびack遺伝子としては、上記GenBank Accession No. X89084の塩基配列を有する遺伝子のほか、宿主染色体上のpta遺伝子
およびack遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有する遺伝子を用いることもでき
る。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
「POXB活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「POXB活性が低減するように改変された」とは、POXB活性が、非改変株、例えば野生株よりも
低くなったことをいう。POXB活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。POXB活性は、Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E. JR, J.Bacteriol.151,1279-1289(1982)）により、活性を測定することによって確認することができる。
低くなったことをいう。POXB活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。POXB活性は、Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E. JR, J.Bacteriol.151,1279-1289(1982)）により、活性を測定することによって確認することができる。
POXB活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってpoxB遺伝子を破壊することにより行うことができる。具体的には、WO2005/113745に開示された方法に従って行
うことができる。poxB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2610（GenBank Accession No． BA000036の2776766-2778505番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝
子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のpoxB遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
うことができる。poxB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2610（GenBank Accession No． BA000036の2776766-2778505番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝
子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のpoxB遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
「ACH活性」は、アセチルCoAと水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACH活性が低減するように改変された」とは、ACH活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ACH活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低
下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ACH活性は、Gergely,J.,らの方法（Gergely,J., Hele,P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334）により測定する
ことが出来る。
下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ACH活性は、Gergely,J.,らの方法（Gergely,J., Hele,P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334）により測定する
ことが出来る。
ACH活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用
いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってach遺伝子を破壊する
ことによって行うことができる。具体的には、WO2005/113744に開示された方法に従って
行うことができる。ach遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2569（GenBank Accession No．BA000036の2729376..2730917番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のach遺伝子と相同組換えを起こす程度の
相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってach遺伝子を破壊する
ことによって行うことができる。具体的には、WO2005/113744に開示された方法に従って
行うことができる。ach遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2569（GenBank Accession No．BA000036の2729376..2730917番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のach遺伝子と相同組換えを起こす程度の
相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
なお、本発明において使用する細菌は、上記PC活性の増強、または、PC活性の増強およびLDH活性の低下に加え、上記改変のうちの2種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。
２．コハク酸の製造方法
本発明のコハク酸の製造方法は、上記細菌を培養した菌体またはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させ、これを採取することを特徴とするコハク酸の製造方法である。
本発明のコハク酸の製造方法は、上記細菌を培養した菌体またはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させ、コハク酸を生成させ、これを採取することを特徴とするコハク酸の製造方法である。
コハク酸の製造に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。種培養に用いる培地は、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般
的な培地を用いることができる。種培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収した後に、コハク酸の製造反応に用いることが好ましい。なお、種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってコハク酸を製造してもよいし、予め増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによってもコハク酸を製造してもよい。
的な培地を用いることができる。種培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収した後に、コハク酸の製造反応に用いることが好ましい。なお、種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによってコハク酸を製造してもよいし、予め増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによってもコハク酸を製造してもよい。
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本細菌が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース又はシュークロースが好ましい。
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
反応液には、例えば上記した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添
加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
本反応に用いる細菌を増殖させて菌体を得るための培養は、通常、コリネ型細菌の生育至適温度である２５℃〜３５℃の範囲、より好ましくは２５℃〜３０℃、特に好ましくは約３０℃で行う。培養時間は一定量の菌体が得られる時間であればよいが、通常、６〜９６時間である。生育至適温度は、コハク酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。
一方、コハク酸生産反応は、本反応に用いるコリネ型細菌の生育至適温度より２〜２０℃高い温度、好ましくは７〜１５℃高い温度で、具体的には、３７〜４５℃、好ましくは３９℃〜４５℃、より好ましくは３９℃〜４３℃、特に好ましくは３９〜４１℃の範囲で行う。コハク酸生産反応の時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。コハク酸生産反応の間、常に３７℃〜４５℃である必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間、上記温度範囲にすることが望ましい。
反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。
反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。
細菌の種培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸などコハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
