KR101302904B1 - ｈＣＭＶ 주요 즉각 조기 유전자의 제 1 인트론 및ｍＣＭＶ 프로모터를 포함한 포유동물 발현 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쥐의 CMV 프로모터 및 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 제 1 인트론을 포함한 포유동물 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함한 포유동물 숙주 세포 및 상기 발현 벡터를 사용함에 의한 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

mCMV 프로모터, hCMV 인트론, 포유동물 발현 벡터, 재조합 단백질

Description

ｈＣＭＶ 주요 즉각 조기 유전자의 제 1 인트론 및 ｍＣＭＶ 프로모터를 포함한 포유동물 발현 벡터 {MAMMALIAN EXPRESSION VECTOR COMPRISING THE MCMV PROMOTER AND FIRST INTRON OF HCMV MAJOR IMMEDIATE EARLY GENE}

본 발명은 쥐의 CMV 프로모터 및 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자 (major immediate early gene) 의 제 1 인트론을 포함한 포유동물 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함한 CHO 세포 및 CHO 세포주 및 상기 발현 벡터를 사용함에 의한 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 포유동물 발현 시스템은 재조합 단백질의 제조에 널리 사용되고 있다. NS-0 과 같은 림프계 세포주 외에, 이는 동물 세포에 대한 단순하고 효율적인 고밀도 현탁 회분식 배양을 가능하게 하는 소수의 세포 유형 중 하나이다. 나아가, CHO 세포는 매우 높은 생성물 수율을 가능하게 하며 대사성 스트레스에 비교적 강한 반면, 림프계 세포는 공업적 규모로 배양하기가 더 어렵다. 제조 비용이 상당하다는 점에서, 생물반응기 1회 가동당 재조합 단백질의 수율을 최대화하는 것이 극히 중요하다. 배양 배지 조성 및 생물반응기 설계 및 작동의 선택은 수율에 영향을 미치는 변수들로서, 최적화하기가 다소 복잡할 수 있다. 세포주에 의해 생산되는 폴리펩티드의 양에 상당한 영향을 끼치는 기타 요인들은 해당 유전자 복제수, 해당 유전자가 전사되고 그의 mRNA 가 번역되는 효율, 해당 mRNA 의 안정성 및 해당 단백질의 분비 효율이다. 따라서, 생성물 단백질의 발현을 조절하는 프로모터의 강도 또는 전사 활성이 증가하면 수율이 높아진다. 단일 세포 수준에서의 점증적 증가는, 10⁶ 내지 10⁷ 개 세포/ml 범위의 세포 밀도에서 정지기 유전자 발현을 보이는 고밀도 회분식 또는 유가식 배양에서 생성물 수율의 상당한 향상으로 이어질 것이다.

포유동물 세포의 형질도입 (transduction) 에 있어서, 지금까지의 대부분의 유전자 전이 실험들에서는 바이러스 유래의 프로모터 요소들의 제어하에 형질전환 유전자 (transgene) 를 인코딩하는 바이러스 벡터가 사용되었다. 이들 발현 카세트에서 가장 흔히 사용된 프로모터 중 하나는 인간 거대세포바이러스 (hCMV) 즉각 조기 (immediate early, IE) 유전자의 프로모터이다. 상기 유전자의 인핸서/프로모터는 광범위한 세포 유형들에서 고수준의 형질전환 유전자 발현을 이끈다. 상기 프로모터의 활성은 일련의 17, 18, 19 및 21 bp 불완전 반복물에 좌우되는데, 이들 중 일부가 NF-κB cAMP 반응성 결합 단백질 (CREB) 의 전사 인자들 및 핵 인자-1 패밀리에 결합한다. 그러나, hCMV IE 프로모터의 단점은 종 선호도 (species preference) 가 뚜렷하다는 것이다.

US 5,866,359 에는 약한 프로모터로부터 아데노바이러스의 E1A 단백질을 공동-발현시킴으로써 CHO 및 NSO 세포들에서 이미 강한 hCMV 프로모터로부터의 발현을 강화시키는 방법이 기재되어 있다. E1A 는 세포 주기 조절에 작용할 가능성 이 있는, 독립적인 전사 활성화 및 억제 기능 도메인을 모두 가진 다기능성 전사 인자이다. E1A 발현의 미세한 조율은 유전자 전이활성 및 세포 주기 진행에 대한 임의의 부정적인 영향 사이의 이상적인 균형을 이루는 데 중요하다. 그러나, 원치않는 E1A 의 과발현은 세포가 관심 재조합 단백질을 합성하는 능력을 감소시킬 수 있을 것이다.

US 5,591,639 에는 이종성 유전자의 인트론 A 상류가 포함된 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자 (hCMV-MIE) 의 프로모터, 인핸서 및 완전 5'-미번역 영역을 포함한 벡터가 기재되어 있다. 상기 약 2100 bp DNA 서열에 의해 여러 개의 이종성 유전자 산물이 고수준으로 발현된다. 그러나, 문헌 [Chapman 등, Nucleic Acids Research, 19 (1991), 3979-3986] 에는, 상기 인간 서열의 첫번째 400 bp 가 발현 플라스미드에 존재하였을 때, 원숭이 신장 세포 (COS7) 및 중국 햄스터 난소 세포 (DXB11) 모두에서 당단백질의 발현이 불량한 것으로 관찰된 것이 보고되어 있다. 이들 세포 유형들에서 이들 상류 조절 서열을 결실시키면, 여러 포유동물 당단백질의 발현이 더 높은 수준으로 이루어졌다. 나아가, SV40 조기 및 hCMV 즉각 조기 프로모터/인핸서들을 비교하였을 때, 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 인트론 A 를 삽입함으로써 hCMV 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

CHO 세포에서 마우스 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 프로모터 (mCMV IE 프로모터) 의 전사 활성은 hCMV 프로모터의 전사 활성보다 훨씬 더 높다는 것이 공지되어 있다. mCMV IE 프로모터는 hCMV IE 프로모터에서 관찰된 뚜 렷한 종 선호도를 나타냄이 없이 고수준의 발현을 이끌 수 있다 (Addison, 등 Journal of General Virology (78 (1997), 1653-1661). 그러나, mCMV 프로모터의 하류에 쥐의 주요 즉각 조기 유전자의 천연 제 1 인트론을 삽입함으로써 hCMV 프로모터와 유사하게 mCMV 프로모터의 활성을 강화시키고자 한 시도는 실패하였다. hCMV 프로모터에 의한 상황 (참고: US 5,591,639) 과는 대조적으로, 상기 mCMV 의 천연 제 1 인트론은 mCMV 프로모터로부터의 재조합 유전자의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다(참고: WO 2004/009823 A1).

당업계에서는 mCMV 프로모터의 활성을 강화시킬 필요성이 여전히 존재한다. 따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적 문제는 포유동물 숙주 세포에서, 특히 CHO 세포에서 mCMV 프로모터에 의한 단백질 발현 강화를 가능하게 하는, mCMV 프로모터에 기초한 발현 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 기술적 문제는 목적하는 재조합 단백질을 인코딩하는 이종성 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 제 1 인트론 (제 1 hCMV 인트론) 및 쥐의 CMV 프로모터를 포함한 포유동물 발현 벡터를 제공함으로써 해결된다. mCMV 프로모터 + 상기 mCMV 프로모터의 하류에 위치한 제 1 hCMV 인트론은 하류 코딩 서열의 발현을 이끄는 조절 단위를 형성한다. 본 발명의 포유동물 발현 벡터는 CHO 세포에서 재조합 유전자 산물을 고수준으로 발현하는데 특히 유용한 발현 벡터 구축물이다. 놀랍게도, 발현 카세트 내에 mCMV 프로모터가 제 1 hCMV 인트론과 함께 포함된 본 벡터는 mCMV 프로모터만 포함된 벡터에서 관찰되는 것보다 더욱 고수준의 이종성 단백질 산물의 발현을 유도한다. mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론에 의해 발현되는 이종성 단백질의 수준은 hCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론에 의해 발현되는 단백질 수준의 등가 이상이다. 임의의 특정 이론에 구애됨을 바라지 않지만, 제 1 hCMV 인트론의 존재는 분명히 대응 mRNA 로부터의 효율적인 단백질 합성을 촉진하는 것으로 여겨진다. 이러한 발견은 mCMV 프로모터의 활성이 상기 제 1 mCMV 인트론과의 조합에 의해 증가될 수 없었던 사실에 비추어 예기치 못한 것이고 놀라운 것이다.

