CN1071794C

CN1071794C - 发酵生产l－谷氨酸的方法

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Publication number: CN1071794C
Application number: CN95100509A
Authority: CN
Inventors: 小野荣治; 辻本信晴; 松井和彦; 仓桥修
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-01-10
Filing date: 1995-01-10
Publication date: 2001-09-26
Anticipated expiration: 2015-01-10
Also published as: DE69530242T2; EP0670370A3; EP0670370A2; CN1128295A; ES2194030T3; PE42395A1; EP0670370B1; DE69530242D1; US5573945A; JPH07203980A; BR9500052A; MY112424A; JP3880636B2

Abstract

本发明通过改进埃希氏杆菌属微生物的L-谷氨酸生产能力，提供了一种低成本而高效的L-谷氨酸生产方法。发酵生产L-谷氨酸的方法包括：在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。

Description

发酵生产L-谷氨酸的方法

本发明涉及一种用于发酵生产L-谷氨酸的突变体和一种用该突变体发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种用于食品和药物的氨基酸。

生产L-谷氨酸的常规方法是用谷氨酸生产菌及其突变体进行发酵，例如用短杆菌属、棒状杆菌属或微杆菌属的细菌及其突变体进行发酵(Amino acid fermentation,Gakkai Shuppan Center,pp195-215,1986)。发酵生产L-谷氨酸的其他已知方法包括采用芽孢杆菌属、链霉菌属或青霉属微生物的方法(美国专利3,220,929)和采用假单胞菌属、节细菌属、沙雷氏菌属或假丝酵母属微生物的方法(美国专利3,563,857)。即便这些常规方法能产生明显较为大量的L-谷氨酸，也还是需要更为有效、更廉价的L-谷氨酸生产方法，以满足不断增加的需求。

大肠杆菌(Escherichia coli)由于生长速度高和可得到足够基因信息而具有作为良好的L-谷氨酸生产菌的潜力，而所报导的大肠杆菌的L-谷氨酸产量却低至23g/l(J.Biochem.,50:164-165,1961)。最近据报导，α-酮戊二酸脱氢酶(以下称为α-KGDH)缺陷或降低的突变体具有生产大量L-谷氨酸的能力(法国专利申请公开2680178)。

本发明的目的是增强属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的菌株的L-谷氨酸生产能力，并提供一种更为有效、成本更低的生产L-谷氨酸的方法。

在用大肠杆菌的突变体生产L-谷氨酸的研究中，现已出人意料地发现，α-KGDH活性缺陷或降低而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下称为PPC)和谷氨酸脱氢酶(以下称为GDH)活性增强的突变体，具有高度的L-谷氨酸生产能力，从而完成了本发明。

因此，本发明包括：

一种具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，其α-KGDH活性缺陷或降低，而PPC和GDH活性增强；以及

一种发酵生产L-谷氨酸的方法，该方法包括：在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-KGDH活性缺陷或降低，而PPC和GDH活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。

本发明详述如下。

(1)α-KGDH活性缺陷或降低的埃希氏杆菌属突变体的制取

作为用于制备本突变体的起始母本菌株，埃希氏杆菌属的任何非致病性菌株都可以采用。这些菌株的实例列于下面：

大肠杆菌K-12(ATCC10798)

大肠杆菌W3110(ATCC27325)

大肠杆菌B(ATCC11303)

大肠杆菌W(ATCC9637)

具有L-谷氨酸生产能力且α-KGDH活性缺陷或降低的埃希氏杆菌属突变体可如下制备。

上述的起始母本菌株先进行X射线或紫外光照射，或与诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(以下称为NG)接触，以引入突变。

另外，也可以利用基因工程技术，例如基因重组、基因转化或细胞融合，有效地引入预期的突变。

利用基因重组来制取α-KGDH缺陷型突变体的方法如下进行。根据α-酮戊二酸脱羧酶基因(以下称为sucA基因)的已知核苷酸顺序(Euro.J.Biochem.141:351-359,1984)合成出引物，然后用染色体DNA作模板用PCR法扩增该sucA基因。在扩增后的sucA基因中插入一个抗药性基因，得到已丧失功能的sucA基因。然后利用同源重组法，用由于插入抗药性基因而丧失功能的sucA基因置换染色体上的sucA基因。

对母本菌株进行诱变处理后，可以用下述方法筛选所要的突变体。

在含有葡萄糖作碳源的基本培养基中，在通气条件下，α-KGDH活性缺陷或降低的突变体要么不能生长，要么只能以明显降低的生长速度生长。但即使在这样的条件下，在含葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸加甲硫氨酸也可能达到正常生长。另一方面，即使在含葡萄糖的基本培养基中该突变体也能在无氧条件下生长(Molec.Gen.Gentics,105:182-190,1969)。根据这些发现，可以筛选出所需的突变体。

下列菌株是所得到的α-KGDH活性缺陷或降低的突变体的一个实例。

大肠杆菌W3110sucA∷Kmr

α-KGDH活性缺陷或降低的突变体更为有用，因为其L-谷氨酸生产能力得到增强，同时它又具有如下性质：L-谷氨酸降解活性降低；或者ace操纵子的表达变为组成性的，ace操纵子是苹果酸合酶(aceB)-异柠檬酸裂合酶(aceA)-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(aceK)操纵子。上述这些性质在法国专利申请公开2680178中作了讨论。当然，已知可改进L-谷氨酸生产能力的各种性质，例如各种营养缺陷型、抗代谢物抗性和抗代谢物敏感性，也有利于增强L-谷氨酸生产能力。

L-谷氨酸降解能力下降的突变体可以作为具有如下性质的突变体而被分离出来，该突变体在含有L-谷氨酸代替萄萄糖作唯一碳源或含有L-谷氨酸代替硫酸铵作唯一氮源的基本培养基中，要么不能生长，要么只能略微生长。但是，在制取过程中采用营养缺陷型时，当然可以在培养基中加入生长所必需的最小量的营养物。