以上のような細菌反応により、コハク酸が反応液中に生成蓄積する。反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より採取することができる。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、コハク酸を採取することができる。
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、特に、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）増強株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５
Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮ
Ａに使用した。
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５
Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮ
Ａに使用した。
（Ｂ）ＰＣプロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製
）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製
）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μ
Ｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バ
ッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを
混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅ
ｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
Ｌ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バ
ッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを
混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅ
ｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモ
ーター：：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
ーター：：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、実施例１（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、
１ｍＭ ＭｇSＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（
Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸
化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．
２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
１ｍＭ ＭｇSＯ4、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡ
ＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（
Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５'末端をリン酸
化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ アンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．
２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース
（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域
とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した（図１）。
（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域
とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した（図１）。
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（LDH活性が低下した株：特開２
００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．３のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１
０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（LDH活性が低下した株：特開２
００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．３のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１
０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性の測定
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び
酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼの発現を強化した無細胞
抽出液における比活性は 0.1U/mg蛋白質であった。尚、親株であるＭＪ２３３/△ＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、本活性測定方法検出限界以下であった。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をコハク酸生産菌として菌体調製用培養、およびコハク酸生産反応に用いた。
また、対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を用いた。
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をグルコース２％、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液（pH7.5）、 0.1mg/10mlビオチン、5mM 塩化マグネシウム、50mM 炭酸水素ナトリウム、5mM ピルビン酸ナトリウム 、5mM アデノシン３リン酸ナトリウム、0.32 mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及び
酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。1Uは１分間に１μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼの発現を強化した無細胞
抽出液における比活性は 0.1U/mg蛋白質であった。尚、親株であるＭＪ２３３/△ＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、本活性測定方法検出限界以下であった。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をコハク酸生産菌として菌体調製用培養、およびコハク酸生産反応に用いた。
また、対照として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を用いた。
［実施例１］
ジャーファーメンターでの評価−１
＜種培養＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬを添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨまたはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて種培養した。
ジャーファーメンターでの評価−１
＜種培養＞
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬを添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨまたはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて種培養した。
＜本培養＞
硫酸アンモニウム：１．０ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、塩化カリウム：１．６７ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．０ｍｇ、塩酸チアミン：１．０ｍｇ、ソルリス（ロケット社製）５．８ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：１．０ｇ及び蒸留水：１０００ｍＬの培地３６５ｍＬを１Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した７２％グルコース水溶液：２０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を２０ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは９．３％アンモニア水を用いて７．５以下にならないように保ち、通気は毎分６００ｍＬ、攪拌は毎分９２０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２%グルコース水溶液を約７００μＬ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃
度が再び上昇するごとに上記の方法にてグルコース水溶液添加を繰り返して、培養開始後２２．５時間まで継続した。