본 발명의 맥락에서 "포유동물 발현 벡터"는, 적절한 포유동물 숙주 세포 내로 트랜스펙션시 숙주 세포 내에서 고수준의 재조합 유전자 산물의 발현을 제공하는, 바람직하게는 분리 및 정제된, DNA 분자이다. 재조합 또는 이종성 유전자 산물을 코딩하는 DNA 서열 외에, 상기 발현 벡터는 숙주 세포주 내에서 코딩 서열로부터의 mRNA 의 효율적인 전사 및 mRNA 의 효율적인 번역에 필요한 조절성 DNA 서열을 포함한다. 특히 본 발명에 따른 발현 벡터는 하나 이상의 조절 단위를 포함하는데, 상기 조절 단위는 하나 이상의 mCMV 프로모터 서열과 함께, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되어 인코딩된 단백질의 발현을 이끄는 인간 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 제 1 인트론 (인트론 A) 을 포함한다. 상기 mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론을 포함한 조절 단위는 상기 이종성 유전자의 코딩 서열에 직접 연결되거나 또는 DNA 에 예를 들어 상기 이종성 유전자의 5'-미번역 영역 또는 이의 일부 등을 개재시킴에 의해 상기 코딩 서열과 분리된다.

본 발명에 따르면 포유동물 발현 벡터의 프로모터는 쥐의 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 프로모터이다(mCMV IE 또는 mCMV 프로모터). 쥐의 CMV (mCMV) IE 프로모터는 문헌 [Dorsch-Hasler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 (1985), 8325-8329] 에 최초로 기재되었으며, 이의 전문은 본 명세서에 참조병합된다.

쥐의 거대세포바이러스 (mCMV) 는 헤르페스바이러스과(科)의 고도로 다양한 군의 일원이다. 다양한 숙주 종의 거대세포바이러스 중에서도 폭넓은 변이가 있을 수 있다. 예를 들어, mCMV 는 생물학적 특성, 즉각 조기 (IE) 유전자 구성 및 전체적인 뉴클레오티드 서열에 있어서 인간 거대세포바이러스 (hCMV) 와는 상당히 상이하다. 또한 mCMV 의 235-kbp 게놈은 hCMV 의 거대한 내부 및 말단 반복 특징을 결여하고 있다. 따라서, mCMV 게놈의 이성질 형태는 존재하지 않는다(Ebeling, A. 등, (1983), J. Virol. 47, 421-433; Mercer, J. A. 등, (1983), Virology 129, 94-106).

"프로모터"는 RNA 중합효소가 DNA 에 결합하도록 유도하고 RNA 합성을 개시하여 전사의 개시를 중재하는 DNA 서열로 정의된다. mCMV 프로모터는 강력한 프로모터, 즉 높은 빈도로 전사가 개시되게 하는 프로모터인 것으로 공지되어 있다. 나아가 바람직하게는 이종성 유전자에 대한 제 1 전사 단위로서 숙주 세포에서 발현시 해당 단백질 산물을 일으키며 mCMV 프로모터의 제어 하에 있는 전사 단위를 포함하고, 글루타민 합성효소 (GS) 마커 유전자를 포함한 제 2 전사 단위를 추가로 포함한 발현 벡터를 사용할 때, 벡터 내에 mCMV 프로모터가 존재하면 CHO 세포에서 트랜스펙션률이 강화되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따르면 상기 사용된 프로모터는 또한 mCMV 프로모터의 기능성 절편 또는 기능성 서열 변이체일 수도 있다. 따라서, 전사 개시를 중재하는데 기능하거나 또는 중재할 수 있어서 재조합 또는 이종성 산물 유전자의 발현을 일시적으로 또는 안정적으로 이끌 수 있는 mCMV 프로모터의 임의의 서열 변이체 또는 절편을 mCMV 프로모터로 사용할 수 있다. mCMV 프로모터의 "기능성 변이"에는, 특히 천연 mCMV 서열의 염기 삽입, 결실 또는 점돌연변이가 포함되며, 이는 당업계에 익히 공지된 방법들에 의해, 예컨대 하기에 의해 생성될 수 있다: 프라이머-유도 (primer-directed) PCR, '오류 유발 (error-prone)' PCR, '유전자-뒤섞기 (gene-shuffling)' 로 불리는, 중복되는 DNA 절편들의 PCR-재조립, 또는 CHO 세포 내에서의 세균성 클론들의 생체내 무작위 돌연변이유발 및 그 후 라이브러리 트랜스펙션 및 기능적 선택. 예를 들어, 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] 에 기재된 바와 같이 알킬화 화학물질 또는 UV-조사로 달성할 수 있다. 임의로는, 숙주 세균의 천연 돌연변이유발-균주를 사용할 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 변이 서열은 천연의 쥐의 CMV 프로모터의 대응 부분에 대해 DNA 서열 중 65% 이상, 더욱 바람직하게는 75%, 가장 바람직하게는 90% 상동이다. mCMV 프로모터의 기능성 서열 변이의 예는 재조합 산물 유전자의 삽입을 위한 적당한 제한효소 인식부위를 생성시키기 위하여 조작된 전사 시작 부위를 가진 프로모터 서열이다.

본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서, 사용된 mCMV 프로모터는 본질적으로 US 4,968,615 에 기재된 약 2.1 kb 의 큰 PstI 절편에 해당한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 이용되는 mCMV 프로모터는 전사 시작 부위 (+0) 를 포함하고 상류로 약 -500 위치까지 확장된 그의 절편이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 전사 시작 부위로부터 상류로 확장된 그러나 천연 전사 시작 부위로부터 약 -150 위치의 Xho I 제한효소 인식부위까지 확장된 또는 심지어 천연 전사 시작 부위로부터 상류로 -100 위치까지 확장된 핵심 프로모터 영역이 이용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서 사용되는 mCMV 프로모터는 문헌 [Addison 등, J. Gen. Virol., 78 (1997), 1653-1661] 에 기재된 바와 같은, mCMV 프로모터의 -491 에서 +36 까지의 절편 또는 -1336 에서 +36 까지의 절편이다.

본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서, 사용된 제 1 hCMV 인트론 (hCMV 인트론 A 또는 인간 CMV 인트론 A) 는 본질적으로 문헌 [Chapman 등, Nucleic Acids Research, 19 (1991), 3979-3986] 에 정의된 바와 같은 823 bp 서열에 해당한다.

본 발명에 따르면 사용된 제 1 hCMV 인트론은 또한 이의 기능성 절편 또는 기능성 서열 변이체일 수 있다. 즉, mCMV 프로모터의 전사 활성을 강화하는데 기능하는 또는 강화할 수 있는 hCMV 인트론 A 의 임의의 서열 변이체 또는 절편이 hCMV 인트론 A 로 사용될 수 있다. 상기 제 1 hCMV 인트론의 "기능성 변이체"에는 특히 천연 mCMV 서열에 대한 염기 삽입, 결실 또는 점돌연변이가 포함된다. 기능성 변이체는 번역 개시를 위한 코작 (Kozak) 공통 서열에 더 가까운 번역 개시 신호를 만드는 단일 염기 변형을 가진 서열을 가질 수 있다. 기능성 변이체에는 또한 문헌 [Chapman 등, Nucleic Acids Research, 19 (1991), 3979-3986] 에 정의된 바와 같은 823 bp 서열의 절단이 포함되는데, 본 발명에 따르면 이에 의해 상기 기능성 변이체의 서열은 100 ~ 150 bp 이상, 바람직하게는 200 ~ 300 bp 이상, 더욱 바람직하게는 400 ~ 500 bp 이상 및 가장 바람직하게는 600 ~ 700 bp 이상의 길이를 갖는다. 본 발명에 따르면 상기 기능성 변이체의 서열은 그의 전체 길이에 걸쳐 문헌 [Chapman 등, Nucleic Acids Research, 19 (1991), 3979-3986] 에 정의된 바와 같은 823 bp 서열에 대해 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상 및 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 맥락에서 용어 "이종성 코딩 서열", "이종성 유전자 서열", "이종성 유전자", "재조합 유전자", "관심 유전자" 및 "형질전환 유전자"는 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어들에 의해 DNA 서열은 재조합 또는 이종성 유전자 산물을 코딩하는 서열을 의미한다. 상기 이종성 유전자 서열은 숙주 세포에 천연적으로는 존재하지 않는 것이며 상이한 종의 유기체로부터 유래한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 또는 이종성 유전자 산물은 포유동물 세포에서 발현시켜 다량 수확하고자 하는 재조합 단백질이다. 상기 유전자 산물은 또한 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이는 임의의 관심 단백질일 수 있는데, 예컨대 인터류킨 또는 효소와 같은 치료용 단백질 또는 항체 또는 이의 절편과 같은 다합체 단백질의 하위단위일 수 있다. 상기 재조합 산물 유전자에는 일단 발현된 폴리펩티드가 숙주 생산자 세포로부터 분비되게 하는 신호 펩티드를 인코딩하는 신호 서열이 포함될 수도 있다. 즉, 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 상기 산물 단백질은 분비된 단백질이다. 더욱 바람직하게는, 상기 산물 단백질은 항체 또는 조작된 항체 또는 이의 절편이고, 가장 바람직하게는 이는 면역글로불린 G (IgG) 항체이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서 포유동물 발현 벡터는 본원에 참조 병합되는 WO 2004/009823 A1 에 개시된 바와 같이 mCMV 프로모터의 활성을 추가로 강화시키는 쥐의 IgG2A 좌위 DNA 의 일부를 추가로 포함한다. WO 2004/009823 A1 으로부터, 쥐의 IgG 2A 표적화 서열이 심지어 CHO 세포를 발현 벡터로 일시적 트랜스펙션시 CHO 세포에서의 유전자 발현을 증진시킨다는 것이 알려져 있다. 바람직하게는 상기 쥐의 IgG2A 좌위 DNA 의 일부는 CH1 엑손의 대부분의 5' 부분을 제외한 쥐의 Ig 감마 2A 의 코딩 영역 전부를 포함하는 5.1 kb BamHI 게놈 절편이다(Yamawaki- Kataoka, Y. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1982) 79: 2623-2627; Hall, B. 등, Molecular Immunology (1989) 26:819-826; Yamawaki-Kataoka, Y. 등, Nucleic Acid Research (1981) 9: 1365-1381).

