DE19904794A1 - Verfahren zur Verbesserung des Primärstoffwechsels von Säugerzelllinien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Primärenergiestoffwechsels von Säurezelllinien, bei dem in die Säurezellen gentechnisch ein Strukturgen für eine cytoplasmatische Hefe-Pyruvatcarboxylase eingeführt und zur Expression gebracht wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Pri­ märenergiestoffwechsels von Säugerzellinien, Expressionsvek­ toren zur Verwendung in dem Verfahren und nach dem Verfahren erhältliche rekombinante Säugerzellen mit verbessertem Pri­ märenergiestoffwechsel.

Glucose, eine der Hauptenergiequellen, kann nur zu einem sehr geringen Anteil vollständig zu CO₂ oxidiert werden. Der Groß­ teil wird als Lactat und Alanin freigesetzt. Da der Energiege­ winn bei der aeroben Glycolyse nur gering ist, wird der Ener­ giebedarf durch die Glutaminolyse gedeckt. Dabei entsteht als toxisches Nebenprodukt Ammonium.

Verschiedene Arbeiten haben gezeigt, dass die entscheidenden Enzyme, die das Endprodukt der Glycolyse, Pyruvat, in den Ci­ tratzyklus (TCA) überführen bei Zellinien nur schwache Ak­ tivität aufweisen (Fitzpatrick et al., 1993; Petch und Butler, 1994; Neermann und Wagner, 1996) (eine Aufstellung der zitier­ ten Literaturstellen befindet sich am Ende dieser Beschrei­ bung). Eine Verbindung zwischen der Glycolyse und dem Citrat­ zyklus sollte den Anteil an Glucose zum Energiestoffwechsel erhöhen und den Bedarf an Glutamin vermindern.

Überblick über den Energiestoffwechsel in Säugetierzellinien

Bei der Kultivierung von Säugetierdauerzellinien besitzen Glucose und Glutamin unter den zahlreichen, essentiellen Kom­ ponenten des relativ komplexen Nährmediums eine Sonderstel­ lung. Denn anders als bei Bakterien oder Hefen sind beide Sub­ strate als Energielieferanten nötig, wobei Glutamin als Haupt­ quelle der zellulären Energie (ATP) dient. Der Grad der zel­ lulären Energieversorgung aus Glutamin hängt dabei von der individuellen Zellinie sowie von der Präsenz und Konzentra­ tion von Glucose ab.

Der Primärenergiestoffwechsel von Säugetierzellen setzt sich somit aus der Glucose- und Glutaminoxidation zusammen und um­ fasst die Stoffwechselwege der Glycolyse, der Glutaminolyse und des Citratzyklus'. Ein vereinfachter Überblick über diese Primärstoffwechselwege mit Verzweigungen und entscheidenden Enzymfunktionen wird in Fig. 1 gegeben.

Glucosestoffwechsel

Über die Glycolyse werden in Säugerzellinien zwischen 80% und 97% der Glucose umgesetzt. Doch im Gegensatz zu Insekten- oder Primärzellen wird in transformierten Säugerzellinien fast die gesamte in der Glycolyse umgesetzte Glucose zu Lactat verar­ beitet, und nur ein sehr kleiner Teil (etwa 0,2 bis 5%) des Glucosekohlenstoffs bzw. der glycolytischen Intermediate ge­ langt in den energieliefernden Citratzyklus.

Auf welche Ursachen der annähernd durchgängige Umsatz von Glu­ cose zu Lactat bzw. die Blockade des Übergangs von glycolyti­ schen Intermediaten in den Citratzyklus bei fast allen Säu­ gerzellinien zurückzuführen ist, ist weitgehend ungeklärt.

In erster Linie wird vermutet, dass die Aktivität des vermit­ telnden Enzyms Pyruvatdehydrogenase, aufgrund niedriger Ex­ pressionsraten oder permanenter Inhibierung durch eine irre­ versible Phosphorylierung sehr gering ist. Als Resultat dieser Fehlregulation werden große Mengen Lactat in das Nährmedium abgegeben und führen dort zu einer unkontrollierten Ansäuerung der Kultur. Diese Umstände bedeuten eine geringe Effizienz bei der Ausnutzung der Nährstoffe, einen hohen Glucoseverbrauch und eine geringe Energieaubeute.

