JP2023540518A - Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法 - Google Patents

Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023540518A
JP2023540518A JP2023514804A JP2023514804A JP2023540518A JP 2023540518 A JP2023540518 A JP 2023540518A JP 2023514804 A JP2023514804 A JP 2023514804A JP 2023514804 A JP2023514804 A JP 2023514804A JP 2023540518 A JP2023540518 A JP 2023540518A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lysine
corynebacterium
strain
corynebacterium glutamicum
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023514804A
Other languages
English (en)
Inventor
ミ・リュ
イン・ピョ・ホン
ミン・ジン・チェ
ソク・ヒョン・パク
ジェ・チュン・ハン
Original Assignee
デサン・コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020210050318A external-priority patent/KR20220030866A/ko
Application filed by デサン・コーポレイション filed Critical デサン・コーポレイション
Publication of JP2023540518A publication Critical patent/JP2023540518A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03001—Citrate (Si)-synthase (2.3.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03003—Citrate (Re)-synthase (2.3.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Abstract

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関し、前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の発現を減少または弱化させることにより、オキサロアセテートのクエン酸転換を抑制してＬ－リジンの生産収率を向上させることができる。

Description

本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関する。
Ｌ－リジンは人間や動物の体内で合成されない必須アミノ酸であって、外部から供給されなければならず、一般的に細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産される。Ｌ－リジンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－リジン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－リジンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大膓菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して優れたＬ－リジン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法が開発されている。韓国登録特許第１０－０８３８０３８号および第１０－２１３９８０６号によれば、Ｌ－リジンの生産に関わる酵素の遺伝子の発現を増加させるか、不必要な遺伝子を除去することにより、Ｌ－リジン生産能が向上できる。
Ｌ－リジンはアスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）由来アミノ酸で、アスパルテートの前駆体であるオキサロアセテート（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）の合成レベルはＬ－リジンの生産にも影響を及ぼす。オキサロアセテートの場合、微生物の当該過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）で生成され、シトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）によってアセチルコエー（ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）と重合されてシトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）として生成される。したがって、オキサロアセテートをシトレートに転換するシトレート合成酵素の発現レベルを調節することにより、Ｌ－リジンの生産量も調節できることが期待される。
韓国登録特許第１０－０８３８０３８号 韓国登録特許第１０－２１３９８０６号
本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リジンの生産方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、コリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いてＬ－リジン生産能が向上した新たな変異株を開発するために研究した結果、シトレート合成酵素の活性を弱化させるためにシトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の配列、特に、開始コドンＡＴＧをＧＴＧまたはＴＴＧに置換した場合、Ｌ－リジンの生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の一態様は、シトレート合成酵素の活性が弱化してＬ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株を提供する。
本発明で使用された「シトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、ＴＣＡ回路に作用する酵素であって、当該過程で生成されたアセチルＣｏＡとオキサロアセテートとを重合してシトレートを合成する反応を触媒する酵素を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムスラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウムルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウムドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムウテレクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウムスタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムパケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムシングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウムマリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムスフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウムフレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムカニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムレナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）、またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。
本発明で使用された「活性が弱化」とは、オブジェクトの遺伝子の発現量が本来の発現量より減少することを意味する。このような活性の弱化は、遺伝子を暗号化するヌクレオシド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性に比べて減少した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現阻害または翻訳阻害などにより、細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＧＴＧに置換されたものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＴＴＧに置換されたものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されたものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列で表されるものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウムグルタミクム菌株のシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を暗号化する配列番号１の塩基配列において開始コドンをＡＴＧからＧＴＧに置換して、ｇｌｔＡ遺伝子の新しい開始コドンを有するコリネバクテリウムグルタミクム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、配列番号３の塩基配列または配列番号４のアミノ酸配列で暗号化されたシトレート合成酵素遺伝子を含むものであってもよい。
