CN101163792B - 包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含鼠CMV启动子和人巨细胞病毒主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体，含此表达载体的哺乳动物宿主细胞以及用该表达载体制备重组蛋白的方法。

Description

包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体

本发明涉及一种包含鼠CMV启动子和人巨细胞病毒主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体，包含所述表达载体的CHO细胞和CHO细胞系以及利用所述表达载体制备重组蛋白的方法。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)哺乳动物表达系统已广泛用于制备重组蛋白。除淋巴样细胞(如NS-0)外，它是少数能够简单有效高密度悬浮批量培养的动物细胞的类型之一。而且，CHO细胞能获得非常高的产量，对抗代谢应力的能力相当强，而产业规模培养淋巴样细胞较难以。鉴于生产成分的考虑，最重要的是要在每次生物反应器运行时获得最高的重组蛋白产量。培养液组成物的选择和生物反应器的设计以及操作是影响产量的参数，要对其进行优化非常复杂。显著影响细胞系多肽产生量的其它因素有基因拷贝数、基因转录效率和mRNA翻译效率、mRNA的稳定性和蛋白分泌效率。因此，提高控制产物蛋白表达的启动子的强度和转录活性可增加产率。在高密度批量或补料批量培养中细胞水平的数量增加将会转变成产品产量的增加，表现为稳定期基因表达的细胞密度可达到10⁶-10⁷细胞/毫升范围。

对于转导哺乳动物细胞，迄今的大多数基因转移实验采用在病毒启动子元件控制下的编码转基因的病毒载体。一种最常用于这些表达盒中的启动子为人巨细胞病毒(hCMV)立即早期(IE)基因。该基因的增强子/启动子能在各种细胞类型中指导高水平的转基因表达。该启动子的活性依赖于一系列的17、18、19和21bp不完全重复序列，其中一些序列能结合转录因子NF-κBcAMP反应结合蛋白(CREB)和核因子-1家族。然而，hCMVIE启动子的缺点是具有明显的物种偏爱性。

US5,866,359描述了一种用弱启动子共表达腺病毒E1A蛋白来增强已含强的hCMV启动子的CHO和NSO细胞表达的方法。E1A是一种作用于细胞生命周期调节含有独立转录激活和抑制功能结构域的多功能转录因子。E1A表达的微调对实现基因反式激活和任何对细胞周期进程反面影响之间的理想平衡至关重要。然而，E1A的不良过量表达可降低细胞合成感兴趣的重组蛋白的能力。

US5,591,639描述了含有人巨细胞病毒(hCMV-MIE)主要立即早期基因启动子、增强子和完整5`-非翻译区的载体，其含有位于异源基因上游的内含子A。该大约2100bp的DNA序列可引起数种异源基因产物的高水平表达。然而，Chapman等人在Nucleic Acids Research，19(1991)，3979-3986中报道了当表达质粒中存在该人序列的前400bp时，观察到在猴肾细胞(COS7)和中国仓鼠卵巢细胞(DXB11)中均几乎不表达糖蛋白。删除这些上游调控序列可导致这些细胞类型中数种哺乳动物糖蛋白的较高水平表达。而且，对SV40早期和hCMV立即早期启动子/增强子的比较显示hCMV启动子的活性可通过插入人巨细胞病毒主要立即早期基因的内含子A而得到增强。

已知在CHO细胞中小鼠巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子(mCMV IE启动子)的转录活性比hCMV启动子的转录活性要高得多。该mCMV IE启动子能驱使高水平表达而无hCMV IE启动子所见的明显物种偏爱性(Addison等Journal of GeneralVirology(78(1997)，1653-1661))。然而，将小鼠主要立即早期基因的天然第一内含子插入mCMV启动子的下游来增强mCMV启动子的活性(类似于hCMV启动子)的尝试失败了。与hCMV启动子情况相反(见US5,591,639)，发现mCMV的此天然第一内含子显著降低了mCMV启动子对重组基因的表达(见WO2004/009823 A1)。

本领域仍然需要增强mCMV启动子的活性。因此，本发明要解决的技术问题是提供一种基于mCMV启动子的表达系统，需要能在哺乳动物宿主细胞(具体是CHO细胞)中增强mCMV启动子驱使的蛋白表达。

本发明所述技术问题通过提供一种操作性连接于编码所需重组蛋白的异源基因序列的含有小鼠CMV启动子和人巨细胞病毒的主要立即早期基因第一内含子(第一hCMV内含子)的哺乳动物表达载体而得到解决。所述mCMV启动子加位于mCMV启动子下游的第一hCMV内含子构成了驱动下游编码序列表达的调控单元。本发明的哺乳动物表达载体是在CHO细胞中高水平表达重组基因产物特别有用的表达载体构建物。令人惊喜的是，本发明载体的表达盒中包含的与第一hCMV内含子组合的mCMV启动子驱动的异源蛋白产物表达水平高于只含有mCMV启动子的载体所见水平。mCMV启动子加第一hCMV内含子驱使的异源蛋白表达水平至少等于hCMV启动子加第一hCMV内含子驱动的蛋白表达水平。不希望受任何特定理论的束缚，发明人认为第一hCMV内含子的存在明显促进了从相应的mRNA有效合成蛋白。鉴于mCMV启动子的活性与第一mCMV内含子组合后未能得到增强的事实，这些发现是出乎预料的并且令人惊奇的。

本发明内容中“哺乳动物表达载体”优选是为分离和纯化的DNA分子，将其转染入适当的哺乳动物宿主细胞中可提供该宿主细胞高水平表达重组基因产物。除了编码重组或异源基因产物的DNA序列外，该表达载体还包含在宿主细胞中能有效转录编码序列的mRNA和有效翻译所述mRNA所必需的调控DNA序列。具体说，本发明的表达载体包含至少一个调控单元，其包含操作性连接于重组蛋白编码序列的与人巨细胞病毒主要立即早期基因第一内含子(内含子A)联合的至少一个mCMV启动子序列，并驱动编码蛋白的表达。包含mCMV启动子加第一hCMV内含子的所述调控单元与异源基因的编码序列直连，或通过间插的DNA(例如：通过异源基因的5`非翻译区或其一部分)而与异源基因的编码序列分隔。

本发明哺乳动物表达载体的启动子是鼠巨细胞病毒的主要立即早期基因(mCMVIE或mCMV启动子)。所述鼠CMV(mCMV)IE启动子最初由Dorsch-Hasler等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，82(1985)，8325-8329报道，其全文纳入本文作为参考。

鼠巨细胞病毒(mCMV)是疱疹病毒属高度趋异组的成员。即使在不同种宿主的巨细胞病毒之间也有很大差异。例如，mCMV与人巨细胞病毒(hCMV)在生物学属性、立即早期(IE)基因的构成和整个核苷酸序列方面有明显不同。mCMV的235kbp基因组也缺乏hCMV的特征性大段内部和末端重复序列。因此，不存在mCMV基因组的异构形式(Ebeling，A等，(1983)，J.Virol.47，421-433；Mercer，J.A.等，(1983)，Virology129，94-106)。

“启动子”定义为一种通过引导RNA聚合酶连接到DNA并启动RNA合成来介导转录起始的DNA序列。已知mCMV启动子是强启动子，即能引起高频率转录的启动子。而且已知载体中存在mCMV启动子将增强对CHO细胞的转染率，优选地采用包含针异源基因的第一转录单元，和包含含有谷氨酰胺合成酶(GS)标记基因的第二转录单元的载体，其中所述第一单元引起宿主细胞表达蛋白产物，而所述第一转录单元受mCMV启动子的控制。