Glutaminstoffwechsel

Die Glutaminolyse stellt keinen einzelnen, durchgängigen Stoffwechselweg wie die Glycolyse dar, sondern bildet ein Netzwerk von bis zu acht, teilweise miteinander verknüpften, alternativen metabolischen Routen, auf denen Glutamin zu un­ terschiedlichen Graden oxidiert werden kann und die damit zu verschiedenen Energieausbeuten und Produktkombinationen füh­ ren.

Ein großer Teil des Glutamins wird deaminiert und über das In­ termediat a-Ketoglutarat in den Citratzyklus eingeschleust, wo es vollständig zu CO₂ oxidiert werden kann. Außerdem kann Glut­ amin auch teilweise zu den Aminosäuren Aspartat, Alanin oder auch zu Lactat umgewandelt werden. Diese können entweder ins Kulturmedium sekretiert oder, im Fall von Aspartat, über Oxal­ acetat in den Citratzyklus geschleust werden.

Die Wahl der Wege zur vollständigen oder nur teilweisen Oxida­ tion des Glutamins entscheidet über den Beitrag des Glutamins zum Energiehaushalt der Zelle. Untersuchungen an verschiedenen Säugerzellinien zeigten, dass Glutamin in Gegenwart von Glu­ cose den Energiebedarf der Zelle zu 30% bis 65% deckt, unter Umständen sogar zu 98%. Generell ist der Beitrag von Glutamin zum Energiehaushalt der Säugerzelle umso höher, je niedriger die Glucosekonzentration im Medium ist.

Ein entscheidendes Nebenprodukt des Glutaminabbaus ist Ammo­ nium. In Abhängigkeit vom glutaminolytischen Stoffwechselzweig können pro Mol Glutamin ein oder zwei Mol Ammonium freigesetzt werden, welches eine wachstumsinhibierende bis toxische Wir­ kung auf die Zellen hat. Einerseits kommt es zu einer Ernie­ drigung des intrazellulären pH-Wertes, andererseits führen hohe Mengen an Ammonium zu Veränderungen des Nucleotid- und Zuckernucleotidpools (Ryll et al., 1994; Valley et al., 1999), was einen deutlichen Einfluss auf die Expression der N-gly­ cosidisch gebundenen Kohlenhydratseitenketten von Glycopro­ teinen hat und somit die Produktqualität des Therapeutikums verändert (Gawlitzek et al. 1998; Grammatikos et al. 1998).

Metabolic Engineering in Säuqetierzellinien

Versuche, das Wachstum und die Produktivität von zellulären Systemen entscheidend zu verbessern, bedürfen wahrscheinlich der radikalen Veränderung bestimmter Substratflüsse des Ener­ giestoffwechsels. Dazu sind sehr genaue Kenntnisse über Schlüsselpunkte des Stoffwechsels notwendig.

Da aber ein irreversibler Eingriff in den Stoffwechsel gerade in den sensitiven Säugetierzellen mit größeren Schwierigkeiten verbunden ist, sind in Säugerzellen im Vergleich zu Bakterien und Hefen, erst sehr wenige Versuche zu einem rationalen De­ sign des Stoffwechsels erfolgt.

Tatsächlich haben nach heutigem Kenntnisstand erst sechs er­ folgreiche Versuche eines Metabolic Engineering im sog. Pri­ märstoffwechsel von Säugerzellen stattgefunden.

Den ersten Ansatz in Säugerzellinien veröffentlichten Pendse und Bailey (1994). Unter der Voraussetzung, ein erhöhtes in­ nerzelluläres ATP- bzw. Energieniveau steigere die Produkti­ vität, wurde das Gen für das bakterielle Vitreoscilla-Hämo­ globin (Vhb) in eine tPA-produzierende CHO-Zellinie kloniert. Die resultierende Vhb exprimierende Zellinie zeigte im Ver­ gleich zur nicht transfizierten Kontrollzellinie ein vermin­ dertes Wachstum, aber eine um 40% bis 100% gesteigerte spezi­ fische tPA-Produktion. Offensichtlich kann über erhöhte zellu­ läre Energiezustände sowohl Wachstum als auch Produktivität beeinflusst werden.