바람직하게는, 본 발명의 발현 벡터는 또한 mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론 서열의 제어 하에서의 재조합 유전자를 포함한 발현 카세트의 삽입을 위한 제한된 수의 유용한 제한효소 인식부위를 포함한다. 특히 일시적/에피솜 발현에만 사용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 진핵 숙주 세포에서의 자율 복제/에피솜 유지를 위한 SV40 바이러스 또는 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV) 의 원점과 같은 복제 원점을 추가로 포함할 수 있으나 선별가능 마커는 결여할 수도 있다. 본 발명의 발현 벡터는 예를 들어, 이들에 한정됨 없이, 선형 DNA 절편, 핵 표적화 서열들을 포괄하는 DNA 절편일 수 있고 또는 세균 내에서 이동 및 생산될 수 있는 적당한 플라스미드, 동물 바이러스 또는 트랜스펙션 시약과의 상호작용에 특별히 최적화될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 포유동물 발현 벡터는 동물 세포에서 선별가능한 하나 이상의 발현가능 마커를 추가로 포함한다. 티미딘 키나아제 (tk), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 글루타민 합성효소 (GS) 와 같은 임의의 흔히 사용되는 선별 마커가 사용될 수도 있다. 한가지 바람직한 구현예에서는, 발현가능한 GS 선별 마커가 사용된다(Bebbington 등, 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett 등, 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). GS-시스템은 치료용 단백질의 제조에 특히 중요한 단 2 개의 시스템 중 하나이다. 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템과 비교할 때, 고도 생산성의 세포주가 종종 초기 트랜스펙턴트 (tranfectant) 로부터 생성될 수 있어 유전자 증폭을 수행하기 위하여 선별 제제의 농도를 증가시키면서 복수 회의 선별을 해야 할 필요성을 피할 수 있으므로, 상기 GS 시스템은 개발 동안 커다란 시간적인 유리점을 제공한다(Brown 등, 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotcchnology 9:231-236). 마커 유전자의 발현을 위한 제 2 전사 단위에 대응되게, 발현 단위가 예컨대 당업계에서 일상적으로 사용되는 바와 같은 내부 리보솜 진입 부위를 이용함으로써 산물 유전자 및 마커 유전자 모두를 위한 모노시스트론 (monocistronic) 발현 카세트를 사용할 수 있음은 물론이다.

본 발명의 포유동물 발현 벡터의 한가지 바람직한 구현예에서 재조합 또는 이종성 유전자 산물 및 선별가능 마커는 단일한 디시스트론 (dicistronic) 전사 단위로부터 생산된다. 즉, mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론으로 이루어진 조절 단위는 하류에 위치한 이종성 또는 재조합 유전자 서열의 발현 및 역시 하류에 위치한 선별가능 마커의 발현 모두를 유도한다. 디시스트론 벡터가 선별가능 마커 및 재조합 유전자를 모두 효율적으로 공동증폭시킨다는 것은 공지되어 있다. 또한, 단일한 전사 단위로부터의 2 개의 열린 해독틀 (open reading frame) 의 발현은 고수준의 단백질 생산을 산출하는 것으로 나타났다. 본 발명의 포유동물 발현 벡터의 또 다른 바람직한 구현예에서 관심 유전자, 즉 재조합 또는 이종성 유전자, 및 선별가능 마커 유전자는 별개의 전사 단위들 상에 존재하는데, 즉 이들의 발현은 별개의 프로모터들에 의해 이끌어진다. 본 구현예에서 선별가능 마커 유전자는 또한 mCMV 프로모터 및 제 1 hCMV 인트론으로 이루어진 조절 단위의 제어 하에 있을 수 있다. 그러나, 상기 선별가능 마커의 발현은 또한 또 다른 프로모터, 예컨대 SV40 조기 및 후기 프로모터, 혼성 Moloney 쥐 백혈병 바이러스-SV40 프로모터 SRM 또는 hCMV 프로모터 중 하나에 의해 이끌어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 2 개 이상의 별개의 전사 단위들을 포함한 포유동물 발현 벡터에 관한 것이다. 상기와 같은 발현 벡터는 또한 이중 유전자 벡터로도 지칭된다. 한가지 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 전사 단위 각각은 상이한 관심 재조합 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 제 1 전사 단위는 본 발명의 조절 단위, 즉 mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론의 제어 하에 첫번째 산물 유전자 또는 이종성 코딩 서열을 포함하여, 숙주 세포에서 발현시 첫번째 산물 단백질을 일으키며, 제 2 전사 단위는 본 발명의 조절 단위의 제어 하에 두번째 산물 유전자 또는 이종성 코딩 서열을 포함하여, 숙주 세포에서 발현시 두번째 산물 단백질을 일으킨다. 상기와 같은 벡터의 예는 이중 유전자 벡터인데, 여기서 제 1 전사 단위는 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자를 포함하며 제 2 전사 단위는 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 그러나, 재조합 유전자 서열을 포함한 제 2 전사 단위의 발현이 본 발명의 조절 단위 이외의 조절 단위에 의해 이끌어지는 것도 가능하다. 상기 제 2 전사 단위는 예를 들어 hCMV 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서 포유동물 발현 벡터는 적어도 산물 유전자에 대한 (제 1) 전사 단위를 포함하여, 숙주 세포에서 발현시 산물 단백질을 일으키며, 상기 전사 단위는 본 발명의 조절 단위, 즉 mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론의 제어 하에 있으며, 상기 벡터는 마커 유전자, 바람직하게는 글루타민 합성효소 (GS) 마커 유전자를 포함한 제 2 전사 단위를 추가로 포함한다. 상기 산물 유전자 또는 관심 유전자 (GOI) 는 예컨대 면역글로불린 코딩 서열일 수 있다. 글루타민 합성효소 마커 유전자는 임의의 효소적으로 활성인 GS 코딩 서열로서, 천연 유전자 서열 또는 이의 변이체이다. 상기 바람직한 범위의 서열 상동성을 비롯한 상기 개시한 바와 같은 "기능성 변이체"에 대한 상기 정의들은 여기서도 적용된다. 이러한 발현 벡터에 의하면, CHO 세포에서 트랜스펙션시 예컨대 관심 유전자가 포함된 제 1 전사 단위가 hCMV 프로모터의 제어 하에 있는 발현 벡터에 의한 것보다 훨씬 더 높은 트랜스펙션률이 가능하게 된다. 이는 CHO 세포에서, mCMV 프로모터의 전사 활성이 hCMV 프로모터의 전사 활성보다 훨씬 더 높다는 사실에도 불구하고 그렇다; 보통 트랜스펙션시, 보다 높은 대사 부하 (metabolic load) 는 트랜스펙션시의 클론 생존률을 감소시켜, 트랜스펙턴트의 수가 감소되는 결과를 가져오는 것으로 여겨진다. 즉, 상기 효과는 발현된 산물 단백질의 양 또는 예기치 못한 독성과 명백히 상관관계에 있다고 할 수 없는데, 후자는 트랜스펙턴트의 성장에 악영향을 끼칠 가능성이 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 mCMV 프로모터 + 상기 mCMV 프로모터 서열의 하류에 위치한 제 1 hCMV 인트론을 포함한 조절 단위에 관한 것이다. 본 발명의 조절 단위가 유전자 서열에 작동가능하게 연결되면, 이는 포유동물 세포의 환경 안에서 상기 유전자 서열의 전사 개시를 중재하고 RNA 전사물을 안정화하며 대응 mRNA 로부터 효율적인 단백질 합성을 촉진할 것이다. 바람직하게는 본 발명의 조절 단위는 벡터 내에 이종성 유전자 산물을 코딩하는 서열의 상류로 조절 단위의 삽입을 가능하게 하기 위해 및/또는 벡터로부터의 이의 방출을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 적당한 제한효소 인식부위의 측면에 위치한다. 본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서 상기 조절 단위는 상류에 AscI 제한효소 인식부위 및 하류에 Hind III 제한효소 인식부위가 인접해 있다. 즉, 본 발명에 따른 조절 단위는 발현 벡터, 특히 포유동물 발현 벡터의 구축에 유용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 조절 단위 및 전사 단위, 즉 재조합 또는 이종성 단백질 산물을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한 발현 카세트에 관한 것이다. 상기 조절 단위는 전사 단위의 상류에 위치하여, 그에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 조절 단위는 전사 단위, 즉 이종성 유전자의 코딩 서열에 직접 연결되거나 또는 DNA 에 예를 들어 상기 이종성 유전자의 5'-미번역 영역 등을 개재시킴으로써 이로부터 분리된다. 바람직하게는 상기 발현 카세트는 이를 벡터 내로 삽입 및/또는 이를 벡터로부터 제거하는 것을 가능하게 하기 위하여 하나 이상의 적당한 제한효소 인식부위의 측면에 위치한다. 즉, 본 발명에 따른 발현 카세트는 발현 벡터, 특히 포유동물 발현 벡터의 구축에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 포유동물 발현 벡터를 포함한 포유동물 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 포유동물 숙주 세포는 인간 또는 비-인간 세포일 수 있다. 상기 포유동물 숙주 세포의 바람직한 예로서는, 이들에 한정됨 없이, MRC5 인간 섬유아세포, 983M 인간 흑색종 세포, MDCK 갯과(科) 신장 세포, Sprague-Dawley 래트에서 분리한 RF 배양된 래트 폐 섬유아세포, B16BL6 쥐 흑색종 세포, P815 쥐 비만세포종 세포 및 MT1A2 쥐 유선 선암종 세포를 들 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 세포주이다(Puck 등, 1958, J. Exp. Med. 108: 945-955). 적당한 CHO 세포주로서는, 예컨대 CHO K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12 또는 dhfr- CHO 세포주 DUK-BII (Chassin 등, PNAS 77, 1980, 4216-4220) 또는 DUXB11 (Simonsen 등, PNAS 80, 1983, 2495-2499) 을 들 수 있다.

