CN117165546A

CN117165546A - 提高l-氨基酸发酵产量的方法

Info

Publication number: CN117165546A
Application number: CN202111115579.2A
Authority: CN
Inventors: 张晓云; 吴涛; 栾明月; 薛婷莉; 李鑫磊; 李岩; 赵津津
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本发明提供一种提高L‑氨基酸发酵产量的方法，丙酮酸脱氢酶和支链氨基酸转氨酶在提高L‑氨基酸发酵产量方面至关重要，通过对两种酶进行改造，并以谷氨酸棒状杆菌MHZ‑1200‑5为出发菌验证aceE^P910S突变体、aceE^{del‑1517‑1524}突变体和ilvE^F203E突变体对亮氨酸产量的影响。结果表明，aceE^P910S突变体、aceE^{del‑1517‑1524}突变体和/或ilvE^F203E突变体使得亮氨酸的产量大幅提高，获得一株L‑亮氨酸高产的菌株，该菌株能够实现发酵过程中L‑亮氨酸的高效积累，L‑亮氨酸可达10.3g/L，较出发菌提高1.4倍。本发明为提高L‑氨基酸发酵产量提供有力工具。

Description

提高L-氨基酸发酵产量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种提高L-氨基酸发酵产量的方法。

背景技术

丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDHC)是一组限速酶，在谷氨酸棒杆菌中，PDHC催化糖酵解过程产生的丙酮酸不可逆地氧化脱羧转化成乙酰辅酶A，将糖的有氧氧化与三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，是三羧酸循环的关键酶。PDHC由丙酮酸脱氢酶(E1p)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2p)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3p)组成。其中，E1p酶由aceE基因编码。已有文献报道弱化AceE的表达可以提高棒杆菌L-氨基酸的产量。

支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化酮酸氨化生成支链氨基酸，是支链氨基酸共有的最后一步催化酶。

丙酮酸脱氢酶和支链氨基酸转氨酶在提高L-氨基酸发酵产量方面至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高L-氨基酸发酵产量的方法。

本发明的另一目的是提供新型的丙酮酸脱氢酶突变体、支链氨基酸转氨酶突变体以及编码该突变体的核酸分子、含有该核酸分子的生物材料。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种丙酮酸脱氢酶突变体(aceE^P910S突变体)，所述突变体包含丙酮酸脱氢酶第910位氨基酸由P到S突变位点。

丙酮酸脱氢酶(由aceE基因编码)在NCBI上的参考序列编号为WP_011014985.1。

第二方面，本发明提供支链氨基酸转氨酶突变体(ilvE^F203E突变体)，所述突变体包含支链氨基酸转氨酶第203位氨基酸由F到E突变位点。

支链氨基酸转氨酶(由ilvE基因编码)在NCBI上的参考序列编号为SJM46313.1。

第三方面，本发明提供编码所述丙酮酸脱氢酶突变体或所述支链氨基酸转氨酶突变体的核酸分子。

第四方面，本发明提供一种aceE基因突变体(aceE^{del-1517-1524}突变体)，所述突变体为aceE基因的第1517-1524bp缺失形成的突变体。

第五方面，本发明提供含有所述核酸分子或所述aceE基因突变体的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

第六方面，本发明提供所述核酸分子、或所述aceE基因突变体、或含有所述核酸分子或所述aceE基因突变体的生物材料的以下任一应用：

(1)用于L-氨基酸的发酵生产；

(2)用于提高L-氨基酸的发酵产量；

(3)用于构建产L-氨基酸的基因工程菌。

所述L-氨基酸包括但不限于L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸；优选L-亮氨酸。

第七方面，本发明提供产L-氨基酸的基因工程菌，所述工程菌是利用基因工程手段，在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入如下突变①～③中的至少一种得到的：

①引入的突变导致aceE基因编码的丙酮酸脱氢酶的第910位氨基酸由P突变为S；

②引入的突变导致aceE基因第1517-1524bp缺失；

③引入的突变导致ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶的第203位氨基酸由F突变为E。

优选地，在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入突变①和③；或者，在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入突变②和③。

优选地，所述具有L-氨基酸生产能力的微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，优选保藏编号为CGMCC NO.13408的谷氨酸棒杆菌MHZ-1200-5。菌株MHZ-1200-5已在中国专利ZL201611248621.7中公开。

第八方面，本发明提供所述基因工程菌在发酵生产L-氨基酸或提高L-氨基酸发酵产量中的应用。

第九方面，本发明提供一种提高L-氨基酸发酵产量的方法，利用所述基因工程菌发酵生产L-氨基酸。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明以谷氨酸棒状杆菌MHZ-1200-5为出发菌验证aceE^P910S突变体、aceE^del ^-1517-1524突变体和ilvE^F203E突变体对亮氨酸产量的影响。结果表明，aceE^P910S突变体、aceE^del ^-1517-1524突变体和/或ilvE^F203E突变体使得亮氨酸的产量大幅提高，并获得一株L-亮氨酸高产的菌株MHZ-1200-10，该菌株能够实现发酵过程中L-亮氨酸的高效积累，L-亮氨酸可达10.3g/L，较出发菌提高1.4倍。