Renner et al. (1995) stellten durch Untersuchungen mit Wachs­ tumsfaktoren wie bFGF (basic fibroblast growth factor) einen Zusammenhang zwischen Zellzyklusphasen, Wachstum und Cyclin-E- Expression fest. Bei hoher Cyclin-E-Expression liegt in be­ stimmten CHO-Zellen ein Zellzyklus mit relativ langer G₁-Phase und kurzer S-Phase vor, und das Zellwachstum ist relativ hoch. Daraufhin klonierten die Autoren einen Cyclin-E-Expressions­ vektor in CHO-Zellen. Die transfizierte Zellinie zeigte auf­ grund der nun erhöhten Cyclin-E-Menge höhere Vermehrungsraten als die nicht transfizierten Kontrollzellen, besonders in pro­ teinfreien Basalmedien. Zudem waren die Zellmorphologie und die Zellzyklusphasenverteilung ähnlich der mit bFGF stimulier­ ten CHO-Zellen. Durch dieses metabolische Design des Zellzyk­ lus kann also Zellwachstum und -morphologie beeinflusst wer­ den.

Bell et al. (1995) klonierten einen Vektor mit einem Glutamin­ synthetasegen in eine Hybridomzellinie. Die transfizierte Hy­ bridomzellinie konnte aufgrund ihrer Glutaminsynthetaseak­ tivität im Gegensatz zur nicht transfizierten Kontrollzell­ inie in glutaminfreiem Nährmedium wachsen.

Diese Transfektion stellte einen entscheidenden Eingriff in den Glutaminmetabolismus und damit in den Primär- und Energie­ stoffwechsel der Säugerzelle dar. Gleichzeitig wurde das Prob­ lem der Vergiftung durch aus Glutamin gebildetes Ammonium über die Möglichkeit der glutaminfreien Kultivierung stark vermin­ dert.

Rees und Hay (1995) klonierten den kompletten bakteriellen Threonin-Stoffwechselweg in eine Säugerzellinie, so dass die­ se Zellinie in threoninfreiem Nährmedium wachsen konnte. Die Zellinie wurde mit zwei Vektoren transfiziert, von denen die Gene für Aspartokinase, Aspartatsemialdehyddehydrogenase, Homoserindehydrogenase, Homoserinkinase und Threonin-Syn­ thetase konstitutiv exprimiert wurden. Somit wurde der voll­ ständige bakterielle Biosyntheseweg für Threonin aus Aspartat in eine Säugerzellinie kloniert, für deren Kultivierung die relativ teuere Aminosäure Threonin nicht länger notwendig ist. Die transfizierte Zellinie zeigte bei hohen Aspartat-Konzen­ trationen in threoninfreiem Medium das gleiche Wachstumsver­ halten wie die nicht transfizierte Kontrollzellinie in threo­ ninhaltigem Medium.

Durch diesen Metabolic-Engineering-Ansatz könnten Nährmedien wesentlich einfacher und preisgünstiger gestaltet werden, ohne dabei Wachstum und Produktivität zu vermindern.

Ein weiterer Metabolic-Engineering-Ansatz zielte zwar nicht auf den direkten Primärstoffwechsel, aber auf die Glycosylie­ rung und damit die Funktionalität und Qualität von Glycopro­ teinen wie beispielweise EPO.

Schienke et al. (1997) cotransfizierten eine BHK-Zellinie mit Vektoren, die die Information für 2,6-Sialyltransferase und EPO gemeinsam trugen. Im Vergleich zu einer nur mit der EPO- cDNA transfizierten BHK-Zellinie wies das von dieser cotrans­ fizierten Zellkultur produzierte EPO am Ende der Kohlenhydrat­ seitenketten einen stark erhöhten N-Acetylneuraminsäure-Anteil auf, was auf die coklonierte 2,6-Sialyltransferase zurückzu­ führen ist.

Im Gegensatz zu der natürlicherweise in der BHK-Zellinie vor­ kommenden 2,3-Sialyltransferase kann die 2,6-Sialyltransferase N-Acetylneuraminsäure an N-Acetylgalactosamin-Reste der Koh­ lenhydratseitenketten anbinden. Nur mit dieser Veränderung be­ sitzt das EPO humanidentische Eigenschaften, die für die therapeutische Anwendung wichtig sein können.

Analysen, welche die Erfinder zum Glucose-Stofffluss in Säu­ gerzellinien vornahmen, ergaben einen Engpass bei der Ein­ gangsreaktion der Glycolyse, die von dem Enzym Hexokinase katalysiert wird.

