CN112080534B - 高产l-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高产L‑氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌是通过弱化原始菌株中50S核糖体蛋白基因，获得的基因弱化菌株；其中，原始菌株为产L‑氨基酸的棒状细菌。本发明提供的高产L‑氨基酸的工程菌，具有较高的L‑氨基酸(特别是L‑赖氨酸)生产能力，且棒状细菌胞内的50S核糖体蛋白L35、50S核糖体蛋白L36或50S核糖体蛋白L21蛋白表达被弱化。实验表明，以本发明的高产L‑氨基酸的工程菌作为发酵菌种，其L‑赖氨酸产率和转化率显著提高，为L‑赖氨酸的工业化生产奠定了基础，应用前景广阔。

Description

高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-氨基酸，特别是L-赖氨酸等，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中L-赖氨酸约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。
棒杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是“一般认为安全”(GRAS,generally recognized as safe)的菌株，被广泛用于L-氨基酸生产中。特别是在L-赖氨酸的生产中，相比大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌的赖氨酸合成路径具有明显优势，其合成赖氨酸前体α,ε-二氨基庚二酸仅通过一步酶催化反应，即二氨基庚二酸脱氢酶催化完成，而大肠杆菌则需四步酶催化反应。
微生物发酵法生产L-氨基酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-氨基酸最主要的方法。近年来代谢工程改造已很大程度上提高了菌株性能，但依然有潜力继续提高产量和转化率。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用。
本发明的另一目的是提供发酵生产L-氨基酸的方法或提高L-氨基酸发酵产量的方法。
本发明构思如下：发明人经过长期研究和实践，偶然发现在棒杆菌的染色体中50S核糖体蛋白的基因的改造能够提高L-赖氨酸的产量。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供50S核糖体蛋白基因的活性和/或表达量降低或消失在棒状细菌发酵生产L-氨基酸中的应用。
第二方面，本发明提供一种发酵生产L-氨基酸的方法或提高L-氨基酸发酵产量的方法，包括：
(1)改造棒状细菌的50S核糖体蛋白基因，使该基因的活性和/或表达量降低或消失；
(2)用步骤(1)改造得到的细菌发酵生产L-氨基酸。
进一步地，步骤(1)中所述改造包括使棒状细菌的50S核糖体蛋白基因发生一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或增加。
进一步地，步骤(1)中所述改造包括对棒状细菌的50S核糖体蛋白基因进行敲除。
进一步地，步骤(1)中所述改造包括使棒状细菌的50S核糖体蛋白基因的表达调控序列发生改变。
进一步地，步骤(1)中所述改造包括将棒状细菌的50S核糖体蛋白基因的起始密码子由ATG替换成GTG。
第三方面，本发明提供一种高产L-氨基酸的工程菌，所述工程菌是通过弱化原始菌株中50S核糖体蛋白基因，获得的基因弱化菌株，或者所述工程菌是通过弱化原始菌株中50S核糖体蛋白基因，并弱化与L-氨基酸代谢途径相关的基因，获得的基因弱化菌株；或
增强上述基因弱化菌株中与L-氨基酸生物合成途径相关的基因和/或反馈抑制脱敏相关的基因，获得基因增强菌株。
本发明中，所述弱化包括敲除或降低基因的表达。
所述原始菌株为产L-氨基酸的棒状细菌。
本发明中，所述棒状细菌为棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)中的菌种。
优选谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)或产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)。
更优选地，所述原始菌株为保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
所述50S核糖体蛋白可选自L35、L36、L21中的至少一种。
优选地，所述50S核糖体蛋白基因可选自编码NCBI参考序列NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280的基因中的至少一种。
更优选地，基因NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQID NO:1、3和5所示。
本发明中，所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸，优选L-赖氨酸。
第四方面，本发明提供高产L-氨基酸的工程菌的构建方法，包括：利用基因工程手段弱化产L-氨基酸的棒状细菌中的50S核糖体蛋白基因。
优选地，弱化的方法包括但不限于诱变、定点突变、同源重组。
在本发明的一个具体实施方式中，高产L-氨基酸的工程菌的构建方法包括：以A1和A2、A3和A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板，分别扩增基因NCgl1325突变位点的上、下游片段；然后以上、下游片段混合物为模板，A1和A4为引物进行overlap PCR扩增得到NCgl1325基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl1325GTG重组质粒，将重组质粒导入保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒状杆菌中，筛选阳性转化子，命名为MHZ-1。
