JP2020523990A - 生物製剤の製造のためのユニバーサル自己調節性哺乳動物細胞株プラットフォーム - Google Patents

Abstract

レプレッサーポリペプチドを使用して、条件の変更に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率を低減する、遺伝制御回路、細胞及び方法が開示される。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞ストレスに応答する遺伝制御回路を使用して細胞及び細胞株によって、生成物、例えば、組換えタンパク質の発現を調節する方法及び組成物に関する。

組換え治療用タンパク質は、細胞発現系、例えば、哺乳動物細胞発現系において一般に発現される。２０１４年に、市販の承認された生物学的製剤の総数は、２１２であり、ＦＤＡによって市販のための承認された治療用製品の５６％は、哺乳動物細胞株において製造されている。しかし、製造と関連する高コストが、世界的な医療経皮の増大に寄与している。

さらに、次世代融合タンパク質、多量体糖タンパク質又は次世代抗体などの次世代タンパク質生物製剤（ＮＧＢ）は、複雑な及び／又は非天然構造を有することが多く、モノクローナル抗体などの分子よりも発現することがより困難であるとわかっている。現在の宿主細胞株は、ＮＧＢの効率的な合成及び分泌のための経路を進化させておらず、その結果、大幅に低減された増殖、低い生産性となり、生成物品質（ＰＱ）性状の悪い製品となることも多い。したがって、これらのＮＧＢは、発現することが困難と考えられ、これでは、生産性及び生成物品質は、臨床的及び商業的要求を満たさない。したがって、最終生成物品質を維持しながら、組換え生物学的治療薬を迅速に、効率的に、及び費用効率的に開発し、製造する必要性が高まっている。

哺乳動物細胞株を使用する組換えタンパク質の合成のための現在の遺伝子発現系は、細胞培養条件又は宿主細胞の代謝に関わらず、構成的に活性であり、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写を指示する。このような系は、生成物遺伝子転写を、内因性宿主細胞タンパク質について生じるように宿主細胞株の細胞内状態と調整することができず、特に、ＮＧＢについて細胞ストレス及び不十分な生成物結果につながる。ＮＧＢが、本発明者らの現在の細胞株及び遺伝子発現系を限界に達せさせているので、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写を宿主細胞の全体的な代謝とより良好に調整する必要がある。これは、細胞ストレスのレベルを下げ、本発明者らの哺乳動物細胞工場の、高レベルの、正しい生成物品質性状（例えば、グリコシル化プロフィール、正しいフォールディング構造など）を有する生成物を生成する既存の能力をより良好に利用するのに役立つであろう。

哺乳動物宿主細胞株が、高レベルの組換えタンパク質生成物、特に、ＮＧＢを構成的に合成するように制約される場合又はタンパク質を発現することが困難である場合、フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）と呼ばれる細胞ストレス経路が、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって活性化される。これは、細胞が十分な時間、現在のタンパク質負荷を正しくプロセシングし、フォールディングすることを可能にするための、タンパク質翻訳の全般的な全体的低下につながる。このようなストレス応答の活性化は、組換えタンパク質生成物の全体的な収量に対してだけでなく、望ましいＰＱプロファイルに対しても阻害性である。

［発明の概要］
一態様では、本開示は、レプレッサーポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ活性（ｄＣａｓ９）を欠くＣａｓ９タンパク質のバージョン（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集系に由来する））を使用して、状態の変化（例えば、細胞ストレスの増大）に応じて、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率を低減する遺伝制御回路を特徴とする。状態の変化に応じて、状態依存性遺伝子プロモーターは、レプレッサーポリペプチド遺伝子の転写率を増大する。生じたレプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドがＣａｓ９のバージョンを含む場合には、レプレッサーポリペプチドは、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントに対して相同性を有する少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の同時発現のために、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドと、又は遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドに作動可能に連結された制御エレメントと結合する。レプレッサーポリペプチドが、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド又はそれに作動可能に連結された制御エレメントと結合している場合には、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドの転写率が低減され、治療用ポリペプチドの細胞内ｍＲＮＡコピー数の低下につながる。いくつかの実施形態では、状態の変化は、細胞ストレスの変化、例えば、細胞ストレスの増大又はストレスがない状況からストレスがある状況への移行であり、細胞ストレスの変化は、哺乳動物ＵＰＲの活性化であるが、その他の細胞ストレス応答もこの使用のために充てることができる。一実施形態では、遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチドは、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で転写されるが、その他のプロモーターを使用してもよい（例えば、ｍＣＭＶ及びハイブリッドＣＭＶプロモーター）。遺伝子をコードする外因性治療用ポリペプチド転写率を低減することによって、宿主細胞での外因性治療用ポリペプチドの生合成負荷が低減され、それによって、初期細胞ストレス応答を軽減する。この方法で、宿主細胞株は、組換えタンパク質生成物遺伝子の転写率を自己調節し、初期細胞ストレス応答の長期活性化を避けることができる。ひとたび、初期ストレス応答が軽減されると、外因性治療用ポリペプチドの転写率は、経時的に抑制解除される。細胞が、細胞の生合成能をより良好に利用するために、組換え遺伝子発現を、細胞の生理学的状況全体と最適に調整するので、これは、組換えタンパク質の収率の全体的な増大を経時的にもたらし得る。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントを含む遺伝制御回路を特徴とし、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、遺伝制御回路は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を特徴とし、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０又はそれより多い制御エレメントを含む。一実施形態では、全シグナル伝達経路は、本明細書において開示される方法を使用して経路において単一節を制御することによって制御される。いくつかの実施形態では、全シグナル伝達経路は、例えば、経路の異なる配列を調節する異なるプロモーターを使用することによってシグナル伝達経路の複数の代謝分岐を制御することによって制御される。したがって、本発明の方法は、自己調節性細胞においていくつかの層の制御を提供する。例えば、翻訳伸長開始因子は、複数の経路を制御できるグローバル節点の一例である。或いは、ローカル節点の一例として、組換え抗体重鎖ポリペプチドのＡｓｎ２９７と付着しているグリカンにガラクトース残基を付加し、ガラクトース及びシアル酸残基の両方を有するＮ−グリカンを作製するのに必要である酵素ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がある。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位又はＳＳＩ部位に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、第１の制御エレメント、例えば、挿入部位、例えば、制限部位又はＳＳＩ部位に作動可能に連結された第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、細胞は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む１又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む１つ又は複数の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキットを特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を獲得するステップであって、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、ｂ）細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、ａ）の細胞は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を獲得するステップと、ｂ）細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、ｃ）細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップとを含み、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、ｄ）細胞を治療用ポリペプチドを作製するのを可能にする条件下で培養し、それによって、治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、さらに任意選択で、ｃ）とｄ）の間に、細胞中で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップを含むさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、治療用ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）細胞、例えば、ＣＨＯ細胞を獲得するステップと、ｂ）細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、ｃ）細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップと、任意選択で、ｄ）細胞中で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップであって、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少されるステップと、ｅ）細胞を治療用ポリペプチドを作製することを可能にする条件下で培養し、それによって治療用ポリペプチドを作製するステップとを含む方法を特徴とする。実施形態では、ステップａ〜ｄを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む核酸を特徴とし、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、さらに任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本開示は、挿入部位、例えば、制限部位に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーター及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターを含む核酸を特徴とし、挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現は調節される、例えば、減少される。いくつかの実施形態では、核酸は、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、本開示の細胞を作製する方法であって、ａ）細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、ｂ）細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップであって、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増加され、それによって、細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターをコードする第３の核酸配列を形成又は提供することを含むステップｃ）をさらに含む。実施形態では、ステップａ〜ｃは任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製する方法であって、ａ）細胞中で、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、ｂ）細胞中で、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップであって、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少又は増大され、それによって、目的生成物品質性状を有するポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの経済的に増強された収量をもたらすことが可能な細胞を作製するステップとを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、方法は、細胞中で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターをコードする第３の核酸配列を形成又は提供することを含むステップｃ）をさらに含む。実施形態では、ステップａ〜ｃを任意の順序で実施できる。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

一態様では、本発明の開示は、表１〜４から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表５から選択される第１の制御エレメントと、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表６から選択される第２の制御エレメントと、構成的に発現される１又は複数のｇＲＮＡ配列とを含み、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される細胞を特徴とする。

一態様では、本発明の開示は、１又は複数の細胞が、第１の条件を含み、１又は複数の細胞が、第２の条件を含む、本明細書において記載される複数の細胞を特徴とする。

図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図１Ａでは、組換えタンパク質の生成がストレス／毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図１Ｂでは、図１Ａにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス／毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス／毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る（図１Ｃ）。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス／毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる（図１Ｄ）。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図１Ａでは、組換えタンパク質の生成がストレス／毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図１Ｂでは、図１Ａにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス／毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス／毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る（図１Ｃ）。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス／毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる（図１Ｄ）。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図１Ａでは、組換えタンパク質の生成がストレス／毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図１Ｂでは、図１Ａにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス／毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス／毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る（図１Ｃ）。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス／毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる（図１Ｄ）。 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、状態、例えば、細胞ストレスに応じて組換え又は治療用ポリペプチド生成物遺伝子の転写を調節する遺伝制御回路の設計原理の模式図を示す図である。図１Ａでは、組換えタンパク質の生成がストレス／毒性を誘導し、これはレプレッサーの生成を活性化し、それによって組換え又は治療用ポリペプチド発現の直接阻害を伴う。図１Ｂでは、図１Ａにおける得られた組換え又は治療用ポリペプチド発現の阻害が、ストレス／毒性を最終的に排除し、レプレッサーの活性化を除去し、間接的に組換え又は治療用ポリペプチド発現の受動的増大につながる。事実上、この系は、宿主細胞においてストレス／毒性を誘導する特定のレベル付近の組換え又は治療用ポリペプチド発現の経時的周期的変動につながり得る（図１Ｃ）。制御のさらなる任意選択の層を、細胞ストレス／毒性が軽減されると活性になる組換え又は治療用ポリペプチド発現の正のアクチベーターを含むこの基礎回路に適用することができる（図１Ｄ）。 図２は、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）活性化プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動される組換え又は治療用ポリペプチド（ｒＰ）転写を示す例示的遺伝制御回路を表す図である。この例では、ｒＰを合成する時に起こり得るＵＰＲの活性化時に、レプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９が生成される。ｇＲＮＡと組み合わせて、ｄＣａｓ９は、ＵＰＲストレス応答が軽減されるまで、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、ｒＰ生成を阻害する。 図３Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、構成的ｍＣＭＶプロモーターから制御される、レプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、ＧＦＰ発現を阻害する。図３Ｂは、ｈＣＭＶ−ｅＧＦＰを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、１）空の発現ベクター（ＵＴＣ）、２）ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター又は３）ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター及びｈＣＭＶに対する特異性を有する３つのｇＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光を示すフローサイトメトリーヒストグラムを表す図である。 図３Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、構成的ｍＣＭＶプロモーターから制御される、レプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、ＧＦＰ発現を阻害する。図３Ｂは、ｈＣＭＶ−ｅＧＦＰを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、１）空の発現ベクター（ＵＴＣ）、２）ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター又は３）ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター及びｈＣＭＶに対する特異性を有する３つのｇＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光を示すフローサイトメトリーヒストグラムを表す図である。 図４Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、構成的ｍＣＭＶプロモーターによって制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である、２つの別個の第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭａｂ ＨＣ及びＭａｂ ＬＣ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、Ｍａｂ ＨＣ及びＭａｂ ＬＣ発現を阻害する。図４Ｂは、トランスフェクションの３、４若しくは５日後の、ＤＮＡなし、ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター又はｄＣａｓ９及びｈＣＭＶに対して特異性を有する１つ、２つ若しくは３つのｇＲＮＡをコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から得たｈＣＭＶ−Ｍａｂレベルのグラフを表す図である。 図４Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、構成的ｍＣＭＶプロモーターによって制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である、２つの別個の第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＭａｂ ＨＣ及びＭａｂ ＬＣ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、構成的に発現されたｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、Ｍａｂ ＨＣ及びＭａｂ ＬＣ発現を阻害する。図４Ｂは、トランスフェクションの３、４若しくは５日後の、ＤＮＡなし、ｄＣａｓ９をコードする発現ベクター又はｄＣａｓ９及びｈＣＭＶに対して特異性を有する１つ、２つ若しくは３つのｇＲＮＡをコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から得たｈＣＭＶ−Ｍａｂレベルのグラフを表す図である。 図５Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）ストレス誘導性Ｇｒｐ７８プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、ＵＰＲストレスは、ｄＣａｓ９の発現を促進し、これは、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、ＧＦＰ発現を阻害する。図５Ｂは、ｈＣＭＶ−ｅＧＦＰを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、１）空の発現ベクター（ＷＴ）、２）Ｇｒｐ７８プロモーター下にｄＣａｓ９をコードする発現ベクター（Ｇｒｐ７８ ｄＣａｓ９制御）又は３）Ｇｒｐ７８プロモーター下にｄＣａｓ９をコードする発現ベクター及びｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有するｇＲＮＡをコードする発現ベクターのいずれかを用いて一過性にトランスフェクトされており、４００ｎｇ／ｍＬツニカマイシン（ＴＭ）を用いて処理されている、又はＴＭを用いて処理されていない（０ＴＭ）ＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光を示すフローサイトメトリーデータのグラフを表す図である。 図５Ａは、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメント、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）ストレス誘導性Ｇｒｐ７８プロモーターから制御されるレプレッサーポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９の不在下で構成的である第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、例えば、ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰ転写を示す遺伝制御回路を表す図である。この例では、ＵＰＲストレスは、ｄＣａｓ９の発現を促進し、これは、ｇＲＮＡ１、２又は３（ｈＣＭＶに対して特異的であり、Ｕ６プロモーターから構成的に生成される）と組み合わせて、ｈＣＭＶプロモーターと結合し、ＧＦＰ発現を阻害する。図５Ｂは、ｈＣＭＶ−ｅＧＦＰを安定に発現するＣＨＯ細胞であって、１）空の発現ベクター（ＷＴ）、２）Ｇｒｐ７８プロモーター下にｄＣａｓ９をコードする発現ベクター（Ｇｒｐ７８ ｄＣａｓ９制御）又は３）Ｇｒｐ７８プロモーター下にｄＣａｓ９をコードする発現ベクター及びｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有するｇＲＮＡをコードする発現ベクターのいずれかを用いて一過性にトランスフェクトされており、４００ｎｇ／ｍＬツニカマイシン（ＴＭ）を用いて処理されている、又はＴＭを用いて処理されていない（０ＴＭ）ＣＨＯ細胞のＧＦＰ蛍光を示すフローサイトメトリーデータのグラフを表す図である。 図６Ａ〜図６Ｃは、ＣＨＯ宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図６Ａは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、ｄＣａｓ９遺伝子は、Ｇｒｐ７８プロモーター下にあり、ｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有する３つのｇＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ１、２及び３）は各々、別個の構成的Ｕ６プロモーター下にある（ｇＲＮＡ１２３回路）。このベクターのバリアントは、ｇＲＮＡ１、２及び３配列の代わりにｇＲＮＡ１４配列を含有していた（ｓｇＲＮＡ１４回路）。図６Ｂは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの６日後に決定した。親のＣＨＯ細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、２連で実施したブリナツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図６Ｃは、高度凝集性Ｍａｂ Ｈ９Ｋ７をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された、６日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの２４時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、０．１μｇ／ｍＬの濃度のＵＰＲ−インデューサーツニカマイシン（ＴＭ）を用いて処置した。エラーバーは、３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。 図６Ａ〜図６Ｃは、ＣＨＯ宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図６Ａは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、ｄＣａｓ９遺伝子は、Ｇｒｐ７８プロモーター下にあり、ｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有する３つのｇＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ１、２及び３）は各々、別個の構成的Ｕ６プロモーター下にある（ｇＲＮＡ１２３回路）。このベクターのバリアントは、ｇＲＮＡ１、２及び３配列の代わりにｇＲＮＡ１４配列を含有していた（ｓｇＲＮＡ１４回路）。図６Ｂは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの６日後に決定した。親のＣＨＯ細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、２連で実施したブリナツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図６Ｃは、高度凝集性Ｍａｂ Ｈ９Ｋ７をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された、６日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの２４時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、０．１μｇ／ｍＬの濃度のＵＰＲ−インデューサーツニカマイシン（ＴＭ）を用いて処置した。エラーバーは、３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。 図６Ａ〜図６Ｃは、ＣＨＯ宿主細胞株における一過性の組換えタンパク質発現に対する遺伝制御回路の影響を示す図である。図６Ａは、発現ベクターに含有される遺伝制御回路を示す図であり、ｄＣａｓ９遺伝子は、Ｇｒｐ７８プロモーター下にあり、ｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有する３つのｇＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ１、２及び３）は各々、別個の構成的Ｕ６プロモーター下にある（ｇＲＮＡ１２３回路）。このベクターのバリアントは、ｇＲＮＡ１、２及び３配列の代わりにｇＲＮＡ１４配列を含有していた（ｓｇＲＮＡ１４回路）。図６Ｂは、いくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の、制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された組換えタンパク質濃度を示す図である。組換えタンパク質濃度は、一過性トランスフェクションの６日後に決定した。親のＣＨＯ細胞株は、遺伝制御回路を欠く。エラーバーは、２連で実施したブリナツモマブベクターを用いる親の細胞株のトランスフェクションを除くすべてのデータ点の３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。図６Ｃは、高度凝集性Ｍａｂ Ｈ９Ｋ７をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なＣＨＯプールから生成された、６日目の組換えタンパク質濃度を示す図である。トランスフェクションの２４時間後に、一過性トランスフェクションフラスコの半量を、０．１μｇ／ｍＬの濃度のＵＰＲ−インデューサーツニカマイシン（ＴＭ）を用いて処置した。エラーバーは、３連のトランスフェクションの標準偏差を表す。 図７Ａ及び図７Ｂは、図６Ａ〜図６Ｃに記載されるようないくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なＣＨＯプールによって合成されたタンパク質の組換えタンパク質凝集のレベルを示す図である。組換えタンパク質凝集のレベルは、Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａら ＭＡｂｓ． ２０１５年；７巻（２号）：３５２〜６３頁に記載されるように、オリゴマー検出アッセイ（ＯＤＡ）によって細胞培養上清サンプルから決定した。このアッセイを使用して、タンパク質凝集の減少は、４５０ｎｍでの吸光度の減少によって表される。図７Ａは、図６Ｂにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示し、図７Ｂは、図６Ｃにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示す。 図７Ａ及び図７Ｂは、図６Ａ〜図６Ｃに記載されるようないくつかの発現が困難である組換えタンパク質をコードする発現ベクターを用いる一過性トランスフェクション後の制御回路を含有する安定なＣＨＯプールによって合成されたタンパク質の組換えタンパク質凝集のレベルを示す図である。組換えタンパク質凝集のレベルは、Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａら ＭＡｂｓ． ２０１５年；７巻（２号）：３５２〜６３頁に記載されるように、オリゴマー検出アッセイ（ＯＤＡ）によって細胞培養上清サンプルから決定した。このアッセイを使用して、タンパク質凝集の減少は、４５０ｎｍでの吸光度の減少によって表される。図７Ａは、図６Ｂにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示し、図７Ｂは、図６Ｃにおいて濃度についてアッセイされた細胞培養上清サンプルの凝集データを示す。

定義
本明細書において引用されるありとあらゆる特許、特許出願及び刊行物の開示内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。本発明は特定の態様を参照して開示されているが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、その他の当業者によって本発明のその他の態様及び変法が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、すべてのこのような態様及び同等の変法を含むと解釈されるように意図される。

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用できるが、適した方法及び材料を以下に記載する。本明細書において記載されるすべての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、その全文が参照により組み込まれる。さらに、材料、方法及び実施例は、単に例示であって制限であるように意図されない。見出し、小見出し又は番号付き若しくは文字付き要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に読みやすさのために提示されている。この文書における見出し又は番号付き若しくは文字付き要素の使用は、ステップ若しくは要素が、アルファベット順に実施されること又はステップ若しくは要素が必ずしも互いに別個であることを必要としない。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、図面の説明から及び特許請求の範囲から明らかとなろう。本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのものであって、制限であるように意図されないということも理解されるべきである。

冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つ又は１つより多い（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法上の目的語を指すために本明細書において使用される。例として、「１つの細胞」は、１つの細胞又は１つより多い細胞を意味し得る。