Mit einem Ansatz zum Metabolic Engineering haben die Erfinder ein rekombinantes Hexokinase-Gen aus Rattenhirn in BHK-Zellen kloniert, um mit zusätzlicher Hexokinaseaktivität die ge­ schwindigkeitsbestimmende Reaktion der Glycolyse zu erweitern und den Stofffluss sowie die Zellenergiemenge in Form von ATP zu erhöhen.

In den rekombinanten Zellen lag die Hexokinaseaktivität bis zu 3fach höher als gewöhnlich, der Glucoseverbrauch stieg, der Stofffluss in der Glycolyse nahm zu und die intrazelluläre ATP-Konzentration stieg ebenfalls. Auch wurde der Glutamin­ metabolismus aktiviert. Allerdings sank die Zellwachstumsrate bei den Zellinien mit starker Hexokinaseaktivität und hohen ATP-Raten. Die Produktionsraten der Zellen für rekombinante Proteinprodukte stiegen hingegen. Ein hoher ATP-Gehalt scheint die Wachstumsraten der Zellen nicht zu fördern, unter Umstän­ den aber ihre Produktivität.

Aus den Ergebnissen ergab sich sehr deutlich ein Zusammenhang zwischen glycolytischem Stofffluss und Zellwachstum: Ein er­ höhter relativer oder absoluter glycolytischer Fluss hat ein vermindertes Zellwachstum oder eine verringerte Zellkonzentra­ tion zur Folge, da wahrscheinlich der Fluss des Pentosephos­ phat-Weges verringert und die Bildung von wachstumsreduzieren­ den Metaboliten wie UDP-N-Acetylhexosaminen erhöht wird.

Darüber hinaus scheint ein hoher ATP-Gehalt jedoch für die Er­ höhung der Produktivität bedeutend zu sein. Denn verschiedene Schritte der Proteinbiosynthese können direkt mit der Konzen­ tration von ATP oder GTP zusammenhängen. So stellte Jackson (1991) die Translationsrate für bestimmte rekombinante Pro­ teine direkt proportional zu Verfügbarkeit von ATP in Bezie­ hung.

Vor diesem Hintergrund erklärt sich auch die von den Erfindern gefundene höhere Produktbildungsrate in Zellen mit gesteiger­ tem ATP-Gehalt.

Insgesamt deutet sich also ein direkter Zusammenhang zwischen dem zellulären ATP-Gehalt bzw. der Menge an produziertem ATP und der Produktionsrate bzw. -menge von rekombinantem Protein an. Die Produktivität einer Zelle könnte direkt auch vom ATP- Gehalt und damit vom Energiemetabolismus der Zelle abhängen.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Ver­ fahrens zur Verbesserung des Primärstoffwechsels von Säuger­ zellinien.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einem Verfahren zur Verbesserung des Primärenergiestoffwechsels von Säugerzell­ inien gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Die Erfindung betrifft ferner Expressionsvektoren zur Ver­ wendung in dem Verfahren sowie nach dem Verfahren erhältliche rekombinante Säugerzellen mit im Vergleich zum Wildtyp ver­ bessertem Primärenergiestoffwechsel.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen rekombi­ nanten Zellinien zeigen vermehrte vollständige Glucoseoxida­ tion, verringerte Lactatproduktion, verminderten Glutaminver­ brauch, höheren ATP-Gehalt und höheren Sauerstoffverbrauch.

Ferner wachsen die rekombinanten Zellinien in Batch-Kulturen deutlich länger als Wildtyp-Zellinien und kommen mit den vor­ handenen Nährstoffressourcen länger aus.

Die rekombinanten Zellinien können mit den vorhandenen Nähr­ stoffen deutlich länger produzieren, so dass der Gesamtertrag des Produktes steigt und die Prozesskosten im Vergleich zu herkömmlichen Zellinien reduziert werden.

Weitere Vorteile, die sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielen lassen, werden im Laufe der sich anschließenden de­ taillierteren Beschreibung klar.

Vorteilhafte und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 ist ein Überblick über den Primärstoffwechsel in Säugerzellen.

Fig. 2a ist eine schematische Darstellung der gewöhnlichen Glucoseoxidation in Säugerzellinien.

Fig. 2b veranschaulicht die erfindungsgemäße Strategie für ein Metaboilic Engineering durch die Einschleusung eines cyto­ solisch exprimierten Pyruvatcarboxylase-Gens (PYC2) aus Hefe in die Zellen nach einer bevorzugten Ausführungsform der Er­ findung.