具体实施方式

本发明提供一种新型的丙酮酸脱氢酶突变体，含有该突变体的宿主细胞，以及利用含有该突变体的宿主细胞生产L-亮氨酸的方法。

所述丙酮酸脱氢酶突变体，其910位氨基酸由脯氨酸(P)突变为丝氨酸(S)，蛋白序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种新型的aceE基因突变体，其第1517-1524bp碱基缺失，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种新型的支链氨基酸转氨酶突变体，其第203位氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为谷氨酸(E)，蛋白序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供一种利用含有上述突变体的菌株生产L-氨基酸的方法。

优选地，所述L-氨基酸包括但不限于L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸；更优选地，所述L-氨基酸为L-亮氨酸。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示：

表1引物序列信息

实施例1构建含aceE^{del-1517-1524}突变体的菌株

菌株构建：以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-aceE1-1f/PL-aceE1-1r进行扩增，获得上同源臂aceE1-up；以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-aceE1-2f/PL-aceE1-2r进行扩增，获得下同源臂aceE1-down；以aceE1-up和aceE1-down的混合物为模板，利用引物对PL-aceE1-1f/PL-aceE1-2r进行扩增获得aceE^{del-1517-1524}突变目的片段。aceE^{del-1517-1524}突变目的片段与pK18mobsacB载体用XbaI、SalI进行双酶切。将两个酶切产物以T4 DNA Ligase连接1h，连接产物转化Trans1 T1感受态细胞，得到重组质粒pK18mobsacB-aceE^{del-1517-1524}。将测序正确的重组质粒电转入菌株MHZ-1200-5的感受态细胞中，进过两轮筛选得到含aceE^{del-1517-1524}突变体的改造菌，取代的适当性主要通过在对应于修饰序列(PL-aceE1-ID-F/PL-aceE1-2r)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用引物PL-aceE1-F和PL-aceE1-R分析修饰的序列，以二次确认取代位点的准确性，并命名为MHZ-1200-6。

摇瓶发酵：将获得的MHZ-1200-6在脑心浸液固体培养基上活化，33℃培养16-20h；将菌体从平板上刮下一环，接种于30mL的种子培养基中(葡萄糖20g/L、尿素5g/L、酵母粉10g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、豆粕水解液10g/L、乙酸钾5g/L，HCl调pH4.0)，33℃转速110rpm培养5-8h，OD₅₆₂控制在1；2mL种子液转接到20mL的发酵培养基(葡萄糖60g/L、(NH₄)₂SO₄25g/L、KH₂PO₄ 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L、豆粕水解液10g/L、CaCO₃ 30g/L、乙酸钾5g/L，NaOH调pH7.0)，往复摇床33℃、110rpm发酵培养直至残糖耗尽，测定MHZ-1200-6发酵结束后L-亮氨酸的产量，结果见表2。

表2含aceE^{del-1517-1524}突变体菌株L-亮氨酸的发酵产量

组别	菌株	OD₅₆₂	L-亮氨酸(g/L)	缬氨酸(g/L)	赖氨酸(g/L)
						对照组	MHZ-1200-5	49.7	4.5	1.2	0.2
实验组	MHZ-1200-6	38.3	6.1	1.5	0.3

由表2可知，敲除aceE基因第1517-1524bp并在培养基回补乙酸，菌株可正常生长，但较对照菌组生长较慢。L-亮氨酸的产量为6.1g/L，较出发菌提高35.5％，同时副产物L-缬氨酸和L-赖氨酸的含量分别提高25％和50％；表明通过敲除8bp碱基失活aceE基因的方式可增加前体丙酮酸的积累，有利于提高丙酮酸衍生的L-氨基酸的产量。

实施例2构建含aceE^P910S突变体的菌株及摇瓶验证

以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-aceE2-1f/PL-aceE2-1r进行扩增，获得上同源臂aceE2-up；以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-aceE2-2f/PL-aceE2-2r进行扩增，获得下同源臂aceE2-down；以aceE2-up和aceE2-down的混合物为模板，利用引物对PL-aceE2-1f/PL-aceE2-2r进行扩增获得aceE^P910S突变目的片段。aceE^P910S突变目的片段与pK18mobsacB载体用XbaI、SalI进行双酶切。将两个酶切产物以T4DNA Ligase连接1h，连接产物转化Trans1 T1感受态细胞，得到重组质粒pK18mobsacB-aceE^P910S。将测序正确的重组质粒电转入菌株MHZ-1200-5的感受态细胞中，进过两轮筛选得到含aceE^P910S突变体的改造菌，取代的适当性主要通过在对应于修饰序列(PL-aceE2-ID-F/PL-aceE2-2r)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用引物PL-aceE2-F和PL-aceE2-R分析修饰的序列，以二次确认取代位点的准确性，并命名为MHZ-1200-7。