组成性表达ace操纵子的突变体可以以如下菌株的形式得到：该菌株的母本菌株是一种磷酸烯醇丙酮酸合酶缺陷型菌株，该菌株本身能够在含有乳酸作碳源的基本培养基中生长，但不能在含有丙酮酸或乙酸/丙酮酸作碳源的基本培养基中生长；或者该菌株在通气条件下的生长速度高于其α-KGDH缺陷或下降的母本菌株(J.Bacteriol.,96:2185-2186,1968)。

上述突变体的实例如下：

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

大肠杆菌AJ12628是一种α-KGDH活性下降、L-谷氨酸降解能力下降，兼组成性表达ace操纵子的突变体。大肠杆菌AJ12624是一种α-KGDH活性下降、L-谷氨酸降解能力下降的突变体(法国专利申请公开2680178)。

在所得到的α-KGDH活性缺陷或降低的突变体中，通过三羧酸循环中的α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸的过程得到改善，使L-谷氨酸生产能力得到增强。同样，在α-KGDH活性缺陷或下降且降解所产生的L-谷氨酸的能力明显较低的突变体中，或者在同时还组成性表达ace操纵子从而使生长得到改善的突变体中，L-谷氨酸生产能力也得到提高。

(2)PPC活性和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体的制取

在下述实施例中，由α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的起始母本菌株，得到了PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体。也可以使用埃希氏杆菌属的野生菌株作母本菌株，得到PPC和GDH活性增强的突变体，然后培养突变体使其α-KGDH活性缺陷或下降。

因此，用于制备PPC和GDH活性增强的突变体的起始母本菌株优选是α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，或者是埃希氏杆菌属的非致病性野生型菌株。这种菌株的实例列举如下。

大肠杆菌W3100sucA∷Km^r

大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)

大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)

(以上列出的是α-KGDH活性缺陷或下降并具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体。)

大肠杆菌K-12(ATCC10798)

大肠杆菌W3110(ATCC27325)

大肠杆菌B(ATCC11303)

大肠杆菌W(ATCC9637)

(以上列出的是埃希氏杆菌属的非致病性野生菌株。)

为了增强PPC和GDH活性，将编码PPC和GDH的基因克隆到合适的质粒上，然后用该质粒来转化作为宿主使用的起始母本菌株。增加转化细胞中编码PPC和GDH的基因(以下分别称为ppc基因和gdhA基因)的拷贝，从而使PPC和GDH活性得到增强。

欲克隆的ppc和gdhA基因，可以克隆到欲引入用作宿主的起始母本菌株中的单个质粒中，也可以分别克隆到两种在起始母本菌株中相容的质粒中。

另外，用以下方法也可以进行PPC和GDH活性的增强：使ppc和gdhA基因以多拷贝存在于用作宿主的起始母本菌株的染色体DNA上。为将ppc和gdhA基因以多拷贝引入到埃希氏杆菌属的染色体DNA中，利用以多拷贝存在于染色体DNA上的靶顺序进行同源重组。以多拷贝存在的顺序可以是存在于插入顺序末端的重复DNA和反向重复顺序。另外，也可以如日本特许公开2-109985所述，将ppc和gdhA基因克隆到转座子上，然后进行转座，从而使多拷贝引入到染色体DNA中。增加转化细胞中ppc和gdhA基因的拷贝，使PPC和GDH活性得到增强。

除了上述的基因扩增外，也可以通过用较高效的启动子置换ppc和gdhA基因的启动子来使PPC和GDH活性增强。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、P₀启动子及λ噬菌体的P₁启动子是强启动子。通过增强ppc基因和gdhA基因的表达，使PPC和GDH活性得到增强。

分离出相对于PPC或GDH缺陷型突变体的营养缺陷互补的基因，就可以得到ppc和gdhA基因。另外，由于大肠杆菌中这些基因的核苷酸顺序是已知的(J.Biochem.,95:909-916,1984；Gene,27:193-199,1984)，也可根据这些核苷酸顺序合成出引物，然后用染色体DNA作模板用PCR法得到基因。

(3)用能够生产L-谷氨酸且α-KGDH活性缺陷或降低、PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体发酵生产L-谷氨酸

为了用能够生产L-谷氨酸且α-KGDH活性缺陷或下降、PPC和GDH活性增强的埃希氏杆菌属突变体发酵生产L-谷氨酸，可以使用标准培养基和标准培养方法，标准培养基中含有碳源、氮源、无机盐、必要时还含有有机微量养分如氨基酸和维生素。培养基中所用的碳源和氮源可以是可被所用突变体代谢的任何碳源和氮源。

碳源可以是糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，也可以使用有机酸如乙酸和柠檬酸，有机酸既可以独立使用也可与其他碳源混合使用。

氮源可以是氨和铵盐，例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵及硝酸盐。

有机微量养分可以是氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，可以是这些成分本身也可以是蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解产物等中所含的这些成分。在使用其生长需要某种氨基酸的营养缺陷型时，应添加所需的养分。

无机盐可以是磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

在20-45℃的发酵温度下进行通气培养，pH控制在5-9的范围内。在培养过程中控制pH时，可以加入碳酸钙或碱如氨气来进行中和。培养10小时至4天后，培养液中积累大量的L-谷氨酸。

培养后可以用任何已知方法回收培养液中的L-谷氨酸。例如，从培养液中除去细胞，然后浓缩并沉淀，或者进行离子交换色谱，得到L-谷氨酸。

本发明以下列实施例进一步描述。

实施例1

(1)大肠杆菌的sucA基因和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因的克隆

大肠杆菌K12的sucA基因和二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因(以下称为sucB基因)的核苷酸顺序是已知的。sucA基因和sucB基因的已知核苷酸顺序公开于文献中(Euro.J.Biochem.,141:351-374,1984)，而且也在本文的顺序表中作为7号顺序给出。327位至3128位残基的核苷酸顺序相应于sucA基因的ORF(开放读码)，而3143位至4357位残基的核苷酸顺序相应于sucB基因的ORF。根据所报导的核苷酸顺序，合成1-4号顺序所示的引物，并利用大肠杆菌W3110的染色体DNA作模板，以PCR法扩增sucA和sucB基因。