本明細書において、用語「遺伝制御回路」とは、遺伝子発現エレメント、例えば、タンパク質をコードする配列、制御エレメント又はプロモーターエレメントの配列を指し、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物をコードする少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含み、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物の発現を条件依存性に調節するその他の遺伝子発現エレメントを含む。一実施形態では、遺伝制御回路は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物をコードする少なくとも１つのタンパク質をコードする配列の代わりに、１又は複数のタンパク質をコードする配列の挿入のための適した挿入部位、例えば、制限部位、組換え標的部位又はランディングパッドを含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝制御回路は、単一核酸分子の連続部分、単一核酸分子の複数の別個の部分を含み得る、又は１つより多い核酸分子にわたって分布していることもある。

本明細書において、用語「制御エレメント」とは、コード配列、例えば、遺伝子の発現を調節（例えば、増大又は減少）するのに適した核酸を指す。制御エレメントは、プロモーター配列、エンハンサー配列又はプロモーター及びエンハンサー配列の両方を含み得る。制御エレメントは、連続する核酸配列、不連続の核酸配列（その他のコーディング又は非コーディング核酸配列によって中断された配列）又は両方を含み得る。単一制御エレメントは、単一核酸又は１つより多い核酸に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’又は３’を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に配列を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’又は３’内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に又はその全体で、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。一実施形態では、単一制御エレメントは、ｉ）遺伝子、例えば、組換え、治療用若しくはレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に対して近位の（例えば、隣接する又は内部に含有される）又はｉｉ）（例えば、個別及び別個の核酸に配置された、１０若しくはそれより多い、１００若しくはそれより多い、１０００若しくはそれより多い又は１０，０００若しくはそれより多い塩基によってわけられた）遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に対して遠位の核酸配列を含み得る。

本明細書において、用語「プロモーターエレメント」とは、コード配列とプロモーターエレメントを作動可能に連結することが、コード配列の発現をもたらすような、天然に存在する又は遺伝子操作されたプロモーターに由来する十分な配列を有する配列を指す。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターエレメントは、ＣＭＶプロモーターのすべて又は活性断片、例えば、任意選択で、イントロンＡ及び／又はＵＴＲ配列を含む、ＣＭＶプロモーターのすべて又は活性断片を含む。一実施形態では、ＣＭＶプロモーターエレメントは、天然に存在する又は遺伝子操作されたバリアントＣＭＶプロモーターに由来するわずか５、１０、２０、３０、５０又は１００のヌクレオチドで異なる。一実施形態では、ＣＭＶプロモーターエレメントは、天然に存在する又は遺伝子操作されたバリアントＣＭＶプロモーターに由来するそのヌクレオチドのわずか１、５、１０又は５０％で異なる。遺伝子操作されたプロモーターは、合成（天然に存在しない）配列を含むプロモーターである。一実施形態では、遺伝子操作されたプロモーターは、天然に存在する転写調節エレメント（例えば、Ｂｒｏｗｎら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１１巻、８号、２０１４年、８月に記載のとおり）の天然に存在しない再配列を含む。一実施形態では、本開示の細胞、核酸及び方法において使用するためのプロモーターエレメントは、遺伝子操作されたプロモーター、例えば、合成（天然に存在しない）配列を含むプロモーターに由来する十分な配列を有し、コード配列をプロモーターエレメントに作動可能に連結することは、コード配列の発現をもたらす。本明細書において使用されるプロモーターエレメントは、構成的であり、調節され、抑制可能であり、強い、弱い又はプロモーターエレメントが含むプロモーター配列のその他の特性であり得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’又は３’を含み得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に配列を含み得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列の配列５’又は３’内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、コード配列、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターエレメントは、部分的に又はその全体で、遺伝子、例えば、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。

本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドをコード核酸配列と制御エレメント間の関係を指し、ポリペプチドをコードする配列と制御エレメントは、それらが、制御エレメントがポリペプチドをコードする配列の発現を調節するのに適した方法で配置されている場合に作動可能に連結される。したがって、異なる制御エレメントについて、作動可能に連結されたとは、制御エレメントに対して、ポリペプチドをコードする配列の異なる配置を構成する。例えば、ポリペプチドをコードする配列は、プロモーターエレメント及びポリペプチドをコードする配列が、同一核酸に互いに近位に配置される場合に、プロモーターエレメントを含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。別の例では、ポリペプチドをコードする配列は、エンハンサー配列及びポリペプチドをコードする配列が、同一核酸で適した数の塩基だけ離れて配置される場合又はさらに個別及び別個の核酸に配置される場合に、遠位に作動するエンハンサー配列を含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。挿入部位、例えば、制限部位、ランディングパッド又はＳＳＩ部位はまた、挿入部位に挿入されたポリペプチドをコードする配列が、制御エレメントに作動可能に連結される場合に、制御エレメントに作動可能に連結され得る。

本明細書において、用語「内因性」とは、生物、細胞、組織又は系に由来する、又はその内側で天然に生成された任意の材料を指す。

本明細書において、用語「組換え標的部位」は、ターゲッティングされた組換えにとって必須である、リコンビナーゼと一緒にそれを可能にする、及びこのような組換えの位置を規定するヌクレオチドのストレッチである。

本明細書において、遺伝子、例えば、組換え、例えば、治療用、レプレッサー、又は選択マーカー、ポリペプチドをコードする遺伝子の「両端に位置する」又は「両端に位置している」遺伝子とともに使用される用語「組換え標的部位」とは、組換え標的部位が前記遺伝子の５’及び３’に位置していることを意味し、それは、一方の標的部位が、対象の遺伝子コード配列の５’に位置し、もう一方の標的部位が３’に位置することを意味する。組換え標的部位は、対象の遺伝子コード配列に直接隣接して位置する場合も、規定の距離に位置する場合もある。両端に位置する配列、特に、組換え標的部位の両端に位置するものは、フォワード又はリバース配向で位置し、好ましくは、両方ともフォワードであり、又は好ましくは、両方ともリバース配向にある。

本明細書において、用語「外因性」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はその外側で生成された任意の材料を指す。したがって、「外因性核酸」とは、生物、細胞、組織又は系に導入される、又はその外側で生成される核酸を指す。一実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に生成されない、又は天然に見出されることができない。同様に、「外因性ポリペプチド」とは、例えば、外因性核酸配列からの発現によって外因性ポリペプチドが導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に生成されない、又は天然に見出されることができないポリペプチドを指す。

本明細書において、用語「異種」とは、異なる種に由来する生物、細胞、組織又は系に導入される場合のある種に由来する任意の材料を指す。

本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、同義的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）又はそれらのＤＮＡ又はＲＮＡの組合せ及び一本鎖又は二本鎖の形態のいずれかのそのポリマーを指す。用語「核酸」として、限定されるものではないが、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡが挙げられる。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば、化学的に合成されたもの又は人工）又は組換えである。具体的に制限されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの類似体又は誘導体を含有する分子を包含し、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチドと同様の方法で代謝される。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列並びに明確に示された配列も暗に包含する。具体的には、１つ又は複数の選択された（又はすべての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって縮重コドン置換を達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。

本明細書において、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合によって連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含有しなくてはならず、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。一実施形態では、タンパク質は、１つより多い、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれより多いポリペプチドを含むことができ、各ポリペプチドが、共有結合又は非共有結合／相互作用によって別のものと会合している。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって互いに接合された２つ又はそれより多いアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において、この用語は、一般に、当技術分野で、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般に、当技術分野で、多数の種類があるタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す「ポリペプチド」として、例えば、中でも、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。

本明細書において、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」とは、本明細書において記載される細胞によって生成され得るポリペプチドを指す。組換えポリペプチドは、ポリペプチドをコードする配列の少なくとも１つのヌクレオチド又はポリペプチドの発現を制御する配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、遺伝子工学（細胞の、又は前駆体細胞の）によって形成されたものである。例えば、少なくとも１つのヌクレオチドが変更された、例えば、細胞に導入された又は遺伝子操作された再配列の生成物である。例えば、組換えポリペプチドはまた、治療用ポリペプチドでもある。

本明細書において、「治療用ポリペプチド」とは、治療用ポリペプチドを生成するように修飾又は遺伝子操作されている細胞によって生成される、例えば、発現される、ヒト又は動物の健康又は医薬に対して有用性を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しないポリペプチド、例えば、合成ポリペプチドである。一実施形態では、治療用ポリペプチドの部分は、天然に存在し、治療用ポリペプチドの別の部分は、天然に存在しない。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、組換えポリペプチドである。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、診断的又は前臨床的使用に適している。別の実施形態では、治療用ポリペプチドは、治療的使用に、例えば、疾患の治療に適している。一実施形態では、治療用ポリペプチドは、表１〜４から選択される。いくつかの実施形態では、修飾又は遺伝子操作された細胞は、発現を制御する、又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。その他の実施形態では、修飾又は遺伝子操作された細胞は、例えば、細胞において治療用ポリペプチドの発現又は構築を制御する核酸ではないその他の分子を含む。

本明細書において、「レプレッサーポリペプチド」とは、レプレッサーポリペプチドを生成するように修飾又は遺伝子操作されている細胞によって生成される、例えば、発現される、別のポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）の発現を制御するポリペプチドを指す。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在しない ポリペプチド、例えば、合成ポリペプチドである。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドの部分は天然に存在し、レプレッサーポリペプチドの別の部分は、天然に存在しない。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、治療用ポリペプチドの発現を減少させる。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、治療用ポリペプチドの発現を完全に排除する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドの発現は調節される。例えば、レプレッサーポリペプチドは、ある条件のセット下で高度に発現され、別の条件のセット下では、レプレッサーポリペプチドの発現は阻害される、例えば、減少される又は完全に排除される。

本明細書において、「活性のレベル」とは、制御エレメント又はプロモーターエレメントによって誘導される発現の強度の尺度を指す。例えば、制御エレメントは、制御エレメントに作動可能に連結されたコード配列が強力に発現されるような高レベルの活性を有し得る。

本明細書において、「条件」とは、制御エレメント又はプロモーターエレメントの活性のレベルに影響を及ぼし得る、細胞及び／又は環境パラメータの値を指す。条件が、細胞及び環境パラメータの１つの値を含む場合も、条件が細胞及び環境パラメータの１つの値を１つより多い（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれより多い）値を含む場合もある。例えば、制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し得る。細胞及び環境パラメータとして、それだけには限らないが、１つ又は複数のポリペプチドのレベル、１つ又は複数のポリペプチドのコンパートメントに局在されたレベル（例えば、核、細胞質又は小胞体に局在する）、細胞シグナル伝達経路、例えば、ストレス応答、フォールディングされていないタンパク質応答、熱ショック応答などの活性化のレベル、シグナル伝達分子（例えば、Ｃａ^＋２、ｃＡＭＰ、グルコース、ＡＴＰなど）のレベル、温度、ｐＨ、細胞周期／増殖期、培養物の細胞密度及び栄養素利用能が挙げられる。

Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、その用語が本明細書において使用される場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と相互作用し得る、ｇＲＮＡ分子と協力して、標的ドメイン及びＰＡＭ配列を含む部位に真っすぐ進む又は局在する分子又はポリペプチドを指す。Ｃａｓ９分子及びＣａｓ９ポリペプチドは、それらの用語が本明細書において使用される場合、天然に存在するＣａｓ９分子及び遺伝子操作された、変更された若しくは修飾されたＣａｓ９分子又は例えば、少なくとも１個のアミノ酸残基だけ参照配列から異なるＣａｓ９ポリペプチド、例えば、最も類似した天然に存在するＣａｓ９分子又は配列を含む。例示的Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド配列は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１５７０７０に見ることができる。Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ＤＮＡ切断及びニッキング活性及びその他を有するＣａｓ９分子、例えば、ＤＮＡをはっきりとは切断又はニッキングしないｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドを含む。

概要
一態様では、本開示は、細胞又は環境条件の変化、例えば、細胞ストレス応答、例えば、フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の変化に応じて、組換え又は治療用タンパク質生成物遺伝子（単数又は複数）の転写率を微調整するための細胞又は細胞株を作製する遺伝制御回路、核酸、細胞、方法並びに方法を提供する。遺伝制御回路のための本開示の一般的な設計原則の例は、図１Ａ及び図１Ｂに表わされている。この限定されない概略例では、組換えタンパク質生成物の生成は、ストレス／毒性を誘導し、これは、レプレッサーポリペプチドの生成を活性化し、それによって、組換えポリペプチド生成物発現を阻害する。ストレスシグナルの除去は、レプレッサーポリペプチドの発現を不活性化する。阻害の軽減は、組換えポリペプチド生成物生成の再活性化を伴う。

生成物
高収量の生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は製造するための遺伝制御回路、細胞及び方法が本明細書において提供される。本開示によって包含される生成物として、それだけには限らないが、細胞において生成、例えば、発現され得る分子、核酸、ポリペプチド（例えば、組換え及び／又は治療用ポリペプチド）又はそのハイブリッドが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、生成物を生成するように遺伝子操作される、又は修飾される。このような修飾として、生成物の生成を制御する、又はそれをもたらす分子を導入することが挙げられる。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を導入することによって修飾され、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドの生成、例えば、発現及び分泌に適した条件下で培養される。別の例では、細胞が、例えば、非修飾細胞において、内因性に生成されるレベル又は量よりも高いレベル又は量のポリペプチドを生成するように、細胞は、細胞によって内因性に発現されるポリペプチドの発現を制御、例えば、増大する外因性核酸を導入することによって修飾する。実施形態では、本明細書において記載される方法によって同定、選択又は作製された細胞又は細胞株は、医学的状態、障害又は疾患の治療において有用な生成物、例えば、組換えポリペプチドを生成する。医学的状態、障害又は疾患の例として、それだけには限らないが、代謝的疾患又は障害（例えば、代謝酵素欠乏症）、内分泌障害（例えば、ホルモン欠乏症）、止血、血栓症、造血障害、肺の障害、胃腸障害、免疫調節（例えば、免疫不全）、不妊症、移植、がん及び感染性疾患が挙げられる。

組換えポリペプチドは、外因性タンパク質、例えば、細胞によって天然に発現されないタンパク質である。組換えポリペプチドは、例えば、薬物スクリーニングにとって有用な治療用タンパク質又は診断用タンパク質であり得る。治療用又は診断用タンパク質は、抗体分子、例えば、抗体又は抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、リポータータンパク質、治療用ペプチド又はその構造的及び／若しくは機能的断片又はこれらのいずれかのハイブリッドであり得る。実施形態では、生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖、例えば、重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。

一実施形態では、生成物、例えば、組換えポリペプチドは、抗体分子である。本明細書において包含される生成物は、イメージング技術にとって有用な診断用抗体分子、例えば、モノクローナル抗体又はその抗体断片及び対象への投与に適した、例えば、疾患又は障害の治療にとって有用な治療用抗体分子である。抗体分子は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列である。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体又は抗体断片である。抗体及びマルチフォーマットタンパク質は、ポリクローナル又はモノクローナル、複数鎖若しくは一本鎖又は無傷の免疫グロブリンであり得、天然供給源に、又は組換え供給源型に由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。

「抗体断片」とは、無傷の抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、抗体断片の、抗原などの標的の認識及び特異的結合を付与するのに十分である、無傷の抗体の抗原結合ドメイン、例えば、抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン及びヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多特異性抗体並びに抗体の単離されたＣＤＲ又はその他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、細胞内抗体、二特異性抗体、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖ（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻：１１２６〜１１３６頁、２００５年を参照のこと）に組み込まれ得る。抗原結合断片はまた、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとするスキャフォールドにグラフトされてもよい（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。

実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、例えば、ボトックス（ＢＯＴＯＸ）、ミオブロック（Ｍｙｏｂｌｏｃ）、ニューロブロック（Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ）、ジスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ）（又はボツリヌス神経毒のその他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、コリオゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロウリン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ−ｎｌ、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（Ｓｕｎｔｏｒｙ）（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、デジファブ（ＤｉｇｉＦａｂ）、ヴィペラタブ（ＶｉｐｅｒａＴＡｂ）、エキタブ（ＥｃｈｉＴＡｂ）、クロファブ（ＣｒｏＦａｂ）、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド、カルシトニン、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ）、エプタコグアルファ（活性化型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコンビナート（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ）、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え型）、アルフンメート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イングルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、リュープロリド（ＡＴＲＩＧＥＬ）、リュープロリド（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ソマトロピン、メカセルミン、エンルファビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテルミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ ｍＴｃ−アプシチド、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、酢酸グラチラマー、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（組換え型）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）の組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Ｚｅｍａｉｒａ）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクチムン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン（Ｔｒｉｃｏｍｉｎ）、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４、エポエチンデルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（ａｖｉｐｔａｄｉｌ）、イカチバント、エカランチド、オミガナン（ｏｍｉｇａｎａｎ）、オーログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、酢酸ペキシガナン（ｐｅｘｉｇａｎａｎａｃｅｔａｔｅ）、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデリンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、ファブルド（Ｆａｖｌｄ）、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド、チファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ（ａｍｅｄｉｐｌａｓｅ）、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ジアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン、インスリン（テクノスフェア（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ））、インスリン（ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−ｎ３、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン（ｏｐｅｂａｃａｎ）、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、リンフォスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ（ｒａｎｐｉｒｎａｓｅ）、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド（ｌｕｓｕｐｕｌｔｉｄｅ）、ＭＰ５２、シプロイセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテスペン、ヒトトロンビン、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ（ａｌｆｉｍｅｐｒａｓｅ）、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマンバーク（Ｂｏｗｍａｎ Ｂｉｒｋ）阻害剤、ＸＭＰ−６２９、９９ ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）、オザレリクス（ｏｚａｒｅｌｉｘ）、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン（ｉｂｏｃｔａｄｅｋｉｎ）、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、ビファシックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス（Ｏｎｃｏｖａｘ）−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ネミフィチド（ｎｅｍｉｆｉｔｉｄｅ）、ｒＡＡＴ、ＣＧＲＰ、ペグスネルセプト（ｐｅｇｓｕｎｅｒｃｅｐｔ）、チモシンベータ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（エリゲン）、エキサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン、カルデバ（Ｃａｒｄｅｖａ）、ベラフェルミン（ｖｅｌａｆｅｒｍｉｎ）、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット（ｄｅｐｅｌｅｓｔａｔ）、ヘマタイド、クリサリン、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソームの）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ソノリシスプロリーゼ（ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ）、ニューロバックス（ＮｅｕｒｏＶａｘ）、ＣＺＥＮ−００２、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（徐放、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ−９６０４、リナクロチドアセタート（ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ−１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ、速効型インスリン（注射用、ビアデル（Ｖｉａｄｅｌ））、インスリン（エリゲン）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０、タラクトフェリン（ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ｒＥＶ−１３１、ｒＥＶ−１３１、組換えヒトインスリン、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン、ＣＹＴ−９９００７ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト（ｖａｌａｔｅｇｒａｓｔ）、インターフェロンアルファ−ｎ３、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン（Ｔａｕｆｅｒｏｎ）、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ）、アルカリ（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、ＡＬＴＵ−１３５、組換えノイラミニダーゼ、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）（ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ））、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨ類似体、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆ、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換えペストＦＩＶ、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７、ＰＲ１ペプチド抗原、突然変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）、ＷＴ１−ペプチド、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド（ｉｃｒｏｃａｐｔｉｄｅ）、テルベルミン（ｔｅｌｂｅｒｍｉｎ）、ルピントリビル（ｒｕｐｉｎｔｒｉｖｉｒ）、レチクローズ（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン−受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７、Ｌ−１９ベースのｒａ、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨ、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３
６］、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）（ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ））、デュラマイシン、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン（ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合物、ＥＰ−１０４３、ｇｐＥ１、ｇｐＥ２、ＭＦ−５９、ｈＰＴＨ（１−３４）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管をターゲッティングするＴＮＦ、デスモプレシン、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）及びＴＰ−９２０１がある。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アダリムマブ（ヒュミラ）、インフリキシマブ（レミケード（商標））、リツキシマブ（リツキサン（商標）／ＭＡＢ ＴＨＥＲＡ（商標））エタネルセプト（エンブレル（商標））、ベバシズマブ（アバスチン（商標））、トラスツズマブ（ヘルセプチン（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ニューラスタ（ＮＥＵＬＡＳＴＡ）（商標））又はバイオシミラー及びバイオベターを含む任意のその他の適したポリペプチドである。

その他の適したポリペプチドは、以下に、及び米国特許出願公開第２０１６／００９７０７４号の表１に列挙されたものである：

実施形態では、ポリペプチドは、表２に示されるような、ホルモン、血液凝固／凝固因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。

実施形態では、タンパク質は、表３に示されるような多重特異性タンパク質、例えば、二重特異性抗体である。

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、がん細胞によって発現された抗原である。いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３ 抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌胎児抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２，ガングリオシドＧＤ３、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様成長因子受容体１、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソテリン、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ１バリアント（例えばＭＵＣ１ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＲＥＰ又はＳＥＣ）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５_ＡＣ、ＭＵＣ５_Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦ−アルファ前駆体及びそれらの組合せから選択される。