また、本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウムグルタミクム菌株のシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を暗号化する配列番号１の塩基配列において開始コドンをＡＴＧからＴＴＧに置換して、ｇｌｔＡ遺伝子の新しい開始コドンを有するコリネバクテリウムグルタミクム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、配列番号５の塩基配列または配列番号６のアミノ酸配列で暗号化されたシトレート合成酵素遺伝子を含むことを確認した。
本発明で使用された「生産能が向上した」とは、親菌株に比べてＬ－リジンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になるか、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株または野生型から変異された菌株であってもよい。例えば、親菌株は、リジンの生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆおよびｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株であって、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０２１年４月２日付で受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐで寄託されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株（以下、「コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株」という）であってもよい。
本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株に比べて増加したＬ－リジン生産能を示し、特に、親菌株に比べてＬ－リジンの生産量が５％以上、具体的には５～２０％増加して、菌株培養液１ｌあたり６６～８０ｇのＬ－リジンを生産することができ、好ましくは、６８～７８ｇのＬ－リジンを生産することができる。
本発明の一具体例によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株にシトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＧＴＧまたはＴＴＧに置換された変異体を含む組換えベクターにより実現できる。
本発明で使用された「変異体」は、Ｌ－リジンの生合成に関与するシトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＡＴＧからＧＴＧまたはＴＴＧに置換された遺伝子変異体を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＧＴＧに置換された変異体は、配列番号３の塩基配列または配列番号４のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＴＴＧに置換された変異体は、配列番号５の塩基配列または配列番号６のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
本発明で使用された「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」とは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリポソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージ、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明で使用された「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムとは無関係に複製可能であるか、ゲノムそのものに縫合される。この時、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製原点を含むことができる。
前記形質転換は、宿主細胞によって好適なベクター導入技術が選択されて、目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。
前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。
また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例としてカナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換されていてもよい。
本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。
また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法を提供する。
前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）を参照できるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。あるいは、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。さらに、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加できるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続してもよいし、例えば１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップは、培養方法により当該分野にて公知の適した方法を用いて培地から生産されたＬ－リジンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されない。
本発明の一具体例によれば、リジンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。
本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リジンを回収するステップは、Ｌ－リジンを精製する工程を含むことができる。
本発明によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の発現を減少または弱化させることにより、オキサロアセテートのクエン酸転換を抑制してＬ－リジンの生産収率を向上させることができる。
本発明の一実施例により開始コドンがＡＴＧからＧＴＧに置換されたシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）ベクターの構造を示す図である。 本発明の一実施例により開始コドンがＡＴＧからＴＴＧに置換されたシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｔ）ベクターの構造を示す図である。
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明により制限されるものではない。
実施例１．コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造
コリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造するために、コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。
前記コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇおよびビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。
抗生剤（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用し、ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。
１－１．組換えベクターの作製
菌株にＴＣＡ回路を弱化させ、炭素源の効率性を増加させるために、シトレート合成酵素の弱化を導入した。本実施例で用いた方法は、シトレート合成酵素を暗号化しているｇｌｔＡ遺伝子の発現を減少するために、当該遺伝子の解読開始コドンに特異的変異を誘発した。ｇｌｔＡ遺伝子の解読開始コドンをＡＴＧからＧＴＧに変異を導入し、コリネバクテリウムグルタミクムゲノム上でｇｌｔＡ遺伝子の真ん中を中心に左アーム４７８ｂｐ部分と右アーム４７５ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）と名付けた（図１参照）。前記プラスミドを作製るために、それぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表１のプライマーを使用した。