按照实施例1(种子培养基和发酵培养基中不添加乙酸钾)对菌株MHZ-1200-7进行摇瓶发酵，L-亮氨酸的产量见表3。

表3含aceE^P910S突变体菌株L-亮氨酸的发酵产量

组别	菌株	OD₅₆₂	L-亮氨酸(g/L)	缬氨酸	赖氨酸
						对照组	MHZ-1200-5	47.8	4.4	1.1	0.17
实验组	MHZ-1200-7	44.7	6.9	1.5	0.26

由表3可知，aceE^P910S突变体对菌株的生长造成一定的影响，但有利于生产L-亮氨酸。MHZ-1200-7菌株的L-亮氨酸的产量为6.9g/L，较出发菌MHZ-1200-5提高了56.8％，同时副产物L-缬氨酸和L-赖氨酸的含量分别提高36％和53％表明aceE^P910S突变体对aceE基因有一定的弱化作用，增加了丙酮酸的供应，为L-亮氨酸以及丙酮酸衍生相关的氨基酸的合成提供了便利条件。

实施例3构建含ilvE^F203E突变体的菌株及摇瓶验证

菌株构建：以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-ilvE-1f/PL-ilvE-1r进行扩增，获得上同源臂ilvE-up；以菌株MHZ-1200-5的基因组为模板，利用引物对PL-ilvE-2f/PL-ilvE-2r进行扩增，获得下同源臂ilvE-down；以ilvE-up和ilvE-down的混合物为模板，用引物对PL-ilvE-1f/PL-ilvE-2r进行融合PCR，获得ilvE^F203E突变目的条带。ilvE^F203E突变目的条带与pK18-mob-sacB载体用XbaI和SalI进行双酶切。将两个酶切产物以T4 DNA Ligase连接1h，连接产物转化Trans1 T1感受态细胞，得到重组质粒pK18mobsacB-ilvE^F203E。将测序正确的重组质粒电转入菌株MHZ-1200-5的感受态细胞中，进过两轮筛选得到含ilvE^F203E突变体的改造菌，取代的适当性主要通过在对应于修饰序列(PL-ilvE-ID-F/PL-ilvE-2r)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用引物PL-ilvE-F和PL-ilvE-R分析修饰的序列，以二次确认取代的适当性，并命名为MHZ-1200-8。

摇瓶验证：按照实施例1(种子培养基和发酵培养基中不添加乙酸钾)对菌株MHZ-1200-8进行摇瓶发酵，L-亮氨酸的产量见表4。

表4含ilvE^F203E突变体菌株L-亮氨酸的生产

组别	菌株	OD₅₆₂	L-亮氨酸(g/L)	缬氨酸	异亮氨酸
						对照组	MHZ-1200-5	47.1	4.7	1.2	0.18
实验组	MHZ-1200-8	52.3	5.8	1.6	0.25

由表4可知，ilvE^F203E突变体实现了L-亮氨酸产量的提高，相较出发菌MHZ-1200-5，MHZ-1200-8菌株产酸5.8g/L，提高了23.4％。同时副产物缬氨酸和异亮氨酸分别提升33％和39％。表明ilvE^F203E突变体加速了酮酸的胺化，有助于L-亮氨酸及L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成。

实施例4ilvE^F203E突变体叠加至aceE突变体及摇瓶验证

将重组质粒pK18mobsacB-ilvE^F203E电转至菌株MHZ-1200-6和MHZ-1200-7的感受态中，并按照实施案例3的方式筛选获得测序正确的重组菌株，分别命名为菌株MHZ-1200-9和MHZ-1200-10。然后分别按照实施例1的摇瓶验证方式对两株菌株进行性能验证。发酵结束后L-亮氨酸的产量如表5所示。

表5 ilvE和aceE双突变的菌株L-亮氨酸的生产

由表5可知，ilvE^F203E突变与aceE^{del-1517-1524}突变叠加菌株MHZ-1200-9的L-亮氨酸的产量为8.6g/L较菌株MHZ-1200-6提高45.7％；ilvE^F203E突变与aceE^P910S突变叠加菌株MHZ-1200-10的L-亮氨酸的产量为10.3g/L，较菌株MHZ-1200-7提高45.1％。表明ilvE突变体和aceE突变体叠加效果更显著，同时有利于提高L-异亮氨酸和L-缬氨酸的产量。

综上，利用aceE^{del-1517-1524}突变、aceE^P910S突变和ilvE^F203E对菌株进行改造，有助于增加支链氨基酸特别是L-亮氨酸的产量，分别提高35.5％、56.8％和23.4％，其中含aceE^P910S和ilvE^F203E双突变体的菌株MHZ-1200-10L-亮氨酸的产量最高，产酸10.3g/L，较出发菌MHZ-1200-5产酸提高了1.4倍。可见，这些突变体在L-亮氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 胡丹