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、活性化受容体であり、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α_４β_１インテグリン、β_２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤｌＯＯ、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭｌ（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳｌ（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）と、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅの活性化形態、１つ又は複数の天然細胞毒性受容体、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５及びそれらの組合せから選択され、任意選択で、β_２インテグリンは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８又はＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、任意選択で、ＫＩＲの活性化形態は、ＫｌＲ２ＤＳｌ、ＫＩＲ２ＤＳ４又はＫＩＲ−Ｓを含み、任意選択で、天然細胞毒性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６又はＮＫｐ８０を含む。

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、阻害性受容体であり、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−ｌ／ＣＤ８５ｊと、ＫＩＲ、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻害性形態及びそれらの組合せから選択され、任意選択で、ＫＩＲの阻害性形態は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２又はＫＩＲ−Ｌを含む。

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、活性化受容体であり、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙｌ０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）及びそれらの組合せから選択される。

いくつかの実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチドは、阻害性受容体であり、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈｌ（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）及びそれらの組合せから選択される。

その他の例示的治療用又は診断用タンパク質として、それだけには限らないが、Ｌｅａｄｅｒら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： ａ ｓｕｍｍａｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００８年、７号：２１〜３９頁（参照により本明細書に組み込まれる）の表１〜１０に記載される任意のタンパク質、又は本明細書において記載される組換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、類似体若しくは機能的断片が挙げられる。

その他の組換え生成物として、それだけには限らないが、ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ及びアドネクチンなどの非抗体スキャフォールド又は代替タンパク質スキャフォールドが挙げられる。このような非抗体スキャフォールド又は代替タンパク質スキャフォールドは、１又は２又はそれより多い、例えば、１、２、３、４又は５又はそれより多い異なる標的又は抗原を認識又は結合するように遺伝子操作することができる。

核酸
また、核酸、例えば、生成物、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸が本明細書において提供される。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、標準技術を使用して、遺伝子を発現する細胞から得たライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むと知られているベクターから核酸配列を導き出すことによって、又はそれを含有する細胞及び組織から直接単離することなどによって得ることができる。或いは、組換えポリペプチドをコードする核酸を、クローニングするのではなく合成によって製造してもよい組換えＤＮＡ技術及びテクノロジーは、当技術分野で高度に進歩しており、十分に確立されている。したがって、本明細書において記載される組換えポリペプチドのアミノ酸配列の知識を有する当業者であれば、組換えポリペプチドをコードするであろう核酸配列を容易に想起又は作製できる。

組換えポリペプチドの発現は、通常、組換えポリペプチド又はその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること及び構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物又は原核生物における複製及び組込みに適したものであり得る。通常のクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターなどのその他の調節エレメントを含有する。

実施形態では、生成物、例えば、外因性治療用ポリペプチドは、複数のポリペプチド鎖、例えば、重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸配列は、一緒に配置される（例えば、同一核酸に配置された、各ポリペプチド鎖をコードする配列）ことも別個に配置される（例えば、異なる核酸に配置された、各ポリペプチド鎖をコードする配列）こともある。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする配列は、単一の制御エレメント、例えば、第１の制御エレメントに、又は個別の、別個の制御エレメントに作動可能に連結されていてもよい（例えば、各ポリペプチド鎖をコードする配列が、その自身の第１の制御エレメントに作動可能に連結されている）。複数のポリペプチド鎖を含む外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、個別の、別個の制御エレメントに作動可能に連結されている一実施形態では、制御エレメントのうち１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６又はすべて）は、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有してもよく、制御エレメントのうち１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６又はそれより多く）は、構成的であり得る。

組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸をそれだけには限らないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。特に対象とするベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター及びシーケンシングベクターが挙げられる。実施形態では、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクターテクノロジーは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、１〜４巻、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）に、及びその他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、それだけには限らないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、適したベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーターエレメント及び任意選択でエンハンサーエレメントを含む制御エレメント、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１又は複数の選択マーカーを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号、同０１／２９０５８号及び米国特許第６，３２６，１９３号）。ウイルスに由来するベクターは、それらが、導入遺伝子の長期間の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期間の遺伝子導入を達成するための適したツールである。

ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源及びＣｏｌＥ１又は当技術分野で公知のその他のもの）及び／又は選択を可能にするエレメント、例えば、選択マーカー又はリポーター遺伝子を含み得る。

考慮されるベクターは、ポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチド又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列を挿入するのに適した挿入部位を含み得る。

挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。

挿入部位は、組換え標的部位を含んでもよく、組換え標的部位は、ポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチド又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の両端に位置する。一実施形態では、組換え標的部位は、ｌｏｘ部位である。組換え標的部位がｌｏｘ部位である場合には、宿主細胞は、クロスオーバー又は組換え事象を達成するためにＣｒｅリコンビナーゼの存在及び発現を必要とする。

一実施形態では、組換え標的部位は、ＦＲＴ部位である。組換え標的部位が、ＦＲＴ部位（ｃｉｔｅ）である場合には、宿主細胞は、クロスオーバー又は組換え事象を達成するためにＦＬＰ（ＦＬＰリコンビナーゼ）の存在及び発現を必要とする。

挿入部位は、短い、およそ２５ｂｐの独特な配列及び／又は制限部位が両端に位置するランディングパッド、例えば、ＤＮＡの部分、例えば、選択マーカーを含み得る。考慮される材料及び方法は、当技術分野で公知の、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６２／４６０，４２０号におけるランディングパッド部位特異的組込み技術を含む。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１７、１８、１９又はそれらの相同体の単離されたヌクレオチド配列のうち少なくとも１つ（例えば、１、２又はそれより多く）を含む。一実施形態では、ベクターは、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が位置する選択マーカーをコードする少なくとも１つの配列を含み、配列番号１７又は１８又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも１つは、選択マーカーをコードする配列の３’末端に位置する。一実施形態では、ベクターは、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が位置する、選択マーカーをコードする少なくとも１つの配列を含み、配列番号１９又はその相同な配列において与えられるような少なくとも１つのヌクレオチド配列は、選択マーカーをコードする配列の５’末端に位置する。

第１の制御エレメント
一実施形態では、生成物、例えば、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼの動員の原因となる第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメントをさらに含む。第１の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れたポリペプチドの発現を調節するエレメント及び近位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、ポリペプチドの発現を調節するエレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節される制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメントは、第１の条件、例えば、細胞の増殖の第１の段階、例えば、対数増殖下で第１のレベルの活性及び第２の条件、例えば、細胞の増殖の第２の段階、例えば、対数未満の増殖を有する相、例えば、増殖安定相下で第２のレベルの活性を有する。一実施形態では、本明細書において記載される方法に適した制御エレメントは、普通、エンハンサーと会合して、多量の転写を駆動し、ひいては、標的外因性ｍＲＮＡの多量のコピーを送達する。一実施形態では、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメントは、両方とも、その由来する同名ウイルス又はプロモーターに由来する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター（Ｘｉａ、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら２００６年）及びＳＶ４０プロモーター（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、Ｍｏｒｙら１９８４年）を含む。いくつかのその他のあまり一般的ではないウイルスプロモーターが、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲを含む発現ベクター中に含めると転写を駆動するように成功裏に使用されてきた（Ｐａｐａｄａｋｉｓ、Ｎｉｃｋｌｉｎら２００４年）。別の実施形態では、特定の内因性哺乳動物プロモーターを利用して、対象の遺伝子の構成的転写を駆動できる（Ｐｏｎｔｉｌｌｅｒ、Ｇｒｏｓｓら２００８年）。ＣＨＯ特異的チャイニーズハムスター延長因子１−アルファ（ＣＨＥＦ１α）プロモーターが、ウイルスベースの配列の高収量の代替物を提供してきた（Ｄｅｅｒ、Ａｌｌｉｓｏｎ ２００４年）。いくつかの実施形態では、組換え、例えば、治療用ポリペプチドの転写を駆動するために使用される第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメントとして、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、アクチンプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーター）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、サイクリンＴ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ３プロモーター、シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｌｉｎ）プロモーター、オートグラファカリフォルニアニュークリア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ）多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）Ｐ１０プロモーター、β３−ガラクトシルトランスフェラーゼ５（β３ＧＡＬ−Ｔ５）プロモーター、Ｆｅｒ１プロモーター、ＣＭＶ−ＥＦ１αプロモーターなどの複合プロモーター及び基本プロモーター及び３部分複合プロモーターを挙げることができる。前記プロモーターエレメントは、表５にまとめられており、当技術分野で公知である。本発明は、特定のプロモーター又はプロモーターに制限されないということが考慮される。国際公開第２００４／００９８２３号、同２００６／１１１３８７号及び同２０１４０４４８４５号（参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）に記載されるプロモーター及び転写制御機序もまた、第１の及び／又は第２の制御エレメントに関連して考慮される。いくつかの実施形態では、第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、合成（天然に存在しない）配列を含む遺伝子操作されたプロモーターである。例えば、第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントは、Ｂｒｏｗｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１１巻、８号、２０１４年８月に記載されるプロモーターを含み得る。

第２の制御エレメント
一実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントをさらに含み、第２の制御エレメントは、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼの動員の原因となる。第２の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れた、又は個別及び別個の核酸上のポリペプチドの発現を調節するエレメント並びに近位エレメント、例えば、ポリペプチドをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、ポリペプチドの発現を調節するエレメントを含み得る。一実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２のレベルの活性は、第１のレベルの活性に対して、例えば、高く又は低く調節される。

いくつかの実施形態では、第１の条件及び第２の条件の対は、ストレスの第１の、例えば、低いレベル及びストレスの第２の、例えば、高いレベル；フォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；サイトゾルにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びサイトゾルにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；小胞体（ＥＲ）におけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びＥＲにおけるフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；熱ショック応答（ＨＳＲ）の活性化の第１の、例えば、低いレベル及びＨＳＲの活性化の第２の、例えば、高いレベル；フォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化の第１の、例えば、低いレベル及びＵＰＲの活性化の第２の、例えば、高いレベル；ＥＲシャペロン、例えば、ＢｉＰの第１の、例えば、高いレベル及びＥＲシャペロン、例えば、ＢｉＰの第２の、例えば、低いレベル；第１の、例えば、低い温度及び第２の、例えば、高い温度；酸化ストレスの第１の、例えば、低いレベル及び酸化ストレスの第２の、例えば、高いレベル；ＥＲ Ｃａ^２＋の第１の、例えば、高いレベル及びＥＲ Ｃａ^２＋の第２の、例えば、低いレベル；ＥＲ酸化状態の第１の、例えば、より多い酸化レベル及びＥＲ酸化状態の第２の、例えば、より少ない酸化レベル；第１の、例えば、高い細胞エネルギーレベル及び第２の、例えば、低い細胞エネルギーレベル；第１の、例えば、高いＡＴＰレベル及び第２の、例えば、低いＡＴＰレベル；第１の、例えば、高いグルコースレベル及び第２の、例えば、低いグルコースレベル；活性化されたＨｓｆ１ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及び活性化されたＨｓｆ１ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；リン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びリン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；活性な、例えば、スプライシングされたＸｂｐ１ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及び活性な、例えば、スプライシングされたＸｂｐ１ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；ＡＴＦ４ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びＡＴＦ４ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；ＮＲＦ２ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びＮＲＦ２ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベル；並びにＡＴＦ６（例えば、ＡＴＦ６α又はＡＴＦ６β）ポリペプチドの第１の、例えば、低いレベル及びＡＴＦ６（例えば、ＡＴＦ６α又はＡＴＦ６β）ポリペプチドの第２の、例えば、高いレベルを含むリストから選択できる。

いくつかの実施形態では、第２の制御エレメントは、第Ｎの条件下で第Ｎのレベルの活性を有し、Ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより大きく、第Ｎの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件（例えば、条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、例えば、減少又は増大される。本明細書において列挙された第１及び第２の条件の各対について、さらなる第Ｎ（例えば、第３、第４、第５など）の条件が考慮され、さらなる第Ｎの条件は、さらなる関連条件である。例えば、ストレスの第１の、例えば、低いレベル及びストレスの第２の、例えば、高いレベルが上記で列挙され、ストレスのさらなる第Ｎの（例えば、第３、第４、第５など）（例えば、低い又は高い）レベルも、活性の対応する第Ｎのレベルとともに考慮される。

いくつかの実施形態では、第１の条件は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を阻害する。いくつかの実施形態では、第２の条件は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する。いくつかの実施形態では、第２の条件は、ポリペプチド、例えば、レプレッサーポリペプチドの発現を誘導し、レプレッサーポリペプチドは、別のポリペプチド、例えば、外因性治療用ポリペプチドの発現を阻害する。いくつかの実施形態では、第２の条件下で、外因性治療用ポリペプチドの発現、例えば、転写レベルは、第１の条件での発現と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低減される。

いくつかの実施形態では、第２の制御エレメントは、第１の条件下で、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導せず（例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドは、明らかには発現されない）、第２の条件下でポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する（例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドは、明らかに発現される）。明らかな発現は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの検出可能な（例えば、当技術分野で公知の方法によって）蓄積又はポリペプチド、例えば、組換え若しくはレプレッサーポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出可能な蓄積であり得る。

いくつかの実施形態では、第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性、第２の条件下で第２のレベルの活性及び第３の条件下で第３のレベルの活性を有する。第１のレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの明らかな発現の欠如をもたらし得る。第２のレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの明らかな発現をもたらし得る。活性の第３のレベルは、第２のレベルの活性に対する、ポリペプチド、例えば、組換え又はレプレッサーポリペプチドの発現の調節（例えば、増大又は減少を）をもたらし得る。

いくつかの実施形態では、第２の制御エレメントは、第Ｎの条件下で第Ｎのレベルの活性を有し、Ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより大きく、第Ｎの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件（例えば、条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、例えば、減少又は増大される。一実施形態では、第２の制御エレメントの第Ｎのレベルの活性は、第Ｎの条件の周期的変動に基づいて周期的に変動する。例えば、細胞ストレスの第１のレベルである第１の条件及び細胞ストレスの第２のレベルである第２の条件を仮定すると、第２の制御エレメントは、第１のレベルの活性及び第２のより高いレベルの活性を有し得る（例えば、この例示的第２の制御エレメントは、細胞ストレスに比例する活性を有する）。第２のより高いレベルの活性は、ポリペプチド、例えば、レプレッサーポリペプチドの発現を増大することができ、これは蓄積すると、組換え又は治療用ポリペプチドの発現を変更する、例えば、減少させる。組換え又は治療用ポリペプチドの発現の変化、例えば、減少は、第３の条件（例えば、細胞ストレスの第２のレベルよりも低い、細胞ストレスの第３のレベル）を作り出す。第３の条件は、第２の制御エレメントの活性の対応する第３のレベルを有し、本実施例において、その第３のレベルの活性は、第２のレベルの活性に対して減少されることもあり、レプレッサーポリペプチドの発現の減少をもたらす。第３の条件下でのレプレッサーポリペプチド発現の減少は、組換え又は治療用ポリペプチドの発現の増大につながることもあり、第４の条件を作り出す（例えば、細胞ストレスの第３のレベルよりも高い細胞ストレスの第４のレベル）など。いくつかの実施形態では、条件の周期的変動に関連した第２の制御エレメントの活性の周期的変動は、経時的に、平衡、例えば、第Ｎの条件及び第Ｎ＋１の条件での第２の制御エレメントの活性の相違が無視できる状況に近づき得る。一実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）：熱ショックエレメント（ＨＳＥ）であって、配列番号８〜１１に対応する１つ又は複数の配列を含むＨＳＥ、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）であって、配列番号１２に対応する配列を含むＣＲＥ、抗酸化薬応答エレメント（ＡＲＥ）であって、配列番号１３に対応する配列を含むＡＲＥ、小胞体ストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）であって、配列番号１４に対応する配列を含むＥＲＳＥを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、当技術分野で公知の関連コンセンサス配列に対してゼロ、１つ、２つ、３つ又は４つ又は５つの置換を含む配列を含む、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＨＳＥ、ＣＲＥ、ＡＲＥ又はＥＲＳＥを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、表６に列挙されたコンセンサス配列を含む、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＨＳＥ、ＣＲＥ、ＡＲＥ又はＥＲＳＥを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、表６に列挙された又は当技術分野で公知の対応するコンセンサスに対して、ゼロ、１つ、２つ、３つ又は４つ又は５つの置換を含む配列を含む１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＨＳＥ、ＣＲＥ、ＡＲＥ又はＥＲＳＥを含み得る。本発明は、特定のプロモーター又はプロモーターに制限されないということは考慮される。

いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、熱ショック応答又はフォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）のエレメントによって調節される、例えば、活性化される、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）エレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって調節される、例えば、活性化される、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）エレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）Ｘｂｐ１応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又はそれより多い（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＡＴＦ６応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＡＴＦ４応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）ＮＲＦ２応答プロモーターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントは、１つ又は複数の（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれより多い）Ｈｓｆ１応答プロモーターエレメントを含む。

第３の制御エレメント
いくつかの実施形態では、本発明の同一物を含む細胞、ベクター、核酸及びキット及び方法は、第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントに作動可能に連結された、１又は複数のｇＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多いｇＲＮＡ）をコードする核酸配列をさらに含む、又は使用する。第３の制御エレメントは、１又は複数のｇＲＮＡの発現の転写開始を可能にするポリメラーゼの動員の原因となる。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結され、複数のｇＲＮＡ及び／又は複数のｇＲＮＡをコードする配列は、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｏ，Ｙ．及びＹ．Ｚｈａｏ（２０１４年）．Ｊ Ｉｎｔｅｇｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ５６巻（４号）：３４３〜３４９頁；Ｍａｒｔｉｃｋ、Ｍ．ら（２００８年）．Ｎａｔｕｒｅ ４５４巻（７２０６号）：８９９〜９０２頁；Ｘｉｅ，Ｋ．ら（２０１５年）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２巻（１１号）：３５７０〜３５７５頁；Ｎｉｓｓｉｍ，Ｌ．ら（２０１４年）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５４巻（４号）：６９８〜７１０頁；並びにＰｏｒｔ，Ｆ．及びＳ．Ｌ．Ｂｕｌｌｏｃｋ（２０１６年）．「Ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｔｈ ｔＲＮＡ−ｆｌａｎｋｅｄ ｓｇＲＮＡｓ．」Ｎａｔ Ｍｅｔｈ ［先行オンライン公開］に記載されるように提供し、製造し、配置し、処理することができる。第３の制御エレメントは、遠位エレメント、例えば、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列から少し離れた、例えば、数塩基の長さ離れた、又は個別及び別個の核酸上のポリペプチドの発現を調節するエレメント並びに近位エレメント、例えば、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に近接した、又はその内部の位置に幾分か起因して、１又は複数のｇＲＮＡの発現を調節するエレメントを含み得る。一実施形態では、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、構成的制御エレメントである。いくつかの実施形態では、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、調節される制御エレメント、例えば、内因性又は外因性ポリペプチドによって調節されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、第３の制御エレメント、例えば、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３のプロモーターエレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する。

いくつかの実施形態では、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、本明細書において記載される第１の制御エレメントのコピーである。いくつかの実施形態では、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、本明細書において記載される第２の制御エレメントのコピーである。

いくつかの実施形態では、第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、合成（天然に存在しない）配列を含む遺伝子操作されたプロモーターである。例えば、第３の制御エレメント、例えば、第３のプロモーターエレメントは、ＢｒｏｗｎらＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１１巻、８号、２０１４年８月に記載されるようなプロモーターを含み得る。

本明細書において記載されるベクターは、プロモーターに加えて、コアプロモーターに近接して、上記のようなエンハンサー領域；特定のヌクレオチドモチーフ領域をさらに含み。これは、転写因子を動員して転写の速度を上方制御できる（Ｒｉｅｔｈｏｖｅｎ ２０１０年）。プロモーター配列と同様に、これらの領域は、ウイルスに由来することが多く、ｈＣＭＶなどのプロモーター配列及びＳＶ４０エンハンサー配列内に包含されるか、又はさらにアデノウイルス由来配列などに含まれることもある（Ｇａｉｌｌｅｔ、Ｇｉｌｂｅｒｔら２００７年）。