在本发明的另一个具体实施方式中，高产L-氨基酸的工程菌的构建方法包括：以B1和B2、B3和B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板，分别扩增基因NCgl2446a突变位点的上、下游片段；然后以上、下游片段混合物为模板，B1和B4为引物进行overlap PCR扩增得到NCgl2446a基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl2446aGTG重组质粒，将重组质粒导入保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒状杆菌中，筛选阳性转化子，命名为MHZ-2；
在本发明的另一个具体实施方式中，高产L-氨基酸的工程菌的构建方法包括：以C1和C2、C3和C4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板，分别扩增基因NCgl2280突变位点的上、下游片段；然后以上、下游片段混合物为模板，C1和C4为引物进行overlap PCR扩增得到NCgl2280基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl2280GTG重组质粒，将重组质粒导入保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒状杆菌中，筛选阳性转化子，命名为MHZ-3。
在本发明的另一个具体实施方式中，高产L-氨基酸的工程菌的构建方法包括：将pK18mobsacB-NCgl2446aGTG重组质粒导入MHZ-1中，筛选阳性转化子，命名为MHZ-4。
在本发明的另一个具体实施方式中，高产L-氨基酸的工程菌的构建方法包括：将pK18mobsacB-NCgl2280GTG重组质粒导入MHZ-4中，筛选阳性转化子，命名为MHZ-5。
A1～A4的引物序列分别如SEQ ID NO:7-10所示。B1～B4的引物序列分别如SEQ IDNO:11-14所示。C1～C4的引物序列分别如SEQ ID NO:15-18所示。
第五方面，本发明提供所述的工程菌或按照上述方法构建的工程菌在发酵生产L-氨基酸(特别是L-赖氨酸)中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的高产L-氨基酸的工程菌，具有较高的L-氨基酸(特别是L-赖氨酸)生产能力，且棒状细菌胞内的50S核糖体蛋白L35、50S核糖体蛋白L36或50S核糖体蛋白L21表达蛋白失活或弱化。实验表明，以本发明的高产L-氨基酸的工程菌作为发酵菌种，其L-赖氨酸产率和转化率显著提高，为L-赖氨酸的工业化生产奠定了基础，应用前景广阔。此外，该方法与现有改造的大量高产L-天冬氨酸家族氨基酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高效果，从而在实践上可用于多种细菌发酵生产L-氨基酸。
附图说明
图1为本发明重组质粒pK18mobsacB-NCgl1325GTG的简化结构示意图。
图2为本发明重组质粒pK18mobsacB-NCgl2446aGTG的简化结构示意图。
图3为本发明重组质粒pK18mobsacB-NCgl2280GTG的简化结构示意图。
具体实施方式
本发明提供一种高产L-氨基酸的棒状细菌，具有L-氨基酸生产能力，且其细胞内NCgl1325基因和/或NCgl2446a基因和/或NCgl2280基因表达蛋白弱化或失活。
本发明中，所述基因失活或弱化方式改造，不限于点突变，敲除或启动子改变等方式。术语“改造”是指相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但不限于诱变、定点突变或同源重组，优选定点突变或同源重组。改造位于染色体上的基因使得该基因的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，例如可以在该基因中插入无义密码子，也可以敲除该基因。也可以通过改造该基因的调控序列来间接改造该基因，从而使其编码的蛋白质的活性和/或表达量降低。
本发明中，具有L-赖氨酸产率的微生物可选自由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC11001，中所述棒状细菌是指属于棒状杆菌属或短杆菌属的微生物。可用于本发明的棒状细菌的实例包括但不限于谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和产氨棒杆菌。
发明人偶然发现降低NCgl1325、NCgl2446a和NCgl2280基因表达蛋白可以提高L-赖氨酸的产量，并且现无人针对这几个基因进行研究改造，本发明人做了大量的实验研究，偶然发现在产L-赖氨酸菌株中弱化或敲除这些几个基因在不同程度上都能提高L-赖氨酸的产量。
本发明中，NCBI参考序列NCgl1325基因表达蛋白是50S核糖体蛋白L35，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。50S核糖体蛋白L35表达被弱化后(即，其活性和/或表达量消失)，L-天冬氨酸含量增加，L-赖氨酸，L-苏氨酸的产量提高。因此，本发明中，50S核糖体蛋白L35的活性和/或表达量优选降低。
本发明中，NCBI参考序列NCgl2446a基因表达蛋白是50S核糖体蛋白L36，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。50S核糖体蛋白L36被弱化后(即，其活性和/或表达量消失)，L-天冬氨酸含量增加，L-赖氨酸，L-苏氨酸的产量提高。因此，本发明中，50S核糖体蛋白L36的活性和/或表达量优选降低。