<120> 提高L-氨基酸发酵产量的方法

<130> KHP211121305.6

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2769

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

atggccgatc aagcaaaact tggtggtaag ccctcggatg actctaactt cgcgatgatc 60

cgcgatggcg tggcatctta tttgaacgac tcagatccgg aggagaccaa cgagtggatg 120

gattcactcg acggattact ccaggagtct tctccagaac gtgctcgtta cctcatgctt 180

cgtttgcttg agcgtgcatc tgcaaagcgc gtatctcttc ccccaatgac gtcaaccgac 240

tacgtcaaca ccattccaac ctctatggaa cctgaattcc caggcgatga ggaaatggag 300

aagcgttacc gtcgttggat tcgctggaac gcagccatca tggttcaccg cgctcagcga 360

ccaggcatcg gcgtcggcgg acacatttcc acttacgcag gcgcagcccc tctgtacgaa 420

gttggcttca accacttctt ccgcggcaag gatcacccag gcggcggcga ccagatcttc 480

ttccagggcc acgcatcacc aggtatgtac gcacgtgcat tcatggaggg tcgcctttct 540

gaagacgatc tcgatggctt ccgtcaggaa gtttcccgtg agcagggtgg cattccgtcc 600

taccctcacc cacacggtat gaaggacttc tgggagttcc caactgtgtc catgggtctt 660

ggcccaatgg atgccattta ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc 720

aaggacacct ctgaccagca cgtctgggcc ttccttggcg acggcgaaat ggacgagcca 780

gaatcacgtg gtctcatcca gcaggctgca ctgaacaacc tggacaacct gaccttcgtg 840

gttaactgca acctgcagcg tctcgacgga cctgtccgcg gtaacaccaa gatcatccag 900

gaactcgagt ccttcttccg tggcgcaggc tggtctgtga tcaaggttgt ttggggtcgc 960

gagtgggatg aacttctgga gaaggaccag gatggtgcac ttgttgagat catgaacaac 1020

acctccgatg gtgactacca gaccttcaag gctaacgacg gcgcatatgt tcgtgagcac 1080

ttcttcggac gtgacccacg caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc 1140

tggaagctgc cacgtggcgg ccacgattac cgcaaggttt acgcagccta caagcgagct 1200

cttgagacca aggatcgccc aaccgtcatc cttgctcaca ccattaaggg ctacggactc 1260

ggccacaact tcgaaggccg taacgcaacc caccagatga agaagctgac gcttgatgat 1320

ctgaagttgt tccgcgacaa gcagggcatc ccaatcaccg atgagcagct ggagaaggat 1380

ccttaccttc ctccttacta ccacccaggt gaagacgctc ctgaaatcaa gtacatgaag 1440

gaacgtcgcg cagcgctcgg tggctacctg ccagagcgtc gtgagaacta cgatccaatt 1500

caggttccac cactggataa gcttcgctct gtccgtaagg gctccggcaa gcagcagatc 1560

gctaccacta tggcgactgt tcgtaccttc aaggaactga tgcgcgataa gggcttggct 1620

gatcgccttg tcccaatcat tcctgatgag gcacgtacct tcggtcttga ctcttggttc 1680

ccaaccttga agatctacaa cccgcacggt cagaactacg tgcctgttga ccacgacctg 1740

atgctctcct accgtgaggc acctgaagga cagatcctgc acgaaggcat caacgaggct 1800

ggttccgtgg catcgttcat cgctgcgggt acctcctacg ccacccacgg caaggccatg 1860

attccgctgt acatcttcta ctcgatgttc ggattccagc gcaccggtga ctccatctgg 1920

gcagcagccg atcagatggc acgtggcttc ctcttgggcg ctaccgcagg tcgcaccacc 1980

ctgaccggtg aaggcctcca gcacatggat ggacactccc ctgtcttggc ttccaccaac 2040

gagggtgtcg agacctacga cccatccttt gcgtacgaga tcgcacacct ggttcaccgt 2100

ggcatcgacc gcatgtacgg cccaggcaag ggtgaagatg ttatctacta catcaccatc 2160

tacaacgagc caaccccaca gccagctgag ccagaaggac tggacgtaga aggcctgcac 2220

aagggcatct acctctactc ccgcggtgaa ggcaccggcc atgaggcaaa catcttggct 2280

tccggtgttg gtatgcagtg ggctctcaag gctgcatcca tccttgaggc tgactacgga 2340

gttcgtgcca acatttactc cgctacttct tgggttaact tggctcgcga tggcgctgct 2400

cgtaacaagg cacagctgcg caacccaggt gcagatgctg gcgaggcatt cgtaaccacc 2460

cagctgaagc agacctccgg cccatacgtt gcagtgtctg acttctccac tgatctgcca 2520

aaccagatcc gtgaatgggt cccaggcgac tacaccgttc tcggtgcaga tggcttcggt 2580

ttctctgata cccgcccagc tgctcgtcgc ttcttcaaca tcgacgctga gtccattgtt 2640

gttgcagtgc tgaactccct ggcacgcgaa ggcaagatcg acgtctccgt tgctgctcag 2700

gctgctgaga agttcaagtt ggatgatagt acgagtgttt ccgtagatcc aaacgctcct 2760

gaggaataa 2769

<210> 2

<211> 922

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 2

Met Ala Asp Gln Ala Lys Leu Gly Gly Lys Pro Ser Asp Asp Ser Asn

1 5 10 15

Phe Ala Met Ile Arg Asp Gly Val Ala Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Asp