その他の核酸特徴
一実施形態では、生成物、例えば、ポリペプチド、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、選択マーカーは、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与する酵素又は抗生物質マーカー、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、ピューロマイシン又はブラストサイジンなどの抗生物質に対する耐性を付与する酵素を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、セレキシス（Ｓｅｌｅｘｉｓ）選択系（例えば、Ｓｅｌｅｘｉｓ ＳＡから市販されている、ＳＵＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）及びＳｅｌｅｘｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標））又はカタラント（Ｃａｔａｌａｎｔ）選択系を含む、又はそれと適合する。

一実施形態では、本明細書において記載される組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、本明細書において記載される組換え生成物をコードする核酸配列を含む細胞（単数又は複数）を同定するのに有用である選択マーカーを含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書において記載されるような、組換え生成物をコードする核酸配列のゲノムへの組込みを含む細胞（単数又は複数）を同定するのに有用である。組換えタンパク質をコードする核酸配列を組み込んでいる細胞（単数又は複数）の同定は、生成物を安定に発現する細胞又は細胞株の選択及び遺伝子操作にとって有用であり得る。

使用するのに適したベクターは、市販されており、これとして、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＰＬＣから入手可能な、ＧＳ発現系（商標）、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系又はポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶテクノロジーと関連するベクター、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＦａｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．（２０１３年）；１巻（５号）：４８７〜５０２頁に記載されるようなベクターが挙げられる。ＧＳ発現ベクターは、ＧＳ遺伝子又はその機能的断片（例えば、ＧＳミニ遺伝子）と、１つ又は複数の、例えば、１、２又は３つ又はそれより多い、対象の遺伝子、例えば、本明細書において記載される組換えポリペプチドをコードする核酸の発現のための高効率転写カセットとを含む。ミニ遺伝子は、ＧＳ遺伝子の単一イントロン及び約１ｋｂの３’端に位置するＤＮＡを含有し、ＳＶ４０後期プロモーターから転写される。一実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｌプロモーター及び１つ又は２つのポリＡシグナルに作動可能に連結されたＧＳ遺伝子を含む。別の実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｅプロモーター並びにＳＶ４０イントロンスプライシング及びポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたＧＳ遺伝子を含む。このような実施形態では、例えば、対象の遺伝子又は本明細書において記載される組換えポリペプチドの発現のための転写カセットは、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及び第１のイントロンを含むｈＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子由来の５’非翻訳配列を含む。その他のベクターを、ＧＳ発現ベクターに基づいて構築することができ、例えば、これでは、その他の選択マーカーを、本明細書において記載される発現ベクターにおいてＧＳ遺伝子と置換する。

本明細書において記載される方法において使用するのに適したベクターとして、それだけには限らないが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、これまではＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＴａｒｇｅｔ、ＨａｌｏＴａｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）；ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ｐＣＭＶ６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）；ｐＥＥ１２又はｐＥＥ１４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）又はｐＢＫ−ＣＭＶ／ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ−７／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのその他の市販のベクターが挙げられる。

細胞
組換えタンパク質又はポリペプチド、例えば、治療用ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造され、宿主細胞によって発現されることができ、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）から精製される、又は流体、例えば、宿主細胞が培養される細胞培地中に分泌され、流体から精製されることができる。高収率で、適当な品質の組換えタンパク質又はポリペプチドを生成可能な細胞は、当技術分野において高度に望ましい。組換え、例えば、治療用ポリペプチドを作製する、細胞、細胞を作製する方法、方法及びそれに関連するキットは、生存力が改善された細胞、高生産性細胞を作製して、高収率の組換え、例えば、治療用ポリペプチド生成物を得る、又は組換えポリペプチド生成物の高品質な調製物、例えば、多量の正しくフォールディングされたタンパク質、少量の凝集したタンパク質、所望のグリコシル化パターン若しくは所望のレベルのグリコシル化を含む組換えポリペプチド生成物の調製物を提供するために有用である。組換え、例えば、治療用ポリペプチドを作製する、細胞、細胞を作製する方法、方法及びそれに関連するキットは、効率的な細胞株の開発、多量の組換え治療用ポリペプチド生成物及び患者における治療的使用のための高い等級の品質に対する需要がある場合に、組換え、例えば、治療用ポリペプチドの製造にとって特に有用である。

細胞及び細胞培養
一態様では、本開示は、生成物、例えば、本明細書において記載されるような組換え又は治療用ポリペプチドを生成する細胞又は細胞株を評価、分類、同定、選択又は作製する方法に関する。別の態様では、本開示は、生産性及び生成物品質が改善された、例えば、高められた細胞又は細胞株を評価、分類、同定、選択又は作製する方法及び組成物に関する。

実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。その他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の細胞である。一実施形態では、細胞は、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット又はネコに由来する。実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞又はげっ歯類細胞、例えば、ハムスター細胞、マウス細胞又はラット細胞である。別の実施形態では、細胞は、アヒル、オウム、魚類、昆虫、植物、真菌又は酵母に由来する。一実施形態では、細胞は、古細菌である。一実施形態では、細胞は、放線菌類の種、例えば、結核菌である。

一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、ポテリジェント（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８ノックアウト（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＰＬＣ．）である。

一実施形態では、細胞は、部位特異的組込み（ＳＳＩ）宿主細胞である。一実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、内因性Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子を含み、外因性ヌクレオチド配列は、前記Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に組み込まれている。いくつかの実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの対象の遺伝子コード配列、例えば、治療用、レプレッサー又は選択マーカーポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つの組換え標的部位を含む。いくつかの実施形態では、組換え標的部位は、少なくとも１つの対象の遺伝子コード配列の両端に位置する。その他の実施形態では、組換え標的部位は、少なくとも１つの対象の遺伝子コード配列に隣接し、両端に位置しない。いくつかの実施形態では、対象の遺伝子コード配列は、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含む。

一実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、少なくとも１つの、組換え、例えば、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の存在を特徴とし、配列番号１７又は１８又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも１つは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’末端に位置する。一実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、組換え、例えば、治療用又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列の存在を特徴とし、配列番号１９又はその相同な配列において与えられるような少なくとも１つのヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’末端に位置する。

一実施形態では、細胞は、部位特異的組込み（ＳＳＩ）宿主細胞である。一実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、選択マーカーをコードする少なくとも１つの配列の存在を特徴とし、配列番号１７又は１８又はその相同な配列のヌクレオチド配列の少なくとも１つは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’末端に位置する。一実施形態では、ＳＳＩ宿主細胞は、それ自身、その５’及び３’末端に各１つの組換え標的部位が両端に位置する、外因性ヌクレオチド配列、すなわち、選択マーカーをコードする少なくとも１つの配列の存在を特徴とし、配列番号１９又はその相同な配列において与えられるような少なくとも１つのヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’末端に位置する。

別の実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ポテリジェント（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ ＧＳノックアウト、Ｘｃｅｅｄ（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ ＤＸＢ１１及びＣＨＯＺＮ又はそれに由来する任意の細胞である。

一実施形態では、真核細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であり得る。

一実施形態では、細胞は、本明細書において記載される細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養中の任意の一次細胞に由来する細胞である。

実施形態において、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、などの肝細胞又は非実質細胞である。例えば、細胞は、付着可能代謝適格ヒト肝細胞、付着可能誘導適格ヒト肝細胞、付着可能キアリストトランスポーターサーティファイド（Ｑｕａｌｙｓｔ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）（商標）ヒト肝細胞、懸濁液適格ヒト肝細胞（１０人のドナー及び２０人のドナーのプールされた肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星状細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールされたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（スプラーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）、ウィスターハン（Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ）及びウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘア（Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ｓｈｏｒｔｈａｉｒ）肝細胞を含む）及びウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）肝細胞を含む）であり得る。例示的肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、ＬＬＣ、６ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、米国、ノースカロライナ州 ２７７０９から市販されている。

一実施形態では、真核細胞は、例えば、酵母細胞（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及びピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ））、コマガテラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（例えば、コマガテラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガテラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガテラ・ファフィー（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えば、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイジニー（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えば、ゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などの低級真核細胞である。種ピキア・パストリスが好ましい。ピキア・パストリス株の例として、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５がある。

一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種（Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）、Ａ．フミガツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．オリゼ（ｏｒｚｙａｅ）、Ａ．ミデュラ（ｎｉｄｕｌａ）など）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の種（Ａ．サーモフィルム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）の種（Ｃ．サーモフィルム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）など）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の種（Ｃ．サーモフィル（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、コルディセプス属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）の種（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓなど）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）の種、クテノミセス属（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種（Ｆ．オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）など）、グロメレラ属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）の種（Ｇ．グラミニコラ（ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）など）、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種（Ｈ．ジェコリナ（ｊｅｃｏｒｉｎａ）など）、マグナポルサ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）の種（Ｍ．オルジエ（ｏｒｚｙａｅ）など）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の種（Ｍ．サーモフィル（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）の種（Ｎ．ヘアマトコッカ（ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）など）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種（Ｎ．クラッサ（ｃｒａｓｓａ）など）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）の種（Ｓ．サーモフィル（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）など）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）の種（Ｔ．テレストリス（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ．ヘテロサリカ（ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）など）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種（Ｔ．リーゼイ（ｒｅｅｓｅｉ）など）又はバーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種（Ｖ．ダーリア（ｄａｈｌｉａ）など）である。

一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、ミミック（Ｍｉｍｉｃ）（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ハイファイブ（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８ ｃｅｌｌｓ）、藻類細胞（例えば、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）の種、バシラリオフィセアエ属（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）の種、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）の種、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）の種、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の種、シアノフィタ属（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）の種（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）の種、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）の種又はオクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）の種のもの）又は植物細胞（例えば、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ又はセタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）の種）に由来する、又は双子葉植物（例えば、キャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、ニセツリガネコケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）又はアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の種に由来する細胞である。

一実施形態では、細胞は、細菌細胞又は原核細胞である。

実施形態では、原核細胞は、グラム陽性細胞である。ｓ ｓｕｃｈ ａｓ バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種又はラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種である。使用できるバチルス属の種として、例えば、Ｂ．スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ナット（ｎａｔｔｏ）又はＢ．メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）がある。実施形態では、細胞は、Ｂ．スブチリス３ＮＡ及びＢ．スブチリス１６８などのＢ．スブチリスである。バチルス属の種は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５６、４８４ ウエスト第１２アベニュー、オハイオ州、コロンバス４３２１０−１２１４から入手することができる。

一実施形態では、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えば、ＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉなどのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）並びに大腸菌Ｂ株に由来するもの、例えば、ＢＬ−２１若しくはＢＬ２１（ＤＥ３）又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどであり、そのすべては市販されている。

適した宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ａｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツ、ブラウンシュヴァイク）又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの培養物コレクションから市販されている。

一実施形態では、細胞は、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、例えば、組換えポリペプチド、例えば、表１〜４から選択される組換えポリペプチドを発現する本明細書において記載された細胞のいずれか１である。

一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、フェド−バッチ培養、ドローアンドフィル（ｄｒａｗ ａｎｄ ｆｉｌｌ）培養又は連続培養として実施する。一実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養物を、組換えポリペプチドの発現のためにｉｎ ｖｉｖｏに入れる、例えば、モデル生物又はヒト対象に入れる。

一実施形態では、培養培地は、血清不含である。血清不含、タンパク質不含及び化学的に定義された動物成分不含（ＣＤＡＣＦ）培地は、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから市販されている。

哺乳動物細胞株のための適した培地及び培養方法は、例えば、米国特許第５，６３３，１６２号に記載されるように当技術分野で周知である。実験用フラスコ又は低密度細胞培養のための、及び特定の細胞種の必要性に適応している標準細胞培養培地の例として、例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ，Ｇ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９〜５２０頁．１９６７年）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．ら、Ａｍｅｒ． Ｊ． ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ、７８巻、１号１７３頁〜、１９６３年）、「ダルベッコ改変イーグル培地 」（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．５３巻、２８８頁〜１９６５年）又はアルブミン、トランスフェリン及びレシチンを欠くイスコフ改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１巻、９２３頁〜、１９７８年）がある。例えば、ハムＦ１０又はＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞培養のために特別に設計された。ＣＨＯ細胞培養に特別に適応されたその他の培地は、欧州特許第４８１７９１号に記載されている。このような培養培地にウシ胎児血清（ＦＢＳ、ウシ胎児血清ＦＣＳとも呼ばれる）を補給してもよく、後者は過剰のホルモン及び成長因子の天然供給源を提供することが知られている。哺乳動物細胞の細胞培養は、今日では、科学教本及びマニュアルに十分に記載される通常の操作であり、例えば、Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ、ａ ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．、２０００年に詳細に述べられている。

その他の適した培養方法は、当業者に公知であり、組換えポリペプチド生成物及び利用される宿主細胞に応じて変わり得る。細胞によって発現されるべき組換え又は治療用ポリペプチドの発現及び生成に適した条件を決定又は最適化することは、当業者の技術の範囲内である。

一態様では、細胞又は細胞株は、生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。一実施形態では、細胞又は細胞株は、生成物、例えば、治療薬又は診断薬を発現する。所望のポリペプチド又はタンパク質を発現するように細胞を遺伝子改変又は遺伝子操作するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、トランスフェクション、形質導入（例えば、ウイルス形質導入）又はエレクトロポレーションが挙げられる。

核酸、例えば、本明細書において記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照のこと。

核酸、例えば、本明細書において記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段として、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで送達媒体として使用するための例示的コロイド系として、リポソーム（例えば、人工膜小胞）がある。ターゲッティングされるナノ粒子を用いるポリヌクレオチドの送達又はその他の適したサブミクロンサイズの送達系などの、核酸の最先端のターゲッティング送達のその他の方法が利用可能である。

実施形態では、外因性核酸の、宿主細胞の核酸、例えば、宿主細胞のゲノム又は染色体核酸への組込みが望まれる。外因性核酸の、宿主細胞のゲノムへの組込みが起こったか否かを調べる方法として、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法を挙げることができる。ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、細胞からのタンパク質の高レベル発現を選択するために、組換えＧＳ遺伝子によるグルタミン栄養要求性の補完を使用する。手短には、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、グルタミンシンセターゼをコードする核酸を、組換えポリペプチド生成物をコードする外因性核酸を含むベクターに含めることを含む。メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の投与によって、組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチド及びＧＳの両方をコードする外因性核酸を、ゲノム中に安定に組み込んでいる細胞が選択される。ＧＳは、一部の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞によって内因性に発現されることがあるので、宿主ゲノム中に組換え、治療用又はレプレッサーポリペプチド生成物をコードする外因性核酸を安定に組み込んでいる高生成細胞を同定するために、ＭＳＸを用いる選択の濃度及び期間を最適化することができる。ＧＳ選択及びその系は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＦａｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．（２０１３年）；１巻（５号）：４８７〜５０２頁にさらに記載されている。

外因性核酸を宿主細胞ゲノム中に安定に組み込んでいる細胞を同定及び選択するためのその他の方法は、それだけには限らないが、外因性核酸にリポーター遺伝子を含めること及び細胞におけるリポーター遺伝子の存在の評価並びに外因性核酸のＰＣＲ解析及び検出を含み得る。

一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞（例えば、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメント、例えば、第２のプロモーターエレメントを含む細胞であって、第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が調節される、例えば、減少される、細胞）は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて唯一の選択方法を使用して選択された細胞よりも高い又はより一貫した収量のタンパク質生成物を生成可能である。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍又はそれより多い生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍又はそれよりも増大される期間又は細胞継代数の間、生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００％のより正しくフォールディングされた生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％のあまり凝集していないタンパク質又は生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製された細胞は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけの細胞と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００％のよりグリコシル化された生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成する。一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して選択され、同定され又は作製され、生成物を生成するために使用される細胞の集団は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする外因性核酸の安定な発現、例えば、組込みについて選択され、同定され、又は作製されただけであり、生成物を生成するために使用された細胞と比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００％より生存可能である。

細胞の評価、分類、選択又は同定
一態様では、本開示は、細胞、例えば、候補細胞を、生成物生成、例えば、組換え又は治療用ポリペプチド生成の能力について評価する方法を特徴とする。このような評価の結果は、高生成細胞又は細胞株である細胞又は細胞株を作製するための細胞の選択又は同定にとって有用な情報を提供し得る。別の実施形態では、本明細書において記載される評価に応じて、細胞又は細胞株を、例えば、高生成能力を有する細胞又は細胞株として分類できる。

高生成細胞又は細胞株は、参照細胞又は本明細書において記載された方法によって選択又は作製されていなかった細胞と比較して、高収量の組換え又は治療用ポリペプチド生成物を生成可能である。一実施形態では、高生成細胞株は、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ又は１００ｇ／Ｌ又はそれより多い生成物、例えば、組換えポリペプチド生成物を生成可能である。一実施形態では、高生成細胞株は、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ又は１００ｇ／Ｌ又はそれより多い生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチド生成物を生成する。生成される生成物の量は、細胞種、例えば、種及び発現されるべき組換え又は治療用ポリペプチドに応じて変わり得る。例として、高生成細胞は、例えば、本明細書において記載されるように、少なくとも１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ又は２５ｇ／Ｌ又はそれより多い組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である。

生成物が発現することが困難である実施形態では、高生成細胞は、より低い濃度の生成物、例えば、０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ又は１ｇ／Ｌ未満を生成し得るが、生産性は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含まない細胞について観察されるものよりも高い又は増大される。例えば、同定又は選択された細胞によって生成される生成物のレベル、量（ａｍｏｕｎｔ）又は量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む細胞を含まない細胞によって生成されるレベル、量（ａｍｏｕｎｔ）又は量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）と比較して、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍又はそれより多く増大される。

細胞を評価するための本明細書において記載される方法は、細胞機能と関連する１つ又は複数のパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果を評価することを含む。細胞機能と関連するパラメータとして、それだけには限らないが、細胞生存、培養生存力、増殖する能力、生成物を生成する能力及びタンパク質分解が挙げられる。実施形態では、細胞機能に関連するパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果を調べるために、例えば、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含む細胞が、細胞機能と関連するパラメータの１つの増大又は減少をもたらすか否かを調べるために、細胞機能と関連する１つ又は複数のパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの発現の効果の値を、参照値と比較する。一実施形態では、細胞機能と関連するパラメータのうち１つ又は複数の増大又は減少の決定に応じて、細胞生成株として開発するために細胞を選択又は同定できる。一実施形態では、細胞機能と関連するパラメータのうち１つ又は複数の増大又は減少の決定に応じて、高生成細胞、例えば、高収量の生成物を生成可能な細胞として細胞を同定できる。

本明細書において記載される実施形態のいずれかでは、参照値は、参照細胞、例えば、所定の生産性を有する細胞の細胞機能と関連するパラメータに対するレプレッサーポリペプチドの効果の値であり得る。或いは、又はさらに、本明細書において記載される実施形態のいずれかにおいて、参照値は、試験されている同一細胞の細胞機能と関連するパラメータの値であることもあり、これでは、細胞は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸を含まない、例えば、細胞を、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸と接触させる前にパラメータの値を測定した、又はレプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含む核酸と接触させていない細胞の別個のアリコート。

一実施形態では、細胞生存力、例えば、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現を存続する細胞の数又は量を決定又は定量化することによって、細胞生存を測定できる。細胞生存の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後に残る、細胞、例えば、無傷の細胞又は生細胞の数の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い増大を含む。或いは、細胞生存の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後のアポトーシス細胞数の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれより多い減少を含む。細胞生存又はアポトーシスを検出するための方法、例えば、アネキシンＶアッセイ、生存細胞濃度（ＩＶＣ）の時間積分、最大生存細胞濃度及び細胞特異的生産性率は、当技術分野で公知である。

一実施形態では、生細胞、例えば、培養物又は細胞の集団中の生細胞又は生存力と関連する特徴、例えば、増殖マーカー、無傷のＤＮＡを有する細胞若しくはアポトーシスマーカーを示さない細胞の数又は量を決定又は定量化することによって、培養生存力を測定できる。培養生存力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後に残る、細胞、例えば、無傷の細胞又は生細胞の数の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い増大を含む。培養生存力を調べる方法は、当技術分野で公知である。培養生存力を評価するその他の方法として、それだけには限らないが、トリパンブルー排除法と、それに続いて、血球計算器又はＶｉ−ＣＥＬＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントすることが挙げられる。培養生存力を評価するその他の方法は、生存バイオマスを調べることを含むことがあり、高周波インピーダンス又は静電容量を使用すること（例えば、Ｃａｒｖｅｌｌ及びＤｏｗｄ、２００６年、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５０巻：３５〜４８頁）又はラマン分光法を使用すること（例えば、Ｍｏｒｅｔｔｏら、２０１１年、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ、１４巻）を含む。