本发明中，NCBI参考序列NCgl2280基因表达蛋白是50S核糖体蛋白L21，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。50S核糖体蛋白L21表达被弱化后(即，其活性和/或表达量消失)，L-天冬氨酸含量增加，L-赖氨酸，L-苏氨酸的产量提高。因此，本发明中，50S核糖体蛋白L21的活性和/或表达量优选降低。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变50S核糖体蛋白L35的NCgl1325基因的起始密码子由ATG弱化成GTG，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内50S核糖体蛋白L35活性降低，命名为MHZ-1。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变50S核糖体蛋白L36的NCgl2446a基因的起始密码子由ATG弱化成GTG，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内50S核糖体蛋白L36活性降低，命名为MHZ-2。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变50S核糖体蛋白L21的NCgl2280基因的起始密码子由ATG弱化成GTG，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内50S核糖体蛋白L21活性降低，命名为MHZ-3。
本发明还提供了所述高产赖氨酸的棒状细菌的构建方法，制备关键酶的编码基因的基因片段缺失，与载体连接获得重组载体，转化棒状细菌获得高产赖氨酸的棒状细菌。
本发明中，所述载体为pK18mobsacB载体。
本发明中，改造优选是通过同源重组进行的改造，更优选是通过同源重组进行的敲除。
在一些实施方案中，高产L-赖氨酸的棒状细菌的构建方法中使用的棒状细菌为保藏编号为CGMCC No.11942的谷氨酸棒状杆菌，参见CN105734004B。该菌株具有产L-赖氨酸的能力，并且未对NCgl1325基因、NCgl2446a基因和NCgl2280基因进行优化改造。本领域技术人员可以按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)制备CGMCCNo.11942感受态细胞。
本发明中，制备NCgl1325基因起始密码子由ATG弱化成GTG重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增NCgl1325基因突变位点上、下游片段，以上、下游片段混合物为模板，利用引物组A1/A4进行overlapPCR扩增得到NCgl1325基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl1325GTG重组质粒。
本发明中，制备NCgl2446a基因起始密码子由ATG弱化成GTG重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增NCgl2446a基因突变位点上、下游片段，以上、下游片段混合物为模板，利用引物组A1/A4进行overlap PCR扩增得到NCgl2446a基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl2446aGTG重组质粒。
本发明中，制备NCgl2280基因起始密码子由ATG弱化成GTG重组载体的方法具体为以C1/C2、C3/C4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增NCgl2280基因突变位点上、下游片段，以上、下游片段混合物为模板，利用引物组A1/A4进行overlapPCR扩增得NCgl2280基因突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-NCgl2280GTG重组质粒。
A1～A4的引物序列分别如SEQ ID NO:7-10所示。B1～B4的引物序列分别如SEQ IDNO:11-14所示。C1～C4的引物序列分别如SEQ ID NO:15-18所示。
利用本发明构建的谷氨酸棒杆菌工程菌进行发酵生产，能够实现发酵过程中L-氨基酸的有效积累，且具有较高的转化率。因此本发明还提供了所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。
进一步地，本发明还提供一种L-赖氨酸的生产方法，将上述高产赖氨酸的棒状细菌接种发酵培养基发酵培养。
本发明中使用的发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 30g/L，pH7.0。
优选地，发酵培养条件为：33℃、200rpm恒温振荡培养15h。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的pK18mobsacB载体为通用载体，由中国科学院微生物研究所惠赠。
实施例1 重组质粒pK18mobsacB-NCgl1325GTG，pK18mobsacB-NCgl2446aGTG，pK18mobsacB-NCgl2280GTG的构建
在GenBank数据库中获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032 NCgl1325基因的核苷酸序列，设计在特定位置(该基因起始密码子)引入碱基突变以使NCgl1325基因表达量降低，基于碱基序列及所选缺失位置合成了四条引物(表1)。以ATCC 13032基因组为模板，分别以A1/A2，A3/A4作为引物进行PCR扩增，获得上、下游同源臂片段，以两个片段混合物为模板，利用引物组A1/A4进行PCR扩增得到全长片段，用EcoRI/BamHI进行消化，同时将pK18mobsacB利用EcoRI/BamHI进行消化，并用T4DNA连接酶将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞，获得重组质粒pK18mobsacB-NCgl1325GTG重组质粒。
pK18mobsacB-NCgl2446aGTG质粒构建与上述类似，所用引物为B1/B2，B3/B4PCR扩增上、下游同源臂片段，B1/B4引物PCR扩增得到全长产物，内切消化酶为BamHI/HindIII，最终获得pK18mobsacB-NCgl2446aGTG重组质粒。
pK18mobsacB-NCgl2280GTG质粒构建与上述类似，所用引物为C1/C2，C3/C4 PCR扩增上、下游同源臂片段，C1/C4引物PCR扩增得到全长产物，内切消化酶为BamHI/HindIII,最终获得pK18mobsacB-NCgl2280GTG重组质粒。