用于扩增sucA基因的合成此物具有1号和2号顺序所示的核苷酸顺序，1号顺序相应于由文献所述的sucA基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.,141:354,1984)中的45位至65位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示的核苷酸顺序的45位至65位残基的碱基组成的顺序。

2号顺序相应于文献所示的sucB基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.,141:364,1984)中的3173位至3193位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示的核苷酸顺序的3173位至3193位残基的碱基组成的顺序。

用于扩增sucB基因的合成引物具有3号和4号顺序所示的核苷酸顺序，3号顺序相应于由文献所示的sucA基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.,141:354,1984)中的2179位至2198位残基的碱基组成的顺序。它也相应于由7号顺序所示核苷酸顺序的2179位至2198位残基的碱基组成的顺序。

4号顺序相应于文献所示的sucB基因的核苷酸顺序图(Euro.J.Biochem.,141:364,1984)中的4566位至4591位残基的碱基组成的顺序。它也相应于7号顺序所示的核苷酸顺序的4566位至4591位残基的碱基组成的顺序。sucA基因和sucB基因构成一个操纵子。

用标准方法回收大肠杆菌W3110的染色体DNA(《生物工学实验所》，日本生物工学会编，第97-98页，Baifukan,1992)。

在文献所述的标准条件下进行PCR反应(PCR Technology,HenryErlich编，第8页，Stockton Press,1989)。

利用T4.DNA聚合酶将所产生的PCR产物的两端转化为平末端，并克隆到pBR322载体的EcoRV位点上。将sucA基因克隆到pBR322中得到的质粒定名为pBR-sucA，用sucB构建的质粒定名为pBR-sucB。将所得质粒引入到大肠杆菌JM109中，并制备质粒。然后建立限制图谱并与所报导的sucA和sucB基因的限制图谱比较，从而证实了已克隆的基因是sucA和sucB基因。

如图1所示，用KpnⅠ和EcoRⅠ消化pBR-sucB，制得含sucB基因的DNA片段。用KpnⅠ-和EcoRⅠ消化pBR-sucA，制得一个大片段。这两个片段用T4DNA连接酶连接，产生pBR-sucAB。

(2)大肠杆菌W3110染色体DNA上的sucA基因的破坏

图2概括了大肠杆菌W3110染色体DNA上的sucA基因的破坏。

用KpnⅠ消化pBR-sucAB，利用T4DNA聚合酶得到平末端。另一方面，用PstⅠ消化pUC4K(购自Pharmacia)，制得含卡那霉素抗性基因的DNA片段，用T4DNA聚合酶使其转化为平末端。这两个片段用T4DNA连接酶连接，得到pBR-sucA∷Km^r。由该质粒切下含有卡那霉素抗性基因的HindⅢ-EcoRⅠ片段，用该线性DNA转化由大肠杆菌遗传原种中心(美国耶鲁大学)得到的大肠杆菌JC7623(thr-1,ara-14,leuB6,△(gpt-proA)62,lacY1,tsx-23,supE44,gal K2,λ^-,rac,sbcB15,hisG4,rfbD1,recB21,recC22,rpsL31,kdgK51,xyl-5,mtl-1,argE3,thi-1)，并在添加有25μg/ml卡那霉素的L培养基(细菌胰胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l、琼脂15g/l,pH7.2)上，筛选其染色体DNA上的sucA基因已被插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因(sucA∷Km^r)置换的菌株。由于大肠杆菌JC7623具有recB、recC和sbcB，即使用线性DNA进行转化也能以高频率实现重组。

由所得到的12个卡那霉素抗性菌株的每个菌株制备染色体DNA，并用KpnⅠ消化。用含有sucA基因的DNA片段作探针进行Southern杂交，证实这12个菌株都是其染色体DNA上的sucA基因已被插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因置换的菌株。在Southern杂交中使用含有pBR-sucA的sucA基因的2.6Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段作探针时，由于在含有sucA基因的DNA片段中存在KpnⅠ位点，野生菌株显示出5.2Kb和6.2Kb两个条带，而置换有已插入了卡那霉素抗性基因的sucA基因的菌株，由于在引入卡那霉素抗性基因时破坏了KpnⅠ位点，只显示出11.4Kb一个条带。然后，用P1噬菌体感染所得到的具有卡那霉素抗性的大肠杆菌JC7623(sucA∷Km^r)，并制备噬菌体溶解产物。然后用sucA∷Km^r转导大肠杆菌W3100菌株。用标准方法进行P1噬菌体转导(《生物工学实验所》，日本生物工学会编，第75-76页，Baifukan,1992)。所分离出的卡那霉素抗性菌株的代表定名为W3110sucA∷Km^r。

按照Reed等人的方法(Hethods in Enzymology,13:55,1969)测定W3110sucA∷Km^r菌株和大肠杆菌W3110的α-KGDH活性。结果示于表1。未检测到大肠杆菌W3110sucA∷Km^r的α-KGDH活性。因此，大肠杆菌W3110sucA∷Km^r是α-KGDH活性缺陷的菌株。

表1

W3110 W3110sucA∷Km^r

α-KGDH活性 3.70 未检测到

(单位：微摩尔/毫克蛋白/分)

(3)大肠杆菌W3110的gdhA基因的克隆。

与sucA和sucB基因的克隆类似，用PCR法来克隆gdhA基因。根据Fernando等人报导的gdhA基因的核苷酸顺序，合成PCR引物。gdhA基因的核苷酸顺序公开于文献中(Gene,27:193-199,1984)，并也在本文的顺序表中作为8号顺序给出。引物的核苷酸顺序示于5号和6号顺序中。

5号顺序相应于文献给出的gdhA基因核苷酸顺序图(Gene,27:195,1984)中191位至171位残基的顺序，它也相应于8号顺序中3位至23位残基的顺序。

6号顺序相应于由文献给出的gdhA基因核苷酸顺序图(Gene,27:195,1984)中1687位至1707位残基组成的顺序，它也相应于由8号顺序中的1880位至1900位残基组成的顺序。