一実施形態では、細胞の数、細胞倍加又は細胞の成長速度を定量化又はカウントすることによって、細胞の増殖する能力を測定できる。或いは、例えば、フローサイトメトリー解析による細胞のゲノム含量（例えば、複製しているＤＮＡ）の解析によって、又は細胞周期に関与している増殖マーカー、例えば、Ｋｉ６７、リン酸化サイクリン−ＣＤＫ複合体の存在の解析によって、増殖している細胞を同定できる。増殖する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、細胞の数又は増殖マーカーを発現する細胞の数の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い増大を含む。或いは、増殖する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、細胞の倍加又は成長速度の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い増大を含む。培養生存力を調べる方法は、当技術分野で公知である。

本明細書において提供される方法は、組換え又は治療用ポリペプチド、例えば、生成物を生成するための改善された能力を有する細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するのに有用である。一実施形態では、本明細書において提供される方法はまた、組換え又は治療用ポリペプチドの改善された品質をもたらす細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するのに有用である。

一実施形態では、生成される生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、細胞の、生成物を生成する能力を測定できる。生成物を生成する能力の増大は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後のタンパク質生成の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い増大を含む。

一実施形態では、適切にフォールディングされた生成物、機能的生成物又は非凝集生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの品質を測定できる。細胞によって生成される生成物の品質の上昇は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の適切にフォールディングされた生成物、機能的生成物又は非凝集生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの量又は濃度の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い上昇を含む。

一実施形態では、正しいグリコシル化プロフィール、マクロ不均一性（すなわち、部位占有率）及びグリコシル化の一貫性を有する生成物の量又は濃度を調べる又は定量化することによって、生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの品質を測定できる。細胞によって生成される生成物の品質の上昇は、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントを含まない細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後と比較した、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントも含む細胞における組換え又は治療用ポリペプチドの発現後の、グリコシル化プロフィールを有する、部位占有率の増大した、又はグリコシル化の一貫性が増大した生成物の量又は濃度の１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍又は５倍又はそれより多い上昇を含む。

タンパク質生成の増大を測定する方法は、当業者に周知である。例えば、組換え又は治療用タンパク質生成の増大は、ＥＬＩＳＡによって組織培養培地において力価を測定することによって小規模で調べることができる（Ｓｍａｌｅｓら２００４年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８８巻：４７４〜４８８頁）。例えば、培地中の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）濃度のハイスループット測定のためにＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔによって（Ｍａｓｏｎら ２０１２年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２８巻：８４６〜８５５頁）又はプロテインＡ ＨＰＬＣによって大規模で（Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄら ２００７年 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９７巻：４１０〜４２４頁）定量的に調べることもできる。生成物、例えば、本明細書において記載される組換え又は治療用ポリペプチドの生成を調べるその他の方法は、細胞中の生成物、特に、組換え又は治療用ポリペプチドの特定の生成速度（ｑＰ）及び／又は生存細胞濃度（ＩＶＣ）の時間積分を指すことができる。培養培地中のポリペプチドの濃度として定義されている組換え又は治療用ポリペプチド生成又は生産性は、Ｐｏｒｔｅｒら（Ｐｏｒｔｅｒら ２０１０年 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２６巻：１４４６〜１４５５頁）に従って算出される、これら２つのパラメータ（ｑＰ及びＩＶＣ）の関数である。

本明細書において記載されるように作製された細胞株によって生成された生成物の改善された品質を測定するための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、発現された組換え又は治療用ポリペプチド生成物の一次配列の忠実度を調べる方法、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ペプチドマピング及びＩＥＦは、当技術分野で公知である。円偏光二色性又は発現された組換え又は治療用ポリペプチドの内因性蛍光を評価することによって、適切にフォールディングされた生成物、例えば、発現された組換え又は治療用ポリペプチドの量又は濃度の増大を決定できる。組換え又は治療用ポリペプチドの同一性に応じて種々の機能的アッセイを使用して、機能的生成物の量又は濃度の増大を試験できる。例えば、ＥＬＩＳＡ又はその他の免疫親和性アッセイによって抗体を試験できる。

細胞株及び組換えポリペプチド生成のための方法
哺乳動物及び微生物選択系の両方における現在の最先端は、ＲＮＡへのＤＮＡの転写のレベルで選択圧を適用することである。対象の遺伝子を選択マーカーと結合して、対象の遺伝子の高発現をもたらす可能性が高い選択マーカーの高レベルの発現を作製する。生存し、増殖することができるほど十分に高いレベルで選択マーカーを発現する細胞、そうではないものは、生存し、増殖する可能性が低い。このようにして、細胞の集団を、選択マーカーを発現する細胞について、また高レベルの対象の遺伝子の暗示によって濃縮することができる。この方法は、発現することが困難ではないタンパク質を発現するために極めて上首尾であると証明されている。

いくつかの実施形態では、生成物の発現、例えば、生成物の転写、翻訳及び／若しくは分泌又は生成物の品質、例えば、適切なフォールディング及び／又は一次配列の忠実度を改善するために、さらなるステップを実施してもよい。このようなさらなるステップは、生成物発現又は生成物品質を改善する物質を導入することを含む。一実施形態では、生成物発現又は生成物品質を改善する物質は、小分子、ポリペプチド又はタンパク質フォールディングを改善するポリペプチド、例えば、シャペロンタンパク質をコードする核酸であり得る。一実施形態では、タンパク質フォールディングを補助する物質は、シャペロンタンパク質、例えば、ＢｉＰ、ＰＤ１又はＥＲＯ１をコードする核酸を含む（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ ＆ Ｂｕｌｌｅｉｄ ２００４年；Ｂｏｒｔｈら ２００５年；Ｄａｖｉｓら ２０００年）。生成物の収量及び品質を改善するためのその他のさらなるステップは、ＳＢＰ１及びＡＴＦ６などの転写因子の（Ｔｉｇｇｅｓ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ２００６年；Ｃａｉｎら ２０１３年；Ｋｕら ２００８年）、及びカルネキシン及びカルレティキュリンなどのレクチン結合シャペロンタンパク質の（Ｃｈｕｎｇら ２００４年）の過剰発現を含む。本明細書において記載されるタンパク質フォールディング及び生成物品質及び収量タンパク質を補助又は改善する物質の過剰発現は、タンパク質をコードする外因性核酸の導入によって達成できる。別の実施形態では、生成物発現又は生成物品質を改善する物質は、生成物の発現又は生成物の品質を増大するために細胞培養物に添加できる小分子である。一実施形態では、例えば、細胞が普通に成長される温度よりも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃又は１０℃低い低温での細胞の培養。

本明細書において記載される方法のいずれかは、高い生産性を有し、高品質の生成物をもたらす細胞を同定するためのさらなる選択ステップをさらに含み得る。例えば、ＦＡＣ選択は、所望の特徴、例えば、タンパク質フォールディングタンパク質、例えば、シャペロンのより高い発現を有する特定の細胞を選択するために利用できる。

一態様では、本開示は、組換え又は治療用ポリペプチド生成物を回収する又は取り出すステップを含む方法を提供する。組換え又は治療用ポリペプチドが細胞から分泌される実施形態では、方法は、組換え又は治療用ポリペプチドを細胞、細胞集団又は細胞が培養された培養培地から取り出す、収集する又は分離するステップを含み得る。組換え又は治療用ポリペプチドが細胞内にある実施形態では、組換え又は治療用ポリペプチド生成物の精製は、以下：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、宿主細胞脂質及び／又は宿主細胞に由来するその他のデブリのいずれかのうち１つ又は複数からの、細胞によって生成された組換え又は治療用ポリペプチドの分離を含む。

実施形態では、本明細書において記載されるプロセスは、実質的に純粋なタンパク質生成物を提供する。本明細書において、「実質的に純粋な」とは、発熱性材料を実質的に含まない、核酸を実質的に含まない、及び／又は宿主細胞由来の内因性細胞タンパク質酵素及び構成成分、例えば、ポリメラーゼ、リボソームタンパク質及びシャペロンタンパク質を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なタンパク質生成物は、例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の宿主細胞由来の混入する内因性タンパク質（別名宿主細胞タンパク質）、核酸又はその他の高分子を含有する。

生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを回収及び精製する方法は、当技術分野で十分に確立されている。組換え又は治療用ポリペプチド生成物を回収するために、物理的又は化学的又は物理−化学的方法が使用される。物理的又は化学的又は物理−化学的方法は、濾過方法、遠心分離方法、超遠心方法、抽出方法、凍結乾燥方法、沈殿方法、クロマトグラフィー方法又はそれらの２つ若しくはそれより多い方法の組合せであり得る。一実施形態では、クロマトグラフィー方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（又はゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又はマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ又は複数を含む。

レプレッサーポリペプチド
高収量の生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能な細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するための遺伝制御回路、細胞及び方法において有用なレプレッサーポリペプチド及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、本明細書において提供される。一般に、レプレッサーポリペプチドは、生成物、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドの発現を調節された方法で阻害する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドをコードする配列は、１つ又は複数の条件に応じてレプレッサーポリペプチドをコードする配列の転写を活性化する制御エレメントの転写制御下にある。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、制御エレメント、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターエレメントと結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドの、制御エレメントとの結合は、作動可能に連結された組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列の転写を阻害する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、組換え又は治療用ポリペプチドの転写物の非翻訳領域をコードする配列と結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドの、組換え又は治療用ポリペプチドの転写物の非翻訳領域との結合は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列の翻訳を阻害する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列のコード配列と結合する。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドの、組換え又は治療用ポリペプチドのコード配列との結合は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列の転写、翻訳又は転写及び翻訳を阻害する。

本開示は、個別のレプレッサーポリペプチドに対して特異的ではないということは考慮される。例示的レプレッサーポリペプチドは、それだけには限らないが、Ｃａｓ９分子、ＴＡＬＥ分子及びジンクフィンガー分子が挙げられる。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、当技術分野で公知のＣａｓ関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するタンパク質である（例えば、Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９巻、４６７頁（２０１１年）；Ｋ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｎ．Ｖ．Ｇｒｉｓｈｉｎ、Ｓ．Ａ．Ｓｈａｂａｌｉｎａ、Ｙ．Ｉ．Ｗｏｌｆ、Ｅ．Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ、Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １巻、７頁（２００６年）；又はＫ．Ｓ．Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｌ．Ａｒａｖｉｎｄ、Ｙ．Ｉ．Ｗｏｌｆ、Ｅ．Ｖ．Ｋｏｏｎｉｎ、Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ６巻、３８頁（２０１１年）に記載されるような）。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、Ｃａｓ９分子である。Ｃａｓ９分子であるレプレッサーポリペプチドは、組換え又は治療用ポリペプチドの発現を阻害するために１又は複数の（例えば、１、２、３、４又はそれより多い）適したｇＲＮＡを必要とする。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、ＴＡＬＥ分子である。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、ジンクフィンガー分子である。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメントの内因性レプレッサーである。一実施形態では、レプレッサーポリペプチドをコードする内因性遺伝子は、不活性である、例えば、機能の喪失をもたらすようにノックアウト又は突然変異されている。

Ｃａｓ９分子
本開示の遺伝制御回路、細胞及び方法において使用されるべきＣａｓ９分子は、種々の種に起因するポリペプチドを含み得る。さらに、例えば、融合タンパク質において、ある種におけるＣａｓ９分子に由来する１つ又は複数のドメインを、別の種におけるＣａｓ９分子に由来する１つ又は複数のドメインと組み合わせてもよい。さらなるＣａｓ９ポリペプチドを含む種として、アシドボラックス・アヴェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバシラス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバシラス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の種、シクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミチー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコッティー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ジノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア、グルコナセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエジ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノヴィー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアセアエ・バクテリウム（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）の種、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の種、ナイセリア・ワズワーシー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）の種、パルビバクルム ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラクトバクテリウム・スクシナツテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ライストニア・シジギ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブルム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）の種、サイモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）の種、スポロラクトバチルス・ビネエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、スブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）の種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）の種又はベルミネフロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。

Ｃａｓ９構造及び活性
結晶構造は、天然に存在するＣａｓ９ポリペプチドについて（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４３巻（６１７６号）：１２４７９９７頁、２０１４年）及びガイドＲＮＡととものＳ．ピオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合物）について（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕら、Ｃｅｌｌ、１５６巻：９３５〜９４９頁、２０１４年；及びＡｎｄｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４年、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）利用可能である。

一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、以下のドメイン：ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインのうち１つ又は複数を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドであり、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドは、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性を欠くＲｕｖＣ様ドメイン及び／又はＨＮＨ様ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性を欠くＨＮＨ様ドメインを含む。

一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、１つより多いＲｕｖＣ様ドメイン（例えば、１、２、３又はそれより多いＲｕｖＣ様ドメイン）を含み得る。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、その活性を変更する１つ又は複数の突然変異を含み、その結果、ＲｕｖＣドメインは、ＤＮＡを切断しない、又はＤＮＡ切断活性が低減されている。一実施形態では、ＲｕｖＣ様ドメインは、少なくとも５、６、７、８個のアミノ酸長であるが、多くても２０、１９、１８、１７、１６又は１５個のアミノ酸長である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、約１０〜２０個のアミノ酸、例えば、約１５個のアミノ酸長のＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインを含む。

一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、１より多いＨＮＨ様ドメイン（例えば、１、２、３又はそれより多いＨＮＨ様ドメイン）を含み得る。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、その活性を変更する１つ又は複数の突然変異を含み、その結果、ＨＮＨ様ドメインは、ＤＮＡを切断しない、又はＤＮＡ切断活性が低減されている。一実施形態では、ＨＮＨ様ドメインは、少なくとも１５、２０、２５アミノ酸長であるが、多くても４０、３５又は３０個のアミノ酸長、例えば、２０〜３５個のアミノ酸長、例えば、２５〜３０個のアミノ酸長である。

実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用する能力を有し、ｇＲＮＡ分子とともにコア標的ドメインに局在するが、標的核酸を切断不能である、又は効率的な速度で切断不能である。切断活性を有さない、又は実質的に有さないＣａｓ９分子は、本明細書において、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドと呼ばれる。例えば、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドは、切断活性を欠く、又は実質的に少ない、例えば、当技術分野で公知のアッセイ又は本明細書において記載されるアッセイによって測定されるような、参照Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドの切断活性の２０、１０、５、１又は０．１％未満を有する場合がある。

ターゲッティング及びＰＡＭ
Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子とともに、標的ドメイン及びＰＡＭ配列を含む部位に局在し得るポリペプチドである。

一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドの、標的核酸と相互作用する能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。異なる細菌種に由来するＣａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識し得る。Ｃａｓ９分子を、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更するように遺伝子操作することができる。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３年１０巻：５号、７２７〜７３７頁に記載されている。

Ｃａｓ９構造の変更
いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドの１つ又は複数のＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、ＨＮＨ様ドメイン、ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインの外側の領域中に１つ又は複数の突然変異が存在し得る。いくつかの実施形態では、突然変異（複数可）は、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン中に存在する。いくつかの実施形態では、突然変異（複数可）は、ＨＮＨ様ドメイン中に存在する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン及びＨＮＨ様ドメインの両方中に存在する。

一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチド、例えば、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドは、本明細書において記載される任意のＣａｓ９分子配列又は本明細書において列挙される、若しくはＣｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３年１０巻：５号、７２７〜７３７頁；Ｈｏｕら、ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３年、１〜６頁に記載される種に由来する天然に存在するＣａｓ９分子配列、例えば、Ｃａｓ９分子と、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有する、
比較した場合に、アミノ酸残基の２、５、１０、１５、２０、３０又は４０％以下で異なる、
少なくとも１、２、５、１０又は２０個のアミノ酸で、ただし、１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０個以下のアミノ酸で異なる、又は
同一であるアミノ酸配列を含み、一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、以下の活性：ヘリカーゼ活性又はｇＲＮＡ分子と一緒に、標的核酸に局在する能力のうち１つ又は複数を含む。一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、ニッカーゼ活性又は二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）を含まない。

Ｓ．ピオゲネス配列に関連してＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメインにおいて行われ得る例示的突然変異として、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａが挙げられる。

例示的Ｃａｓ９ポリペプチド及びＣａｓ９ドメイン配列は、国際公開第２０１５／１５７０７０号の表５０〜５４に見ることができる。

ｄＣａｓ９レプレッサーポリペプチド
一実施形態では、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドは、参照Ｃａｓ９分子と比較して、ＲｕｖＣドメイン中及び／又はＨＮＨドメイン中に１つ又は複数の相違を含むｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドであり、ｄＣａｓ９分子又はｄＣａｓ９ポリペプチドは、核酸を切断しない、又は野生型が行うよりも有意に少ない効率で切断し、例えば、本明細書において記載されるような切断アッセイにおいて野生型と比較した場合に、例えば、本明細書において記載されるアッセイによって測定されるような参照Ｃａｓ９分子の５０、２５、１０又は１％未満で切断する。

Ｃａｓ９タンパク質の両ＤＮＡ切断ドメイン中の突然変異する重要な残基（例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異）は、触媒的に不活性のＣａｓ９（死んだＣａｓ９としても知られるｄＣａｓ９）分子の生成をもたらす。酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ｇＲＮＡのターゲッティングドメインによって指定されるＤＮＡ配列に局在するが、標的ＤＮＡを切断しない。酵素的に不活性の（例えば、ｄＣａｓ９）Ｃａｓ９分子は、コード配列中の初期領域に動員された場合に転写を遮断できる。転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ又はＥＲＤ）を酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９と融合すること及びそれを標的配列、例えば、遺伝子の開始コドンの３’の１０００ｂｐ以内の配列又は例えば、開始コドンの５’の５００ｂｐ以内の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントに動員することによって、さらなる抑制を達成できる。プロモーターのＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）をターゲッティングすること（例えば、ＤＨＳに対して相補的であるｇＲＮＡを作製することによって）は、これらの領域は、酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９に到達できる可能性がより高く、また、内因性転写因子のための部位を有する可能性が高いので、遺伝子抑制、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列の阻害のためのさらなる戦略であり得る。理論に捉われようとは思わないが、本明細書において、内因性転写因子又はＲＮＡポリメラーゼの結合部位を遮断することは、遺伝子発現、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列の発現を下方調節することにおいて役立つであろうということが考慮される。一実施形態では、１つ又は複数の内因性転写因子の結合を遮断するために１又は複数の酵素的不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９分子を使用してもよい。別の実施形態では、酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９分子を、エフェクタードメイン、例えば、抑制ドメイン、活性化ドメイン、メチル化酵素などと融合できる。酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９の、エフェクタードメインとの融合によって、エフェクターの、ｇＲＮＡによって指定される任意のＤＮＡ部位への動員が可能になる。クロマチン状態を変更することは、標的遺伝子の発現の減少をもたらし得る。クロマチン状態を変更するために、１又は複数のクロマチン修飾タンパク質に融合された１又は複数の酵素的に不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９分子を使用してもよい。

一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、制御エレメント（例えば、プロモーターエレメント）、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメントをターゲッティングできる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列をターゲッティングできる。

ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、その用語が本明細書において使用される時には、標的配列へのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の特異的ターゲッティング又はホーミングを促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、本明細書において「キメラ」ｇＲＮＡと呼ばれることもある単分子（単一ＲＮＡ分子を含む）である場合も、モジュラー（１つより多い、通常、２つの別個のＲＮＡ分子を含む）である場合もある。ｇＲＮＡ分子は、いくつかのドメインを含む。

一実施形態では、単分子又はキメラｇＲＮＡは、通常５’から３’に、
ターゲッティングドメイン、
第１の相補性ドメイン、
連結ドメイン、
第２の相補性ドメイン（第１の相補性ドメインに対して相補的である）、
近位ドメイン、及び
任意選択で、テールドメイン
を含む。

一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、
通常、５’から３’に
ターゲッティングドメイン、
第１の相補性ドメイン
を含む第１鎖と、
通常、５’から３’に
任意選択で、５’伸長ドメイン、
第２の相補性ドメイン、
近位ドメイン
任意選択で、テールドメイン
を含む第２鎖と
を含む。

一実施形態では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第１鎖と、ｃｒＲＮＡを含む第２鎖とを含む。例示的ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ及びそれを設計する方法は、当技術分野で、例えば、Ｊｉｎｅｋら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２年８月１７日：３３７巻、６０９６号、８１６〜８２１頁において見ることができる。

例示的ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡを設計する方法は、国際公開第２０１５／１５７０７０号、Ｘｕ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２０１５年８月；２５巻（８号）：１１４７〜５７頁及び当技術分野で公知の方法において見ることができる。