本发明所用的启动子也可以是mCMV启动子的功能性片段或其功能性序列变体。因此，具有介导转录起始功能或能介导转录起始从而能瞬时或稳定地驱动重组或异源产物基因表达的mCMV启动子的任何序列变体或片段均可用作mCMV启动子。mCMV启动子的“功能性变体”包括含有碱基插入、删除或点突变的天然mCMV序列，可用本领域熟知方法产生，如引物-定向PCR、‘易错PCR’、重叠DNA片段的被称为‘基因重组’的PCR-重装，或先在体内随机诱变细菌克隆，再经文库转染和在CHO细胞中进行功能性选择来产生。例如，随机诱变可通过烷化化学试剂或UV辐射来实现，如在Miller，J.，《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics)，ColdSpring Harbor Laboratory(1972)中所述。任选地，可以采用宿主菌的天然突变菌株。优选地，此类变体序列的DNA序列与天然小鼠CMV启动子对应部分至少65％同源、更优选地，75％同源、最优选地90％同源。mCMV启动子功能性序列变体的例子是含有转录起始位点的经基因工程改造而设置了合适的限制性位点用于插入重组产物基因的启动子序列。

在本发明的一优选实施方式中，采用的mCMV启动子与US4,968,615中所述的约2.1kb的PstI大片段基本上相对应。另一优选实施方式中，所采用的mCMV启动子是包含转录起始位点(+0)并向上游延伸至约-500位的片段。另一优选实施方式中，采用从转录起始位点向上游延伸至XhoI限制性位点(距天然转录起始位点约-150位置处)或甚至延伸至距天然转录起始位点上游是-100位置处的核心启动子。还有另一优选实施方式中，采用的mCMV启动子是mCMV启动子的从-491到+36的片段或从-1336到+36的片段，见Addison等，J.Gen.Virol.，78(1997)，1653-1661所述。

本发明的一优选实施方式中，所采用的第一hCMV内含子(hCMV内含子A或人CMV内含子A)与由Chapman等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，19(1991)，3979-3986所定义的823bp序列基本上对应。

本发明采用的第一hCMV内含子也可以是其功能性片段或功能性序列变体。因此，具有mCMV启动子转录活性功能或能增强mCMV启动子转录活性的hCMV内含子A的任何序列变体或片段均可用作hCMV内含子。第一hCMV内含子的“功能性变体”包括含有碱基插入、删除或点突变的天然mCMV序列。功能性变体的序列含有单个碱基修饰，使翻译起始信号更靠近翻译起始的Kozak共有序列。功能性变体还包括如Chapman等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，19(1991)，3979-3986所定义的823bp截短序列，因此，本发明的功能性变体序列长度至少为100-150bp，优选至少200-300bp，更优选至少400-500bp，最优选至少600-700bp。本发明的功能性变体序列的全长显示与Chapman等，《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，19(1991)，3979-3986所定义的823bp序列至少60％同源，优选至少70％同源，更优选为至少80％同源，最优选至少90％或95％同源。

本发明内容中，术语“异源编码序列”、“异源基因序列”、“异源基因”、“重组基因”、“感兴趣的基因”和“转基因”可互换使用。这些术语用于DNA序列时指编码重组或异源基因产物的DNA序列。所述异源基因序列在宿主细胞中天然不存在而且来自不同种的生物。可使本发明的重组或异源基因产物在哺乳动物细胞中表达和大量收集。所述基因产物也可以是肽或多肽，可以是任何感兴趣的蛋白质，如治疗蛋白质(如白介素)或酶或多聚蛋白质的亚单元(如抗体或其片段)。所述重组产物的基因可包含信号序列，其编码的信号肽可使宿主生产细胞表达的多肽分泌出来的。因此，在本发明的进一步优选的实施方式中，产物蛋白是为分泌蛋白质。更优选地，所述产物蛋白是抗体或工程改造的抗体或其片段，最优选是免疫球蛋白G(IgG)抗体。

本发明的另一优选实施方式中，该哺乳动物表达载体还包含鼠IgG 2A基因座DNA的一部分，此部分能进一步增强mCMV启动子的活性，见WO2004/009823 A1中所述，其作为参考纳入本文。从WO2004/009823 A1中可知鼠IgG 2A的靶向序列甚至可促进表达载体瞬时转染的CHO细胞的基因表达。优选的鼠IgG 2A基因座的DNA部分是5.1kb BamHI染色体片段，其包含鼠Igγ2A除CH1外显子最远端5`部分以外的所有编码区域(Yamawaki-kataoka，Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1982)79：2623-2627；Hall，B等，Molecular Immunology(1989)26：819-826；Yamawaki-Kataoka，Y.等，Nucleic Acid Research(1981)9：1365-1381)。

优选本发明的表达载体还含有有限数目的有用的限制性位点，用于插入含有在mCMV启动子加第一hCMV内含子序列控制下的重组基因的表达盒。在只具体用于瞬时/附加型表达时，本发明的表达载体还可含复制起点如EB病毒(Epstein Barr病毒)或SV40病毒的复制起点，用于在真核宿主细胞中自主复制/附加型维持，但是可不带选择性标记。本发明的表达载体可以是，例如但不限于：线性DNA片段、含核靶向序列的DNA片段，或可经特异性优化而能与转染试剂反应的载体、动物病毒或能在细菌中穿梭和产生的合适的质粒。

优选本发明的哺乳动物表达载体还包含至少一种在动物细胞中可选择的可表达标记。可采用任何常用的选择标记，如胸苷激酶(tK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。在一优选的实施方式中，采用可表达GS的选择标记(Bebbington等，1992，采用谷氨酰胺合成酶基因作为可扩增可选择标记用骨髓瘤细胞高水平表达重组抗体(High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cellsusing a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker)，Bio/Technology 10：169-175；Cockett等，1990，利用谷氨酰胺合成酶基因扩增在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高水平表达金属蛋白酶的组织抑制剂(Highlevel expression oftissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary(CHO)cellsusing Glutamine synthetase gene amplification)，Bio/Technology 8：662-667)。GS系统是制备治疗性蛋白质特别重要的唯一的两种系统之一。与二氢叶酸还原酶(DHFR)系统相比，由于常可从原始转染子创建高产细胞系而无需在高浓度选择试剂存在下进行多轮选择即可实现基因扩增，因此所述GS系统开发过程中有巨大的时间优势(Brown等，1992，利用谷氨酰胺合成酶(GS)系统制备重组抗体的方法进展(Process development for the production of recombinant antibodies using theglutamine synthetase(GS)system)，Cytotechnology 9：231-236)。不用说与表达标记基因的第二转录单元相同，产物基因和标记基因的表达单元均可通过采用本领域常规采用的内部核糖体进入位点，而使用单顺反子表达盒。