以上のプライマーを用いて、下記の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下で２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲの実施条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。
このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウムグルタミクム菌株の組換えに使用した。
前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法でｐＣＧＩベクターに挿入してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選別した。染色体の遺伝子塩基置換（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、それぞれ断片の遺伝子を個別増幅してオーバーラップＰＣＲで目的ＤＮＡ断片を製造した。遺伝子組換え時のＰＣＲ増幅酵素としてはＥｘ Ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用いており、各種制限酵素およびＤＮＡ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を使用し、供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。
１－２．変異株の製造
前記ｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）ベクターを用いて、変異菌株であるＤＳ２菌株を製造した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように用意して、コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシンが２０μｇ／μｌ含まれるＣＭ－寒天プレートに塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適宜挿入されたかを、ＰＣＲおよび塩基配列の分析により確認した。このように分離された菌株を再度２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）を含有したＣＭ－寒天液体培地に接種し、一晩以上培養して、同一濃度のストレプトマイシンを含有した寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニー中においてカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性がない菌株中においてｇｌｔＡ遺伝子に変異が導入されたかを、塩基配列の分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に変異ｇｌｔＡ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＤＳ２）を取得した。
実施例２．コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造
ｇｌｔＡ遺伝子の開始コドンをＴＴＧに置換したことを除けば、実施例１と同様の方法でコリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造した。
ここで、プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表２のプライマーを使用し、作製されたプラスミドｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｔ）ベクターを用いて変異菌株であるＤＳ２－１菌株を製造した。最終的に変異ｇｌｔＡ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＤＳ２－１）を取得した。
実験例１．変異株のＬ－グルタミン酸の生産性の比較
親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株と、実施例１および２で製造されたリジン生産変異株であるＤＳ２菌株およびＤＳ２－１菌株のＬ－リジンの生産性を比較した。
下記表３のような組成を有するリジン培地１０ｍｌを含有した１００ｍｌのフラスコに、親菌株（ＤＳ１）または変異株（ＤＳ２またはＤＳ２－１）をそれぞれ接種し、３０℃で２８時間、１８０ｒｐｍの条件で振盪培養した。培養終了後、リジン分析はＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本）でＬ－リジンの生産量を測定し、その結果を下記表４に示した。
前記表４に示しているように、コリネバクテリウムグルタミクム変異株ＤＳ２とＤＳ２－１は、リジン生合成経路の強化のために、ｇｌｔＡ遺伝子が最適な翻訳開始配列（ＧＴＧまたはＴＴＧ）に置換されることにより、親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株に比べてＬ－リジンの生産性が約６．９％増加したことが確認された。この結果を通して、ｇｌｔＡ遺伝子の発現弱化が代謝の炭素源の流れを減少させることにより、菌株のＬ－リジン生産能を向上させることが分かった。
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれたものと解釈されなければならない。
本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法に関する。
Ｌ－リジンは人間や動物の体内で合成されない必須アミノ酸であって、外部から供給されなければならず、一般的に細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産される。Ｌ－リジンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－リジン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－リジンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大膓菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して優れたＬ－リジン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－リジンの生産方法が開発されている。韓国登録特許第１０－０８３８０３８号および第１０－２１３９８０６号によれば、Ｌ－リジンの生産に関わる酵素の遺伝子の発現を増加させるか、不必要な遺伝子を除去することにより、Ｌ－リジン生産能が向上できる。
Ｌ－リジンはアスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）由来アミノ酸で、アスパルテートの前駆体であるオキサロアセテート（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）の合成レベルはＬ－リジンの生産にも影響を及ぼす。オキサロアセテートの場合、微生物の当該過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）で生成され、シトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）によってアセチルコエー（ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）と重合されてシトレート（ｃｉｔｒａｔｅ）として生成される。したがって、オキサロアセテートをシトレートに転換するシトレート合成酵素の発現レベルを調節することにより、Ｌ－リジンの生産量も調節できることが期待される。
韓国登録特許第１０－０８３８０３８号 韓国登録特許第１０－２１３９８０６号
本発明は、Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リジンの生産方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、コリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いてＬ－リジン生産能が向上した新たな変異株を開発するために研究した結果、シトレート合成酵素の活性を弱化させるためにシトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の配列、特に、開始コドンＡＴＧをＧＴＧまたはＴＴＧに置換した場合、Ｌ－リジンの生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の一態様は、シトレート合成酵素の活性が弱化してＬ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株を提供する。