Fig. 3 zeigt die Befreiung des 5'- und 3'-Bereiches des PYC2-Gens von flankierenden hefespezifischen Sequenzen.

Fig. 4 ist eine schematische Zeichnung des Expressionsvektors pCMVSHE-PYC2 sowie des Selektionsvektors pAG60.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Fi­ guren detaillierter erläutert.

Um den negativen Effekt eines hohen glycolytischen Stoffflus­ ses zu umgehen, jedoch die Ausnutzung der Glucose im Hinblick auf die ATP Produktion zu verbessern, musste eine anderer Weg als im Stand der Technik eingeschlagen werden.

Dieser setzte bei der Tatsache an, dass die Aktivitäten aller Enzyme, die die Glycolyse mit dem Citratzyklus verbinden, wie Pyruvatdehydrogenase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase und Pyru­ vatcarboxylase (PC), bei Zellinien im Vergleich zu Primärzel­ len wenig oder gar nicht vorhanden sind (Fig. 2a).

Insbesondere das Fehlen der Pyruvatcarboxylase ist bereits als Erbkrankheit gut bekannt, wobei die Patienten an einer starken Azidose leiden, die zu einem frühen Tod führt. Um eine Schleu­ sung von Glucose- und Pyruvat-Kohlenstoff in den Citratzyklus bei Zellinien zu gewährleisten, wurde erfindungsgemäß ein zu­ sätzlicher metabolischer Seitenweg durch die Einführung einer cytoplasmatisch exprimierten Pyruvatcarboxylase (PC) einge­ führt.

Die natürliche PC wird in den Mitochondrien exprimiert und ist strikt abhängig von der Anwesenheit ausreichender Mengen Ace­ tyl-CoA. Da jedoch die Menge an Acetyl-CoA in Zellinien auf­ grund der fehlenden Versorgung mit diesem Metaboliten über Pyruvat als kritisch einzustufen war, konnte der Weg über die Erhöhung der Gendosis, ähnlich wie bei der Hexokinase, hier nicht beschritten werden.

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae jedoch ist die Pyruvat­ carboxylase, auch ohne die Anwesenheit von Acetyl-CoA aktiv ist (Colowick und Kaplan).

Nach Bereinigung des Gens für PYC2 von hefespezifischen Se­ quenzen, die zu Problemen bei der Expression in Säugerzell­ inien führen könnten, wurde ein Expressionsplasmid in BHK- Zellen transfiziert und im Cytoplasma zur Expression gebracht.

Mit der Expression einer cytoplasmatischen Pyruvatcarboxylase (PYC2) aus Saccharomyces cerevisiae ist zum erstenmal die Ex­ pression eines Hefegens in Säugerzellinien gelungen.

Dieser neue Schritt ermöglicht nun den Zellen, Pyruvat aus der Glycolyse noch im Cytoplasma zunächst in Oxalacetat und dann mit der schon vorhandenen cytoplasmatischen Malatdehydrogenase zu Malat umzuwandeln, welches dann via Malat-Aspartat-Shuttle in die Mitochondrien zur weiteren Oxidation eingeschleust wer­ den kann (Fig. 2b).

Fig. 2a zeigt eine schematische Darstellung der gewöhnlichen Glucoseoxidation in Säugerzellinien. In den Mitochondrien von Primärzellen wird Pyruvat normalerweise zu Acetyl-CoA durch den Pyruvatdehydrogenase-Komplex (PDHC) decarboxyliert und in den Citratzyklus eingeschleust. In Säugerzellinien wird wenig oder keine PDHC-Aktivität gefunden. Ebenfalls sind die Pyru­ vatcarboxylase- (PC) und Phosphoenolpyruvatcarboxykinase- (PEPCK) Aktivitäten sehr gering.

Fig. 2b zeigt die Strategie für ein Metabolic Engineering durch die Einschleusung eines cytosolisch exprimierten Pyru­ vatcarboxylase-Gens (PYC2) aus Hefe in die Zellen. Pyruvat wird jetzt zu Oxalacetat konvertiert und in die Mitochondrien als Malat via Malat-Aspartat-Shuttle geschleust. PYC2 konkur­ riert mit der Lactatdehydrogenase (LDH) um den cytoplasmati­ schen Pyruvat-Pool, wodurch weniger Substrat für die Lactat­ bildung zur Verfügung steht. Darüber hinaus wird NAD⁺ durch die cytoplasmatische Malatdehydrogenase (MDH_cyt) zurückgebildet. Außerdem bietet die Rückreaktion über das Malatenzym (ME) einen weiteren nützlichen Zyklus zur Bildung des wichtigen NADPH. 1 = MDH_cyt, 2 = ME