20 25 30

Pro Glu Glu Thr Asn Glu Trp Met Asp Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln

35 40 45

Glu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Arg Tyr Leu Met Leu Arg Leu Leu Glu

50 55 60

Arg Ala Ser Ala Lys Arg Val Ser Leu Pro Pro Met Thr Ser Thr Asp

65 70 75 80

Tyr Val Asn Thr Ile Pro Thr Ser Met Glu Pro Glu Phe Pro Gly Asp

85 90 95

Glu Glu Met Glu Lys Arg Tyr Arg Arg Trp Ile Arg Trp Asn Ala Ala

100 105 110

Ile Met Val His Arg Ala Gln Arg Pro Gly Ile Gly Val Gly Gly His

115 120 125

Ile Ser Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Tyr Glu Val Gly Phe Asn

130 135 140

His Phe Phe Arg Gly Lys Asp His Pro Gly Gly Gly Asp Gln Ile Phe

145 150 155 160

Phe Gln Gly His Ala Ser Pro Gly Met Tyr Ala Arg Ala Phe Met Glu

165 170 175

Gly Arg Leu Ser Glu Asp Asp Leu Asp Gly Phe Arg Gln Glu Val Ser

180 185 190

Arg Glu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Tyr Pro His Pro His Gly Met Lys

195 200 205

Asp Phe Trp Glu Phe Pro Thr Val Ser Met Gly Leu Gly Pro Met Asp

210 215 220

Ala Ile Tyr Gln Ala Arg Phe Asn Arg Tyr Leu Glu Asn Arg Gly Ile

225 230 235 240

Lys Asp Thr Ser Asp Gln His Val Trp Ala Phe Leu Gly Asp Gly Glu

245 250 255

Met Asp Glu Pro Glu Ser Arg Gly Leu Ile Gln Gln Ala Ala Leu Asn

260 265 270

Asn Leu Asp Asn Leu Thr Phe Val Val Asn Cys Asn Leu Gln Arg Leu

275 280 285

Asp Gly Pro Val Arg Gly Asn Thr Lys Ile Ile Gln Glu Leu Glu Ser

290 295 300

Phe Phe Arg Gly Ala Gly Trp Ser Val Ile Lys Val Val Trp Gly Arg

305 310 315 320

Glu Trp Asp Glu Leu Leu Glu Lys Asp Gln Asp Gly Ala Leu Val Glu

325 330 335

Ile Met Asn Asn Thr Ser Asp Gly Asp Tyr Gln Thr Phe Lys Ala Asn

340 345 350

Asp Gly Ala Tyr Val Arg Glu His Phe Phe Gly Arg Asp Pro Arg Thr

355 360 365

Ala Lys Leu Val Glu Asn Met Thr Asp Glu Glu Ile Trp Lys Leu Pro

370 375 380

Arg Gly Gly His Asp Tyr Arg Lys Val Tyr Ala Ala Tyr Lys Arg Ala

385 390 395 400

Leu Glu Thr Lys Asp Arg Pro Thr Val Ile Leu Ala His Thr Ile Lys

405 410 415

Gly Tyr Gly Leu Gly His Asn Phe Glu Gly Arg Asn Ala Thr His Gln

420 425 430

Met Lys Lys Leu Thr Leu Asp Asp Leu Lys Leu Phe Arg Asp Lys Gln

435 440 445

Gly Ile Pro Ile Thr Asp Glu Gln Leu Glu Lys Asp Pro Tyr Leu Pro

450 455 460

Pro Tyr Tyr His Pro Gly Glu Asp Ala Pro Glu Ile Lys Tyr Met Lys

465 470 475 480

Glu Arg Arg Ala Ala Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Glu Arg Arg Glu Asn

485 490 495

Tyr Asp Pro Ile Gln Val Pro Pro Leu Asp Lys Leu Arg Ser Val Arg

500 505 510

Lys Gly Ser Gly Lys Gln Gln Ile Ala Thr Thr Met Ala Thr Val Arg

515 520 525

Thr Phe Lys Glu Leu Met Arg Asp Lys Gly Leu Ala Asp Arg Leu Val

530 535 540

Pro Ile Ile Pro Asp Glu Ala Arg Thr Phe Gly Leu Asp Ser Trp Phe

545 550 555 560

Pro Thr Leu Lys Ile Tyr Asn Pro His Gly Gln Asn Tyr Val Pro Val

565 570 575

Asp His Asp Leu Met Leu Ser Tyr Arg Glu Ala Pro Glu Gly Gln Ile

580 585 590

Leu His Glu Gly Ile Asn Glu Ala Gly Ser Val Ala Ser Phe Ile Ala

595 600 605

Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Thr His Gly Lys Ala Met Ile Pro Leu Tyr