本発明で使用された「シトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、ＴＣＡ回路に作用する酵素であって、当該過程で生成されたアセチルＣｏＡとオキサロアセテートとを重合してシトレートを合成する反応を触媒する酵素を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムスラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウムルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウムドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムウテレクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウムスタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムパケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムシングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウムマリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムスフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウムフレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムカニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムレナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）、またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。
本発明で使用された「活性が弱化」とは、オブジェクトの遺伝子の発現量が本来の発現量より減少することを意味する。このような活性の弱化は、遺伝子を暗号化するヌクレオシド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性に比べて減少した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現阻害または翻訳阻害などにより、細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＧＴＧに置換されたものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＴＴＧに置換されたものであってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されたものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列で表されるものであってもよい。
本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウムグルタミクム菌株のシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を暗号化する配列番号１の塩基配列において開始コドンをＡＴＧからＧＴＧに置換して、ｇｌｔＡ遺伝子の新しい開始コドンを有するコリネバクテリウムグルタミクム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、配列番号３の塩基配列または配列番号４のアミノ酸配列で暗号化されたシトレート合成酵素遺伝子を含むものであってもよい。
また、本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウムグルタミクム菌株のシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を暗号化する配列番号１の塩基配列において開始コドンをＡＴＧからＴＴＧに置換して、ｇｌｔＡ遺伝子の新しい開始コドンを有するコリネバクテリウムグルタミクム変異株を取得した。このようなコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、配列番号５の塩基配列または配列番号６のアミノ酸配列で暗号化されたシトレート合成酵素遺伝子を含むことを確認した。
本発明で使用された「生産能が向上した」とは、親菌株に比べてＬ－リジンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になるか、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株または野生型から変異された菌株であってもよい。例えば、親菌株は、リジンの生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆおよびｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株であって、韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０２１年４月２日付で受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐで寄託されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株（以下、「コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株」という）であってもよい。
本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株に比べて増加したＬ－リジン生産能を示し、特に、親菌株に比べてＬ－リジンの生産量が５％以上、具体的には５～２０％増加して、菌株培養液１ｌあたり６６～８０ｇのＬ－リジンを生産することができ、好ましくは、６８～７８ｇのＬ－リジンを生産することができる。
本発明の一具体例によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株にシトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＧＴＧまたはＴＴＧに置換された変異体を含む組換えベクターにより実現できる。
本発明で使用された「変異体」は、Ｌ－リジンの生合成に関与するシトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＡＴＧからＧＴＧまたはＴＴＧに置換された遺伝子変異体を意味する。
本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＧＴＧに置換された変異体は、配列番号３の塩基配列または配列番号４のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
また、本発明の一具体例によれば、前記シトレート合成酵素遺伝子の開始コドンがＴＴＧに置換された変異体は、配列番号５の塩基配列または配列番号６のアミノ酸配列を有するものであってもよい。
本発明で使用された「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」とは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリポソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージ、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明で使用された「組換えベクター」は、好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムとは無関係に複製可能であるか、ゲノムそのものに縫合される。この時、前記「好適な宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製原点を含むことができる。
前記形質転換は、宿主細胞によって好適なベクター導入技術が選択されて、目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。
前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。
また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例としてカナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換されていてもよい。
本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。
また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法を提供する。
前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）を参照できるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。あるいは、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。さらに、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加できるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続してもよいし、例えば１０～１６０時間であってもよい。
本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップは、培養方法により当該分野にて公知の適した方法を用いて培地から生産されたＬ－リジンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を用いることができるが、これに限定されない。
本発明の一具体例によれば、リジンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。
本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－リジンを回収するステップは、Ｌ－リジンを精製する工程を含むことができる。