利用合成引物用PCR法扩增gdhA基因，采用大肠杆菌W3110的染色体DNA作模板。纯化所得的PCR产物，并利用T4DNA聚合酶使其转化为平末端，然后与已用EcoRV消化的pBR322连接，得到质粒pBRGDH。

(4)含ppc和gdhA基因的质粒的构建

图3显示了含ppc和gdhA基因的质粒的构建步骤。用HindⅢ消化质粒pS2，并用T4DNA聚合酶将其两端转化为平末端。质粒pS2中，在pBR322的SalⅠ位点中插入了含有得自大肠杆菌K-12的整个ppc基因区的4.4Kb SalⅠ片段(J.Biochem.,9:909-916,1984)。另一方面，利用T4DNA聚合酶将用PCR法合成的含gdhA基因的DNA片段转化为平末端。随后用T4DNA连接酶连接这两个片段。用所得质粒转化得自大肠杆菌遗传原种中心(美国耶鲁大学)的一个GDH缺陷型菌株，即大肠杆菌PA340(thr-1,fhuA2,leuB6,lacY1,supE44,gal-6,λ^-,gdh-1,hisG1,rfbD1,galP63,△(gltB-F),rpsL19,malT1(λR),xyl-7,mtl-2,argH1,thi-1)，并分离其生长不需谷氨酸的氨苄青霉素抗性菌株。由该菌株制备一个质粒并建立限制图谱，从而证实该质粒上存在ppc和gdhA基因。该质粒定名为pGK。

(5)将pS2、pBRGDH和pGK引入α-KGDH缺陷型菌株大肠杆菌W3100sucA∷Km^r并评定L-谷氨酸的生产

分别用pS2、pBRGDH和pGK转化α-KGDH缺陷型菌株大肠杆菌W3100sucA∷KM^r，将每个转化菌株分别接种到装有20ml具有表2所示组成的培养基的500ml摇瓶中，然后在37℃下进行培养，直到培养基中的葡萄糖完全消耗。结果示于表3。

表2组分浓度(g/l)葡萄糖 40(NH₄)₂SO₄ 20KH₂PO₄ 1MgSO₄·7H₂O 1FeSO₄·7H₂O 0.01HnSO₄·5H₂O 0.01

酵母提取物 2

盐酸硫胺素 0.01

CaCO₃ 50

表3

菌株积累的L-谷氨酸(g/l)

W3110sucA∷Km^r 19.2

W3110sucA∷Km^r/pS2 19.9

W3110sucA∷Km^r/pBRGDH 2.8

W3110sucA∷Km^r/pGK 23.3

(AJ12949)

虽然由于引入pS2而使PPC活性增强的转化菌株与宿主菌株W3110sucA∷Km^r相比生长略有下降，但它积累L-谷氨酸的量与宿主菌株的积累量相似。由于引入pBRGDH而使GDH活性增强的菌株生长很差，L-谷氨酸的积累量出人意料地小于W3110sucA∷Km^r菌株的积累量。

相反，由于引入pGK而使PPC和GDH活性同时增强的转化菌株，其生长与宿主菌株类似，但L-谷氨酸的积累量增加。已引入了含ppc和gdhA基因的pGK质粒的大肠杆菌W3110sucA∷Km^r定名为AJ12949。大肠杆菌AJ12949于1995年1月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)，保藏号为CCTCC NO:M94076。从保藏菌株AJ12949中除去质粒而不损坏细胞，可以得到宿主菌株，即W3110 sucA∷Km^r。该质粒可以自发地从AJ12949中丢失，也可以用某种脱除方法脱除(Bact.Rev.,36:361-405,1972)。脱除方法的一个例子如下。用AJ12949菌株接种L-液体培养基(细菌胰胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l,pH7.2)，并于40℃下培养过夜。将培养液适当稀释并铺在L-培养基上。在37℃下培养过夜后，将形成的菌落转移到含100μg/ml氨苄青霉素的L-培养基上，然后分离氨苄青霉素敏感菌落。所得到的菌株是W3110sucA∷Km^r。

本发明方法提供了埃希氏杆菌属突变体的较高L-谷氨酸生产能力，以及L-谷氨酸的高效、低成本生产。

顺序表

顺序识别号：1

顺序长度：21

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌sucA基因的引物

顺序

ACGCGCAAGC GTCGCATCAG G 21

顺序识别号：2

顺序长度：21

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌sucA基因的引物

顺序

ATCGGCTACG AATTCAGGCA G 21

顺序识别号：3

顺序长度：20

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌sucB基因的引物

顺序

CCGGTCGCGG TACCTTCTTC 20

顺序识别号：4

顺序长度：26

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌sucB基因的引物

顺序

CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26

顺序识别号：5

顺序长度：21

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌gdhA基因的引物

顺序

GGGTGGCAAA GCTTTAGCGT C 21

顺序识别号：6

顺序长度：21

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：合成DNA

特征：用于扩增大肠杆菌gdhA基因的引物

顺序

TCGAGAAGCA TGCATTATAT A 21

顺序识别号：7

顺序长度：4623

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源：

生物：大肠杆菌

特征：

特征关键词：CDS

位置：327..3128

特征测定方法：E

特征关键词：CDS

位置：3143..4357

特征测定方法：E

顺序TCGATGTTGT TGCAACGTAA TGCGTAAACC GTAGGCCTGA TAAGACGCGC AAGCGTCGCA 60TCAGGCAACC AGTGCCGGAT GCGCGTGAAC GCCTTATCCG GCCTACAAGT CATTACCCGT 120AGGCCTGATA AGCGCAGCGC ATCAGGCGTA ACAAAGAAAT GCAGGAAATC TTTAAAAACT 180GCCCCTGACA CTAAGACAGT TTTTAAAGGT TCCTTCGCGA GCCACTACGT AGACAAGAGC 240TCGCAAGTGA ACCCCGGCAC GCACATCACT GTGCGTGGTA GTATCCACGG CGAAGTAAGC 300ATAAAAAAGA TGCTTAAGGG ATCACG ATG CAG AAC AGC GCT TTG AAA GCC TGG 353

Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp

1 5TTG GAC TCT TCT TAC CTC TCT GGC GCA AAC CAG AGC TGG ATA GAA CAG 401Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln

10 15 20 25CTC TAT GAA GAC TTC TTA ACC GAT CCT GAC TCG GTT GAC GCT AAC TGG 449Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp

30 35 40CGT TCG ACG TTC CAG CAG TTA CCT GGT ACG GGA GTC AAA CCG GAT CAA 497Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln

45 50 55TTC CAC TCT CAA ACG CGT GAA TAT TTC CGC CGC CTG GCG AAA GAC GCT 545Phe His Ser Gln Thr Arg Glu Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala

60 65 70TCA CGT TAC TCT TCA ACG ATC TCC GAC CCT GAC ACC AAT GTG AAG CAG 593Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln

75 80 85GTT AAA GTC CTG CAG CTC ATT AAC GCA TAC CGC TTC CGT GGT CAC CAG 641Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln

90 95 100 105CAT GCG AAT CTC GAT CCG CTG GGA CTG TGG CAG CAA GAT AAA GTG GCC 689His Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala

110 115 120GAT CTG GAT CCG TCT TTC CAC GAT CTG ACC GAA GCA GAC TTC CAG GAG 737Asp Leu Asp Pro Ser Phe His Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu

125 130 135ACC TTC AAC GTC GGT TCA TTT GCC AGC GGC AAA GAA ACC ATG AAA CTC 785Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu

140 145 150GGC GAG CTG CTG GAA GCC CTC AAG CAA ACC TAC TGC GGC CCG ATT GGT 833Gly Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Pro Ile Gly

155 160 165GCC GAG TAT ATG CAC ATT ACC AGC ACC GAA GAA AAA CGC TGG ATC CAA 881Ala Glu Tyr Met His Ile Thr Ser Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln170 175 180 185CAG CGT ATC GAG TCT GGT CGC GCG ACT TTC AAT AGC GAA GAG AAA AAA 929Gln Arg Ile Glu Ser Gly Arg Ala Thr Phe Asn Ser Glu Glu Lys Lys

190 195 200CGC TTC TTA AGC GAA CTG ACC GCC GCT GAA GGT CTT GAA CGT TAC CTC 977Arg Phe Leu Ser Glu Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Arg Tyr Leu

205 210 215GGC GCA AAA TTC CCT GGC GCA AAA CGC TTC TCG CTG GAA GGC GGT GAC 1025Gly Ala Lys Phe Pro Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp

220 225 230GCG TTA ATC CCG ATG CTT AAA GAG ATG ATC CGC CAC GCT GGC AAC AGC 1073Ala Leu Ile Pro Met Leu Lys Glu Met Ile Arg His Ala Gly Asn Ser

235 240 245GGC ACC CGC GAA GTG GTT CTC GGG ATG GCG CAC CGT GGT CGT CTG AAC 1121Gly Thr Arg Glu Val Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn250 255 260 265GTG CTG GTG AAC GTG CTG GGT AAA AAA CCG CAA GAC TTG TTC GAC GAG 1169Val Leu Val Asn Val Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu

270 275 280TTC GCC GGT AAA CAT AAA GAA CAC CTC GGC ACG GGT GAC GTG AAA TAC 1217Phe Ala Gly Lys His Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr

285 290 295CAC ATG GGC TTC TCG TCT GAC TTC CAG ACC GAT GGC GGC CTG GTG CAC 1265His Met Gly Phe Ser Ser Asp Phe Gln Thr Asp Gly Gly Leu Val His

300 305 310CTG GCG CTG GCG TTT AAC CCG TCT CAC CTT GAG ATT GTA AGC CCG GTA 1313Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val

315 320 325GTT ATC GGT TCT GTT CGT GCC CGT CTG GAC AGA CTT GAT GAG CCG AGC 1361Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Asp Glu Pro Ser330 335 340 345AGC AAC AAA GTG CTG CCA ATC ACC ATC CAC GGT GAC GCC GCA GTG ACC 1409Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Thr

350 355 360GGG CAG GGC GTG GTT CAG GAA ACC CTG AAC ATG TCG AAA GCG CGT GGT 1457Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly

365 370 375TAT GAA GTT GGC GGT ACG GTA CGT ATC GTT ATC AAC AAC CAG GTT GGT 1505Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly

380 385 390TTC ACC ACC TCT AAT CCG CTG GAT GCC CGT TCT ACG CCG TAC TGT ACT 1553Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr

395 400 405GAT ATC GGT AAG ATG GTT CAG GCC CCG ATT TTC CAC GTT AAC GCG GAC 1601Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp410 415 420 425GAT CCG GAA GCC GTT GCC TTT GTG ACC CGT CTG GCG CTC GAT TTC CGT 1649Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg

430 435 440AAC ACC TTT AAA CGT GAT GTC TTC ATC GAC CTG GTG TCG TAC CGC CGT 1697Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Ser Tyr Arg Arg

445 450 455CAC GGC CAC AAC GAA GCC GAC GAG CCG AGC GCA ACC CAG CCG CTG ATG 1745His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met

460 465 470TAT CAG AAA ATC AAA AAA CAT CCG ACA CCG CGC AAA ATC TAC GCT GAC 1793Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp

475 480 485AAG CTG GAG CAG GAA AAA GTG GCG ACG CTG GAA GAT GCC ACC GAG ATG 1841Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met490 495 500 505GTT AAC CTG TAC CGC GAT GCG CTG GAT GCT GGC GAT TGC GTA GTG GCA 1889Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala

510 515 520GAG TGG CGT CCG ATG AAC ATG CAC TCT TTC ACC TGG TCG CCG TAC CTC 1937Glu Trp Arg Pro Met Asn Met His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu

525 530 535AAC CAC GAA TGG GAC GAA GAG TAC CCG AAC AAA GTT GAG ATG AAG CGC 1985Asn His Glu Trp Asp Glu Glu Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg

540 545 550CTG CAG GAG CTG GCG AAA CGC ATC AGC ACG GTG CCG GAA GCA GTT GAA 2033Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu

555 560 565ATG CAG TCT CGC GTT GCC AAG ATT TAT GGC GAT CGC CAG GCG ATG GCT 2081Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp Arg Gln Ala Met Ala570 575 580 585GCC GGT GAG AAA CTG TTC GAC TGG GGC GGT GCG GAA AAC CTC GCT TAC 2129Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr

590 595 600GCC ACG CTG GTT GAT GAA GGC ATT CCG GTT CGC CTG TCG GGT GAA GAC 2177Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp

605 610 615TCC GGT CGC GGT ACC TTC TTC CAC CGC CAC GCG GTG ATC CAC AAC CAG 2225Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ala Val Ile His Asn Gln

620 625 630TCT AAC GGT TCC ACT TAC ACG CCG CTG CAA CAT ATC CAT AAC GGG CAG 2273Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His Ile His Asn Gly Gln

635 640 645GGC GCG TTC CGT GTC TGG GAC TCC GTA CTG TCT GAA GAA GCA GTG CTG 2321Gly Ala Phe Arg Val Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu650 655 660 665GCG TTT GAA TAT GGT TAT GCC ACC GCA GAA CCA CGC ACT CTG ACC ATC 2369Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Thr Leu Thr Ile

670 675 680TGG GAA GCG CAG TTC GGT GAC TTC GCC AAC GGT GCG CAG GTG GTT ATC 2417Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile

685 690 695GAC CAG TTC ATC TCC TCT GGC GAA CAG AAA TGG GGC CGG ATG TGT GGT 2465Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly

700 705 710CTG GTG ATG TTG CTG CCG CAC GGT TAC GAA GGG CAG GGG CCG GAG CAC 2513Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His

715 720 725TCC TCC GCG CGT CTG GAA CGT TAT CTG CAA CTT TGT GCT GAG CAA AAC 2561Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn730 735 740 745ATG CAG GTT TGC GTA CCG TCT ACC CCG GCA CAG GTT TAC CAC ATG CTG 2609Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu

750 755 760CGT CGT CAG GCG CTG CGC GGG ATG CGT CGT CCG CTG GTC GTG ATG TCG 2657Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser

765 770 775CCG AAA TCC CTG CTG CGT CAT CCG CTG GCG GTT TCC AGC CTC GAA GAA 2705Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val Ser Ser Leu Glu Glu

780 785 790CTG GCG AAC GGC ACC TTC CTG CCA GCC ATC GGT GAA ATC GAC GAG CTT 2753Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Glu Leu

795 800 805GAT CCG AAG GGC GTG AAG CGC GTA GTG ATG TGT TCT GGT AAG GTT TAT 2801Asp Pro Lys Gly Val Lys Arg Val Val Met Cys Ser Gly Lys Val Tyr810 815 820 825TAC GAC CTG CTG GAA CAG CGT CGT AAG AAC AAT CAA CAC GAT GTC GCC 2849Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asn Gln His Asp Val Ala

830 835 840ATT GTG CGT ATC GAG CAA CTC TAC CCG TTC CCG CAT AAA GCG ATG CAG 2897Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Lys Ala Met Gln

845 850 855GAA GTG TTG CAG CAG TTT GCT CAC GTC AAG GAT TTT GTC TGG TGC CAG 2945Glu Val Leu Gln Gln Phe Ala His Val Lys Asp Phe Val Trp Cys Gln

860 865 870GAA GAG CCG CTC AAC CAG GGC GCA TGG TAC TGC AGC CAG CAT CAT TTC 2993Glu Glu Pro Leu Asn Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe

875 880 885CGT GAA GTG ATT CCG TTT GGG GCT TCT CTG CGT TAT GCA GGC CGC CCG 3041Arg Glu Val Ile Pro Phe Gly Ala Ser Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro890 895 900 905GCC TCC GCC TCT CCG GCG GTA GGG TAT ATG TCC GTT CAC CAG AAA CAG 3089Ala Ser Ala Ser Pro Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Lys Gln

910 915 920CAA CAA GAT CTG GTT AAT GAC GCG CTG AAC GTC GAA TAAATAAAGG 3135Gln Gln Asp Leu Val Asn Asp Ala Leu Asn Val Glu

925 930ATACACA ATG AGT AGC GTA GAT ATT CTG GTC CCT GAC CTG CCT GAA TCC 3184

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser

1 5 10GTA GCC GAT GCC ACC GTC GCA ACC TGG CAT AAA AAA CCC GGC GAC GCA 3232Val Ala Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala15 20 25 30GTC GTA CGT GAT GAA GTG CTG GTA GAA ATC GAA ACT GAC AAA GTG GTA 3280Val Val Arg Asp Glu Val Leu Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val

35 40 45CTG GAA GTA CCG GCA TCA GCA GAC GGC ATT CTG GAT GCG GTT CTG GAA 3328Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Ile Leu Asp Ala Val Leu Glu

50 55 60GAT GAA GGT ACA ACG GTA ACG TCT CGT CAG ATC CTT GGT CGC CTG CGT 3376Asp Glu Gly Thr Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Arg

65 70 75GAA GGC AAC AGC GCC GGT AAA GAA ACC AGC GCC AAA TCT GAA GAG AAA 3424Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys Glu Thr Ser Ala Lys Ser Glu Glu Lys

80 85 90GCG TCC ACT CCG GCG CAA CGC CAG CAG GCG TCT CTG GAA GAG CAA AAC 3472Ala Ser Thr Pro Ala Gln Arg Gln Gln Ala Ser Leu Glu Glu Gln Asn95 100 105 110AAC GAT GCG TTA AGC CCG GCG ATC CGT CGC CTG CTG GCT GAA CAC AAT 3520Asn Asp Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Leu Ala Glu His Asn