Mit diesem Schritt wurden nun 3 wesentliche Vorteile in den neuen rekombinanten Zellen erreicht:

• 1. Mehr Glucose-Kohlenstoff kann im Citratzyklus vollständig oxidiert werden.
• 2. Die rekombinante cytoplasmatische Pyruvatcarboxylase kon­ kurriert mit der Lactatdehydrogenase um das Substrat Py­ ruvat und entzieht dieser Substratmengen für die Bildung von Lactat.
• 3. Die Malatdehydrogenase-Reaktion führt zur Rückbildung von NAD⁺ aus NADH, welches der Glycolyse wieder auf der Stufe der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase zur Ver­ fügung steht. Dieser Schritt vermindert die Bedeutung der Lactatdehydrogenase-Reaktion zur Rückbildung von NAD⁺. In Abhängigkeit der Einschleusrate von Malat über den Shutt­ le-Mechanismus in die Mitochondrien kann außerdem ein Malatüberschuss unter Bildung von NADPH durch die Anwe­ senheit des Malatenzyms unter Rückbildung von Pyruvat de­ carboxyliert werden. NADPH wird für viele aufbauende Pro­ zesse und Synthesen gebraucht.

In den rekombinanten BHK-Zellen konnte der Glucoseverbrauch um den Faktor 4, sowie der Glutaminverbrauch um das 2fache im Vergleich zu den herkömmlichen BHK-Zellen reduziert werden. Darüber hinaus ließ sich ein 1,4fach höherer ATP-Gehalt bei vergleichbar gutem Wachstum nachweisen (Tab. 1).

Die Bestätigung, dass auch wirklich Glucose-Kohlenstoff in den Citratzyklus gelangt, wurde mit Hilfe radioaktiv markierter Glucose und markiertem Pyruvat über die Freisetzung von ra­ dioaktivem ¹⁴CO₂ geführt und eine höhere Glucoseoxidation unter­ mauert.

Der zellspezifische Sauerstoffverbrauch, der ein Indiz für den oxidativen Stoffwechsel ist, stieg bis um den Faktor 3 bei der rekombinanten, PYC2 exprimierenden Zellinie im Vergleich zur Ursprungszelle an. Durch die geringeren Substratverbrauchsmen­ gen ergibt sich eine höhere Produktmenge pro verbrauchtem Sub­ strat, so dass sich nun mit diesen rekombinanten Zellinien Pharmaproteine über einen längeren Zeitraum mit dem vorhan­ denen Kulturmedium herstellen lassen, welches letztendlich zur Verminderung der Gesamtherstellungskosten beiträgt.

Tabelle 1

Stoffwechseldaten für Wildtyp-Zellen und PYC₂-transfizierte Zellklonkulturen

Hierzu wurden auf an sich bekannte Weise Plasmide hergestellt, die das PYC2-Gen aus Hefe tragen und BHK-Zellen entprechend damit transfiziert. Dem Fachmann ist klar, dass statt der BHK- Zellen auch andere Zellen verwendet werden können. Der Erfolg wurde über stoffwechselspezifische Daten verifiziert. Der Flux von Glucose in den TCA ist leicht erhöht. Die Sauerstoffver­ brauchsrate, ein Indiz für den oxidativen Phosphorylierungs­ grad, ist ebenfalls erhöht.

Es zeigt sich außerdem, dass die metabolisch veränderten PYC- tragenden rekombinanten Zellen einen geringeren Glucose- und Glutaminverbrauch aufweisen. Gleichzeitig sinkt die Lactatpro­ duktionsrate. Als Folge ist der Wachstumszyklus der PYC-Zellen in Batchkultur gegenüber den unveränderten Zellen verlängert. Das bedingt für eine Batchfermentation eine verbesserte Sub­ stratnutzung und damit eine verlängerte Produktionsphase.

In kontinuierlichen Kulturen konnten die Erfinder zeigen, dass aufgrund des reduzierten Substratverbrauchs der rekombinanten Zellen die verbesserte Substratverwertung zu einer höheren Zellkonzentration im Fließgleichgewicht des Chemostaten führt.