本発明によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の発現を減少または弱化させることにより、オキサロアセテートのクエン酸転換を抑制してＬ－リジンの生産収率を向上させることができる。
本発明の一実施例により開始コドンがＡＴＧからＧＴＧに置換されたシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）ベクターの構造を示す図である。 本発明の一実施例により開始コドンがＡＴＧからＴＴＧに置換されたシトレート合成酵素ｇｌｔＡ遺伝子を含むｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｔ）ベクターの構造を示す図である。
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明により制限されるものではない。
実施例１．コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造
コリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造するために、コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ（ＨＩＴ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＨ６１８）を使用した。
前記コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株は、蒸留水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇおよびビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。
抗生剤（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用し、ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。
１－１．組換えベクターの作製
菌株にＴＣＡ回路を弱化させ、炭素源の効率性を増加させるために、シトレート合成酵素の弱化を導入した。本実施例で用いた方法は、シトレート合成酵素を暗号化しているｇｌｔＡ遺伝子の発現を減少するために、当該遺伝子の解読開始コドンに特異的変異を誘発した。ｇｌｔＡ遺伝子の解読開始コドンをＡＴＧからＧＴＧに変異を導入し、コリネバクテリウムグルタミクムゲノム上でｇｌｔＡ遺伝子の真ん中を中心に左アーム４７８ｂｐ部分と右アーム４７５ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］参照）にクローニングした。前記プラスミドをｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）と名付けた（図１参照）。前記プラスミドを作製るために、それぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表１のプライマーを使用した。
以上のプライマーを用いて、下記の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下で２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲの実施条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。
このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウムグルタミクム菌株の組換えに使用した。
前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法でｐＣＧＩベクターに挿入してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選別した。染色体の遺伝子塩基置換（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、それぞれ断片の遺伝子を個別増幅してオーバーラップＰＣＲで目的ＤＮＡ断片を製造した。遺伝子組換え時のＰＣＲ増幅酵素としてはＥｘ Ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用いており、各種制限酵素およびＤＮＡ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を使用し、供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。
１－２．変異株の製造
前記ｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｇ）ベクターを用いて、変異菌株であるＤＳ２菌株を製造した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように用意して、コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシンが２０μｇ／μｌ含まれるＣＭ－寒天プレートに塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適宜挿入されたかを、ＰＣＲおよび塩基配列の分析により確認した。このように分離された菌株を再度２次組換えを誘導するために、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）を含有したＣＭ－寒天液体培地に接種し、一晩以上培養して、同一濃度のストレプトマイシンを含有した寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終的に分離したコロニー中においてカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性がない菌株中においてｇｌｔＡ遺伝子に変異が導入されたかを、塩基配列の分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に変異ｇｌｔＡ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＤＳ２）を取得した。
実施例２．コリネバクテリウムグルタミクム変異株の製造
ｇｌｔＡ遺伝子の開始コドンをＴＴＧに置換したことを除けば、実施例１と同様の方法でコリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造した。
ここで、プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表２のプライマーを使用し、作製されたプラスミドｐＣＧＩ（ｇｌｔＡ－Ａ１Ｔ）ベクターを用いて変異菌株であるＤＳ２－１菌株を製造した。最終的に変異ｇｌｔＡ遺伝子が導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＤＳ２－１）を取得した。
実験例１．変異株のＬ－リジンの生産性の比較
親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株と、実施例１および２で製造されたリジン生産変異株であるＤＳ２菌株およびＤＳ２－１菌株のＬ－リジンの生産性を比較した。
下記表３のような組成を有するリジン培地１０ｍｌを含有した１００ｍｌのフラスコに、親菌株（ＤＳ１）または変異株（ＤＳ２またはＤＳ２－１）をそれぞれ接種し、３０℃で２８時間、１８０ｒｐｍの条件で振盪培養した。培養終了後、リジン分析はＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本）でＬ－リジンの生産量を測定し、その結果を下記表４に示した。
前記表４に示しているように、コリネバクテリウムグルタミクム変異株ＤＳ２とＤＳ２－１は、リジン生合成経路の強化のために、ｇｌｔＡ遺伝子が最適な翻訳開始配列（ＧＴＧまたはＴＴＧ）に置換されることにより、親菌株コリネバクテリウムグルタミクムＤＳ１菌株に比べてＬ－リジンの生産性が約６．９％増加したことが確認された。この結果を通して、ｇｌｔＡ遺伝子の発現弱化が代謝の炭素源の流れを減少させることにより、菌株のＬ－リジン生産能を向上させることが分かった。
これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれたものと解釈されなければならない。

Claims (5)

  1. シトレート合成酵素（ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が弱化してＬ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
  2. 前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＧＴＧに置換されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株。
  3. 前記シトレート合成酵素の活性の弱化は、シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子の開始コドンがＴＴＧに置換されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株。
  4. 前記シトレート合成酵素を暗号化する遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表されるものである、請求項２または３に記載のコリネバクテリウムグルタミクム変異株。