상기 발현 벡터를 본 발명에 따른 포유동물 숙주 세포 내로 도입하기 위해서는 주어진 숙주 세포 유형에 적절할 경우 당업계에 익히 공지된 것들 등의 임의의 트랜스펙션 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 공침 (co-precipitation), DEAE-덱스트란 트랜스펙션, 리포펙션을 이용할 수 있다. 본 발명의 벡터로 트랜스펙션된 포유동물 숙주 세포는 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션된 세포주인 것으로 해석되어야 함을 유의해야 한다. 즉, 본 발명에 따르면 본 발명의 포유동물 발현 벡터는 에피솜으로 유지될 수 있고 또는 포유동물 숙주 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합될 수 있다.

일시적인 트랜스펙션은 벡터에 포함된 선별 마커를 위한 임의의 선택압의 비적용을 특징으로 한다. 일시적인 트랜스펙션에서 비롯된 세포의 풀 또는 뱃치 (batch) 는 외래 DNA 를 흡수하여 발현하는 세포 및 외래 DNA 를 흡수하지 않은 세포를 포함한 풀화 (pooled) 세포 집단이다. 트랜스펙션 후 통상 20 ~ 50 시간 지속되는 일시적인 발현 실험에서, 트랜스펙션된 벡터는 에피솜의 구성요소로 유지되며 아직은 게놈 내로 통합되지 않는다. 즉 트랜스펙션된 DNA 는 보통 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않는다. 상기 숙주 세포는 상기 트랜스펙션된 DNA 를 잃어버리는 경향이 있으며, 일시적으로 트랜스펙션된 세포 풀의 배양시 상기 집단 중 트랜스펙션된 세포가 과도하게 성장한다. 따라서 발현은 트랜스펙션 직후의 기간에 가장 강하며, 시간에 따라 감소한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 일시적인 트랜스펙턴트는 트랜스펙션 후 90 시간까지 선택압의 부재 하에서 세포 배양에서 유지된 세포로 이해된다.

본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서 포유동물 숙주 세포 예컨대 CHO 숙주 세포는 본 발명의 포유동물 발현 벡터로 안정적으로 트랜스펙션된다. 안정적인 트랜스펙션이란, 벡터 DNA 와 같은 새로이 도입된 외래 DNA 가, 보통은 무작위의 비상동성 재조합에 의해, 게놈 DNA 내로 편입되는 것을 의미한다. 상기 벡터 서열이 숙주 세포의 DNA 내로 통합된 후 증폭된 세포주를 선별함으로써 상기 벡터 DNA 의 복제수 및 부수적으로 그의 유전자 산물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 이러한 안정적인 통합은, 유전자 증폭을 위한 추가적인 선택압에의 노출시, CHO 세포에서 이중 미세 염색체를 생성시킬 수 있다. 게다가, 벡터 서열의 경우, 안정적인 트랜스펙션의 결과로서 재조합 유전자 산물의 발현과 직접 관련되지 않은 벡터 서열 부분, 예컨대 게놈으로의 통합시 과잉이 된 세균 복제수 제어 영역 등의 결실이 일어날 수 있다. 따라서, 트랜스펙션된 숙주 세포는 상기 발현 벡터의 일부 이상 또는 상이한 부분들을 그의 게놈 내로 통합시킨 것이다. 마찬가지로, 적어도 생체내에서 쥐의 CMV 프로모터 및 제 1 hCMV 인트론의 제어 하에서 본 발명의 포유동물 발현 벡터의 본질적 구성요소들의 기능적 등가물, 즉 이종성 유전자 산물을 야기하는 2 개 또는 여러 개의 DNA 절편에 의한 CHO 세포의 트랜스펙션은 이러한 트랜스펙션된 숙주 세포의 정의에 포함된다. 절편화된 DNA 의 트랜스펙션 후의 기능성 DNA 서열들의 생체내 조립은 예컨대 WO 99/53046 에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 단계들을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다:

a) 포유동물 숙주 세포 또는 숙주 세포주를, 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 hCMV 인트론 및 쥐의 CMV 프로모터를 포함한 발현 벡터로 트랜스펙션하는 단계;

b) 상기 세포를 상기 세포의 성장 및/또는 증식 및 상기 재조합 단백질의 발현/생산을 가능하게 하는 적절한 조건 하에서 배양하는 단계; 및

c) 상기 생산된 재조합 단백질을 수확하는 단계.

포유동물 숙주 세포 또는 포유동물 숙주 세포주를 벡터로 트랜스펙션하는 방법은 당업계에 익히 알려져 있다. 본 발명에 따른 방법에서는 주어진 숙주 세포 유형에 적절할 경우 당업계에 익히 알려진 것들과 같은 임의의 트랜스펙션 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 공침, DEAE-덱스트란 트랜스펙션, 리포펙션을 이용할 수 있다. 본 발명에 따르면 상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙션될 수 있다.