本发明的哺乳动物表达载体的一优选实施方式中，从一个双顺反子转录单元制备所述重组或异源基因产物和可选择标记为。也就是说，由mCMV启动子和第一hCMV内含子组成的调控单元驱动了位于下游的异源或重组基因序列的表达和也位于下游的可选择标记的表达。已知双顺反子载体能有效地共扩增可选择标记和重组基因。也已证明一个转录单元中的两个开放读码框表达可产生高水平的蛋白质产量。在本发明哺乳动物表达载体的另一优选实施方式中，感兴趣的基因，即重组或异源基因，和可选择标记基因位于不同的转录单元，即它们的表达受不同启动子的驱动。在此实施方式中，也可将可选择标记基因置于mCMV启动子和第一hCMV内含子组成的调控单元的控制下。然而，也可用另一个启动子的驱动可选择标记的表达，如，SV40早期和晚期启动子之一，杂交的莫洛尼鼠白血病病毒-SV40启动子SRM或hCMV启动子。

本发明的另一优选实施方式涉及包含至少两种分开的转录单元的哺乳动物表达载体。此种表达载体也称为双基因载体。一优选的实施方式中，第一和第二转录单元各包含不同的感兴趣重组基因。优选第一转录单元包含受本发明调控单元(即mCMV启动子加hCMV内含子)控制的第一产物基因或异源编码序列，在宿主细胞中表达产生第一产物蛋白质，第二转录单元包含受本发明调控单元控制的第二产物基因或异源编码序列，在宿主细胞中表达产生第二产物蛋白质。此类载体的例子有双基因载体，该载体中第一转录单元包含编码抗体重链的基因，第二转录单元包含编码该抗体轻链的基因。然而，也可用本发明调控单元以外的调控单元所驱动包含重组基因序列的第二转录单元的表达。所述第二转录单元可以包含例如hCMV启动子。

在本发明的另一优选实施方式中，哺乳动物表达载体包含至少一个(第一)产物基因的转录单元，在宿主细胞中表达产生该产物蛋白质，此转录单元受本发明调控单元(即mCMV启动子加第一hCMV内含子)的控制，并且还包含含有标记基因，优选谷氨酰胺合成酶(GS)标记基因的第二转录单元。所述产物基因或感兴趣的基因(GOI)可以是例如免疫球蛋白编码序列。谷氨酰胺合成酶标记基因是任何具有酶活性的GS编码序列，可以是天然基因序列或其变体。这里应用的上述“功能性变体”具有上述定义，同样包括优选范围的序列同源性。此类表达载体在CHO细胞中的转染效率比含有在hCMV启动子控制下感兴趣的基因的第一转录单元的表达载体高得多。尽管事实上在CHO细胞中，mCMV启动子的转录活性比hCMV启动子要高得多；但通常认为转染时较高的代谢负荷将减少转染克隆的存活，产生转染子的数量低。因此其效果与表达的产物蛋白质的数量或意外毒性不明显相关，表达的蛋白质毒性可能反过来影响转染子的生长。

本发明的另一方面涉及一种包含mCMV启动子加位于mCMV启动子序列下游的第一hCMV内含子的调控单元。当本发明的调控单元操作性连接于某基因序列时，在哺乳动物细胞环境中，它可介导此基因序列转录的起始和稳定RNA转录物并促进相应的mRNA有效合成蛋白质。优选本发明的调控单元侧接一个或多个合适的限制位点而能将该调控单元插入载体和异源基因产物编码序列的上游和/或使它能从载体中释放。本发明的一优选实施方式中，所述调控单元上游侧接了一个AscI限制位点，下游侧接了一个HindIII限制位点。因此，本发明的调控单元可用于构建表达载体，具体是哺乳动物表达载体。

本发明另一方面还涉及一种包含本发明调控单元和转录单元，即编码重组或异源蛋白产物的DNA序列的表达盒。所述调控单元位于所述转录单元的上游并与其操作性相连。本发明的调控单元可直接与转录单元(即异源基因的编码序列)相连或被间插的DNA如异源基因的5`非翻译区所隔开。优选该表达盒侧接于一个或多个合适的限制位点使得能将该表达盒插入载体中和/或从载体中切除。因此，本发明的表达盒可用于构建表达载体，具体是哺乳动物表达载体。

本发明还有一个方面涉及含有本发明哺乳动物表达载体的哺乳动物宿主细胞。所述哺乳动物宿主细胞可以是人或非人细胞。哺乳动物宿主细胞的优选例子包括但不限于：MRC5人纤维母细胞、983M人黑色素瘤细胞、MDCK犬肾细胞、分离自Sprague-Dawley大鼠的RF培养的大鼠肺纤维母细胞、B16BL6鼠黑色素瘤细胞、P815鼠肥大细胞瘤细胞和MT1A2鼠乳腺腺癌细胞。在特别优选的实施方式中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或细胞系(Puck，1958，J.Exp.Med.108：945-955)。合适的CHO细胞系包括如CHO K1(ATCC CCL-61)、CHO pro3-、CHO DG44、CHOP12或dhfr-细胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS 77，1980，4216-4220)或DUXB11(Simonsen等，PNAS 80，1983，2495-2499)。

为了将表达载体诱导入本发明的哺乳动物宿主细胞中，如果对给定的宿主细胞类型合适，可采用任何转染技术，例如本领域熟知的技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡萄糖转染、脂转染。应该注意，可用本发明载体转染的哺乳动物宿主细胞应是可瞬时或稳定转染的细胞系。因此，本发明的哺乳动物表达载体可维持于游离体形式或可稳定地整合进哺乳动物宿主细胞的染色体组中。

瞬时转染的特征是对含有选择标记的载体不施加任何选择压力。来源于瞬时转染的细胞群或一批细胞包括插入了外来DNA并表达的细胞和没有插入外来DNA的细胞的混合细胞群。在转染后通常持续20-50小时的瞬时表达实验中，转染的载体维持为游离型元件尚未整合入染色体中，即转染的DNA，经常没有整合入宿主细胞染色体中。宿主细胞倾向于丢失转染的DNA培养瞬时转染细胞群时细胞群中的转染细胞过度生长。因此在紧接转染后的时间内表达最强而随时间推移减弱。优选理解本发明的瞬时转染子是能在转染后在没有选择压力的细胞培养中维持表达90个小时的细胞。

在本发明一优选实施方式中，用本发明的哺乳动物表达载体稳定转染哺乳动物宿主细胞，如CHO宿主细胞。稳定转染指新引入的外来DNA(例如载体DNA)，通常通过随机非同源重组而掺入染色体DNA中。可通过选择扩增地载体序列已整合入宿主细胞DNA中的细胞系来提高载体DNA的拷贝数目和伴随的基因产物数量。因此，这种稳定整合有可能在接触基因扩增进一步选择压力时在CHO细胞中加倍产生微小染色体。而且，就载体序列而言，稳定转染会导致丢失与重组基因产物表达不直接相关的载体序列部分，如，细菌拷贝数目控制区在染色体整合时可产生过剩。因此，转染的宿主细胞染色体中已整合了至少一部分或不同部分的表达载体。同样，此种转染宿主细胞的定义包括用至少在体内能产生与本发明哺乳动物表达载体所必需元件同等功能的两个或多个DNA片段(称为在鼠CMV启动子和第一hCMV内含子调控下的异源基因产物)转染的CHO细胞，包含在。体内转染片段化的DNA后组装成功能性DNA序列的描述可参见例如WO 99/53046。