ｇＲＮＡドメイン
ターゲッティングドメインは、標的核酸上の標的配列に対して相補的である、例えば、少なくとも８０、８５、９０又は９５％相補的、例えば、完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ターゲッティングドメインは、ＲＮＡ分子の一部であり、したがって、塩基ウラシル（Ｕ）を含み、一方、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含むであろう。一実施形態では、ターゲッティングドメインの、標的配列との相補性は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の、標的核酸との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。一実施形態では、ターゲッティングドメインは、５〜５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ターゲッティングドメインは、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、組換え若しくは治療用ポリペプチドをコードする配列に対して、又は第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント若しくは組換え若しくは治療用ポリペプチドをコードする配列内に含まれる非翻訳領域若しくはイントロンに対して相補性を有する。ターゲッティングドメインが相補的である標的核酸の鎖は、本明細書において、相補鎖と呼ばれる。

第１の相補性ドメインは、第２の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有し、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する。

第１の相補性ドメインは、天然に存在する第１の相補性ドメインと相同性を共有し得る、又はそれに由来し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）又はＳ．サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の第１の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。連結ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補性ドメインを、第２の相補性ドメインと連結するように働く。連結ドメインは、第１及び第２の相補性ドメインを共有結合によって、又は非共有結合によって連結することができる。一実施形態では、連結は共有結合である。通常、連結ドメインは、１つ又は複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドを含む。

モジュラーｇＲＮＡ分子では、２つの分子が、相補性ドメインのハイブリダイゼーションにより会合している。

一実施形態では、モジュラーｇＲＮＡは、本明細書において５’伸長ドメインと呼ばれるさらなる配列を、第２の相補性ドメインの５’に含み得る。一実施形態では、５’伸長ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれより多いヌクレオチド長である。

第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインと相補的であり、一実施形態では、第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有し、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する。一実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループアウトする配列を含み得る。一実施形態では、第２の相補性ドメインは、５〜２７ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１の相補性領域よりも長い。第２の相補性ドメインは、天然に存在する第２の相補性ドメインと相同性を共有し得る、又はそれに由来し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．オーレウス又はＳ．サーモフィルス由来の第２の相補性ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。

一実施形態では、近位ドメインは、５〜２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を共有し得る、又はそれに由来し得る。一実施形態では、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．オーレウス又はＳ．サーモフィルス由来の近位ドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。

一実施形態では、テールドメインは、０（存在しない）、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長である。一実施形態では、テールドメインヌクレオチドは、天然に存在するテールドメインの５’末端に由来する配列と相同性を共有し得る、又はそれに由来し得る。一実施形態では、本明細書において開示されるテールドメイン、例えば、Ｓ．ピオゲネス、Ｓ．オーレウス又はＳ．サーモフィルステールドメインと少なくとも５０％の相同性を有する。一実施形態では、テールドメインは、互いに相補的である配列を含み、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成する。

一実施形態では、テールドメインは、３’末端に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ転写の方法と関連しているヌクレオチドを含む。ｉｎ ｖｉｖｏ転写にＵ６プロモーターが使用される場合には、これらのヌクレオチドは、配列ＵＵＵＵＵＵであり得る。

ｇＲＮＡを設計する方法
ｇＲＮＡ標的配列を選択及び検証する方法並びにオフターゲット解析は、例えば、Ｍａｌｉら、２０１３年Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９巻（６１２１号）：８２３〜８２６頁；ＨｓｕらＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１巻（９号）：８２７〜３２頁；Ｆｕら、２０１４年Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒら、２０１４年Ｎａｔ ＭＥＴＨＯＤＳ １１巻（２号）：１２２〜３頁 ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅら、２０１４年ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ Ａら、２０１４年ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載されている。

例えば、ソフトウェアツールを使用して、ユーザーの標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化して、例えば、ゲノム中の総オフターゲット活性を最小化できる。オフターゲット活性は、ＤＮＡ結合、ＤＮＡ切断、ＤＮＡニッキング又は別の活性であり得る。Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９を使用する、あり得るｇＲＮＡ選択各々について、ツールは、最大で特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のミスマッチしている塩基対を含有するゲノム中のすべてのオフターゲット配列（先行するＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭのいずれか）を同定できる。次いで、あり得るｇＲＮＡ各々を、その合計の予測されるオフターゲット切断に従ってランク付けし、最上位にランク付けされたｇＲＮＡは、最大のオンターゲット及び最小のオフターゲット切断を有する可能性が高いものに相当する。その他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動化試薬設計、オンターゲットサーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）アッセイのためのプライマー設計及び次世代シーケンシングによるオフターゲット切断のハイスループット検出及び定量化のためのプライマー設計を、ツールに含めることができる。候補ｇＲＮＡ分子は、当技術分野で公知の方法によって評価できる。

ＴＡＬＥ分子
転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）分子又はＴＡＬＥポリペプチドは、その用語が本明細書において使用される場合、ＴＡＬＥ ＤＢＤによって指定される核酸位置にホーミング又は局在できる複数のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合リピートドメイン（ＴＡＬＥ ＤＢＤ）を含む分子又はポリペプチドを指す。ＴＡＬＥ分子及びＴＡＬＥポリペプチドは、それらの用語が本明細書において使用される場合、例えば、参照配列、例えば、当技術分野で公知の最も類似した天然に存在するＴＡＬＥ分子から少なくとも１個のアミノ酸残基だけ異なる、天然に存在するＴＡＬＥ分子及び遺伝子操作された、変更された又は修飾されたＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドを指す。

ＴＡＬＥ ＤＢＤは、その用語が本明細書において使用される場合、モチーフの位置１２及び１３に２つの高頻度可変性残基（すなわち、リピート可変二残基、ＲＶＤ）を含む３３〜３５のアミノ酸モチーフを指す。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のＲＶＤは、ＴＡＬＥ ＤＢＤが結合親和性を有するＤＮＡ塩基対又は塩基対を指定する。ＴＡＬＥ ＤＢＤをアレイでＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチド内で組み合わされると、ＴＡＬＥ ＤＢＤ（及びそのＲＶＤ）の順序が、ＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドが結合親和性を有するＤＮＡ配列を決定する。天然に存在するＴＡＬＥポリペプチド及びＴＡＬＥ ＤＢＤは、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の細菌によって生成される。

リピート可変二残基（ＲＶＤ）は、その用語が本明細書において使用される場合、ＴＡＬＥ ＤＢＤの位置１２及び１３の２つの高頻度可変性 アミノ酸残基を指す。ＲＶＤは、ＴＡＬＥ ＤＢＤのＤＮＡ塩基対親和性を決定する。ＲＶＤのすべてのあり得る組合せ及びそのそれぞれの塩基対親和性は、当技術分野で公知である。例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｇ Ｌ．ら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１２年７月２４日； ３（）：９６８；Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ Ａ．ら Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１５年１月３０日；５（）：８１５０；Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｃ．ら Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２、４６５〜４７１頁（２０１５年）；Ｓｔｒｅｕｂｅｌ Ｊ．ら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０巻、５９３〜５９５頁（２０１２年）；及びＹａｎｇ Ｊ．ら Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２４、６２８〜６３１頁（２０１４年）を参照のこと。レプレッサーポリペプチド、例えば、本明細書において記載されるＴＡＬＥ分子とともの使用のために、すべてのあり得るＲＶＤが考慮される。

ＴＡＬＥ ＤＢＤアレイは、その用語が本明細書において使用される場合、ＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチド内のＴＡＬＥ ＤＢＤ、例えば、各ＴＡＬＥ ＤＢＤのＲＶＤの同一性及び順序を指す。ＴＡＬＥ ＤＢＤアレイは、ＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドの配列特異的結合親和性を決定する。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、ＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドである。キサントモナス属の任意の種に由来するＴＡＬＥ ＤＢＤ及びＴＡＬＥポリペプチドを、高収量の生成物、例えば、本明細書において記載される組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するための、遺伝制御回路、細胞及び方法において使用できる。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、天然に存在するＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、遺伝子操作されたＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチド、すなわち、天然に存在するＴＡＬＥ分子若しくはＴＡＬＥポリペプチドに由来する、又は当技術分野で公知の別の遺伝子操作されたＴＡＬＥ分子若しくはＴＡＬＥポリペプチドに由来する１個又は複数のアミノ酸だけ異なるＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴＡＬＥ分子又はＴＡＬＥポリペプチドは、
本明細書において記載される任意のＴＡＬＥ分子配列又は天然に存在するＴＡＬＥ分子配列、例えば、本明細書において列挙される、若しくは本明細書において参照される刊行物に記載される種に由来するＴＡＬＥ分子と、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有する、
比較した場合に、アミノ酸残基の２、５、１０、１５、２０、３０又は４０％以下で異なる、
少なくとも１、２、５、１０又は２０個のアミノ酸で、ただし１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０個以下のアミノ酸で異なる、又は
同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ分子は、そのＴＡＬＥ分子のＴＡＬＥ ＤＢＤアレイによって指定される標的ＤＮＡ配列に局在する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ分子は、コード配列、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドのコード配列中の初期領域に動員された場合に転写を遮断できる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ分子は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントに動員された場合に転写を遮断できる。いくつかの実施形態では、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ又はＥＲＤ）をＴＡＬＥ分子と融合し、ＴＡＬＥ ＤＢＤアレイによって指定される任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にすることによって、さらなる抑制を達成できる。

いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ分子は、２つ又はそれより多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれより多い）ＴＡＬＥ ＤＢＤを含む。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチド、例えば、ＴＡＬＥ分子のＴＡＬＥ ＤＢＤアレイは、標的ＤＮＡ配列を指定する。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤアレイによって指定される標的配列は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメント、例えば、プロモーターエレメント内に含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＢＤアレイによって指定される標的配列は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列内に含まれる。

高収量の生成物、例えば、本明細書において記載される組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するための、例示的な天然に存在する、及び遺伝子操作されたＴＡＬＥポリペプチド配列並びに遺伝制御回路、細胞及び方法とともに使用するためのＴＡＬＥポリペプチドの設計及び試験のための方法は、当技術分野において、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ Ｆら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１年；２９巻：１４９〜１５３頁；Ｇｅｉｓｓｌｅｒ Ｒら ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１年；６：ｅ１９５０９；Ｇａｒｇ Ａら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２年；Ｂｕｌｔｍａｎｎ Ｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２年；４０巻：５３６８〜５３７７頁；Ｃｅｒｍａｋ Ｔら Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｂａｓｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１１年；３９巻：ｅ８２；Ｃｏｎｇ Ｌら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１２年；３巻：９６８頁；及びＭｉｌｌｅｒ ＪＣら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１１年；２９巻：１４３〜１４８頁に見ることができる。

ジンクフィンガー分子
ジンクフィンガー分子は、その用語が本明細書において使用される時には、複数のジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）を含む分子又はポリペプチドを指す。ジンクフィンガー分子は、ジンクフィンガー分子が含むＺＦＤの同一性及び順序によって決定される特定のＤＮＡ配列に対して親和性を有する。

ジンクフィンガードメイン（ＺＦＤ）は、その用語が本明細書において使用される時には、配列中のＤＮＡと特異的に結合し、ＤＮＡと結合するために亜鉛イオンリガンドを必要とするポリペプチドのファミリーのいずれかを指す。ＺＦＤの多数のファミリーが研究され、特性決定されている（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａ，ＳＳ．ら Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００３年）３１巻（２号）：５３２〜５５０頁を参照のこと）。本開示は、当業者に公知の任意の種類又は起源のＺＦＤを含み得るジンクフィンガー分子を考慮する。任意の特定の種類のＺＦＤに限定されようとは思わないが、本開示は、当技術分野で最も蔓延している、十分に研究されているＺＦＤであるＣｙｓ_２Ｈｉｓ_２ ＺＦＤを含むジンクフィンガー分子を考慮する。Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２ ＺＦＤは、逆平行ベータシート及びアルファヘリックスを形成する２つのベータ鎖を含む。アルファヘリックスの位置−１、１、２、３、５及び６は、ＤＮＡ塩基対と相互作用することによってＤＮＡ配列特異的結合を指定すると知られている。一実施形態では、Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２ ＺＦＤは、３塩基対標的配列に対する特異的結合親和性を有し得る。一実施形態では、Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２ ＺＦＤは、標的配列に隣接するさらなる塩基対と、状況特異的に、すなわち、ジンクフィンガー分子内の隣接するＺＦＤの存在又は同一性に応じて特異的に相互作用し得る。

ジンクフィンガードメインアレイ又はＺＦＤアレイは、その用語が本明細書において使用される時には、ジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチド内のＺＦＤの同一性及び順序を指す。ＺＦＤアレイは、ジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドの配列特異的結合親和性を決定する。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、ジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドである。任意の種（例えば、哺乳動物種、例えば、ヒト）に由来するＺＦＤ及びジンクフィンガーポリペプチドは、高収量の生成物、例えば、本明細書において記載される組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するための遺伝制御回路、細胞及び方法において使用できる。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、天然に存在するジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチドは、遺伝子操作されたジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチド、すなわち、天然に存在するジンクフィンガー分子若しくはジンクフィンガーポリペプチドに由来する、又は当技術分野で公知の別の遺伝子操作されたジンクフィンガー分子若しくはジンクフィンガーポリペプチドに由来する１個又は複数のアミノ酸だけ異なるジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドは、本明細書において記載される任意のジンクフィンガー分子配列又は天然に存在するジンクフィンガー分子配列、例えば、本明細書において列挙される、若しくは本明細書において参照される刊行物に記載される種に由来するジンクフィンガー分子と、
６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有する、
比較した場合に、アミノ酸残基の２、５、１０、１５、２０、３０又は４０％以下で異なる、
少なくとも１、２、５、１０又は２０個のアミノ酸で、ただし１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０個以下のアミノ酸で異なる、又は
同一であるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー分子は、そのジンクフィンガー分子のＺＦＤアレイによって指定される標的ＤＮＡ配列に局在する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー分子は、コード配列、例えば、組換え又は治療用ポリペプチドのコード配列中の初期領域に動員された場合に転写を遮断できる。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー分子は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメント、例えば、プロモーターエレメントに動員された場合に転写を遮断できる。いくつかの実施形態では、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ又はＥＲＤ）をジンクフィンガー分子と融合し、ＺＦＤアレイによって指定される任意のＤＮＡ部位へのエフェクターの動員を可能にすることによって、さらなる抑制を達成できる。

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー分子は、２つ又はそれより多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０又はそれより多い）ＺＦＤを含む。いくつかの実施形態では、ＺＦＤアレイを既知標的配列親和性を有するＺＦＤから構築して、所望の特異的標的配列を有するジンクフィンガー分子又はジンクフィンガーポリペプチドを作製できる。

いくつかの実施形態では、レプレッサーポリペプチド、例えば、ジンクフィンガー分子のＺＦＤアレイは、標的ＤＮＡ配列を指定する。いくつかの実施形態では、ＺＦＤアレイによって指定される標的配列は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された制御エレメント、例えば、プロモーターエレメント内に含まれる。いくつかの実施形態では、ＺＦＤアレイによって指定される標的配列は、組換え又は治療用ポリペプチドをコードする配列内に含まれる。

高収量の生成物、例えば、本明細書において記載される組換え又は治療用ポリペプチドを生成可能である細胞又は細胞株を同定、選択又は作製するための、例示的な天然に存在する、及び遺伝子操作されたジンクフィンガーポリペプチド配列並びに遺伝制御回路、細胞及び方法とともに使用するためのジンクフィンガーポリペプチドの設計及び試験のための方法は、当技術分野において、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｗｏｌｆｅ ＳＡら Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ． ２０００年；２９巻：１８３〜２１２頁；Ｐａｂｏ ＣＯら Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００１年；７０巻：３１３〜３４０頁；Ｇｒｅｉｓｍａｎ ＨＡ、Ｐａｂｏ ＣＯ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９７年；２７５巻：６５７〜６６１頁；Ｉｓａｌａｎ Ｍら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９７年；９４巻：５６１７〜５６２１頁；Ｗｏｌｆｅ ＳＡら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９９年；２８５巻：１９１７〜１９３４頁に見ることができる。

特異的標的ＤＮＡ配列と結合するＺＦＤ及びＺＦＤアレイを設計する方法は、当技術分野で、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｍａｅｄｅｒ ＭＬら Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００８年；３１巻：２９４〜３０１頁；Ｓａｎｄｅｒ ＪＤら Ｎａｔ ＭＥＴＨＯＤｓ． ２０１１年；８巻：６７〜６９頁；及びＭｅｎｇ Ｘら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８年；２６巻：６９５〜７０１頁に見ることができる。

製造への適用
本明細書において開示される細胞、方法、キット、反応混合物及び核酸は、バイオリアクター又は処理容器若しくはタンクにおいて、より一般的には、任意の供給源を用いて使用するものであり得る。本明細書において記載されるデバイス、設備及び方法は、原核及び／又は真核細胞株を含む任意の所望の細胞株を培養するのに適している。また、懸濁液細胞又は足場依存性（接着）細胞を培養するのに適している構成成分を含み、医薬品及び医薬製剤製品−ポリペプチド生成物、核酸生成物（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は細胞療法及び／若しくはウイルス療法において使用されるものなどの細胞及び／又はウイルスなどの製造のために設定された生産作業に適している工業設備も含まれる。

実施形態では、細胞は、組換え治療用生成物又は診断用生成物などの生成物を発現又は生成する。以下により詳細に記載されるように、細胞によって生成される生成物の例として、それだけには限らないが、抗体分子（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティクス（抗原と特異的に結合するが、抗体と構造的に関連していないポリペプチド分子、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ、アドネクチン又はＩｇＮＡＲなど）、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、その他の組換えタンパク質（例えば、グリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療用（例えば、遺伝子療法及びウイルス免疫療法のための抗がん瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター）、細胞治療用（例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成体幹細胞）、ワクチン又は脂質によって被包された粒子（例えば、エキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）又はＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡなど）、抗生物質又はアミノ酸が挙げられる。実施形態では、バイオシミラーを製造するためにデバイス、設備及び方法を使用できる。

また、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞又は例えば、酵母細胞若しくは糸状菌細胞などの下等真核細胞又はグラム陽性若しくはグラム陰性細胞などの原核細胞並びに／又は真核細胞若しくは原核細胞の生成物、例えば、真核細胞によって大規模に合成される、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）の製造を可能にする構成成分を含む工業設備も含まれる。本明細書において別に示されない限り、デバイス、設備及び方法は、任意の所望の容量又はそれだけには限らないが、ベンチ規模、パイロット規模及びフル製造規模能力を含む製造能力を含み得る。

さらに、本明細書において別に示されない限り、設備は、それだけには限らないが、撹拌槽、気泡ポンプ、ファイバー、マイクロファイバー、中空ファイバー、セラミックマトリックス、流動層、固定層及び／又は噴流層バイオリアクターを含む任意の適したリアクター（複数可）を含み得る。本明細書において、「リアクター」は、発酵槽又は発酵ユニット又は任意のその他の反応容器を含んでもよく、用語「リアクター」は、「発酵槽」と同義的に使用される。例えば、いくつかの態様では、例示的バイオリアクターユニットは、以下：栄養分及び／又は炭素供給源の供給、適したガス（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の入口及び出口流、ガス及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、及び／又は洗浄／滅菌のうち１つ又は複数又はすべてを実施できる。発酵ユニットなどの例示的リアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含有してもよく、例えば、ユニットは、各ユニット中に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００又はそれより多いバイオリアクターを有することができ、及び／又は設備は、施設内に単一又は複数のリアクターを有する複数のユニットを含有してもよい。種々の実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、半フェド−バッチ、フェド−バッチ、灌流及び／又は連続発酵プロセスに適したものであり得る。任意の適したリアクター径を使用できる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬから約５０，０００Ｌの間の容量を有し得る。限定されない例として、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル及び／又は５０，０００リットルの容量が挙げられる。さらに、適したリアクターは、複数回使用、単回使用、使い捨て又は非使い捨てであってよく、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意のその他の適したステンレス鋼）及びインコネルなどの合金、プラスチック及び／又はガラスを含む任意の適した材料から形成され得る。

実施形態では、本明細書において別に記載されない限り、設備はまた、このような生成物の分離、精製及び単離のための作業及び／又は機器などの、そうでなければ言及されない任意の適したユニット作業及び／又は機器を含み得る。伝統的な現場組み立て設備、モジュール式、移動性及び一時的な設備又は任意のその他の適した構築物、設備及び／又はレイアウトなどの任意の適した設備及び環境を使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、モジュール式クリーンルームを使用できる。さらに、別に記載されない限り、本明細書において記載されるデバイス、システム及び方法を、単一の場所又は設備において収容及び／若しくは実施でき、又はあるいは、別個の又は複数の場所及び／又は設備に収容及び／又は実施できる。