In Zukunft soll unter Verwendung von EPO als Modellprotein un­ tersucht werden, ob die zellspezifische Produktivität bzw. die Raum-Zeit-Ausbeute im Fermenter erhöht werden kann.

Herstellung des Genkonstrukts

Die cDNA der Pyruvatcarboxylase (PYC2, Isoenzym 2) aus Saccha­ romyces cerevisiae wurde von R. Stucka (Stucka et al., 1991) bezogen. Um mögliche Wechselwirkungen des an den codierende Bereich angrenzenden Hefevektor-Fragments zu vermeiden, wurde die cDNA durch Endonuclease-Restriktion und Ligation nach im Stand der Technik gut bekannten Verfahren mit kleinen PCR- Fragmenten bis auf die essentiellen codierenden Sequenzen zurechtgeschnitten (Fig. 3).

Die veränderte cDNA wurde unter die Transcriptions-Kontrolle eines CMV-Promotors gestellt. Das resultierende pCMVPYC2-Plas­ mid enthält darüberhinaus ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Es ist klar, dass auch andere Promotoren und Resistenz-Gene oder all­ gemein Selektionsmarker verwendet werden können.

Fig. 3 zeigt die Befreiung des 5'- und 3'-Bereiches des PYC2-Gens von flankierenden hefespezifischen Sequenzen.

Zunächst wurde mit PvuII ein 678-bp-Fragment vom 5-Ende herausgeschnitten, mit PCR (Polymerasekettenreaktion) über spezifische Primer die fehlenden 381 bp ligiert und eine HindIII-Schnittstelle vor der codierenden Sequenz angebaut.

Für das 3'-Ende wurde entsprechend über die ClaI-Schnittstelle durch Entfernung von 469 bp und Ligation mit einem 176 bp langen Fragment verfahren. Das Fragment wurde mit einer HindIII- und SmaI-Schnittstelle am 3'-Ende versehen.

Herstellung rekombinanter BHK-Zellen

Das Plasmid pCMVSHE-PYC2 wurde mit einem Neomycin-Resistenz- Plasmid (pAG60) mit Hilfe der Calciumphosphat-Copräzipita­ tions-Methode (Maitland and McDougall, 1977) in BHK-21A Zellen nach einem veränderten Protokoll von Kriegler (Kriegler, 1990) transfiziert (Fig. 4). Nach Entfernen der Präzipitate wurde kein osmotischer Schock durch die Zugabe von Glycin angewandt. Die letzteren Maßnahmen können aber durchgeführt werden, wenn die praktischen Gegebenheiten es erfordern. Es sind auch an­ dere, im Stand der Technik bekannte Transfektionsverfahren anwendbar.

Fig. 4 ist eine schematische Zeichnung des Expressionsvektors pCMVSHE-PYC2, basierend auf dem Standardexpressionsvektor pCMVSHE. Es bedeuten: CMV: Cytomegalovirus immediate early enhancer promotor; SVpA: late polydenylation signal, splice sites, SV40 early late splice sites.

Literaturverzeichnis

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Claims (9)

1. Verfahren zur Verbesserung des Primärenergiestoffwechsels von Säugerzellinien, bei dem

• a) geeignete Säugerzellen mit einem oder mehreren Ex­ pressionsvektoren, der/die
  • a) ein Strukturgen für eine cytoplasmatische Hefe- Pyruvatcarboxylase,
  • b) einen geeigneten Promotor zur Transkriptionskon­ trolle und
  • c) einen oder mehrere Selektionsmarker enthält/ent­ halten,
  transformiert oder transfiziert werden,
• b) die Zellen unter zur Expression und Selektion geeig­ neten Bedingungen gezüchtet und
• c) überlebende Zellklone isoliert und/oder fermen­ tiert/kultiviert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Säuger­ zellen um BHK-Zellen handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Hefe um Saccharomyces cerevisiae handelt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Promotor um den CMV-Promotor handelt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Selektionsmarker um ein Ampicillin-Resis­ tenz-Gen handelt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Selektionsmarker um ein Geneticin-Resis­ tenz-Gen handelt.

7. Expressionsvektor zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der ein Strukturgen für eine cytoplasmatische Hefe-Pyruvatcarboxylase enthält.

8. Expressionsvektor nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Hefe um Saccharomyces cerevisiae handelt.

9. Rekombinante Säugerzellen mit verbessertem Primärenergie­ stoffwechsel, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.