610 615 620

Ile Phe Tyr Ser Met Phe Gly Phe Gln Arg Thr Gly Asp Ser Ile Trp

625 630 635 640

Ala Ala Ala Asp Gln Met Ala Arg Gly Phe Leu Leu Gly Ala Thr Ala

645 650 655

Gly Arg Thr Thr Leu Thr Gly Glu Gly Leu Gln His Met Asp Gly His

660 665 670

Ser Pro Val Leu Ala Ser Thr Asn Glu Gly Val Glu Thr Tyr Asp Pro

675 680 685

Ser Phe Ala Tyr Glu Ile Ala His Leu Val His Arg Gly Ile Asp Arg

690 695 700

Met Tyr Gly Pro Gly Lys Gly Glu Asp Val Ile Tyr Tyr Ile Thr Ile

705 710 715 720

Tyr Asn Glu Pro Thr Pro Gln Pro Ala Glu Pro Glu Gly Leu Asp Val

725 730 735

Glu Gly Leu His Lys Gly Ile Tyr Leu Tyr Ser Arg Gly Glu Gly Thr

740 745 750

Gly His Glu Ala Asn Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Met Gln Trp Ala

755 760 765

Leu Lys Ala Ala Ser Ile Leu Glu Ala Asp Tyr Gly Val Arg Ala Asn

770 775 780

Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Trp Val Asn Leu Ala Arg Asp Gly Ala Ala

785 790 795 800

Arg Asn Lys Ala Gln Leu Arg Asn Pro Gly Ala Asp Ala Gly Glu Ala

805 810 815

Phe Val Thr Thr Gln Leu Lys Gln Thr Ser Gly Pro Tyr Val Ala Val

820 825 830

Ser Asp Phe Ser Thr Asp Leu Pro Asn Gln Ile Arg Glu Trp Val Pro

835 840 845

Gly Asp Tyr Thr Val Leu Gly Ala Asp Gly Phe Gly Phe Ser Asp Thr

850 855 860

Arg Pro Ala Ala Arg Arg Phe Phe Asn Ile Asp Ala Glu Ser Ile Val

865 870 875 880

Val Ala Val Leu Asn Ser Leu Ala Arg Glu Gly Lys Ile Asp Val Ser

885 890 895

Val Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Phe Lys Leu Asp Asp Ser Thr Ser