용어 "숙주 세포" 또는 "숙주 세포주"는 배양시 성장하여 목적하는 단백질 재조합 산물 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포, 특히 포유동물 세포를 지칭한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 포유동물 숙주 세포는 인간 또는 비-인간 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서 트랜스펙션에 사용된 포유동물 숙주 세포주는 임의의 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주일 수 있다(Puck 등, 1958, J. Exp. Med. 108: 945-955). 적당한 세포주로서는, 예컨대 CHO K1 (ATCC CCL-61), CHO pro3-, CHO DG44, CHO P12 또는 dhfr- CHO 세포주 DUK-BII (Chassin 등, PNAS 77, 1980, 4216-4220) 또는 DUXB11 (Simonsen 등, PNAS 80, 1983, 2495-2499) 를 들 수 있다. 마우스 거대세포바이러스의 주요 즉각 조기 유전자의 프로모터 (mCMV 프로모터) 의 전사 활성은 CHO 세포 내에서 매우 높은 것으로 알려져 있다. 나아가, 본 발명의 포유동물 발현 벡터가 쥐의 IgG2a 서열을 포함할 경우 상기 서열은 심지어 본 발명에 따른 발현 벡터로 CHO 세포를 일시적으로 트랜스펙션시 CHO 세포에서 유전자 발현을 증진시킬 것이다.

포유동물 세포주에 적당한 배지 및 배양 방법은, 예를 들어 US 5,633,162 에 기재된 바와 같이 당업계에 익히 알려져 있다. 특정 세포 유형의 필요에 적합하게 된 실험실용 플라스크용 또는 저밀도 세포 배양을 위한 표준 세포 배양 배지의 예로서는, 이들에 한정됨 없이, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p.519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. 등, Amer. J. of Hygiene, 78, Ip.173 ff, 1963), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 이글 최소 필수 배지 (MEM), 햄 F12 배지 (Ham, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결여된 이스코베 (Iscoves) 변형 DMEM (Iscoves 등, J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978) 를 들 수 있다. 예를 들어, 햄 F10 또는 F12 배지는 특별히 CHO 세포 배양을 위해 고안된 것이었다. CHO 세포 배양에 특별히 적합하게 된 기타 배지는 EP-481 791 에 기재되어 있다. 이러한 배양 배지에 소 태아 혈청 (FBS, 또한 송아지 태아 혈청 (fetal calf serum, FCS) 으로도 불림) 이 보충될 수 있는 것이 알려져 있는데, 후자는 과잉의 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공한다. 포유동물 세포의 세포 배양은 오늘날 과학 교본 및 편람에 익히 기재된 일상적인 작업으로서, 이는 예컨대 문헌 [R. Ian Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 제 4 판, Wiley-Liss/N.Y., 2000] 에서 상세히 다뤄져 있다.

본 발명의 한가지 바람직한 구현예에서, 사용된 세포 배양 배지에는 송아지 태아 혈청 (FCS 또는 FBS) 이 결여되어 있는데, 이는 '무혈청'으로 지칭된다. 무혈청 배지 중의 세포는 일반적으로 최적의 성장을 위해 무혈청 배지 중에 인슐린 및 트랜스페린을 필요로 한다. 트랜스페린은 WO 94/02592 에 기재된 바와 같은 트로폴론 (tropolone) 과 같은 철분포획체 (siderophore) 또는 비-펩티드 킬레이트제 또는 비타민 C 와 같은 산화방지제와 유리하게 결합된 증가된 수준의 유기 철의 공급원에 의해 적어도 부분적으로 대체될 수 있다. 대부분의 세포주는 예컨대 상피세포 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II (IGFI, IGFII) 등을 비롯한 하나 이상의 합성 성장 인자 (재조합 폴리펩티드를 포함한 것) 를 필요로 한다. 필수적일 수 있는 기타 부류의 인자들로서는 하기가 있다: 프로스타글란딘, 수송 및 결합 단백질 (예컨대 세룰로플라스민 (ceruloplasmin), 고- 및 저밀도 지질단백질, 소 혈청 알부민 (BSA)), 스테로이드-호르몬을 비롯한 호르몬, 및 지방산. 폴리펩티드 인자 시험은 성장을 촉진하는 것으로 나타난 것들의 존재하에서 새로운 폴리펩티드 인자들을 시험하는 순차적 방식으로 가장 잘 행해진다. 이들 성장 인자들은 합성 또는 재조합된 것이다. 동물 세포 배양에서 익히 알려진 방법론적인 접근들이 여럿 존재하는데, 예시적인 것은 하기에 기재된다. 초기 단계는 세포가 혈청-보충된 배양 배지로부터 이전 후 3 ~ 6 일 동안 생존 및/또는 느리게 성장하는 조건을 수득하는 것이다. 대부분의 세포 유형에서, 이는 적어도 부분적으로는 접종원 밀도의 기능이다. 최적의 호르몬/성장 인자/폴리펩티드 보충물이 발견되면, 생존에 필요한 접종원 밀도는 감소될 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지는 단백질을 포함하지 않은 것인데, 즉 태아 혈청 및 개별 단백질 성장 인자 보충물 또는 재조합 트랜스페린과 같은 기타 단백질이 모두 결여된 것이다.

또 다른 구현예에서 재조합 산물 단백질의 발현 및 수확으로 이끄는 본 발명의 방법에는 예컨대 공업적 유가식 생물반응기에서 동물 숙주 세포를 고밀도 성장시키는 것이 포함된다. 이후 통상의 하부 공정을 적용할 수 있다. 따라서, 고밀도 성장 배양 배지가 이용되어야 한다. 이러한 고밀도 성장 배지는 통상 모든 아미노산과 같은 영양물, 상기 주어진 범위의 포도당과 같은 에너지원, 무기 염류, 비타민, 미량 원소 (통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 완충액, 4 개의 뉴클레오시드 또는 이들의 대응 뉴클레오티드, (환원된) 글루타티온, 비타민 C 와 같은 산화방지제 및 중요 막 지질, 예컨대 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 또는 지질 전구체, 예컨대 콜린 또는 이노시톨과 같은 기타 성분으로 보충될 수 있다. 고밀도 배지에는 이들 화합물의 대부분 또는 전부가 풍부할 것이며, 필수적으로 등장성인 배지의 삼투질 농도 (osmolality) 를 조절하는 무기 염류를 제외하고는, 이는 RPMI 1640 과 비교시 GB2251 249 로부터 유추될 수 있는 바와 같이 앞서 언급한 표준 배지보다는 더 많은 (강화된) 양으로 이들을 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 고밀도 배양 배지는 트립토판을 제외한 모든 아미노산이 배양 배지 1 ℓ 당 75 mg 을 초과한다는 점에서 강화된다. 바람직하게는, 일반적인 아미노산 요건과 관련하여, 글루타민 및/또는 아스파라긴은 고밀도 배양 배지 1 ℓ 당 1 g 초과, 더욱 바람직하게는 2 g 초과로 존재한다. 본 발명의 맥락에서, 고밀도 세포 배양은 일시적으로 생존가능한 세포의 밀도가 적어도 10⁵ 개 세포/ml 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 10⁶ 개 세포/ml 또는 그 이상인 동물 세포의 집단으로서, 일정한 또는 증가하는 배양 부피에서 세포 배양 배지 중의 생존가능한 세포 밀도가 더 낮은 단일 세포 또는 접종원으로부터 지속적으로 성장해 온 집단으로 정의된다.