本发明的另一方面涉及制备一种重组蛋白的方法，包括步骤：

(a)用含鼠CMV启动子和第一hCMV内含子操作性连接于重组蛋白的编码序列的表达载体转染哺乳动物宿主细胞或宿主细胞系

(b)在适当条件下培养所述细胞使细胞生长和/或增殖并表达/产生该重组蛋白，和

(c)收获产生的重组蛋白。

用载体转染哺乳动物宿主细胞或哺乳动物宿主细胞系的方法是本领域熟知的。在本发明的方法中，可采用适合于给定类型宿主细胞的任何转染技术，例如本领域熟知的技术，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染、脂转染。本发明的宿主细胞可用此表达载体稳定或瞬时转染。

术语“宿主细胞”或“宿主细胞系”指能够培养生长并表达所需蛋白质重组产物的任何细胞，具体指哺乳动物细胞。本发明方法中所采用的哺乳动物宿主细胞可以是人或非人细胞。在一优选实施方式中，用于转染的哺乳动物宿主细胞系可以是任何中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(Puck等，1958，J.Exp.Med.108：945-955)。合适的细胞系包括如CHO K1(ATCC CCL-61)、CHO pro3-、CHO DG44、CHO P12或dhfr-细胞系DUK-BII(Chassin等，PNAS 77，1980，4216-4220)或DUXB11(Simonsen等，PNAS 80，1983，2495-2499)。已知小鼠巨细胞病毒主要立即早期基因的启动子(mCMV启动子)在CHO细胞中有非常高的转录活性。而且，如果本发明的哺乳动物表达载体含鼠IgG2a序列，用本发明的表达载体瞬时转染CHO细胞，此序列甚至能增进CHO细胞的基因表达。

哺乳动物细胞系的合适培养液和培养方法是本领域熟知的，例如可见US5,633,162中的描述。用于实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需要的标准细胞培养液的例子包括但不限于：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养液(Morre，G，The journal of the American Medical Association，199：519，1967)、L-15培养液(Leibovitz，A等，Amer.J.of Hygiene，78：173，1963)、Dulbecco改良Eagle培养液、Eagle最简单基础培养液(Eagle’s minimal essentialmedium，MEM)、Ham F12培养液(Ham，R等，Proc.Natl.Acad.Sc.53：288，1965)或缺少白蛋白、运铁蛋白和卵磷脂的Iscoves改良DMEM(Iscoves等，

J.Exp.med.1：923，1978)。例如，Ham F10或F12培养液是专门为CHO细胞培养设计的。特别适合于CHO细胞培养的其它培养液见EP-481791中所述。已知此类培养液中可增添胎牛血清(FBS，也称为胎小牛血清FCS)，后者提供了天然来源的丰富激素和生长因子。目前哺乳动物细胞的培养是常规操作，在科学教科书和手册中有全面的描述，细节可参见R.Ian Fresney，《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.，2000。

在本发明一优选实施方式中，所采用的细胞培养液不含胎小牛血清(FCS或FBS)，因此称为“无血清”。为了获得最佳的生长，无血清培养液中的细胞通常需要在无血清培养液中含有胰岛素和运铁蛋白。运铁蛋白可以至少部分可用非肽螯合剂或铁运载体如环庚三烯酚酮(如WO 94/02592所述)或递增水平的易于与抗氧化剂如维生素C结合的有机铁源取代。大多数细胞系需要一种或多种合成的生长因子(包括重组多肽)，包括例如表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGFI、IDFII)等。可能是必需的其它类型因子包括：前列腺素、运输和结合蛋白(如血浆铜蓝蛋白、高和低密度载脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括类固醇激素)和脂肪酸。最好在发现具有生长刺激作用的物质存在下以检测新多肽因子的逐步方式进行多肽因子的检测。那些生长因子是合成或重组的生长因子。动物细胞培养的检测有许多方法，以下描述了其中一个例子。最初步骤是获得细胞存活条件和/或从添加血清的培养液转移出后缓慢生长3-6天。在大多数细胞类型中，这是接种细胞密度函数的至少一部分。一旦找到最优的激素/生长因子/多肽添加物，存活所需的接种细胞密度将减小。

在另一优选实施方式中，所述细胞培养液不含蛋白质，即不含胎牛血清和各蛋白质生长因子添加物或其它蛋白质如重组运铁蛋白。

在涉及表达和收集重组产物蛋白质的本发明方法的另一实施方式中，包括例如在工业化补料分批生物反应器中高密度培养动物宿主细胞。然后进行常规的下游加工。接着，采用高密度生长培养液。这种高密度生长培养液要添加营养物(如所有氨基酸)、上述范围内的能源(如葡萄糖)、无机盐、维生素、微量元素(定义为通常以微摩尔终密度存在的无机化合物)、缓冲液、四种核苷或其对应核苷酸、抗氧化剂(如谷胱甘肽(还原))、维生素C和其它组分，如重要的膜脂(如胆固醇或卵磷脂)或脂质前体(如胆碱或肌醇)。高密度培养液富含大多数或所有这些化合物，如GB2251 249与RPMI 1640比较得到的那样，除了基于调节培养液等渗摩尔渗透压的无机盐以外，可含有比比以上提到的标准培养液更高含量(强化)的这些化合物。优选强化本发明的高密度培养液加入所有的氨基酸(除色氨酸外)超过75mg/升培养液。高密度培养液一般的氨基酸需求优选谷氨酰胺和/或天冬酰胺超过1g/升，更优选地2g/升高密度培养液。本发明内容中，高密度细胞培养定义为在恒定的或不断增加的培养液体积中，从一个细胞开始连续培养或以较低的活细胞密度接种细胞培养液并连续培养动物细胞群使活细胞的瞬时密度至少或超过10⁵细胞/毫升，优选地至少或超过10⁶细胞/毫升。

本发明方法的另一优选实施方式包括补料分批培养。补料分批培养是一种培养体系，在如GB2251249所述的细胞培养液中，除另外进料控制葡萄糖浓度外至少补料加入谷氨酰胺，和任选的一种或多种其它氨基酸(优选甘氨酸)，以维持它们在培养液中的浓度。更优选在如EP229 809-A所述在细胞培养液中补加谷氨酰胺和任选的一种或多种其它氨基酸以及一种或多种能源如葡萄糖。补料通常在培养开始后25-60小时时开始；例如，当细胞密度达到大约10⁶细胞/毫升时开始补料。本领域熟知培养动物细胞的谷氨酰胺代谢(McKeehan等，1984，动物细胞中的谷氨酰胺代谢(Glutaminolysis in animal cells)，《培养细胞的碳水化合物代谢(CarbohydrateMetabolism in Cultured Cells)》，M.J.Morgan，Plenum Press出版，纽约，第11-150页)可变为生长阶段重要的能量来源。谷氨酰胺和/或天冬氨酸进料总量(以天冬氨酸取代谷氨酰胺，参见Kurano，N.等，1990，J.Biotechnology 15，113-128)范围通常为0.5-10g/升，优选1-2克/升培养液体积；其它可用作进料的氨基酸为10-300毫克总进料/升培养液体积，具体说，甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸进料量常比其它氨基酸高至少为150-200mg。加入补料可以是喷射加入或用泵连续加入补料，优选将所述补料用泵连续加入生物反应器。自然不用说，在生物反应器分批补料培养过程中应通过添加碱或缓冲液来小心控制pH使其在给定细胞系最佳生理pH左右。当用葡萄糖作为能源时，葡萄糖进料总量通常为1-10g，优选3-6g/每升培养液。除加入氨基酸外，进料优选加入范围5-20mg/每升培养液的低含量胆碱。更优选如US6,048,728所述，胆碱补料必需与乙醇胺一起添加，，特别是，与谷氨酰胺一起补料。自然不用说，由于过量谷氨酰胺的累积加上内源产生谷氨酰胺会导致氨的产生伴发毒性，与非GS标记系统相比，采用用GS标记系统需要的谷氨酰胺应较少。对于GS系统，培养液或补料中的谷氨酰胺大部分可用其等效物和/或前体替代，即用天冬氨酸和/或谷氨酸盐替代。