115 120 125CTC GAC GCC AGC GCC ATT AAA GGC ACC GGT GTG GGT GGT CGT CTG ACT 3568Leu Asp Ala Ser Ala Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr

130 135 140CGT GAA GAT GTG GAA AAA CAT CTG GCG AAA GCC CCG GCG AAA GAG TCT 3616Arg Glu Asp Val Glu Lys His Leu Ala Lys Ala Pro Ala Lys Glu Ser

145 150 155GCT CCG GCA GCG GCT GCT CCG GCG GCG CAA CCG GCT CTG GCT GCA CGT 3664Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gln Pro Ala Leu Ala Ala Arg160 165 170AGT GAA AAA CGT GTC CCG ATG ACT CGC CTG CGT AAG CGT GTG GCA GAG 3712Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu175 180 185 190CGT CTG CTG GAA GCG AAA AAC TCC ACC GCC ATG CTG ACC ACG TTC AAC 3760Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn

195 200 205GAA GTC AAC ATG AAG CCG ATT ATG GAT CTG CGT AAG CAG TAC GGT GAA 3808Glu Val Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Glu

210 215 220GCG TTT GAA AAA CGC CAC GGC ATC CGT CTG GGC TTT ATG TCC TTC TAC 3856Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Ile Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr

225 230 235GTG AAA GCG GTG GTT GAA GCC CTG AAA CGT TAC CCG GAA GTG AAC GCT 3904Val Lys Als Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala

240 245 250TCT ATC GAC GGC GAT GAC GTG GTT TAC CAC AAC TAT TTC GAC GTC AGC 3952Ser Ile AsP Gly Asp Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser255 260 265 270ATG GCG GTT TCT ACG CCG CGC GGC CTG GTG ACG CCG GTT CTG CGT GAT 4000Met Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp

275 280 285GTC GAT ACC CTC GGC ATG GCA GAC ATC GAG AAG AAA ATC AAA GAG CTG 4048Val Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu

290 295 300GCA GTC AAA GGC CGT GAC GGC AAG CTG ACC GTT GAA GAT CTG ACC GGT 4096Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Glu Asp Leu Thr Gly

305 310 315GGT AAC TTC ACC ATC ACC AAC GGT GGT GTG TTC GGT TCC CTG ATG TCT 4144Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser

320 325 330ACG CCG ATC ATC AAC CCG CCG CAG AGC GCA ATT CTG GGT ATG CAC GCT 4192Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala335 340 345 350ATC AAA GAT CGT CCG ATG GCG GTG AAT GGT CAG GTT GAG ATC CTG CCG 4240Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Glu Ile Leu Pro

355 360 365ATG ATG TAC CTG GCG CTG TCC TAC GAT CAC CGT CTG ATC GAT GGT CGC 4288Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg

370 375 380GAA TCC GTG GGC TTC CTG GTA ACG ATC AAA GAG TTG CTG GAA GAT CCG 4336Glu Ser Val Gly Phe Leu Val Thr Ile Lys Glu Leu Leu Glu Asp Pro

385 390 395ACG CGT CTG CTG CTG GAC GTG TAGTAGTTTA AGTTTCACCT GCACTGTAGA 4387Thr Arg Leu Leu Leu Asp Val

400 405CCGGATAAGG CATTATCGCC TTCTCCGGCA ATTGAAGCCT GATGCGACGC TGACGCGTCT 4447TATCAGGCCT ACGGGACCAC CAATGTAGGT CGGATAAGGC GCAACGCCGC ATCCGACAAG 4507CGATGCCTGA TGTGACGTTT AACGTGTCTT ATCAGGCCTA CGGGTGACCG ACAATGCCCG 4567GAAGCGATAC GAAATATTCG GTCTACGGTT TAAAAGATAA CGATTACTGA AGGATG 4623

顺序识别号：8

顺序长度：1937

顺序类型：核酸

链数：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源：

生物：大肠杆菌

顺序特征：

特征关键词：CDS

位置：194..1537

特征测定方法：E

顺序CCGGGTGGCA AAACTTTAGC GTCTGAGGTT ATCGCAATTT GGTTATGAGA TTACTCTCGT 60TATTAATTTG CTTTCCTGGG TCATTTTTTT CTTGCTTACC GTCACATTCT TGATGGTATA 120GTCGAAAACT GCAAAAGCAC ATGACATAAA CAACATAAGC ACAATCGTAT TAATATATAA 180GGGTTTTATA TCT ATG GAT CAG ACA TAT TCT CTG GAG TCA TTC CTC AAC 229

Met Asp Gln Thr Tyr Ser Leu Glu Ser Phe Leu Asn

1 5 10CAT GTC CAA AAG CGC GAC CCG AAT CAA ACC GAG TTC GCG CAA GCC GTT 277His Val Gln Lys Arg Asp Pro Asn Gln Thr Glu Phe Ala Gln Ala Val

15 20 25CGT GAA GTA ATG ACC ACA CTC TGG CCT TTT CTT GAA CAA AAT CCA AAA 325Arg Glu Val Met Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Glu Gln Asn Pro Lys

30 35 40TAT CGC CAG ATG TCA TTA CTG GAG CGT CTG GTT GAA CCG GAG CGC GTG 373Tyr Arg Gln Met Ser Leu Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Val45 50 55 60ATC CAG TTT CGC GTG GTA TGG GTT GAT GAT CGC AAC CAG ATA CAG GTC 421Ile Gln Phe Arg Val Val Trp Val Asp Asp Arg Asn Gln Ile Gln Val

65 70 75AAC CGT GCA TGG CGT GTG CAG TTC AGC TCT GCC ATC GGC CCG TAC AAA 469Asn Arg Ala Trp Arg Val Gln Phe Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys

80 85 90GGC GGT ATG CGC TTC CAT CCG TCA GTT AAC CTT TCC ATT CTC AAA TTC 517Gly Gly Met Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe

95 100 105CTC GGC TTT GAA CAA ACC TTC AAA AAT GCC CTG ACT ACT CTG CCG ATG 565Leu Gly phe Glu Gln Thr Phe Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Pro Met