더욱 바람직한 구현예에서 본 발명의 방법에는 유가식 배양이 포함된다. 유가식 배양은 GB2251249 에 기재된 바와 같이, 포도당 농도를 별개의 공급물로 조절하는 것 외에, 적어도 글루타민을, 임의로는 1 개 또는 여러 개의 다른 아미노산, 바람직하게는 글리신과 함께, 세포 배양물에 공급하여 배지 중에서 이들의 농도를 유지하는 배양 시스템이다. 더욱 바람직하게는, EP-229 809-A 에 기재된 바와 같이 글루타민 및 임의로는 1 개 또는 여러 개의 다른 아미노산의 공급을, 세포 배양물에 대해 포도당과 같은 하나 이상의 에너지원을 공급하는 것과 조합시킨다. 공급은 통상 배양 시작 후 25 ~ 60 시간에 개시된다; 예를 들어, 세포의 밀도가 약 10⁶ 개 세포/ml 에 도달할 때 공급을 시작하는 것이 유용하다. 배양된 동물 세포에서, '글루타미노 (glutamino) 용해' (McKeehan 등, 1984, Glutaminolysis in animal cells,in: Carbohydrate Metabolism in Cultured Cells, ed. MJ. Morgan, Plenum Press, New York, pp. 11-150) 가 성장기 동안 중요한 에너지원이 될 수 있음은 당업계에 익히 알려져 있다. 총 글루타민 및/또는 아스파라긴 공급 (글루타민을 아스파라긴으로 대체한 경우, Kurano, N. 등, 1990, J. Biotechnology 15, 113-128 참조) 은 보통 배양 부피 1 ℓ 당 0.5 내지 1O g, 바람직하게는 ℓ 당 1 내지 2 g 범위이다; 공급물에 존재할 수 있는 기타 아미노산의 총 공급량은 배양물 1 ℓ 당 10 내지 300 mg 로서, 특히 글리신, 리신, 아르기닌, 발린, 이소류신 및 류신은 통상 다른 아미노산들에 비해 적어도 150 내지 200 mg 의 더 많은 양으로 공급된다. 상기 공급물은 단번에 첨가하거나 또는 지속적으로 펌핑 (pumping) 하는 공급으로 첨가될 수 있는데, 바람직하게는 상기 공급물은 대체로 생물반응기 내로 지속적으로 펌핑된다. 생물반응기에서의 유가식 배양 동안 염기 또는 완충액을 첨가하여 pH 를 주어진 세포주에 최적인 대략적인 생리적 pH 로 주의깊게 조절함은 물론이다. 포도당을 에너지원으로 사용하는 경우 총 포도당 공급량은 보통 배양물 1 ℓ 당 1 내지 10, 바람직하게는 3 내지 6 g 이다. 아미노산을 포함시키는 것 외에, 상기 공급물은 바람직하게는 배양물 1 ℓ 당 5 내지 20 mg 범위의 소량의 콜린을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 이러한 콜린의 공급을 US 6,048,728 에 기재된 바와 같이 필수적으로 에탄올아민의 보충과 병행하는데, 특히 공급 글루타민과 조합하여 한다. 내생적으로 생성된 것에 더하여 과도한 글루타민의 축적은 암모니아를 생성시키고 그에 수반하여 독성을 야기하기 때문에, 비(非)-GS 발현 시스템과 비교할 때, GS-마커 시스템의 사용시에 더 적은 양의 글루타민이 필요할 것임은 물론이다. GS 에 있어서, 배지 또는 공급물 중의 글루타민은 대부분 그의 등가물 및/또는 전구체, 즉 아스파라긴 및/또는 글루타메이트로 대체된다.

주어진 단백질을 세포, 세포 배양물 또는 세포가 배양된 배지로부터 수확하는, 즉 분리 및/또는 정제하는 방법은 당업계에 익히 알려져 있다. 단백질은 예를 들어 염류 또는 유기 용매를 이용한 분별 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, HPLC, 친화 크로마토그래피 등에 의해 생물학적 물질로부터 분리 및/또는 정제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 제 1 hCMV 인트론을 사용함에 의한, 포유동물 숙주 세포에서 재조합 또는 이종성 유전자 산물을 발현시키는 mCMV 프로모터의 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 본 방법에 따르면, 분자 클로닝 방법에 의해 hCMV 인트론 A 서열을 이미 존재하는 벡터 분자 내의 mCMV 프로모터 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자 서열 사이에, mCMV 프로모터 및 제 1 hCMV 인트론이 상기 이종성 유전자 서열에 작동가능하게 연결되도록 삽입함으로써 mCMV 프로모터로부터의 목적하는 이종성 유전자 산물의 발현을 현저히 강화시킬 수 있다. 분자 클로닝 방법은 당업계에 익히 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Maniatis, T., Fritsch, E. F. 및 Sambrook, J., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 에 기재되어 있다. 그 후 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포를 이렇게 생성된, mCMV 프로모터 및 그의 하류에 위치한 목적 단백질을 인코딩하는 이종성 DNA 서열 사이에 제 1 hCMV 인트론을 포함한 벡터 구축물로 트랜스펙션한다. 그 후 트랜스펙턴트를 세포의 성장 및/또는 증식 및 재조합 단백질의 발현/생산이 이루어지게 하기 위해 적절한 조건 하에서 배양한다. 마지막으로 생산된 재조합 단백질을 수확, 즉 분리 및 정제한다. 본 발명의 방법에서 제 1 hCMV 인트론을 사용함에 의해, 재조합 단백질이 mCMV 프로모터로부터 발현되는 효율을 현저히 강화시키고 재조합 단백질을 고수준으로 발현시키는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 따르면 재조합 유전자의 발현이 mCMV 프로모터에 의해서만 유도되는 기존의 발현 벡터의 발현 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명은 또한 mCMV 프로모터의 활성을 향상시키기 위해 제 1 hCMV 인트론을 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예는 도면으로 도시된다. 도면으로 나타낸 것은 하기와 같다:

도 1: 도 4 에 도시된 바와 같은 짧은 mCMV 프로모터 및 인간 인트론 A 를 포함한 mCMV-인간 인트론 A 절편 및 도 3 에 도시된 바와 같은 짧은 mCMV 프로모터를 포함한 mCMV (짧은)-Ex1 PCR 산물을 클로닝하는데 사용된 벡터 Delta-pEE12.4 의 물리적 지도.

도 2: mCMV 프로모터의 PCR 증폭에 사용된 mCMV 주형의 물리적 지도로서, 사용된 다양한 프라이머들의 위치가 표시되어 있음.

도 3: mCMV 프로모터 + 제 1 인간 CMV 인트론을 포함한, 절편 mCMV-인간 인트론 A 를 수득하기 위해 인트론 A-PCR 절편과 연결하는데 사용된 짧은 mCMV 프로모터를 포함한 mCMV (짧은)-Ex1 PCR 산물의 물리적 지도.

도 4: mCMV 프로모터 + 제 1 인간 CMV 인트론을 포함한 절편 mCMV-인간 인트론 A 의 물리적 지도.

도 5: 인간 IgG4/Kappa 항체를 발현시키는 이중 유전자 발현 벡터 pcB72.3-mCMV 의 플라스미드 지도로서, 상기 항체의 발현은 짧은 mCMV 프로모터의 제어 하에 있음. 상기 벡터는 선별가능한 GS 마커 유전자를 추가로 포함함.

도 6: 인간 IgG4/Kappa 항체를 발현시키는 이중 유전자 발현 벡터 pcB72.3-mCMV + 인트론 A 의 플라스미드 지도로서, 이 때 상기 항체의 발현은 짧은 mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론의 제어 하에 있음. 상기 벡터는 선별가능한 GS 마커 유전자를 추가로 포함함.

도 7: 인간 IgG4/Kappa 항체의 이중 유전자 발현 벡터 pcB72.3 의 플라스미드 지도로서, 상기 항체의 발현은 hCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론의 제어 하에 있음(대조군). 상기 벡터는 선별가능한 GS 마커 유전자를 추가로 포함함.

도 8: 안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1SV 세포에서 짧은 mCMV 프로모터 단독, mCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론, 및 hCMV 프로모터 + 제 1 hCMV 인트론 (대조군) 으로부터의 IgG4/Kappa 항체의 상대적 발현 수준.

본 발명의 본 명세서에서 제시된 바람직한 구현예에서 이루어진 설명 및 참조는 본 발명의 모든 추가적인 바람직한 구현예에도 마찬가지로 관련됨은 물론이다.

본 발명을 하기 실시예로 더욱 상세히 설명한다.

물질 및 방법

사용된 세포

CHO 세포주 CHOK1SV: 세포주 CHO-K1 의 변이체로서 현탁 및 단백질 부재 배지에서의 성장에 적합하게 된 것임.

CHOK1SV 세포의 증식:

CHOK1SV 세포를 현탁 진탕기 플라스크에서 6 mM L-글루타민이 보충된 CD-CHO 배지 (Invitrogen) 중에서 일상적으로 증식시켰다. 접종 농도 (seed concentration) 는 2 x 10⁵ 개 세포/ml 이었고, 세포를 4 일마다 분할하였다. 플라스크들을 5% CO₂ 로 처리하고, 140 rpm 으로 회전식 진탕하면서 36.5℃ (35.5℃ 및 37.0℃ 사이) 에서 인큐베이션하였다.

안정적 트랜스펙션:

트랜스펙션에 사용된 세포를 앞서 상세히 기재한 바와 같이 세포 현탁 배양물에서 성장시켰다. 성장 배양물로부터의 세포를 원심분리하고 무혈청 배지에서 1 회 세정한 후, 1.43 x 10⁷ 개 세포/mL 의 농도로 재현탁하였다. 0.7 mL 부피의 상기 세포 현탁물 및 40 ㎍ 의 플라스미드 DNA 를 전기천공 큐벳에 첨가하였다. 그 후, 상기 큐벳을 전기천공 장치에 위치시키고, 250 V 및 400 μF 의 단일 펄스를 가하였다. 트랜스펙션 후, 상기 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 대략 2,500 개의 숙주 세포 (5 x 10⁴/mL) 로 분배하였는데, 10% dFCS 가 보충된 비-선택적 DMEM-기재 배지를 사용하였다. 상기 플레이트를 공기 중 10% CO₂ 의 대기 중에서 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃ 사이) 에서 인큐베이션하였다.