收集方法，即从细胞、细胞培养物或细胞培养液中分离和/或纯化给定蛋白质的方法是为本领域熟知的。例如，可通过用盐或有机溶剂进行分级沉淀、离子交换层析、凝胶层析、HPLC、亲和层析等，分离和/或纯化生物材料中的蛋白质。

本发明另一个方面涉及利用第一hCMV内含子来提高哺乳动物宿主细胞表达重组或异源基因产物的mCMV启动子活性的方法。本发明的此方法是，用分子克隆方法将hCMV内含子A序列插入现有载体分子中mCMV启动子序列与编码所需蛋白的基因序列之间，使mCMV启动子和第一hCMV内含子操作性连接于异源基因序列而显著增强mCMV启动子驱动所需异源基因产物的表达。分子克隆方法是本领域熟知的，在例如Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.，《分子克隆：实验手册》(Molecularcloning：A laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，纽约(1989)中有所描述。然后，用如此构建的在mCMV启动子与位于下游的编码所需蛋白质的异源DNA序列之间含有第一hCMV内含子的载体转染哺乳动物宿主细胞如CHO细胞。然后，在适当条件下培养转染子使细胞生长和/或增殖并表达/产生重组蛋白。最后，收集即分离和纯化产生的重组蛋白。通过在本发明的方法中利用所述第一hCMV内含子，可以显著增强mCMV启动子驱动重组蛋白的表达效率而获得高水平表达的重组蛋白。因此，本发明可能改进现有的只通过mCMV启动子驱动重组基因表达的表达载体的表达效率。

因此，本发明还涉及利用第一hCMV内含子来改进mCMV启动子的活性。

本发明的优选实施方式通过附图加以阐述。附图显示的是：

图1用于克隆图3所述含短mCMV启动子的mCMV(短)-Ex1 PCR产物和图4所述含短mCMV启动子和人内含子A的mCMV-人内含子A片段的载体δ-pEE12.4的结构图。

图2用于PCR扩增mCMV启动子的mCMV模板的结构图，其中标明了所用各引物的位置。

图3含有用于连接内含子A-PCR片段产生片段mCMV-人内含子A(含mCMV启动子+第一人CMV内含子)的短mCMV启动子的mCMV(短)-Ex1 PCR产物的结构图。

图4含mCMV启动子+第一人CMV内含子的片段mCMV-人内含子A的结构图。

图5表达人IgG4/κ抗体的双基因表达载体pcB72.3-mCMV质粒的结构图，其中，抗体的表达受短mCMV启动子的控制。该载体还含有可选择性GS标记基因。

图6表达人IgG4/κ抗体的双基因表达载体pcB72.3-mCMV+内含子A质粒的结构图，其中，抗体的表达受短mCMV启动子+第一hCMV内含子的控制。该载体还含有可选择性GS标记基因。

图7表达人IgG4/κ抗体的双基因表达载体pcB72.3质粒的结构图，其中，抗体的表达受hCMV启动子+第一hCMV内含子(对照)的控制。该载体还含有可选择性GS标记基因。

图8在分别用只含短mCMV启动子、含mCMV启动子加第一hCMV内含子和含hCMV启动子加第一hCMV内含子(对照)的载体质粒稳定转染的CHOK1SV细胞中，IgG4/Kappa抗体的相对表达水平。

应理解本发明说明书对给出的优选实施方式进行的解释和参考内容同样适合本发明的所有其它优选实施方式。

本发明通过以下实施例作更详细说明。

实施例

材料和方法

采用的细胞

CHO细胞系CHOK1SV：是细胞系CHO-K1的变体，已适应悬浮培养和无蛋白质培养液。

CHOK1SV细胞的增殖：

常规使CHOK1SV细胞悬浮液在摇瓶中添加有6mM L-谷氨酰胺的CD-CHO培养液(Invitrogen)中增殖。接种密度2×10⁵细胞/毫升，每4天细胞分裂一次。瓶中充入5％CO₂气体，36.5℃轨道式摇床140rpm培养。

稳定转染：

如前所述，用于转染的细胞以细胞悬浮液培养。离心培养的细胞并用无血清培养液洗涤一次，然后重悬浮浓度为1.43×10⁷细胞/毫升。将0.7ml体积细胞悬液和40μg质粒DNA加入电穿孔小杯中。然后将所述小杯放入电穿孔装置中施加250V和400μF的单脉冲。转染后，用添加有10％dFCS的非选择性DMEM基础培养液将细胞以约2,500个宿主细胞/孔(5×10⁴/ml)分配加入96孔板。在含有10％CO₂的空气中36.5℃(在35.5℃-37.0℃之间)培养96空板。

转染后当天，每孔(150微升/孔)中加入添加有10％dFCS的DMEM基础培养液/66μM L-甲硫氨酸磺酰亚胺(L-methionine sulphoximine)，至L-甲硫氨酸磺酰亚胺最终浓度达到50μM。监测96孔板确定未转染细胞死亡和转染细胞集落出现的时间。转染细胞集落大约在转染后3到4周变得明显。检查所有的细胞系，进一步增殖单个集落孔中的细胞。。

评估静态培养细胞系的产率

培养96孔转染平板约3周后形成细胞群落。显微镜检得到的群落以验证具有进行试验的合适大小(覆盖孔底面积60％以上)的和每孔只有一个的群落。

将合适的群落转移到含有1mL选择性培养液(DMEM基础培养液/10％dFCS/25μML-甲硫氨酸磺酰亚胺)的24孔板的孔中。在含有10％CO₂的空气中36.5℃(在35.5℃-37.0℃之间)培养这些细胞14天。收集各孔上清液用蛋白质A HLPC方法分析存在的抗体浓度。

夹心ELISA：

用夹心ELISA(测量装配的人IgG)测定样品的抗体浓度。其包括将样品和标准品捕获到包被有抗人Fc抗体的96孔板上。用连接辣根过氧化物酶的抗人轻链抗体和产色的酶底物TMB显示结合的抗体。与标准品比较，显色程度与样品中存在的抗体浓度成比例。

蛋白质A HPLC：

在一台Agilent 1100 HPLC上进行测量IgG的蛋白质A亲和层析方法。IgG产物选择性地结合于Poros蛋白质A免疫检测柱。洗去柱不结合的物质，留下的结合抗体通过降低溶剂pH释放。检测洗脱液280nm吸光度值，用通用的抗体标准品(用Chemstation软件)并对消光系数的差异进行修正来定量产物。

载体构建

表1：克隆步骤所用载体的序列表

引物编号	引物序列(5′-3′)(有关的限制性酶切位点以黑体标出)
		1	CCAGAGAGATCTTTGTGAAGG
2	GCGCGCTGTACATATTATGATATGGATACAACGTATGCAATGGCCAATAGCCAATATTGGCGCGCCTCACCGTCCTTGACACGAAGC
		3	CGTATAGGCGCGCCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCC
4	GCATCGAAGCTTCTGCGTTCTACGGTGGTCAGACC
		5	GATCGGCGCGCCTAAGCTACTGAGTCATTAGGGACTTTC
6	GATCCCTGAGGCTGCGTTCTACGGTGGTC
		7	GATCCCTCAGGACCTCCATAGAAGACACC
8	GATCAAGCTTCGTGTCAAGGACG
		9	GATCGCTAGCGGCCGCTGAGGCGCGCCTACTGAG