900 905 910

Val Ser Val Asp Pro Asn Ala Pro Glu Glu

915 920

<210> 3

<211> 2761

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 3

atggccgatc aagcaaaact tggtggtaag ccctcggatg actctaactt cgcgatgatc 60

cgcgatggcg tggcatctta tttgaacgac tcagatccgg aggagaccaa cgagtggatg 120

gattcactcg acggattact ccaggagtct tctccagaac gtgctcgtta cctcatgctt 180

cgtttgcttg agcgtgcatc tgcaaagcgc gtatctcttc ccccaatgac gtcaaccgac 240

tacgtcaaca ccattccaac ctctatggaa cctgaattcc caggcgatga ggaaatggag 300

aagcgttacc gtcgttggat tcgctggaac gcagccatca tggttcaccg cgctcagcga 360

ccaggcatcg gcgtcggcgg acacatttcc acttacgcag gcgcagcccc tctgtacgaa 420

gttggcttca accacttctt ccgcggcaag gatcacccag gcggcggcga ccagatcttc 480

ttccagggcc acgcatcacc aggtatgtac gcacgtgcat tcatggaggg tcgcctttct 540

gaagacgatc tcgatggctt ccgtcaggaa gtttcccgtg agcagggtgg cattccgtcc 600

taccctcacc cacacggtat gaaggacttc tgggagttcc caactgtgtc catgggtctt 660

ggcccaatgg atgccattta ccaggcacgt ttcaaccgct acctcgaaaa ccgtggcatc 720

aaggacacct ctgaccagca cgtctgggcc ttccttggcg acggcgaaat ggacgagcca 780

gaatcacgtg gtctcatcca gcaggctgca ctgaacaacc tggacaacct gaccttcgtg 840

gttaactgca acctgcagcg tctcgacgga cctgtccgcg gtaacaccaa gatcatccag 900

gaactcgagt ccttcttccg tggcgcaggc tggtctgtga tcaaggttgt ttggggtcgc 960

gagtgggatg aacttctgga gaaggaccag gatggtgcac ttgttgagat catgaacaac 1020

acctccgatg gtgactacca gaccttcaag gctaacgacg gcgcatatgt tcgtgagcac 1080

ttcttcggac gtgacccacg caccgcaaag ctcgttgaga acatgaccga cgaagaaatc 1140

tggaagctgc cacgtggcgg ccacgattac cgcaaggttt acgcagccta caagcgagct 1200

cttgagacca aggatcgccc aaccgtcatc cttgctcaca ccattaaggg ctacggactc 1260

ggccacaact tcgaaggccg taacgcaacc caccagatga agaagctgac gcttgatgat 1320

ctgaagttgt tccgcgacaa gcagggcatc ccaatcaccg atgagcagct ggagaaggat 1380

ccttaccttc ctccttacta ccacccaggt gaagacgctc ctgaaatcaa gtacatgaag 1440

gaacgtcgcg cagcgctcgg tggctacctg ccagagcgtc gtgagaacta cgatccaatt 1500

caggttccac cactggcgct ctgtccgtaa gggctccggc aagcagcaga tcgctaccac 1560

tatggcgact gttcgtacct tcaaggaact gatgcgcgat aagggcttgg ctgatcgcct 1620

tgtcccaatc attcctgatg aggcacgtac cttcggtctt gactcttggt tcccaacctt 1680

gaagatctac aacccgcacg gtcagaacta cgtgcctgtt gaccacgacc tgatgctctc 1740

ctaccgtgag gcacctgaag gacagatcct gcacgaaggc atcaacgagg ctggttccgt 1800

ggcatcgttc atcgctgcgg gtacctccta cgccacccac ggcaaggcca tgattccgct 1860

gtacatcttc tactcgatgt tcggattcca gcgcaccggt gactccatct gggcagcagc 1920

cgatcagatg gcacgtggct tcctcttggg cgctaccgca ggtcgcacca ccctgaccgg 1980

tgaaggcctc cagcacatgg atggacactc ccctgtcttg gcttccacca acgagggtgt 2040

cgagacctac gacccatcct ttgcgtacga gatcgcacac ctggttcacc gtggcatcga 2100

ccgcatgtac ggcccaggca agggtgaaga tgttatctac tacatcacca tctacaacga 2160

gccaacccca cagccagctg agccagaagg actggacgta gaaggcctgc acaagggcat 2220

ctacctctac tcccgcggtg aaggcaccgg ccatgaggca aacatcttgg cttccggtgt 2280

tggtatgcag tgggctctca aggctgcatc catccttgag gctgactacg gagttcgtgc 2340

caacatttac tccgctactt cttgggttaa cttggctcgc gatggcgctg ctcgtaacaa 2400

ggcacagctg cgcaacccag gtgcagatgc tggcgaggca ttcgtaacca cccagctgaa 2460

gcagacctcc ggcccatacg ttgcagtgtc tgacttctcc actgatctgc caaaccagat 2520

ccgtgaatgg gtcccaggcg actacaccgt tctcggtgca gatggcttcg gtttctctga 2580

tacccgccca gctgctcgtc gcttcttcaa catcgacgct gagtccattg ttgttgcagt 2640

gctgaactcc ctggcacgcg aaggcaagat cgacgtctcc gttgctgctc aggctgctga 2700

gaagttcaag ttggatgatc ctacgagtgt ttccgtagat ccaaacgctc ctgaggaata 2760

a 2761

<210> 4

<211> 1104

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 4

atgacgtcat tagagttcac agtaacccgt accgaaaatc cgacgtcacc cgatcgtctg 60

aaggaaattc ttgccgcacc gaagttcggt aagttcttca ccgaccacat ggtgaccatt 120

gactggaacg agtcggaagg ctggcacaac gcccaattag tgccatacgc gccgattcct 180

atggatcctg ccaccaccgt attccactac ggacaggcaa tttttgaggg aattaaggcc 240

taccgccatt cggacgaaac catcaagact ttccgtcctg atgaaaacgc cgagcgtatg 300

cagcgttcag cagctcgaat ggcaatgcca cagttgccaa ccgaggactt tattaaagca 360

cttgaactgc tggtagacgc ggatcaggat tgggttcctg agtacggcgg ggaagcgtcc 420