限定されない例として、制限するものではないが、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、同２０１２／００７７４２９号、同２０１１／０２８０７９７号、同２００９／０３０５６２６号並びに米国特許第８，２９８，０５４号、同７，６２９，１６７号及び同５，６５６，４９１号に、適したものであり得る例示的設備、機器及び／又はシステムが記載されている。

例示的配列
ＨＣＭＶプロモーター及びイントロン中の例示的ガイドＲＮＡ標的配列
（下線が引かれたＰＡＭ配列）
すべて５’から３’

gRNA 1
TGTCAACATGGCGGTAATGTTGG（配列番号１）

gRNA 2
TACCGCCCATTTGCGTCAATGGG（配列番号２）

gRNA 3
CTACCGCCCATTTGCGTCAATGG（配列番号３）

gRNA14
ACCGTTAACAGCACCGCAACGGG（配列番号４）

配列５−ｇＲＮＡによってターゲッティングされるｈＣＭＶ−ＭＩＥ領域
＞ｐＥＥ１２．４（５４２１ｂｐ〜７５２８ｂｐ、直接）２１０８ｂｐ
CTGCAGTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATCGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACG（配列番号５）

配列６−Ｕ６プロモーター
TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC（配列番号６）

配列７−Ｇｒｐ７８プロモーター
＞ＧＡ＿Ｇｒｐ７８＿ｄＣａｓ９＿Ｕｂ＿Ｐｕｒｏ＿Ｕ６＿ＲＧＲ＿２＋１＋３（１５ｂｐ〜１５０８ｂｐ、直接）１４９４ｂｐ
TAGCATAAGCTACAGATCAACCAGGTTATCAATTCTACCTGTACCACTCACCAGTGACTATTCTATTTAGCCACCCCCCCCCCAATGATCTCTTCTGGAAAATGGGAAACATCTACCAAGAATTAATCAAAGGACTAAATGACACATGCAAAAAAAAAAAAACCTTAGAACAGTGTTTTAAGCAGGATAAGTAGTTCAAGACCAGTTTGGACCATGTCTCAAAACTAAAGGAACAACGAAGTACATTTAGTATTTTTTGCAACATGTTATTATTACATAGCATCAGGAAGACAATTTTTTCTTTGTCTGCTAAATGCCTTTGTCATATCAGACCTATTTCAAGAGTCAGGATAGAATGGTGTCAAGAAGGGATGAGGAAGGACTTGTAAATTATAACCAAGCCACAAATGAAAATGATAGACAAGGATCGGGAACATTATGGGGCGACAAGCTAGAGAAAAAAAATGATATATTCCAGGGTGGAAAGTGCTCGCTTGACTATTCATAGAACAGAATAGCCACAGCATAGCGGGGGGCTCAGTACTAGGTTGCAAATGGCCAGGCCAATTCTGGGACTTAACCCCAAGAAAAGAAAAATTGGCAAGGCCAGGATAGACAAATGCAGCTGGCCTAGGGGTGAAGGGAAAACAGTTGGCTGAGAAGAGCCACGATTCGCAGAGAGGCAGAACACAGACTAGGACCCAGCTCGAGACGTGCAGGCCGGGTGGGTAACATAGAGCCCGGGCGCTCGGCTACCCGAGAACGTGAGGGAGGCTGGGAAGGGCAGAGATGCGTTCCCAGGCGACCACAGCATCTATGCTGAGGCTGAGCAGCTCGGGACCCGAGGGGACTTAGGAGGAGAAAAGGCCGCATACTGCTTCGGGGTAAGGGACAGACCGGGGAAGGACCCAAGTCCCACCGCCCAGAGGGAACTGACACGCAGACCCCGCAGCAGTCCCCGGGGGCCGGGTGACGGGAGGACCTGGACGGTTACCGGCGGAAACGGTCTCGGGTTGAGAGGTCACCTGAGATGCTGCCTCTCATTGGCGGCCGTTGAGAGTAACCAGTAGCCAATGAGTCAGCCCGGGGGGCGTAGCGGTGACGTAAGTTGCGGAGGAGGCCGCTTCGAATCGGCAGCGGCCAGCTTGGTGGCATGGACCAATCAGCGTCCTCCAACGAGAAGCGCCTTCACCAATCGGAGGCCTCCACGACGGGGCTGGGGGGAGGGTATATAAGCCAAGTCGGCGGCGGCGCGCTCCACACTGGCCAAGACAACAGTGACCGGAGGACCTGCCTTTGCGGCTCCGAGAGGTAAGCGCCGCGGCCTGCTCTTGCCAGACCTCCTTTGAGCCTGTCTCGTGGCTCCTCCTGACCCGGGGGGCTTCTGTCGCCCTCAGATCGGAACGCCGCCGCGCTCCGGGACTACAGCCTGTTGCTGGACTTCGAGACTGCAGACGGACCGACCGCTGAGCACTGGCCCACAGCGCCGGCAAG（配列番号７）

ＨＲＥコンセンサス配列１：
nGAAnnTTCnnGAA（配列番号８）

ＨＲＥコンセンサス配列２：
nGAAnnGAAnnTTCn（配列番号９）

ＨＲＥコンセンサス配列３：
nGAAnnGAAnnGAAn（配列番号１０）

ＨＲＥコンセンサス配列４：
nTTCnnGAAnnGAAn（配列番号１１）

ＣＲＥコンセンサス配列：
TGACGTCA（配列番号１２）

ＡＲＥコンセンサス配列：
TGAG/CnnnGC（配列番号１３）

ＥＲＳＥコンセンサス配列：
CCAAT(N9)CCACG（配列番号１４）

野生型Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９：
MDKKYSIGLD IGTNSVGWAV ITDEYKVPSK KFKVLGNTDRHSIKKNLIGA LLFDSGETAE
ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHRLEESFLVEED KKHERHPIFG
NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAHMIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSRRLENLIAQLP GEKKNGLFGN
LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLAQIGDQYADLF LAAKNLSDAI
LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVRQQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLRKQRTFDNGSI PHQIHLGELH
AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNSRFAWMTRKSE ETITPWNFEE
VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTVYNELTKVKYV TEGMRKPAFL
SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEISGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYAHLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDDSLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIVIEMARENQTT QKGQKNSRER
MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGRDMYVDQELDI NRLSDYDVDH
IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNL
TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMNTKYDENDKLI REVKVITLKS
KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKKYPKLESEFVY GDYKVYDVRK
MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKRPLIETNGETG EIVWDKGRDF
ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLIARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPIDFLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLASHYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDKPIREQAENII HLFTLTNLGA
PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号１５）

ｄＣａｓ９：
MDKKYSIGLA IGTNSVGWAV ITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGA LLFDSGETAE
ATRLKRTARR RYTRRKNRIC YLQEIFSNEM AKVDDSFFHRLEESFLVEED KKHERHPIFG
NIVDEVAYHE KYPTIYHLRK KLVDSTDKAD LRLIYLALAHMIKFRGHFLI EGDLNPDNSD
VDKLFIQLVQ TYNQLFEENP INASGVDAKA ILSARLSKSRRLENLIAQLP GEKKNGLFGN
LIALSLGLTP NFKSNFDLAE DAKLQLSKDT YDDDLDNLLAQIGDQYADLF LAAKNLSDAI
LLSDILRVNT EITKAPLSAS MIKRYDEHHQ DLTLLKALVRQQLPEKYKEI FFDQSKNGYA
GYIDGGASQE EFYKFIKPIL EKMDGTEELL VKLNREDLLRKQRTFDNGSI PHQIHLGELH
AILRRQEDFY PFLKDNREKI EKILTFRIPY YVGPLARGNSRFAWMTRKSE ETITPWNFEE
VVDKGASAQS FIERMTNFDK NLPNEKVLPK HSLLYEYFTVYNELTKVKYV TEGMRKPAFL
SGEQKKAIVD LLFKTNRKVT VKQLKEDYFK KIECFDSVEISGVEDRFNAS LGTYHDLLKI
IKDKDFLDNE ENEDILEDIV LTLTLFEDRE MIEERLKTYAHLFDDKVMKQ LKRRRYTGWG
RLSRKLINGI RDKQSGKTIL DFLKSDGFAN RNFMQLIHDDSLTFKEDIQK AQVSGQGDSL
HEHIANLAGS PAIKKGILQT VKVVDELVKV MGRHKPENIVIEMARENQTT QKGQKNSRER
MKRIEEGIKE LGSQILKEHP VENTQLQNEK LYLYYLQNGRDMYVDQELDI NRLSDYDVDA
IVPQSFLKDD SIDNKVLTRS DKNRGKSDNV PSEEVVKKMKNYWRQLLNAK LITQRKFDNL
TKAERGGLSE LDKAGFIKRQ LVETRQITKH VAQILDSRMNTKYDENDKLI REVKVITLKS
KLVSDFRKDF QFYKVREINN YHHAHDAYLN AVVGTALIKKYPKLESEFVY GDYKVYDVRK
MIAKSEQEIG KATAKYFFYS NIMNFFKTEI TLANGEIRKRPLIETNGETG EIVWDKGRDF
ATVRKVLSMP QVNIVKKTEV QTGGFSKESI LPKRNSDKLIARKKDWDPKK YGGFDSPTVA
YSVLVVAKVE KGKSKKLKSV KELLGITIME RSSFEKNPIDFLEAKGYKEV KKDLIIKLPK
YSLFELENGR KRMLASAGEL QKGNELALPS KYVNFLYLASHYEKLKGSPE DNEQKQLFVE
QHKHYLDEII EQISEFSKRV ILADANLDKV LSAYNKHRDKPIREQAENII HLFTLTNLGA
PAAFKYFDTT IDRKRYTSTK EVLDATLIHQ SITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号１６）

GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC（配列番号１７）

GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGATAGTATAGGAACTTC（配列番号１８）

GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTACTTAGTATAGGAACTTC（配列番号１９）

番号付けされた実施形態
１．外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む細胞であって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、細胞。

２．挿入部位に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む細胞であって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、細胞。

３．調節が可逆的である、段落１又は２の細胞。

４．調節が不可逆的である、段落１又は２の細胞。

５．第２の制御エレメントが、第Ｎの条件下で第Ｎのレベルの活性を有し、Ｎが、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、第Ｎの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、任意の前述の段落の細胞。

６．第３の制御エレメントが、第Ｎの条件下で第Ｎのレベルの活性を有し、Ｎが３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、第Ｎの条件の存在下で、治療用ポリペプチドの発現が、これまでの条件下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、任意の前述の段落の細胞。

７．第１の制御エレメント及び外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、第１の核酸に配置され、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、第２の核酸に配置される、任意の前述の段落の細胞。

８．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の核酸に配置される、段落７の細胞。

９．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第２の核酸に配置される、段落７の細胞。

１０．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第３の核酸に配置される、段落７の細胞。

１１．第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、同一の核酸に配置される、段落１〜６のいずれかの細胞。

１２．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列と同一の核酸に配置される、段落１１の細胞。

１３．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列とは別個の核酸に配置される、段落１１の細胞。

１４．１又は複数の核酸が、安定な発現に適したベクター、例えば、プラスミド内に含まれる、段落７〜１３のいずれかの細胞。

１５．１又は複数の核酸が、一過性発現に適したベクター内に含まれる、段落７〜１３のいずれかの細胞。

１６．１又は複数の核酸が、同一ベクター内に含まれる段落１４又は１５の細胞。

１７．各核酸が異なるベクターに含まれる、段落１４又は１５の細胞。

１８．１又は複数の核酸が、単一染色体内に含まれる、段落７〜１３の細胞。

１９．各核酸が、異なる染色体内に含まれる、段落７〜１３のいずれかの細胞。

２０．第１の核酸が、ベクター内に含まれ、第２の核酸が染色体内に含まれる、段落７〜１０のいずれかの細胞。

２１．第１の核酸が染色体内に含まれ、第２の核酸がベクター内に含まれる、段落７〜１０のいずれかの細胞。

２２．第１の核酸がベクター内に含まれ、第２の核酸が染色体内に含まれ、第３の核酸がベクター内に含まれる、段落１０の細胞。

２３．第１の核酸が染色体内に含まれ、第２の核酸がベクター内に含まれ、第３の核酸がベクター内に含まれる、段落１０の細胞。

２４．第１の核酸がベクター内に含まれ、第２の核酸が染色体内に含まれ、第３の核酸が染色体内に含まれる、段落１０の細胞。

２５．第１の核酸が染色体内に含まれ、第２の核酸がベクター内に含まれ、第３の核酸が染色体内に含まれる、段落１０の細胞。

２６．ストレス応答が、第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントからのレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する、任意の前述の段落の細胞。

２７．レプレッサーポリペプチドが、治療用ポリペプチドの発現を阻害する、任意の前述の段落の細胞。

２８．第１の制御エレメントが、レプレッサーポリペプチドに対して応答性である、任意の前述の段落の細胞。

２９．第１の制御エレメントが、第１のプロモーターエレメントを含み、第１のプロモーターエレメントが、レプレッサーポリペプチドの不在下で、以下の特性：
ａ）構成的である、
ｂ）調節される、又は
ｃ）細胞の増殖の第１の段階で第１のレベルの発現及び増殖の第２の段階で第２のレベルの発現を有する
のうち１つを有する、任意の前述の段落の細胞。

３０．第１のプロモーターエレメントが、レプレッサーポリペプチドの不在下で構成的である、任意の前述の段落の細胞。

３１．第１のプロモーターエレメントが、表５から選択される、任意の前述の段落の細胞。

３２．治療用ポリペプチドが、
融合タンパク質、
マルチドメインポリペプチド、
二重特異性抗体分子、
多重特異性抗体分子、
多重特異性分子及び
リガンド及び抗体分子を含む分子
を含む、任意の前述の段落の細胞。

３３．治療用ポリペプチドが、表１〜４から選択される、任意の前述の段落の細胞。

３４．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、表５若しくは表６から選択されるか、又は表５若しくは表６から選択される配列と比較して０、１、２若しくは３つの塩基置換を有する配列を含むプロモーターを含む、任意の前述の段落の細胞。

３５．第３の制御エレメントが、表６から選択され、第２の制御エレメントが、表５から選択される、段落３４の細胞。

３６．第３の制御エレメントが、表５から選択され、第２の制御エレメントが表６から選択される、段落３４の細胞。

３７．第２の制御エレメントが、第２のプロモーターエレメントを含み、第２のプロモーターエレメントが、構成的であり、第３の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第３のプロモーターエレメントを含む、段落１〜３４のいずれかの細胞。

３８．第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第２のプロモーターエレメントを含み、第３の制御エレメントが、第３のプロモーターエレメントを含み、第３のプロモーターエレメントが構成的である、段落１〜３４のいずれかの細胞。

３９．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、１つ又は複数の熱ショックエレメント（ＨＳＥ）、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、抗酸化薬応答エレメント（ＡＲＥ）又は小胞体応答エレメント（ＥＲＳＥ）を含む、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４０．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、熱ショック応答又はフォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）のエレメントによって調節される、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４１．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって調節される、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４２．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、Ｘｂｐ１応答プロモーターエレメントを含む、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４３．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、Ｇｒｐ７８プロモーターエレメントを含む、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４４．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、ＡＴＦ６応答プロモーターエレメント、ＡＴＦ４応答プロモーターエレメント、ＮＲＦ２応答プロモーターエレメント又はＨｓｆ１応答プロモーターエレメントを含む、段落１〜３８のいずれかの細胞。

４５．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドの活性、レベル又は発現の低減をもたらす、任意の前述の段落の細胞。

４６．レプレッサーポリペプチドが、標的核酸配列と特異的に結合する、任意の前述の段落の細胞。

４７．レプレッサーポリペプチドが、制御エレメントと特異的に結合する、段落１〜４６のいずれかの細胞。

４８．レプレッサーポリペプチドが、プロモーターと特異的に結合する、段落１〜４６のいずれかの細胞。

４９．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドの転写の低減をもたらす、任意の前述の段落の細胞。

５０．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸と、又は外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された第１のプロモーターと結合する、任意の前述の段落の細胞。

５１．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドの翻訳を低減する、任意の前述の段落の細胞。

５２．レプレッサーポリペプチドが、Ｃａｓ９分子を含む、任意の前述の段落の細胞。

５３．レプレッサーポリペプチドが、天然に存在するＣａｓ９と比較して、修飾された切断活性を有するＣａｓ９分子を含む、任意の前述の段落の細胞。

５４．レプレッサーポリペプチドが、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインのうち一方又は両方において切断活性を欠くＣａｓ９分子を含む、任意の前述の段落の細胞。

５５．レプレッサーポリペプチドが、ｄＣａｓ９分子を含む、任意の前述の段落の細胞。

５６．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドの抑制を増強する異種レプレッサードメインをさらに含むＣａｓ９分子を含む、任意の前述の段落の細胞。

５７．異種レプレッサードメインが、Ｋｏｘ１のＫＲＡＢ（クリュッペル関連ボックス）ドメイン、ＨＰ１αのＣＳ（クロモシャドウ（ｃｈｒｏｍｏｓｈａｄｏｗ））ドメイン、Ｈｅｓ１のＷＰＲＷドメイン及びｍＳｉｎ３相互作用ドメインの４連鎖状コピー（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択される、段落５６の細胞。

５８．Ｃａｓ９分子が、ｇＲＮＡと複合体形成すると、配列特異的様式で標的核酸と結合する、段落５２〜５７のいずれかの細胞。

５９．Ｃａｓ９分子が、ｇＲＮＡと複合体形成すると、非翻訳配列と結合する、段落５２〜５８のいずれかの細胞。

６０．Ｃａｓ９分子：ｇＲＮＡ複合体が、第１の制御エレメントと結合する、段落５２〜５９のいずれかの細胞。

６１．Ｃａｓ９分子：ｇＲＮＡ複合体が、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列と結合する、段落５２〜６０のいずれかの細胞。

６２．細胞が、第３の制御エレメントに作動可能に連結された第ＮのｇＲＮＡをコードする第Ｎの配列をさらに含み、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、任意の前述の段落の細胞。

６３．第３の制御エレメントが、第２の制御エレメントのさらなるコピーである、任意の前述の段落の細胞。

６４．第３の制御エレメントが、第１の制御エレメントのさらなるコピーである、段落１〜６２のいずれかの細胞。

６５．第３の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、第２の条件の存在下で、ｇＲＮＡの発現が調節される、段落１〜６３のいずれかの細胞。

６６．第３の制御エレメントが、以下の特性：
ａ）構成的である、
ｂ）調節される、又は
ｃ）細胞の増殖の第１の段階で第１のレベルの発現及び増殖の第２の段階で第２のレベルの発現を有する
のうち１つを有する、任意の前述の段落の細胞。

６７．第２のレベルの活性が、第１のレベルの活性よりも大きい、任意の前述の段落の細胞。

６８．第１の条件が第１のレベルのストレスであり、第２の条件が、第２のレベルのストレスである、任意の前述の段落の細胞。

６９．第１の条件が、第１のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドであり、第２の条件が、第２のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドである、任意の前述の段落の細胞。

７０．第１の条件が、第１のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチドであり、第２の条件が、第２のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチドである、任意の前述の段落の細胞。

７１．第１の条件が、サイトゾルにおける第１のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドであり、第２の条件が、サイトゾルにおける第２のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドである、任意の前述の段落の細胞。

７２．第１の条件が、小胞体（ＥＲ）における第１のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドであり、第２の条件が、ＥＲにおける第２のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチドである、任意の前述の段落の細胞。

７３．第１の条件／第２の条件対が、
第１のレベルのタンパク質凝集及び第２のレベルのタンパク質凝集、
外因性治療用ポリペプチドでの第１のレベルの第１のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでの第２のレベルの第１のグリコシル化パターン、
外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第１のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第２のグリコシル化パターン、
第１のレベルの細胞生存力及び第２のレベルの細胞生存力、
第１のレベルの熱ショック応答（ＨＳＲ）の活性化及び第２のレベルのＨＳＲの活性化、
第１のレベルのフォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化及び第２のレベルのＵＰＲの活性化、
第１のレベルの遊離ＥＲシャペロン及び第２のレベルの遊離ＥＲシャペロン、
第１の温度及び第２の温度、
第１のレベルの酸化ストレス及び第２のレベルの酸化ストレス、
第１のレベルのＥＲ Ｃａ^＋２及び第２のレベルのＥＲ Ｃａ^＋２、
第１のＥＲ酸化状態及び第２のＥＲ酸化状態、
第１の細胞エネルギーレベル及び第２の細胞エネルギーレベル、
第１のＡＴＰレベル及び第２のＡＴＰレベル、
第１のグルコースレベル及び第２のグルコースレベル、
第１のレベルの活性化されたＨｓｆ１ポリペプチド及び第２のレベルの活性化されたＨｓｆ１ポリペプチド、
第１のレベルのリン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチド及び第２のレベルのリン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチド、
第１のレベルの活性Ｘｂｐ１ポリペプチド及び第２のレベルの活性化されたＸｂｐ１ポリペプチド、
第１のレベルのＡＴＦ４ポリペプチド及び第２のレベルのＡＴＦ４ポリペプチド、
第１のレベルのＮＲＦ２ポリペプチド及び第２のレベルのＮＲＦ２ポリペプチド、並びに
第１のレベルのＡＴＦ６ポリペプチド及び第２のレベルのＡＴＦ６ポリペプチド
からなる群から選択される、任意の前述の段落の細胞。