重组质粒pK18mobsacB-NCgl1325GTG、pK18mobsacB-NCgl2446aGTG、pK18mobsacB-NCgl2280GTG的简化结构示意图分别见图1～图3。
实施例2 50S核糖体蛋白L35弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法制备CGMCC No.11942感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-NCgl1325GTG以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床200rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-1。
实施例3 50S核糖体蛋白L36弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法制备CGMCC No.11942感受态细胞重组质粒pK18mobsacB-NCgl2446aGTG以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床200rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-2。
实施例4 50S核糖体蛋白L21弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法制备CGMCC No.11942感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-NCgl2280GTG以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床200rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-3。
实施例5 50S核糖体蛋白L35和50S核糖体蛋白L36同时弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法制备MHZ-1感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-NCgl2446aGTG以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床200rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-4。
实施例6 50S核糖体蛋白L35、50S核糖体蛋白L36和50S核糖体蛋白L21同时弱化菌株的构建
按照谷棒经典方法制备MHZ-4感受态细胞。重组质粒pK18mobsacB-NCgl2280GTG以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化子，其中感兴趣的基因由于同源性被插入到染色体中。将筛得的转化子过夜培养于普通液体脑心浸液培养基中，培养温度为33℃，回转摇床200rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2连续稀释至10-4)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通固体脑心浸液培养基上，33℃静置培养48h。蔗糖培养基上长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过PCR扩增目的序列，和核苷酸测序分析，获得目的突变菌株，并命名为MHZ-5。
实施例7 L-氨基酸的发酵生产
将实施例2～6中构建的基因工程菌株于500ml三角摇瓶中进行发酵培养(装液量20ml，接种量20％v/v，种子液OD562为10)，培养温度33℃，培养时间14-15小时，每组实验设置三个平行。所述发酵培养基组分如下：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉10g/L，CaCO3 30g/L，NaOH调pH7.0。各基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果见表1。
表1基因工程菌株发酵产L-赖氨酸结果
Figure BDA0002634474650000091
由表1可知，弱化NCgl1325基因，与对照组相比，可提高L-赖氨酸产量，具有显著差异(P＜0.05)。说明50S核糖体蛋白L35表达降低，有助于提高L-赖氨酸产量。
弱化NCgl2446a基因，使50S核糖体蛋白L36表达降低，可提高L-赖氨酸产量，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)。说明降低该蛋白的表达有助于提高L-赖氨酸产量。
弱化NCgl2280基因，与对照组相比，可提高L-赖氨酸产量，具有显著差异(P＜0.05)。说明50S核糖体蛋白L21表达降低，有助于提高L-赖氨酸产量。
同时弱化NCgl1325和NCgl2446a基因，使50S核糖体蛋白L35和50S核糖体蛋白L36表达降低，可大幅度提高L-赖氨酸产量，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)，说明两个基因同时弱化叠加有协同效应，可很大程度提高L-赖氨酸发酵产量。
同时弱化NCgl1325、NCgl2446a和NCgl2280三个基因，使50S核糖体蛋白L35、50S核糖体蛋白L36和50S核糖体蛋白L21表达降低，可最大程度提高L-赖氨酸产量，与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)，说明三个基因同时弱化叠加有协同效应，可最大程度提高L-赖氨酸发酵产量。
综上所述，在棒杆菌中下调NCgl1325和/或NCgl2446a和/或NCgl2280基因的表达，都有助于L-赖氨酸产量的提高，其中同时下调NCgl1325、NCgl2446a和NCgl2280三个基因表达，L-赖氨酸产量得以最大提高，可以应用于产L-赖氨酸的生产菌中，应用前景广阔。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司