트랜스펙션 1일 후, 10% dFCS/66 μM L-메티오닌 술폭시민이 보충된 DMEM-기재 배지를 각 웰에 첨가하여 (150 μL/웰) 최종 50 μM 의 L-메티오닌 술폭시민 농도가 되게 하였다. 상기 플레이트들을 모니터하여 트랜스펙션되지 않은 세포들이 사멸한 시점 및 트랜스펙션된 세포들의 진원 (focus) 들이 나타난 시점을 측정하였다. 트랜스펙션된 세포들의 진원들은 트랜스펙션 후 대략 3 내지 4 주 후에 나타났다. 검사 및 진행된 모든 세포주들은 또한 단 하나의 콜로니가 담긴 웰들에서 가져온 것들이었다.

정치 배양 (Static Culture) 에서의 세포주의 생산성 평가

상기 96-웰 트랜스펙션 플레이트들을 대략 3 주간 인큐베이션하여 콜로니를 형성시켰다. 생성된 콜로니들을 현미경으로 검사하여 콜로니들이 분석에 적당한 크기 (차지한 부분이 웰의 바닥의 60% 를 초과) 인지, 및 각 웰에서 단 1 개의 콜로니가 존재하는지 확인하였다.

적당한 콜로니들을 1 mL 의 선택적 성장 배지 (DMEM-기재 배지/10% dFCS/25μM L-메티오닌 술폭시민) 가 담긴 24-웰 플레이트의 웰들로 옮겼다. 이들 배양물을 공기 중 10% CO₂ 의 대기 중에서 36.5℃ (35.5℃ 내지 37.0℃ 사이) 에서 14 일간 인큐베이션하였다. 각 웰의 상청액을 수확하고, 단백질-A HLPC 방법으로 존재하는 항체의 농도를 분석하였다.

어셈블리 (Assembly) ELISA:

조립된 인간 IgG 를 측정하는 샌드위치 (sandwich) ELISA 를 사용하여 시료들의 항체 농도를 측정하였다. 이는 항-인간 Fc 항체가 코팅된 96 웰 플레이트 상에서 표준 및 시료들에 대한 포획을 포함하였다. 결합한 항체를 서양고추냉이 과산화효소 및 발색성 기질인 TMB 에 연결된 항-인간 경쇄를 이용하여 나타내었다. 발색은 표준과 비교하였을 때 시료 중에 존재하는 항체의 농도에 비례하였다.

단백질 A HPLC:

Agilent 1100 HPLC 상에서 IgG 측정을 위한 단백질 A 친화 크로마토그래피 방법을 수행하였다. IgG 생성물은 Poros 단백질 A 면역검출 컬럼에 선택적으로 결합한다. 결합하지 않은 물질을 세정에 의해 컬럼으로부터 제거하고, 남아있는 결합한 항체는 용매의 pH 를 감소시킴으로써 방출시켰다. 280 nm 에서의 흡광도로 용출을 모니터하고, 일반 항체 표준에 대하여 생성물을 정량하고 (Chemstation 소프트웨어 사용), 흡광 계수의 차에 대하여 보정을 행하였다.

벡터 구축

프라이머 1 내지 9 의 서열은 서열 목록에서 서열번호: 1 내지 9 로 나타나 있다.

벡터 Delta-pEE12.4 의 생성

GS 벡터 pEE12.4 내의 RE 부위들인 Bg1 II 및 SspB I 사이의 hCMV 프로모터 영역의 일부를, 3'-말단에 Asc I 부위를 도입하는 PCR 절편으로 대체하여 벡터 Delta-pEE12.4 를 생성하였다. 이를 위해, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 2 를 사용하였다(표 1 참조).

양 PCR 프라이머를 모두 벡터 pEE12.4 의 DNA 를 DNA 주형으로 사용하는 PCR 반응에 사용하였다. 이의 PCR 산물은 하기 서열을 갖는다(서열번호: 10):

도 1 은 이렇게 수득된 벡터 Delta-pEE12.4 의 물리적 지도를 나타낸다. 벡터 Delta-pEE12.4 는 mCMV 프로모터의 짧은 절편을 클로닝하는데 사용되었다.

mCMV 프로모터의 짧은 절편의 벡터 Delta-pEE12.4 내로의 클로닝

정방향 프라이머 3 및 역방향 프라이머 4 를 사용하여 mCMV-short 절편을 PCR 로 증폭시켰다. 주형으로서는, mCMV 프로모터를 포함한 mCMV DNA (Birmingham 대학의 Dr. Clive Sweet 제공) 를 사용하였다. 상기 PCR 증폭의 개요는 도 2 에 나와 있다.

mCMV-short 절편을 나타내는 이렇게 수득된 PCR 절편 (0.5 kb) 은 하기 서열을 갖는다(서열번호: 11; 프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

도 3 에 도식으로 나타나 있는 상기 절편을, Asc I 및 Hind III 로 사전 절단된 벡터 Delta-pEE12.4 내로 클로닝하였다. 이에 의해, 상기 벡터 내의 인간 CMV 서열의 5'-UTR 및 인트론 A 영역을 제거하였다.

mCMV-short 인트론 A 절편의 벡터 Delta-pEE12.4 내로의 클로닝.

2 개의 별개의 PCR 반응으로 상기 mCMV-short 절편 및 인간 인트론 A 절편을 생성시킨 후, 하기와 같이 서로 연결하였다.

a) mCMV-short 절편의 증폭 및 클로닝

상기 mCMV-short 절편의 증폭을 위해 정방향 프라이머 5 및 역방향 프라이머 6 을 사용하였다. 상기 PCR 증폭의 개요는 도 2 에 나와 있다.

이렇게 수득된 PCR 산물은 하기 서열을 갖는다(서열번호: 12; 프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

상기 PCR 절편을 클로닝 벡터 pCR4-TOTO (Invitrogen) 내로 클로닝하여, 벡터 pCR-4-TOTO + mCMV-short 를 수득하였다.

b) 인간 인트론 A 절편의 증폭 및 클로닝

인간 5'-UTR-인트론 A 절편의 증폭을 위해, 정방향 프라이머 7 및 역방향 프라이머 8 을 사용하였다. 주형 DNA 로서, 벡터 pEE12.4 를 사용하였다.

수득한 PCR 산물은 하기 서열을 가졌다(서열번호: 13; 프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

이렇게 수득된 PCR 절편을 클로닝 벡터 pCR4-TOTO (Invitrogen) 내로 클로닝하여, 벡터 pCR4-TOTO + 인트론 A 를 수득하였다.

c) mCMV-short-인트론 A 절편의 연결

짧은 mCMV 프로모터 절편을 포함한 mCMV-short PCR 산물을 Asc I 및 Bsu36 I 을 이용하여 벡터 pCR4-TOTO + mCMV short 로부터 절단해 내어, 벡터 pCR4-TOTO + 인트론 A 내로 클로닝하여, 벡터 pCR4-TOTO 1 mCMV-인트론 A 를 수득하였다. Asc I 및 Hind III 를 사용하여 상기 벡터로부터 mCMV 프로모터 및 제 1 인간 인트론 A 를 포함한 절편 mCMV-short-인트론 A 를 절단해 내었다. 상기 절편의 구조는 도 4 에 도식화되어 나와 있다. 상기 절편의 서열 (서열번호: 14) 은 하기와 같다(프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

그 후, 상기 절편을 Asc I - Hind III 부위들을 사용하여 상기 기재한 바와 같이 GS-벡터 pEE12.4 의 변형 버전인 Delta-pEE12.4 벡터 내로 클로닝하여, 벡터 Delta-pEE12.4-mcmv/int 를 수득하였다.

mCMV 프로모터의 짧은 절편의 벡터 pEE6.4 내로의 클로닝

mCMV-short 절편을 정방향 프라이머 9 및 역방향 프라이머 4 를 이용하여 PCR 로 증폭시켰다. 주형으로서, mCMV 프로모터를 포함한 mCMV DNA 를 사용하였다. 상기 PCR 증폭의 개요는 도 2 에 나와 있다.

mCMV-short 절편을 나타내는 이렇게 수득된 PCR 산물 (0.5 kb) 은 하기 서열을 갖는다(서열번호: 15; 프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

상기 절편은 Asc I 부위에 더하여 Not I 부위를 가진 것을 제외하고는 도 3 의 것과 매우 유사하다. 상기 절편을 Asc I 및 Hind III 로 사전 절단한 벡터 pEE6.4 내로 클로닝하였다. 이에 의해 벡터 pEE6.4-mCMVshort 가 생성되었다.

mCMV-short 인트론 A 절편의 벡터 pEE6.4 내로의 클로닝

2 개의 별개의 PCR 반응으로 mCMV-short 절편 및 인간 인트론 A 절편을 생성한 후, 다음과 같이 서로 연결시켰다.

a) mCMV-short 절편의 증폭 및 클로닝

mCMV-short 절편의 증폭을 위해서, 정방향 프라이머 9 및 역방향 프라이머 6 을 사용하였다(표 1). 이의 PCR 증폭의 개요가 도 2 에 나와 있다.