引物1-9的序列见序列表中的SEQ ID No.1-9所示。

载体δ-pEE12.4的产生

通过用3′端引入了AscI位点的PCR片段替换GS载体pEE12.4中hCMV启动子区域的RE位点BglII和SspBI之间的部分而产生载体δ-pEE12.4。为此，采用正向引物1和反向引物2(见表1)。

PCR反应中采用了上述2种PCR引物，以载体pEE12.4的DNA作为模板该PCR产物具有以下序列(SEQ ID NO.10)：

CCAGAGAGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACC

TACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTA

CTGATTCTAATTGTTTGTGTATTTTAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGT

GGTGGAATGCCTTTAATGAGGAAAACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGA

TGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAGAC

CCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGAA

CTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAAT

TATGGAAAAATATTCTGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTG

TTTTTTCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGTCTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGT

GTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTGATGTATAGTGCCTT

GACTAGAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCT

CCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTT

ATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCAT

TTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTG

GATCTCTAGCTTCGTGTCAAGGACGGTGAGGCGCGCCAATATTGGCTATTGGCCATTGCAT

ACGTTGTATCCATATCATAATATGTACAGCGCGC

图1显示了获得的载体δ-pEE12.4的结构图。用载体δ-pEE12.4克隆mCMV启动子的短片段。

将mCMV启动子的短片段克降入载体δ-pEE12.4中

采用正向引物3和反向引物4，用PCR扩增所述mCMV短片段。作为模板的mCMVDNA含有mCMV启动子(由伯明翰大学的Clive Sweet博士提供)。PCR扩增方案见图2所示。

如此获得的代表mCMV短片段的PCR片段(0.5kb)具有以下序列(SEQ ID No.11；引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

CGTATAGGCGCGCCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAG

GTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGG

ACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTC

CCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTT

AATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAAC

GTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAA

TACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGG

AAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCG

CGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGAAGCTTCGA

TGC

将图3所示的片段克隆入预先用AscI和HindIII酶切的载体δ-pEE12.4中。以此除去载体中人CMV序列的5′UTR和内含子A。

将mCMV短内含子A片段克隆入载体δ-pEE12.4中

如下通过分别两次PCR反应产生mCMV短片段和人内含子A片段并连接在一起。

a)扩增和克隆mCMV短片段

为了扩增mCMV短片段，采用了正向引物5和反向引物6。PCR扩增方案如图2所示。

如此获得的PCR产物具有以下序列(SEQ IN No.12；引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GATCGGCGCGCCTAAGCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCAATGGGTTTTGCCCAGTACATA

AGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAG

GGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTT

TCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAAT

TTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCA

ACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCC

AATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCT

GGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGG

CGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGCCTCAGG

GATCGA

将该所述PCR片段克隆入载体pCR4-TOTO(Invitrogen)中而获得载体pCR-4-TOTO+mCMV-短。

b)扩增和克隆人内含子A片段

为了扩增人5′UTR内含子A片段，采用正向引物7和反向引物8。采用载体pEE12.4作为模板。

获得的PCR产物具有以下序列(SEQ IN No.13；引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GATCCCTCAGGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGG

TGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATA

GGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCC

CCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCAT

TATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTT

GCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACT

CTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACC

GTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTA

CGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTC

CCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGA

CTTAGGCACAGCACGATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGT

ATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAA

GGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTA

ACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTG

CCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCT

TTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGATC

将获得的PCR片段克隆入载体pCR4-TOTO(Invitrogen)中获得pCR4-TOTO+内含子A。

c)连接mCMV-短-内含子A片段

用AscI和Bsu36I酶切割载体pCR4-TOTO+mCMV短得到含短mCMV启动子片段的mCMV-短PCR产物，将其克隆入载体pCR4-TOTO+内含子A中从而获得载体pCR4-TOTO1mCMV内含子A。用AscI和HindIII酶切割该载体得到含mCMV启动子和第一人内含子A的mCMV短内含子A片段。此片段的结构示意图见4图4示描述。此片段的序列(SEQ ID No.14)如下(引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GGCGCGCCTAAGCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGT

CAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGAC

TTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCC

ATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAA

TTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGT

GACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATA

CACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAA

ATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCG

ACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGCCTCAGGACCT

CCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGG

ATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGG

CTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTT

ATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCC

TATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTT

ATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGG

ATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGC

AGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATG

GGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGA

CTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACG

ATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATG

AGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGA

AGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTG

CTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCA

GACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCG

TCCTTGACACGAAGCTT

然后利用AscI-HindIII位点将此片段克隆入上述改进版的GS载体pEE12.4，δ-pEE12.4载体中，从而获得载体δ-pEE12.4-mcmv/int。

将短片短mCMV启动子克隆入载体pEE6.4中

用PCR扩增该mCMV短片段，采用正向引物9和反向引物4。作为模板的mCMV DNA含有mCMV启动子。PCR扩增方案见图2所示。

如此得到的代表mCMV短片段的PCR片段(0.5kb)具有以下序列(SEQ ID No.15；引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GATCGCTAGCGGCCGCTGAGGCGCGCCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTG

CCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACAC

TGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGT

CAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTT

TTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTG

AAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACC

GTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCC

GGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTG

GGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAAC

GCAGAAGCTTCGATGC

除AscI和NotI位点外，该片段与图3片段非常类似。将该片段再克隆入预先用AscI和HindIII酶切的载体pEE6.4中。从而产生载体pEE6.4mCMV短。

将MCMV短内含子A片段克隆入载体pEE6.4中

通过如下分别两次PCR反应产生mCMV短片段和人内含子A片段并连接在一起。

a)扩增和克隆mCMV短片段

为了扩增mCMV短片段，采用了正向引物9和反向引物6(表1)。PCR扩增方案见图2所示。

如此获得的PCR产物(mCMV短pEE6.4)具有如下序列(SEQ IN No.16；引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GATCGCTAGCGGCCGCTGAGGCGCGCCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCAATGGGTTTTGC

CCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACT

GAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTC

AATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTT

TCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGA

AACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCG

TTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCG

GTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGG

GTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACG

CAGCCTCAGGGATCGA

将此PCR片段克隆入进载体pCR4-TOTO+内含子A中从而获得载体pCR-4-TOTO-mCMV短(pEE6.4)。

b)连接mCMV(pEE6.4)短内含子A片段

用AscI和Bsu36I酶切割载体pCR4-TOTO-mCMV短(pEE6.4)的得到含短mCMV启动子片段的mCMV短(pEE6.4)PCR产物，将其克隆入载体pCR4-TOTO+内含子A中从而获得载体pCR4-TOTO 1mCMV(pEE6.4)-内含子A。用NotI和HindIII酶切割此载体得到含mCMV启动子和第一人内含子A的mCMV短(pEE6.4)内含子A。此片段的结构除了在5′端新引入了NotI位点外，其余与图4示意图所示相同。该片段的序列(SEQ IDNo.17)如下(引物序列下划线，限制位点以黑体标出)：