<120> 高产L-氨基酸的工程菌及其构建方法与应用
<130> KHP201114541.9
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 64
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
Met Lys Asn Lys Thr His Lys Gly Thr Ala Lys Arg Val Lys Val Thr
1 5 10 15
Gly Ser Gly Lys Leu Val Arg Glu Gln Ala Asn Arg Arg His Leu Leu
20 25 30
Glu Gly Lys Ser Ser Thr Arg Thr Arg Arg Leu Lys Gly Ile Val Glu
35 40 45
Val Asp Lys Ala Asp Thr Lys Arg Met Lys Arg Leu Leu Gly Lys Ala
50 55 60
<210> 2
<211> 195
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
atgaagaaca agacccacaa gggcaccgca aagcgcgtta aggtgactgg ctccggcaag 60
ctcgttcgcg agcaggcaaa ccgccgccac cttctcgagg gcaagtcatc tacccgcact 120
cgtcgcctga agggcatcgt tgaggttgac aaggccgaca ccaagcgcat gaagcgcctg 180
ctcggcaagg cttaa 195
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 3
Met Lys Val Arg Asn Ser Leu Arg Ser Leu Lys Asn Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Gln Val Val Arg Arg Arg Gly Lys Val Tyr Val Ile Asn Lys Lys Glu
20 25 30
Pro Arg Phe Lys Ala Arg Gln Gly
35 40
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
atgaaggtac gcaattccct tcggtcgctg aagaacaagc cgggcgccca ggtcgtgcgt 60
cgccgtggca aagtctacgt gatcaacaag aaagagccac gtttcaaggc tcgccagggt 120
taa 123
<210> 5
<211> 101
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 5
Met Tyr Ala Ile Val Lys Thr Gly Gly Lys Gln Tyr Lys Val Ala Glu
1 5 10 15
Gly Asp Leu Val Lys Val Glu Lys Ile Glu Gly Glu Pro Gly Ala Ser
20 25 30
Val Ala Leu Thr Pro Val Leu Leu Val Asp Gly Ala Asp Val Thr Thr
35 40 45
Ala Ala Asp Lys Leu Ala Ser Val Ser Val Asn Thr Glu Ile Val Glu
50 55 60
His Thr Lys Gly Pro Lys Ile Lys Ile Leu Lys Tyr Lys Asn Lys Thr
65 70 75 80
Gly Tyr Lys Lys Arg Gln Gly His Arg Gln Pro Leu Thr Val Leu Lys
85 90 95
Val Thr Gly Ile Lys
100
<210> 6
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtacgcga tcgtcaagac cggcggaaag cagtacaagg ttgccgaagg tgacctcgtt 60
aaggtcgaga agatcgaggg tgagccgggt gcatccgtgg ctctcacccc ggttctgctc 120
gtcgatggcg ccgatgtaac caccgccgct gacaagctcg cttctgtgag cgtcaacacc 180
gagatcgtcg agcacaccaa gggcccgaag atcaagatcc tgaagtacaa gaacaagacc 240
ggatacaaga agcgccaggg acaccgtcag cccctgaccg ttctgaaggt aaccggaatc 300
aagtaa 306
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaattcccg caagctcgca ttcgac 26
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaagttgtc cttaaaccct 20
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggtttaag gacaactttc gtgaagaaca agacccacaa 40
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggatccac agcttacgga actcgc 26
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggaattcata cgtaattaca ttcatgt 27