ctctacctgc gcccattcat gatctccacc gaaattggct tgggtgtcag cccagctgat 480

gcctacaagt tcctggtcat cgcatcccca gtcggcgctt acttcaccgg tggaattaag 540

cctgtttccg tctggctgag cgaagattac gtccgcgctg cacccggcgg aactggtgac 600

gccaaagaag ctggcaacta cgcggcttct ttgcttgccc agtcccaggc tgcggaaaag 660

ggctgtgacc aggtcgtatg gttggatgcc atcgagcaca agtacatcga agaaatgggt 720

ggcatgaacc ttgggttcat ctaccgcaac ggcgaccacg tcaagctagt cacccctgaa 780

ctttccggct cactacttcc aggcatcacc cgcaagtcac ttctacaagt agcacgcgac 840

ttgggctacg aagtagaaga gcgaaagatc accaccaccg agtgggaaga agacgcaaag 900

tctggcgcca tgactgaggc atttgcttgc ggtactgcag ctgttatcac ccctgttggc 960

accgtgaaat cagctcacgg caccttcgaa gtgaacaaca atgaagtcgg agaaatcacg 1020

atgaagcttc gtgaaaccct caccggaatt cagcaaggaa acgttgaaga ccaaaacgga 1080

tggctttacc cactggttgg ctaa 1104

<210> 5

<211> 367

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 5

Met Thr Ser Leu Glu Phe Thr Val Thr Arg Thr Glu Asn Pro Thr Ser

1 5 10 15

Pro Asp Arg Leu Lys Glu Ile Leu Ala Ala Pro Lys Phe Gly Lys Phe

20 25 30

Phe Thr Asp His Met Val Thr Ile Asp Trp Asn Glu Ser Glu Gly Trp

35 40 45

His Asn Ala Gln Leu Val Pro Tyr Ala Pro Ile Pro Met Asp Pro Ala

50 55 60

Thr Thr Val Phe His Tyr Gly Gln Ala Ile Phe Glu Gly Ile Lys Ala

65 70 75 80

Tyr Arg His Ser Asp Glu Thr Ile Lys Thr Phe Arg Pro Asp Glu Asn

85 90 95

Ala Glu Arg Met Gln Arg Ser Ala Ala Arg Met Ala Met Pro Gln Leu

100 105 110

Pro Thr Glu Asp Phe Ile Lys Ala Leu Glu Leu Leu Val Asp Ala Asp

115 120 125

Gln Asp Trp Val Pro Glu Tyr Gly Gly Glu Ala Ser Leu Tyr Leu Arg

130 135 140

Pro Phe Met Ile Ser Thr Glu Ile Gly Leu Gly Val Ser Pro Ala Asp

145 150 155 160

Ala Tyr Lys Phe Leu Val Ile Ala Ser Pro Val Gly Ala Tyr Phe Thr

165 170 175

Gly Gly Ile Lys Pro Val Ser Val Trp Leu Ser Glu Asp Tyr Val Arg

180 185 190

Ala Ala Pro Gly Gly Thr Gly Asp Ala Lys Glu Ala Gly Asn Tyr Ala

195 200 205

Ala Ser Leu Leu Ala Gln Ser Gln Ala Ala Glu Lys Gly Cys Asp Gln

210 215 220

Val Val Trp Leu Asp Ala Ile Glu His Lys Tyr Ile Glu Glu Met Gly

225 230 235 240

Gly Met Asn Leu Gly Phe Ile Tyr Arg Asn Gly Asp His Val Lys Leu

245 250 255

Val Thr Pro Glu Leu Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys

260 265 270

Ser Leu Leu Gln Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Val Glu Glu Arg

275 280 285

Lys Ile Thr Thr Thr Glu Trp Glu Glu Asp Ala Lys Ser Gly Ala Met

290 295 300

Thr Glu Ala Phe Ala Cys Gly Thr Ala Ala Val Ile Thr Pro Val Gly

305 310 315 320

Thr Val Lys Ser Ala His Gly Thr Phe Glu Val Asn Asn Asn Glu Val

325 330 335

Gly Glu Ile Thr Met Lys Leu Arg Glu Thr Leu Thr Gly Ile Gln Gln

340 345 350

Gly Asn Val Glu Asp Gln Asn Gly Trp Leu Tyr Pro Leu Val Gly

355 360 365

Claims

1.支链氨基酸转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体包含支链氨基酸转氨酶第203位氨基酸由F到E突变位点；

支链氨基酸转氨酶在NCBI上的参考序列编号为SJM46313.1。

2.编码权利要求1所述突变体的核酸分子。

3.aceE基因突变体，其特征在于，所述突变体为aceE基因的第1517-1524bp缺失形成的突变体；

aceE基因编码的丙酮酸脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_011014985.1。

4.含有权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述aceE基因突变体的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

5.权利要求2所述核酸分子、或权利要求3所述aceE基因突变体、或权利要求4所述生物材料的以下任一应用：

(1)用于L-氨基酸的发酵生产；

(2)用于提高L-氨基酸的发酵产量；

(3)用于构建产L-氨基酸的基因工程菌；

优选地，所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-丙氨酸；更优选L-亮氨酸。

6.产L-氨基酸的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是利用基因工程手段，在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入如下突变①～③中的至少一种得到的：

②引入的突变导致aceE基因第1517-1524bp缺失；

③引入的突变导致ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶的第203位氨基酸由F突变为E；

aceE基因编码的丙酮酸脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_011014985.1；

ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶在NCBI上的参考序列编号为SJM46313.1。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入突变①和③；或者，

在具有L-氨基酸生产能力的微生物基因组中引入突变②和③。

8.根据权利要求6或7所述的基因工程菌，其特征在于，所述具有L-氨基酸生产能力的微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选保藏编号为CGMCC NO.13408的谷氨酸棒杆菌。

9.根据权利要求6-8任一项所述基因工程菌在发酵生产L-氨基酸或提高L-氨基酸发酵产量中的应用。

10.提高L-氨基酸发酵产量的方法，其特征在于，利用权利要求6-8任一项所述基因工程菌发酵生产L-氨基酸；