硫酸アンモニウム：１．０ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、塩化カリウム：１．６７ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．０ｍｇ、塩酸チアミン：１．０ｍｇ、ソルリス（ロケット社製）５．８ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：１．０ｇ及び蒸留水：１０００ｍＬの培地３６５ｍＬを１Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した７２％グルコース水溶液：２０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を２０ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは９．３％アンモニア水を用いて７．５以下にならないように保ち、通気は毎分６００ｍＬ、攪拌は毎分９２０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２%グルコース水溶液を約７００μＬ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃
度が再び上昇するごとに上記の方法にてグルコース水溶液添加を繰り返して、培養開始後２２．５時間まで継続した。
＜コハク酸生産培養＞
リン酸１アンモニウム：８４．４ｍｇ、リン酸２アンモニウム：７５．８ｍｇ、塩化カリウム１４９．１ｍｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、１Ｌのジャーファーメンターに入れた（これを複数用意した）。この培地２００ｍＬに上記の本培養により得られた培養液（ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株またはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株）９０ｍＬ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース溶液：１００ｍＬ、滅菌水：１２０ｍＬを添加して混合し、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は３５℃、３７℃、３９℃、４１℃、４３℃、４５℃、および４７℃、ＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株は３５℃および４１℃に保温した。ｐＨは炭酸水素アンモニウム：８９．８ｇ、２８％アンモニア水：３８７ｇ、蒸留水：５２０ｇの水溶液を用いて７．６に保ち、毎分２００回転で攪拌しながらコハク酸生産反応を行った。各々の菌株の３５℃反応における菌体比速度を１．００とした時の各温度条件での相対菌体比速度を表１に示す。また、反応温度と相対菌体比速度との関係を図２に示した。なお、菌体比速
度とは、１ｇの菌体が１時間に生産するコハク酸重量（ｇ）を表す。
リン酸１アンモニウム：８４．４ｍｇ、リン酸２アンモニウム：７５．８ｍｇ、塩化カリウム１４９．１ｍｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、１Ｌのジャーファーメンターに入れた（これを複数用意した）。この培地２００ｍＬに上記の本培養により得られた培養液（ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株またはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株）９０ｍＬ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース溶液：１００ｍＬ、滅菌水：１２０ｍＬを添加して混合し、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は３５℃、３７℃、３９℃、４１℃、４３℃、４５℃、および４７℃、ＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株は３５℃および４１℃に保温した。ｐＨは炭酸水素アンモニウム：８９．８ｇ、２８％アンモニア水：３８７ｇ、蒸留水：５２０ｇの水溶液を用いて７．６に保ち、毎分２００回転で攪拌しながらコハク酸生産反応を行った。各々の菌株の３５℃反応における菌体比速度を１．００とした時の各温度条件での相対菌体比速度を表１に示す。また、反応温度と相対菌体比速度との関係を図２に示した。なお、菌体比速
度とは、１ｇの菌体が１時間に生産するコハク酸重量（ｇ）を表す。
表１と図２の結果から、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株では、ＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株とは異なり、３５℃で反応させたときよりも、４１℃で反応させたときの方が高い菌体比速度を示すことがわかった。すなわち、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株は３７℃〜４５℃の高温で反応させたときの方がコハク酸の生産効率が良いことが分かった。また、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株のコハク酸生産効率は反応温度が３９℃から４１℃の時に最も高かった。
［実施例２］
ジャーファーメンターでの評価−２
実施例１の種培養と同様にして得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、および３９℃の温度条件について、実施例１と同様の方法にてコハク酸生産培養評価を実施した。６時間後のコハク酸蓄積濃度と反応温度の関係を図３に示す。
ジャーファーメンターでの評価−２
実施例１の種培養と同様にして得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、および３９℃の温度条件について、実施例１と同様の方法にてコハク酸生産培養評価を実施した。６時間後のコハク酸蓄積濃度と反応温度の関係を図３に示す。
図３より、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株では３７℃以上から急激にコハク酸の生産効率が高まることが分かった。
［実施例３］
簡易評価試験
実施例１の種培養と同様にして得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨまたはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の培養液を１００００×ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、硫酸アンモニウム６６ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ660の吸光度が２０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．
５ｍｌと、基質溶液（グルコース：４０ｇ、炭酸水素アンモニウム：６３．２ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えたものを複数用意し、５〜６％炭酸ガス雰囲気下、それぞれ３５℃及び４１℃で反応させた。
６時間後のコハク酸蓄積濃度を表２に示す。
簡易評価試験
実施例１の種培養と同様にして得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨまたはＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の培養液を１００００×ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、硫酸アンモニウム６６ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ660の吸光度が２０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．
５ｍｌと、基質溶液（グルコース：４０ｇ、炭酸水素アンモニウム：６３．２ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えたものを複数用意し、５〜６％炭酸ガス雰囲気下、それぞれ３５℃及び４１℃で反応させた。
６時間後のコハク酸蓄積濃度を表２に示す。
表２より、小スケールの簡易評価試験でも、ＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株では高温で反応させたときの方がコハク酸の生産効率が良いことが分かった。
また、有機原料としてシュークロースを含有する基質溶液を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
また、有機原料としてシュークロースを含有する基質溶液を用いた場合でも、同様の結果が得られた。
Claims (7)
- ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムおよびコリネバクテリウム・グルタミカムから選択される細菌を培養した菌体、あるいはその処理物を、有機原料を含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法であって、前記細菌が非改変株と比較してピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された細菌であり、該細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３７〜４５℃で有機原料に作用させることを特徴とする方法。
- 前記細菌がさらに非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減するように改変された細菌である、請求項１に記載の方法。
- 前記細菌を培養した菌体あるいはその処理物を３９〜４３℃で有機原料に作用させることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
- 前記有機原料がグルコースまたはシュークロースである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応液が、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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