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgaaggtac gcaattccct 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggaattgcg taccttcact cgggcgctcc tttctctcat 40
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cacaagctta actgcgtaga agacataat 29
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaggatcccc tgcggaaacc tgctgacc 28
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtgtacgcga tcgtcaagac 20
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcttgacgat cgcgtacaca gagggctacc ccttatctga 40
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacaagcttg aagcagcacc agaacaggt 29

Claims (5)

1.一种提高L-赖氨酸发酵产量的方法，包括：
(1)改造棒状细菌的50S核糖体蛋白基因，使该基因的表达量降低；
(2)用步骤(1)改造得到的细菌发酵生产L-赖氨酸；
步骤(1)中所述改造是将棒状细菌的50S核糖体蛋白基因的起始密码子由ATG替换成GTG；
所述50S核糖体蛋白基因为基因NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280中的至少一种；基因NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、3和5所示；
所述棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌的保藏编号为CGMCCNo.11942。
3.高产L-赖氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过弱化原始菌株中50S核糖体蛋白基因，获得的基因弱化菌株；
弱化方法是将棒状细菌的50S核糖体蛋白基因的起始密码子由ATG替换成GTG；
所述50S核糖体蛋白基因为基因NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280中的至少一种；基因NCgl1325、NCgl2446a、NCgl2280编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、3和5所示；
所述棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。
4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌的保藏编号为CGMCC No.11942。
5.权利要求3或4所述的工程菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230313244A1 (en) * 2020-09-03 2023-10-05 Daesang Corporation Corynebacterium glutamicum mutant strain having enhanced l-lysine productivity and method of producing l-lysine using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146772A (zh) * 2013-02-08 2013-06-12 宁夏伊品生物科技股份有限公司 用乌头酸酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产l-赖氨酸的方法
CN110951662A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020119549A1 (en) * 2001-02-16 2002-08-29 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the RPSL gene
US7723097B2 (en) * 2005-03-11 2010-05-25 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains that over-produce L-threonine and processes for their production

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146772A (zh) * 2013-02-08 2013-06-12 宁夏伊品生物科技股份有限公司 用乌头酸酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产l-赖氨酸的方法
CN110951662A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolating promoters from Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 and application in CoA synthesis.;Yingshuo Hou;《BMC Biotechnol.》;20191112;第19卷(第1期);全文 *
Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-theronine;X. Dong;《Biotechnology Advances》;20100803;全文 *
大肠杆菌核糖体蛋白质L24基因_rplX_的一个新的点突变;李沐阳;《科学通报》;19931127;全文 *

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