110 115 120GGC GGT GGT AAA GGC GGC AGC GAT TTC GAT CCG AAA GGA AAA AGC GAA 613Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu125 130 135 140GGT GAA GTG ATG CGT TTT TGC CAG GCG CTG ATG ACT GAA CTG TAT CGC 661Gly Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ala Leu Met Thr Glu Leu Tyr Arg

145 150 155CAC CTG GGC GCG GAT ACC GAC GTT CCG GCA GGT GAT ATC GGG GTT GGT 709His Leu Gly Ala Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly

160 165 170GGT CGT GAA GTC GGC TTT ATG GCG GGG ATG ATG AAA AAG CTC TCC AAC 757Gly Arg Glu Val Gly Phe Met Ala Gly Met Met Lys Lys Leu Ser Asn

175 180 185AAT ACC GCC TGC GTC TTC ACC GGT AAG GGC CTT TCA TTT GGC GGC AGT 805Asn Thr Ala Cys Val Phe Thr Gly Lys Gly Leu Ser Phe Gly Gly Ser

190 195 200CTT ATT CGC CCG GAA GCT ACC GGC TAC GGT CTG GTT TAT TTC ACA GAA 853Leu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Thr Glu205 210 215 220GCA ATG CTA AAA CGC CAC GGT ATG GGT TTT GAA GGG ATG CGC GTT TCC 901Ala Met Leu Lys Arg His Gly Met Gly Phe Glu Gly Met Arg Val Ser

225 230 235GTT TCT GGC TCC GGC AAC GTC GCC CAG TAC GCT ATC GAA AAA GCG ATG 949Val Ser Gly Ser Gly Asn Val Als Gln Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Met

240 245 250GAA TTT GGT GCT CGT GTG ATC ACT GCG TCA GAC TCC AGC GGC ACT GTA 997Glu Phe Gly Ala Arg Val Ile Thr Ala Ser Asp Ser Ser Gly Thr Val

255 260 265GTT GAT GAA AGC GGA TTC ACG AAA GAG AAA CTG GCA CGT CTT ATC GAA 1045Val Asp Glu Ser Gly Phe Thr Lys Glu Lys Leu Ala Arg Leu Ile Glu

270 275 280ATC AAA GCC AGC CGC GAT GGT CGA GTG GCA GAT TAC GCC AAA GAA TTT 1093Ile Lys Ala Ser Arg Asp Gly Arg Val Ala Asp Tyr Ala Lys Glu Phe285 290 295 300GGT CTG GTC TAT CTC GAA GGC CAA CAG CCG TGG TCT CTA CCG GTT GAT 1141Gly Leu Val Tyr Leu Glu Gly Gln Gln Pro Trp Ser Leu Pro Val Asp

305 310 315ATC GCC CTG CCT TGC GCC ACC CAG AAT GAA CTG GAT GTT GAC GCC GCG 1189Ile Ala Leu Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asp Val Asp Ala Ala

320 325 330CAT CAG CTT ATC GCT AAT GGC GTT AAA GCC GTC GCC GAA GGG GCA AAT 1237His Gln Leu Ile Ala Asn Gly Val Lys Ala Val Ala Glu Gly Ala Asn

335 340 345ATG CCG ACC ACC ATC GAA GCG ACT GAA CTG TTC CAG CAG GCA GGC GTA 1285Met Pro Thr Thr Ile Glu Ala Thr Glu Leu Phe Gln Gln Ala Gly Val

350 355 360CTA TTT GCA CCG GGT AAA GCG GCT AAT GCT GGT GGC GTC GCT ACA TCG 1333Leu Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser365 370 375 380GGC CTG GAA ATG CCA CAA AAC GCT GCG CGC CTG GGC TGG AAA GCC GAG 1381Gly Leu Glu Met Pro Gln Asn Ala Ala Arg Leu Gly Trp Lys Ala Glu

385 390 395AAA GTT GAC GCA CGT TTG CAT CAC ATC ATG CTG GAT ATC CAC CAT GCC 1429Lys Val Asp Ala Arg Leu His His Ile Met Leu Asp Ile His His Ala

400 405 410TGT GTT GAG CAT GGT GGT GAA GGT GAG CAA ACC AAC TAC GTG CAG GGC 1477Cys Val Glu His Gly Gly Glu Gly Glu Gln Thr Asn Tyr Val Gln Gly

415 420 425GCG AAC ATT GCC GGT TTT GTG AAG GTT GCC GAT GCG ATG CTG GCG CAG 1525Ala Asn Ile Als Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln

430 435 440GGT GTG ATT TAAGTTGTAA ATGCCTGATG GCGCTACGCT TATCAGGCCT 1574Gly Val Ile445ACAAATGGGC ACAATTCATT GCAGTTACGC TCTAATGTAG GCCGGGCAAG CGCAGCGCCC 1634CCGGCAAAAT TTCAGGCGTT TATGAGTATT TAACGGATGA TGCTCCCCAC GGAACATTTC 1694TTATGGGCCA ACGGCATTTC TTACTGTAGT GCTCCCAAAA CTGCTTGTCG TAACGATAAC 1754ACGCTTCAAG TTCAGCATCC GTTAACTTTC TGCGGACTCA CGCGCGCAGC ACTATGCCAG 1814TAAAGAAATC CCATTTGACT ATTTTTTTGA TAATCTTCTT CGCTTTCGAA CAACTCGTGC 1874GCCTTTCGAG AAGCAAGCAT TATATAATGC CAGGCCAGTT CTTCTTCAAT TGTCCCGTTT 1934TGA 1937

图1显示了pBR-sucAB的构建步骤。

图2显示了破坏大肠杆菌W3110的染色体DNA上的sucA基因的步骤。

图3显示了pGK的构建步骤。

Claims

1．一种具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，该突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氧酸脱氢酶活性增强。

2．一种发酵生产L-谷氨酸的方法，该方法包括：在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的埃希氏杆菌属突变体，所述突变体的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低，而磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶活性增强；在培养液中积累L-谷氨酸；并从中回收L-谷氨酸。