GCGGCCGCTGAGGCGCGCCTACTGAGTCATTAGGGACTTTCAATGGGTTTTGCCCAGTACA

TAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAAT

AGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTT

TTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCA

ATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATG

CAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCTCGAG

CCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCC

CTGGAAATTCCATATTGGCACGCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGA

GGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGCCTCA

GGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGA

ACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCC

CCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCT

CATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCA

CTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACT

CTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTT

TACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGT

GCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCG

GACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTC

CAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCAC

AGCACGATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTG

AAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGC

AGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTT

GCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCG

CCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAG

TCACCGTCCTTGACACGAAGCTT

蛋白质表达研究

抗体表达研究的目的是比较在CHOK1SV细胞中，受mCMV启动子或hCMV启动子控制的IgG₄/κ抗体的表达。

因此，构建了表达IgG₄/κ抗体cB72.3的双基因载体，其含有IgG₄/κ抗体的重链基因和轻链基因，其中各基因分别受同样的调控单元所控制。

用HindIII和EcoRI酶切割所述载体得到针对抗体cB72.3重链和轻链的整个编码区，将其分别克隆入上面产生的载体中：轻链克隆入(i)δ-pEE12.4+mCMV和(ii)δ-pEE12.4/mCMV+内含子A，而重链编码片段克隆入(i)pEE6.4-mCMV和(ii)pEE6.4-mCMV+内含子A。

用NotI和PvuI消化所有载体，并将合适的片段(含CMV启动子和抗体链的编码序列)克隆在一起产生双基因载体，这样产生了两种双基因载体，命名为载体pcB72.3-mCMV(图5)，其含有来源于δ-pEE12.4+mCMV和pEE6.4-mCMV合适的片段，和载体pcB72.3-mCMV+内含子A(图6)，其包含来源于δ-pEE12.4/mCMV+内含子A和pEE6.4-mCMV+内含子A的合适的片段。载体pcB72.3-mCMV中，抗体的表达受mCMV启动子的驱动。载体pcB72.3-mCMV+内含子A中，抗体的表达受mCMV启动子+第一人CMV内含子驱动。

对照载体pcB72.3(图7)含有与受人CMV启动子加人内含子A调控相同的重链和轻链编码区。

通过稳定转染将这些构建物引入CHO细胞中研究抗体表达。

这些实验的结果见图8所示。图8显示在稳定转染的CHOK1SV细胞中，由mCMV启动子和hCMV内含子组成的调控单元驱使的IgG4/κ抗体的表达水平比单由短mCMV启动子驱动的要高得多(p＜0.0001，统计学显著)。此外，与hCMV启动子加hCMV内含子驱动的抗体表达水平相当。因此，由mCMV启动子和hCMV内含子组成的调控单元的异源蛋质的表达至少与由hCMV启动子加hCMV内含子A驱使的同样好。

序列表

<110>英国龙沙生物医药股份有限公司

<120>包含mCMV启动子和hCMV主要立即早期基因第一内含子的哺乳动物表达载体

<130>LBP1008PC00

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ccagagagat ctttgtgaag g                                              21

<210>2

<211>87

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

gcgcgctgta catattatga tatggataca acgtatgcaa tggccaatag ccaatattgg    60

cgcgcctcac cgtccttgac acgaagc                                        87

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cgtataggcg cgcctactga gtcattaggg actttcc                                   37

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcatcgaagc ttctgcgttc tacggtggtc agacc                                     35

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

gatcggcgcg cctaagctac tgagtcatta gggactttc                                 39

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gatccctgag gctgcgttct acggtggtc                                            29

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gatccctcag gacctccata gaagacacc                                29

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

gatcaagctt cgtgtcaagg acg                                      23

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gatcgctagc ggccgctgag gcgcgcctac tgag                          34

<210>10

<211>949

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR产物

<400>10

ccagagagat ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac    60

ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac    120

tactgattct aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc    180

agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg    240

atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag    300

aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta    360

atagaactct tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca    420

agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct ttataagtag gcataacagt tataatcata    480

acatactgtt ttttcttact ccacacaggc atagagtgtc tgctattaat aactatgctc    540

aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt    600

atagtgcctt gactagagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct    660

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt    720

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc    780

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta    840

tcttatcatg tctggatctc tagcttcgtg tcaaggacgg tgaggcgcgc caatattggc    900

tattggccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acagcgcgc                949

<210>11

<211>552

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>11

cgtataggcg cgcctactga gtcattaggg actttccaat gggttttgcc cagtacataa    60

ggtcaatagg ggtgaatcaa caggaaagtc ccattggagc caagtacact gagtcaatag  120

ggactttcca ttgggttttg cccagtacaa aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt  180

ttcccattat tggcacgtac ataaggtcaa taggggtgag tcattgggtt tttccagcca  240

atttaattaa aacgccatgt actttcccac cattgacgtc aatgggctat tgaaactaat  300

gcaacgtgac ctttaaacgg tactttccca tagctgatta atgggaaagt accgttctcg  360

agccaataca cgtcaatggg aagtgaaagg gcagccaaaa cgtaacaccg ccccggtttt  420

cccctggaaa ttccatattg gcacgcattc tattggctga gctgcgttct acgtgggtat  480

aagaggcgcg accagcgtcg gtaccgtcgc agtcttcggt ctgaccaccg tagaacgcag  540

aagcttcgat gc                                                      552

<210>12

<211>555

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>12

gatcggcgcg cctaagctac tgagtcatta gggactttca atgggttttg cccagtacat    60

aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat    120

agggactttc cattgggttt tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt    180

ttttcccatt attggcacgt acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc    240

caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta    300

atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct    360

cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt    420

ttcccctgga aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt    480

ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc    540

agcctcaggg atcga                                                     555

<210>13

<211>951

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段v

<400>13

gatccctcag gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg    60

gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct atagagtcta    120

taggcccacc cccttggctt cttatgcatg ctatactgtt tttggcttgg ggtctataca    180

cccccgcttc ctcatgttat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt gggttattga    240

ccattattga ccactcccct attggtgacg atactttcca ttactaatcc ataacatggc    300

tctttgccac aactctcttt attggctata tgccaataca ctgtccttca gagactgaca    360

cggactctgt atttttacag gatggggtct catttattat ttacaaattc acatatacaa    420

caccaccgtc cccagtgccc gcagttttta ttaaacataa cgtgggatct ccacgcgaat    480

ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt ctccggtagc ggcggagctt ctacatccga    540

gccctgctcc catgcctcca gcgactcatg gtcgctcggc agctccttgc tcctaacagt    600

ggaggccaga cttaggcaca gcacgatgcc caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt    660