  5. ａ）請求項１に記載の変異株を培地で培養するステップと、
    ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リジンを回収するステップとを含むＬ－リジンの生産方法。
JP2023514804A 2020-09-03 2021-04-20 Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法 Pending JP2023540518A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20200112339 2020-09-03
KR10-2020-0112339 2020-09-03
KR1020210050318A KR20220030866A (ko) 2020-09-03 2021-04-19 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR10-2021-0050318 2021-04-19
PCT/KR2021/004965 WO2022050527A1 (ko) 2020-09-03 2021-04-20 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023540518A true JP2023540518A (ja) 2023-09-25

Family

ID=77050787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023514804A Pending JP2023540518A (ja) 2020-09-03 2021-04-20 Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230313244A1 (ja)
EP (1) EP3964572A1 (ja)
JP (1) JP2023540518A (ja)
CN (1) CN114134062A (ja)
WO (1) WO2022050527A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220064681A1 (en) * 2018-12-26 2022-03-03 Daesang Corporation E. coli variant strain or corynebacterium glutamicum variant strain producing l-amino acids, and method for producing l-amino acids using same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4201085A1 (de) * 1992-01-17 1993-07-22 Degussa Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit l-lysin ausscheidender coryneformer bakterien
DE102006032634A1 (de) * 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
KR100838038B1 (ko) 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
US20090215133A1 (en) * 2007-02-02 2009-08-27 Evonik Degussa Gmbh Production of l-lysine and l-lysine-containing feed additives
US8133714B2 (en) * 2007-09-27 2012-03-13 Evonik Degussa Gmbh Process for the fermentative preparation of organic chemical compounds using coryneform bacteria in which the SugR gene is present in attenuated form
BRPI0911770A2 (pt) * 2008-04-30 2015-08-04 Basf Se Método para produzir produtos químicos finos, microorganismo recombinante, uso do mesmo, e, método para preparar um composto
KR101512432B1 (ko) * 2010-06-15 2015-04-16 백광산업 주식회사 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법
CN105754922A (zh) * 2016-04-27 2016-07-13 齐鲁工业大学 一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌的构建方法
KR101915433B1 (ko) * 2018-02-13 2018-11-05 씨제이제일제당 (주) 시트레이트 신타아제 (Citrate synthase)의 활성이 약화된 변이형 폴리펩타이드 및 이를 이용한 L-아미노산 생산방법
KR102139806B1 (ko) 2020-02-13 2020-07-30 씨제이제일제당 (주) 변이형 LysE를 포함하는 미생물, 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법
CN112080534B (zh) * 2020-08-14 2022-03-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3964572A1 (en) 2022-03-09
WO2022050527A1 (ko) 2022-03-10
US20230313244A1 (en) 2023-10-05
CN114134062A (zh) 2022-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023540518A (ja) Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法
JP2024509290A (ja) Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法
JP7475408B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
EP4332229A1 (en) Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine using same
EP4083197A1 (en) Corynebacterium glutamicum mutant strain having enhanced l-lysine productivity and method of producing l-lysine using the same
KR20230084993A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
CN115261294B (zh) L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法
JP2024511329A (ja) Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシン生産方法
KR20230053351A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220030866A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220148694A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220126610A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220126609A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
JP2024014656A (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
JP2024511393A (ja) Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－シトルリンの生産方法
KR20220149219A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220149376A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
JP2024014657A (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
KR20220149379A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230302

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230302

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20240222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240304