이렇게 수득된 PCR 산물 (mCMVshort-pEE6.4) 은 하기 서열을 갖는다(서열번호: 16; 프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

상기 PCR 절편을 클로닝 벡터 pCR4-TOPO + 인트론 A 내로 클로닝하여, 벡터 pCR4-TOTO-mCMVshort(pEE6.4) 를 수득하였다.

b) mCMV(pEE6.4)-short-인트론 A 절편의 연결

짧은 mCMV 프로모터 절편을 포함한 mCMV-short(pEE6.4) PCR 산물을 Asc I 및 Bsu36 I 을 사용하여 벡터 pCR4-TOTO-mCMVshort(pEE6.4) 에서 절단해 내어, 벡터 pCR4-TOTO + 인트론 A 내로 클로닝하여, 벡터 pCR4-TOTO 1 mCMV(pEE6.4)-인트론 A 를 수득하였다. Not I 및 Hind III 를 사용하여 상기 벡터로부터, mCMV 프로모터 및 제 1 인간 인트론 A 를 포함한 상기 절편 mCMV-short(pEE6.4)-인트론 A 를 절단해 내었다. 상기 절편의 구조는 5' 말단에 Not I 부위가 새로 도입된 것을 제외하고는 도 4 에 도식화하여 나타낸 것과 동일하다. 상기 절편의 서열 (서열번호: 17) 은 하기와 같다(프라이머 서열은 밑줄로, 제한효소 인식부위는 볼드체로 되어 있음):

단백질 발현 연구

항체 발현 연구의 목적은 mCMV 프로모터 또는 hCMV 프로모터 중 하나의 제어 하에서의 CHOK1SV 세포 내에서의 IgG₄/카파 항체의 발현을 비교하기 위한 것이었다.

따라서, IgG₄/카파 항체 cB72.3 의 발현을 위한 이중 유전자 벡터들로서 각각 IgG₄/카파 항체에 대한 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자 모두를 포함한 벡터들을 구축하였는데, 이 때 각 유전자는 개별적으로 동일한 조절 단위의 제어 하에 있었다.

항체 cB72.3 의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 전체 영역들을 Hind III 및 EcoR I 를 이용하여 개별적으로 기존의 벡터로부터 클로닝하여, 상기 생성된 벡터들 내로 클로닝하였다: 경쇄 코딩 절편은 (i) Delta-pEE12.4+mCMV 및 (ii) Delta-pEE12.4/mCMV+인트론 A 내로, 및 중쇄 코딩 절편은 (i) pEE6.4-mCMV 및 (ii) pEE6.4-mCMV+인트론 A 내로 클로닝함.

Not I 및 Pvu I 를 이용하여 모든 벡터들을 절단하고, 적절한 절편들 (CMV 프로모터 및 항체 사슬-코딩 서열들을 포함한 것) 을 함께 클로닝하여 이중 유전자 벡터들을 생성시켰는데, 2 개의 이중 유전자 벡터들, 즉 Delta-pEE12.4+mCMV 및 pEE6.4-mCMV 로부터의 적당한 절편들을 포함한 벡터 pcB72.3-mCMV (도 5), 및 Delta-pEE12.4/mCMV+인트론 A 및 pEE6.4-mCMV+인트론 A 로부터의 적당한 절편들을 포함한 벡터 pcB72.3-mCMV+인트론 A (도 6) 이 생성되도록 하였다. 벡터 pcB72.3-mCMV 에서 항체 발현은 상기 mCMV 프로모터에 의해 유발된다. 벡터 pcB72.3-mCMV+인트론 A 에서 항체 발현은 상기 mCMV 프로모터 + 제 1 인간 CMV 인트론에 의해 유발된다.

대조군 벡터인 pcB72.3 (도 7) 은 인간 CMV 프로모터 + 인간 인트론 A 의 조절 하에서 동일한 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 포함한다.

이들 구축물들을 안정적인 트랜스펙션에 의해 CHO 세포 내로 도입하고, 항체 발현을 연구하였다.

이들 실험의 결과는 도 8 에 나타나 있다. 도 8 은 안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1SV 세포 내에서의 mCMV 프로모터 및 hCMV 인트론으로 이루어진 조절 단위로부터의 IgG₄/카파 항체의 발현 수준이 짧은 mCMV 프로모터 단독으로부터의 발현보다 훨씬 더 높다는 것을 보여준다(p<0.0001 에서 통계학상으로 유의미함). 게다가, 이는 hCMV 프로모터 + hCMV 인트론으로부터의 항체 발현 수준에 상당한다. 즉, mCMV 프로모터 및 hCMV 인트론으로 이루어진 조절 단위로부터의 이종성 단백질의 발현은 적어도 hCMV 프로모터 및 hCMV 인트론 A 로부터의 발현만큼은 양호하다.

<110> Lonza Biologics plc <120> Mammalian expression vector comprising the mCMV promotor and first intron of hCMV major immediate early gene <130> LBP1008PC00 <160> 17 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagagagat ctttgtgaag g 21 <210> 2 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcgcgctgta catattatga tatggataca acgtatgcaa tggccaatag ccaatattgg 60 cgcgcctcac cgtccttgac acgaagc 87 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtataggcg cgcctactga gtcattaggg actttcc 37 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcatcgaagc ttctgcgttc tacggtggtc agacc 35 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatcggcgcg cctaagctac tgagtcatta gggactttc 39 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gatccctgag gctgcgttct acggtggtc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatccctcag gacctccata gaagacacc 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gatcaagctt cgtgtcaagg acg 23 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gatcgctagc ggccgctgag gcgcgcctac tgag 34 <210> 10 <211> 949 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplified PCR product <400> 10 ccagagagat ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac 60 ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac 120 tactgattct aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc 180 agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg 240 atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag 300 aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta 360 atagaactct tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca 420 agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct ttataagtag gcataacagt tataatcata 480 acatactgtt ttttcttact 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tactttccca tagctgatta atgggaaagt accgttctcg 360 agccaataca cgtcaatggg aagtgaaagg gcagccaaaa cgtaacaccg ccccggtttt 420 cccctggaaa ttccatattg gcacgcattc tattggctga gctgcgttct acgtgggtat 480 aagaggcgcg accagcgtcg gtaccgtcgc agtcttcggt ctgaccaccg tagaacgcag 540 aagcttcgat gc 552 <210> 12 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplified PCR fragment <400> 12 gatcggcgcg cctaagctac tgagtcatta gggactttca atgggttttg cccagtacat 60 aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat 120 agggactttc cattgggttt tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt 180 ttttcccatt attggcacgt acataaggtc aataggggtg agtcattggg tttttccagc 240 caatttaatt aaaacgccat gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta 300 atgcaacgtg acctttaaac ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct 360 cgagccaata cacgtcaatg ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt 420 ttcccctgga aattccatat tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt 480 ataagaggcg cgaccagcgt cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc 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Claims (9)

1. 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 인간 CMV 인트론 및 쥐의 CMV 프로모터를 포함한 포유동물 발현 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 선별가능 마커를 인코딩하는 제 2 전사 단위를 포함하는 포유동물 발현 벡터.
5. 제 1 항에 따른 포유동물 발현 벡터를 포함한 포유동물 숙주 세포.
6. 제 5 항에 있어서, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포인 포유동물 숙주 세포.
7. 하기 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법:

   a) 포유동물 숙주 세포를, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 인간 CMV 인트론 및 쥐의 CMV 프로모터를 포함한 발현 벡터로 트랜스펙션하는 단계;

   b) 상기 숙주 세포를 상기 세포의 증식 및 상기 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 배양하는 단계; 및

   c) 생산된 재조합 단백질을 수확하는 단계.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
9. 제 1 인간 CMV 인트론을 mCMV 프로모터 및 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자 서열 사이에 벡터에 삽입시킴으로써, 포유류 숙주 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 mCMV 프로모터의 활성을 증가시키기 위한 방법.

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