ggcggtaggg tatgtgtctg aaaatgagct cggggagcgg gcttgcaccg ctgacgcatt    720

tggaagactt aaggcagcgg cagaagaaga tgcaggcagc tgagttgttg tgttctgata    780

agagtcagag gtaactcccg ttgcggtgct gttaacggtg gagggcagtg tagtctgagc    840

agtactcgtt gctgccgcgc gcgccaccag acataatagc tgacagacta acagactgtt    900

cctttccatg ggtcttttct gcagtcaccg tccttgacac gaagcttgat c             951

<210>14

<211>1481

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>14

ggcgcgccta agctactgag tcattaggga ctttcaatgg gttttgccca gtacataagg    60

tcaatagggg tgaatcaaca ggaaagtccc attggagcca agtacactga gtcaataggg    120

actttccatt gggttttgcc cagtacaaaa ggtcaatagg gggtgagtca atgggttttt    180

cccattattg gcacgtacat aaggtcaata ggggtgagtc attgggtttt tccagccaat    240

ttaattaaaa cgccatgtac tttcccacca ttgacgtcaa tgggctattg aaactaatgc    300

aacgtgacct ttaaacggta ctttcccata gctgattaat gggaaagtac cgttctcgag    360

ccaatacacg tcaatgggaa gtgaaagggc agccaaaacg taacaccgcc ccggttttcc    420

cctggaaatt ccatattggc acgcattcta ttggctgagc tgcgttctac gtgggtataa    480

gaggcgcgac cagcgtcggt accgtcgcag tcttcggtct gaccaccgta gaacgcagcc    540

tcaggacctc catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat    600

tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag tctataggcc    660

cacccccttg gcttcttatg catgctatac tgtttttggc ttggggtcta tacacccccg    720

cttcctcatg ttataggtga tggtatagct tagcctatag gtgtgggtta ttgaccatta    780

ttgaccactc ccctattggt gacgatactt tccattacta atccataaca tggctctttg    840

ccacaactct ctttattggc tatatgccaa tacactgtcc ttcagagact gacacggact    900

ctgtattttt acaggatggg gtctcattta ttatttacaa attcacatat acaacaccac    960

cgtccccagt gcccgcagtt tttattaaac ataacgtggg atctccacgc gaatctcggg  1020

tacgtgttcc ggacatgggc tcttctccgg tagcggcgga gcttctacat ccgagccctg  1080

ctcccatgcc tccagcgact catggtcgct cggcagctcc ttgctcctaa cagtggaggc  1140

cagacttagg cacagcacga tgcccaccac caccagtgtg ccgcacaagg ccgtggcggt  1200

agggtatgtg tctgaaaatg agctcgggga gcgggcttgc accgctgacg catttggaag  1260

acttaaggca gcggcagaag aagatgcagg cagctgagtt gttgtgttct gataagagtc  1320

agaggtaact cccgttgcgg tgctgttaac ggtggagggc agtgtagtct gagcagtact  1380

cgttgctgcc gcgcgcgcca ccagacataa tagctgacag actaacagac tgttcctttc  1440

catgggtctt ttctgcagtc accgtccttg acacgaagct t                      1481

<210>15

<211>565

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>15

gatcgctagc ggccgctgag gcgcgcctac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt    60

gcccagtaca taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac    120

actgagtcaa tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg    180

agtcaatggg tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg    240

gtttttccag ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc    300

tattgaaact aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa    360

agtaccgttc tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca    420

ccgccccggt tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt    480

tctacgtggg tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca    540

ccgtagaacg cagaagcttc gatgc                                          565

<210>16

<211>565

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>16

gatcgctagc ggccgctgag gcgcgcctac tgagtcatta gggactttca atgggttttg    60

cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca    120

ctgagtcaat agggactttc cattgggttt tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga    180

gtcaatgggt ttttcccatt attggcacgt acataaggtc aataggggtg agtcattggg    240

tttttccagc caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct    300

attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa    360

gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac    420

cgccccggtt ttcccctgga aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt    480

ctacgtgggt ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac    540

cgtagaacgc agcctcaggg atcga                                          565

<210>17

<211>1487

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增的PCR片段

<400>17

gcggccgctg aggcgcgcct actgagtcat tagggacttt caatgggttt tgcccagtac    60

ataaggtcaa taggggtgaa tcaacaggaa agtcccattg gagccaagta cactgagtca    120

atagggactt tccattgggt tttgcccagt acaaaaggtc aatagggggt gagtcaatgg    180

gtttttccca ttattggcac gtacataagg tcaatagggg tgagtcattg ggtttttcca    240

gccaatttaa ttaaaacgcc atgtactttc ccaccattga cgtcaatggg ctattgaaac    300

taatgcaacg tgacctttaa acggtacttt cccatagctg attaatggga aagtaccgtt    360

ctcgagccaa tacacgtcaa tgggaagtga aagggcagcc aaaacgtaac accgccccgg    420

ttttcccctg gaaattccat attggcacgc attctattgg ctgagctgcg ttctacgtgg    480

gtataagagg cgcgaccagc gtcggtaccg tcgcagtctt cggtctgacc accgtagaac    540

gcagcctcag gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg    600

gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct atagagtcta    660

taggcccacc cccttggctt cttatgcatg ctatactgtt tttggcttgg ggtctataca    720

cccccgcttc ctcatgttat aggtgatggt atagcttagc ctataggtgt gggttattga    780

ccattattga ccactcccct attggtgacg atactttcca ttactaatcc ataacatggc    840

tctttgccac aactctcttt attggctata tgccaataca ctgtccttca gagactgaca    900

cggactctgt atttttacag gatggggtct catttattat ttacaaattc acatatacaa    960

caccaccgtc cccagtgccc gcagttttta ttaaacataa cgtgggatct ccacgcgaat    1020

ctcgggtacg tgttccggac atgggctctt ctccggtagc ggcggagctt ctacatccga    1080

gccctgctcc catgcctcca gcgactcatg gtcgctcggc agctccttgc tcctaacagt    1140

ggaggccaga cttaggcaca gcacgatgcc caccaccacc agtgtgccgc acaaggccgt    1200

ggcggtaggg tatgtgtctg aaaatgagct cggggagcgg gcttgcaccg ctgacgcatt    1260

tggaagactt aaggcagcgg cagaagaaga tgcaggcagc tgagttgttg tgttctgata    1320

agagtcagag gtaactcccg ttgcggtgct gttaacggtg gagggcagtg tagtctgagc    1380

agtactcgtt gctgccgcgc gcgccaccag acataatagc tgacagacta acagactgtt    1440

cctttccatg ggtcttttct gcagtcaccg tccttgacac gaagctt                  1487

Claims (5)

1.一种哺乳动物表达载体，所述载体包含操作性连接于异源编码序列的转录调控单元，所述调控单元包含鼠CMV启动子和第一人CMV内含子，并且所述调控单元的序列如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17所示。

2.如权利要求1所述的哺乳动物表达载体，其特征在于，所述载体还包含编码谷氨酰胺合成酶的第二转录单元，且其中所述谷氨酰胺合成酶是选择标记。

3.一种中国仓鼠卵巢细胞，其含有如权利要求1或2所述的哺乳动物表达载体。

4.一种制备重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞，所述表达载体含有操作性连接于所述重组蛋白编码序列的转录调控单元，所述调控单元包含鼠CMV启动子和第一人CMV内含子，并且所述调控单元的序列如SEQID NO：14或SEQ ID NO：17所示，

b)在合适条件下培养所述细胞以使细胞增殖和表达重组蛋白，和

c)收获产生的重组蛋白。

5.第一人CMV内含子在增强鼠CMV启动子活性以表达重组蛋白中的用途，其中所述第一人CMV内含子位于哺乳动物表达载体中，所述载体包含操作性连接于所述重组蛋白编码序列的转录调控单元，所述调控单元包含鼠CMV启动子和第一人CMV内含子，并且所述调控单元的序列如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：17所示。

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