７４．ストレス応答が、レプレッサーポリペプチドの発現を誘導し、レプレッサーポリペプチドが、治療用ポリペプチドの発現を阻害する、任意の前述の段落の細胞。

７５．第２の条件で、外因性治療用ポリペプチドの発現が、第１の条件での発現と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低減される、任意の前述の段落の細胞。

７６．任意の前述の段落の細胞を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキット。

７７．外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む核酸であって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、核酸。

７８．挿入部位に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む核酸であって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、核酸。

７９．第１の制御エレメント及び外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、第１の核酸及び第２の制御エレメントに含まれ、レプレッサーポリペプチドをコードする配列が、第２の核酸に含まれる、段落７７又は７８の核酸。

８０．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の核酸に配置される段落７９の核酸。

８１．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第２の核酸に配置される、段落７９の核酸。

８２．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第３の核酸に配置される、段落７９の核酸。

８３．第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、同一の核酸に含まれる、段落７７又は７８の核酸。

８４．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列と同一の核酸に配置される、段落８３の核酸。

８５．第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第１の制御エレメント、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列とは別個の核酸に配置される、段落８３の核酸。

８６．１又は複数の核酸が、安定発現に適したベクター内に含まれる、段落７９〜８５のいずれかの核酸。

８７．１又は複数の核酸が、一過性発現に適したベクター内に含まれる段落７９〜８５のいずれかの核酸。

８８．１又は複数の核酸が、同一ベクター内に含まれる、段落８６又は８７の核酸。

８９．各核酸が、異なるベクターに含まれる、段落８６又は８７の核酸。

９０．１又は複数の核酸が、単一染色体内に含まれる段落７９〜８５のいずれかの核酸。

９１．各核酸が、異なる染色体内に含まれる、段落７９〜８５のいずれかの核酸。

９２．第１の核酸が、ベクター内に含まれ、第２の核酸が、染色体内に含まれる、段落７９〜８２のいずれかの核酸。

９３．第１の核酸が、染色体内に含まれ、第２の核酸が、ベクター内に含まれる段落７９〜８２のいずれかの核酸。

９４．第１の核酸が、ベクター内に含まれ、第２の核酸が、染色体内に含まれ、第３の核酸が、ベクター内に含まれる、段落８２の核酸。

９５．第１の核酸が、染色体内に含まれ、第２の核酸が、ベクター内に含まれ、第３の核酸が、ベクター内に含まれる、段落８２の核酸。

９６．第１の核酸が、ベクター内に含まれ、第２の核酸が、染色体内に含まれ、第３の核酸が、染色体内に含まれる、段落８２の核酸。

９７．第１の核酸が、染色体内に含まれ、第２の核酸が、ベクター内に含まれ、第３の核酸が、染色体内に含まれる段落８２の核酸。

９８．段落７７〜９７のいずれかの核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキット。

９９．段落１〜７５のいずれかの細胞を作製する方法であって、
ａ）細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、
ｂ）細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップと、
ｃ）任意選択で、細胞において、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップと
を含み、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節され、
それによって細胞を作製する、方法。

１００．細胞において、第１の核酸配列を形成又は提供するステップが、第１の核酸配列を細胞に導入することを含む、段落９９の方法。

１０１．第１の核酸配列を細胞に導入することが、一過性にトランスフェクトすること、安定にトランスフェクトすること、形質導入すること及び形質転換することから選択される技術を含む、段落１００の方法。

１０２．細胞において、第２の核酸配列を形成又は提供するステップが、第２の核酸配列を細胞に導入することを含む、段落９９〜１０１のいずれかの方法。

１０３．第２の核酸配列を細胞に導入することが、一過性にトランスフェクトすること、安定にトランスフェクトすること、形質導入すること及び形質転換することから選択される技術を含む、段落１０２の方法。

１０４．細胞において、第３の核酸配列を形成又は提供するステップが、第３の核酸配列を細胞に導入することを含む段落９９〜１０２のいずれかの方法。

１０５．第３の核酸配列を細胞に導入することが、一過性にトランスフェクトすること、安定にトランスフェクトすること、形質導入すること及び形質転換することから選択される技術を含む、段落１０４の方法。

１０６．（ａ）、（ｂ）及び任意選択で（ｃ）が、第１、第２及び第３の核酸を細胞に同時に導入することを含む、段落９９の方法。

１０７．（ａ）、（ｂ）及び任意選択で（ｃ）が、逐次生じる、段落９９の方法。

１０８．細胞において、第１の核酸配列を形成又は提供するステップが、細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列を、第１の制御エレメントに作動可能に連結された適した挿入部位に挿入することを含む、段落９９の方法。

１０９．細胞において、第２の核酸配列を形成又は提供するステップが、細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列を、第２の制御エレメントに作動可能に連結された適した挿入部位に挿入することを含む、段落９９の方法。

１１０．細胞において、第３の核酸配列を形成又は提供するステップが、細胞において、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列を、第３の制御エレメントに作動可能に連結された適した挿入部位に挿入することを含む、段落９９の方法。

１１１．治療用ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）段落１〜７５のいずれかの細胞を獲得するステップと、
ｂ）治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップと
を含み、
それによって、治療用ポリペプチドを作製する、方法。

１１２．治療用ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）細胞を獲得するステップと、
ｂ）細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、
ｃ）細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップと、
ｄ）任意選択で、細胞において、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップであって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節されることと、
ｅ）治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップと
それによって、治療用ポリペプチドを作製する、方法。

１１３．段落１〜７５のいずれかの細胞と
培養培地と
を含む反応混合物であって、
培養培地が、治療用ポリペプチドを発現するのに適している、反応混合物。

１１４．外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
任意選択で、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む遺伝制御回路であって、
ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、遺伝制御回路。

１１５．調節が可逆性である、段落１１４の遺伝制御回路。

１１６．ストレス応答が、第２の制御エレメントからのレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する、段落１１４又は１１５の遺伝制御回路。

１１７．レプレッサーポリペプチドが、治療用ポリペプチドの発現を阻害する、段落１１４〜１１６のいずれかの遺伝制御回路。

１１８．第１の制御エレメントが、レプレッサーポリペプチドに対して応答性である、段落１１４〜１１７のいずれかの遺伝制御回路。

１１９．治療用ポリペプチドが、
融合タンパク質、
マルチドメインポリペプチド、
二重特異性抗体分子、
多重特異性抗体分子、
多重特異性分子、及び
リガンド及び抗体分子を含む分子
を含む、段落１１４〜１１８のいずれかの遺伝制御回路。

１２０．治療用ポリペプチドが、表１〜４から選択される、段落１１４〜１１９のいずれかの遺伝制御回路。

１２１．第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、表５又は表６から選択される、段落１１４〜１２０のいずれかの遺伝制御回路。

１２２．第３の制御エレメントが、表６から選択され、第２の制御エレメントが表５から選択される、段落１１４〜１２０のいずれかの遺伝制御回路。

１２３．第３の制御エレメントが、表５から選択され、第２の制御エレメントが、表６から選択される、段落１１４〜１２０のいずれかの遺伝制御回路。

１２４．第２の制御エレメントが、第２のプロモーターエレメントを含み、第２のプロモーターエレメントが構成的であり、第３の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第３のプロモーターエレメントを含む、段落１１４〜１２０のいずれかの遺伝制御回路。

１２５．第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第２のプロモーターエレメントを含み、第３の制御エレメントが、第３のプロモーターエレメントを含み、第３のプロモーターエレメントが構成的である、段落１１４〜１２０のいずれかの遺伝制御回路。

１２６．第３の制御エレメントが、第１の制御エレメントのコピーである、段落１１４〜１２１のいずれかの遺伝制御回路。

１２７．第３の制御エレメントが、第２の制御エレメントのコピーである、段落１１４〜１２１のいずれかの遺伝制御回路。

１２８．レプレッサーポリペプチドが、外因性治療用ポリペプチドの活性、レベル又は発現の低減をもたらす、段落１１４〜１２７のいずれかの遺伝制御回路。

１２９．表１〜４から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表５から選択される第１の制御エレメントと、
Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表６から選択される第２の制御エレメントと、
構成的に発現される１又は複数のｇＲＮＡ配列と
を含む細胞であって、
第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、細胞。

１３０．表１〜４から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表５から選択される第１の制御エレメントと、
Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された表５から選択される第２の制御エレメントと、
表６から選択され、１又は複数のｇＲＮＡ配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
を含む細胞であって、
第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で調節される、細胞。

１３１．１又は複数の細胞が、第１の条件を含み、１又は複数の細胞が、第２の条件を含む、段落１〜７５、１２９又は１３０のいずれか１つの複数の細胞。

１３２．第１の制御エレメントが、遺伝子操作されたプロモーターである、段落１〜３０、３２〜７５、７７〜９７、９９〜１１２及び１１４〜１２８のいずれかの細胞、方法、核酸又は遺伝制御回路。

１３３．第３の制御エレメントが、遺伝子操作されたプロモーターである、段落１〜６２、６５〜７５、７７〜９７、９９〜１１２、１１４〜１２１、１２４〜１２６及び１２８のいずれかの細胞、方法、核酸又は遺伝制御回路。

例示
実施例１
以下の実施例では、図１Ａ及び１Ｂに表される遺伝制御回路の設計原理が利用される。この実施例では、組換えタンパク質遺伝子（すなわち、ＧＦＰ）の発現を抑制するためにレプレッサー（すなわち、ｄＣａｓ９）を使用する原理を、図３Ａに表される回路を使用して試験した。ここで、第１の制御エレメント、例えば、第１のプロモーターエレメント、ｈＣＭＶに作動可能に連結された、組換えポリペプチド遺伝子、ＧＦＰを安定に発現するＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞株を、１）構成的ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された、レプレッサーポリペプチド、ｄＣａｓ９をコードする発現ベクターのみ又は２）レプレッサーポリペプチド（ｄＣａｓ９）をコードする発現ベクター及び各々別個のＵ６プロモーターから制御されるｇＲＮＡ１、２及び３を発現するベクター（図３Ａ）のいずれかを用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって決定し、ｄＣａｓ９＋ｇＲＮＡ１〜３を用いるトランスフェクションが、ｄＣａｓ９のみを用いてトランスフェクトされた細胞又はトランスフェクトされていない対照細胞（ＵＴＣ）と比較して、集団ＧＦＰ蛍光の減少をもたらしたことが観察された（図３Ｂ）。これは、レプレッサーポリペプチド、ｄＣａｓ９及びｇＲＮＡを使用する組換えポリペプチド（ＧＦＰ）発現の抑制を実証する。

実施例２
この実施例では、組換えモノクローナル抗体重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）遺伝子の発現を抑制するためにレプレッサー（すなわち、ｄＣａｓ９）を使用する原理を、図４Ａに表される回路を使用して試験した。この実施例において、本発明者らは、構成的ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたレプレッサーポリペプチドによる、第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメント、ｈＣＭＶに作動可能に連結された治療用ポリペプチド、ＩｇＧ４ Ｍａｂ ｃＢ７２．３の発現の阻害を実証する。各々別個のｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるＩｇＧ４ Ｍａｂ ｃＢ７２．３ ＨＣ及びＬＣ遺伝子を安定に発現するＣＨＯ細胞株プールを使用して、ｄＣａｓ９及びｈＣＭＶプロモーターをターゲッティングするｇＲＮＡ１〜３を使用してＭａｂ発現を下方制御する能力を試験した。プールを、ｄＣａｓ９プラスミドのみ（ｄＣａｓ９）又はｄＣａｓ９プラスミド＋／−ｇＲＮＡをコードするプラスミド（ｄＣａｓ９＋ｇ１〜ｇ３、図４Ｂを参照のこと）のいずれかを用いて一過性にトランスフェクトし、ｓトランスフェクションの３、４及び５日後にＭａｂ濃度を調べた（図４Ｂ）。エラーバーは、三連のトランスフェクションにわたる標準偏差を表す。細胞をまた、陰性対照（ＤＮＡなし）としてバッファーのみを用いてトランスフェクトした。これは、ｄＣａｓ９及びｇＲＮＡを使用するＭａｂ発現の抑制を実証する。

実施例３
この実施例では、図５Ａに表される遺伝制御回路を使用する組換えポリペプチド、ＧＦＰの発現の阻害を実証した。第１の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメント、ｈＣＭＶに作動可能に連結された、ＧＦＰを安定に発現するＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞を、プラスミドのセット；第２の制御エレメント、例えば、プロモーターエレメント、Ｇｒｐ７８プロモーターに作動可能に連結されたレプレッサーポリペプチドをコードする配列、ｄＣａｓ９を含有するプラスミド及び各々別個のＵ６プロモーターの制御下にｇＲＮＡ１〜３の発現をコードするプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。Ｇｒｐ７８プロモーターは、フォールディングされていないタンパク質応答によって活性化され、この場合には、トランスフェクションの２４時間後にツニカマイシン（ＴＭ）の添加によって人為的に活性化した。一過性トランスフェクションの４日後、ＧＦＰアウトプットをフローサイトメトリーによって測定した。ｄＣａｓ９及びｇＲＮＡプラスミド１〜３の両方を用いてトランスフェクトされた細胞において、４００ｎｇ／ｍＬツニカマイシン（ＴＭ）処置（Ｇｒｐ７８ ｄＣａｓ９＋ｇＲＮＡ）後に、同様にトランスフェクトされたが、ツニカマイシンを用いて処置されていない細胞（０ ＴＭ）又はｄＣａｓ９によってトランスフェクトされただけの細胞（Ｇｒｐ７８ ｄＣａｓ９対照）と比較して、ＧＦＰアウトプットが抑制されたことを見ることができる（図５）。

実施例４
この実施例では、図２に表される遺伝制御回路の、発現することが困難であるタンパク質を含む、いくつかの組換えタンパク質の生成を増大する能力が実証される。図６Ａに表されるベクターを使用して、遺伝制御回路を安定に発現するＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞を構築した。このベクターは、Ｇｒｐ７８プロモーター下にｄＣａｓ９遺伝子及び各々別個の構成的Ｕ６プロモーター下にｈＣＭＶプロモーターに対して特異性を有する３種のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１、２及び３）を含有していた。このベクターのバリアントは、ｇＲＮＡ１、２及び３配列の代わりに単一ｇＲＮＡ１４配列を含有しており、バリアントベクターを使用して同様に遺伝制御回路を安定に発現するＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞を構築した。遺伝制御回路ベクターはまた、ＳＶ４０プロモーター下にピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（「ピューロマイシン」））を含有して、抗生物質ピューロマイシンを用いる処置によるトランスフェクション後に遺伝制御回路を安定に組み込んだ細胞の陽性選択を可能にした。次いで、単一ｇＲＮＡ１４配列又はｇＲＮＡ１、２及び３のいずれかとともに遺伝制御回路を発現する安定なＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））プールを、いくつかの発現することが困難である組換えタンパク質：Ｈ１Ｋ１及びＨ９Ｋ７（両方とも高度に凝集するＭａｂ）、エタネルセプト（複合Ｆｃ融合タンパク質）及びブリナツモマブ（複合二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）並びにＩｇＧ４ Ｍａｂ ｃＢ７２．３をコードする発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした。Ｏｃｔｅｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒを使用して決定されるような、トランスフェクションの６日後に生成した組換えタンパク質濃度は、図６Ｂに示されている。結果は、組換えタンパク質バーＨ９Ｋ７のすべてについて、少なくとも１つの遺伝制御回路が、制御回路を欠く親のＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞株と比較して、平均組換えタンパク質濃度の増大を伴ったことを示す。これは、遺伝制御回路が、複雑な、発現することが困難である分子を含むいくつかのタンパク質について生産性を増大し得ることを示唆する。遺伝制御回路の、組換えタンパク質の発現を増大する能力をさらに調査するために、回路を安定に発現し、Ｈ９Ｋ７をコードするベクターを用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、トランスフェクションの２４時間後のツニカマイシン（ＴＭ）（０．１μｇ／ｍＬ）の添加によるＵＰＲの増大に付した（図６Ｃ）。遺伝制御回路を含有する細胞は、ＴＭが添加された場合にはトランスフェクションの６日後にＨ９Ｋ７の平均濃度の増大をもたらしたが、制御回路を欠く親のＣＨＯ宿主細胞株は、効果を示さなかった。これは、遺伝制御回路が、活性化されたＵＰＲの存在下で外因性の発現することが困難であるタンパク質の発現及び収量を増大し得ることを示す。遺伝制御回路の効果は、ＵＰＲと関連しているということも示す。

上記のトランスフェクションのセットでは、細胞培養上清におけるタンパク質凝集のレベルも、ＯＤＡアッセイによって調べた（Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａら ＭＡｂｓ．２０１５年；７巻（２号）：３５２〜６３頁）（図７Ａ及び７Ｂ）。このアッセイでは、ｃＢ７２．３は、低レベルの凝集を示すと知られているが、Ｈ１Ｋ１、Ｈ９Ｋ７及びエタネルセプトは、親の細胞株ＣＨＯＫ１ＳＶ由来ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））では高度に凝集してり、したがって、４５０ｎｍで高い吸光度値を示すと知られている（図７Ａ）。制御回路は、Ｈ９Ｋ７及びエタネルセプトの凝集の低減に関して実質的な利益を示すと全く予測されなかったが、これは、これらが、高度〜重度の凝集を示すと知られており、したがって、このパラメータの回路の制御のダイナミックレンジを超え得るからである。しかし、Ｈ１Ｋ１は、比較によって、依然として高いがわずかに低いレベルの凝集を示すと知られており、改善（すなわち、凝集の低減）を受け入れる可能性がある。実際、このアッセイでは、制御回路の両バリアントは、親の宿主細胞株と比較して全体的な生成物濃度の増大にもかかわらず、平均Ｈ１Ｋ１凝集の低減を伴った（図６Ｂ及び７Ａを比較のこと）。ツニカマイシンの存在下では、制御回路を使用して、ｇＲＮＡ１４及びｇＲＮＡ１２３バリアントについて全体的な生成物濃度の増大にもかかわらず、Ｈ９Ｋ７の凝集の改善（すなわち、低減）は観察されず（図６Ｃを７Ｂと比較のこと）、これはやはり、Ｈ９Ｋ７抗体の凝集挙動は、制御回路の影響のダイナミックレンジを超えるということを示唆する。

上記のトランスフェクションのセットでは、Ｎ−グリカンミクロ／マクロ不均一性などのその他の重要な生成物品質（ＰＱ）性状を測定することが可能であり得（例えば、ＵＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳによる）、制御回路を含有する細胞におけるＰＱの改善が期待される。

〔関連出願〕
本出願は、全文が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／５２１，００５号の優先権を主張する。

Claims (41)

1. 外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
   レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
   任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
   を含む細胞であって、
   ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
   ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
   治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で、例えば、可逆性に調節される、細胞。
2. 挿入部位に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
   レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
   任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
   を含む細胞であって、
   ｉ）第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
   ｉｉ）第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
   挿入部位は、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、
   治療用ポリペプチドの発現は、第２の条件の存在下で、例えば、可逆性に調節される、細胞。
3. 前記第２、第３、又は第２及び第３の制御エレメントが、第Ｎの条件下で第Ｎのレベルの活性を有し、Ｎが、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、前記治療用ポリペプチドの発現が、第Ｎの条件の存在下で、これまでの条件下での治療用ポリペプチドの発現に対して調節される、請求項１又は２に記載の細胞。
4. （ａ）前記第１の制御エレメント及び外因性治療用ポリペプチドをコードする配列が、第１の核酸に配置され、前記第２の制御エレメント及びレプレッサーポリペプチドをコードする配列が、第２の核酸に配置され、
   （ｉ）前記第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、前記第１の核酸に配置されるか、
   （ｉｉ）前記第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、前記第２の核酸に配置されるか、又は
   （ｉｉｉ）前記第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、第３の核酸に配置され；又は
   （ｂ）前記第１の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第２の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列が、同一の核酸に配置され、
   （ｉ）前記第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、前記第１の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第２の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列と同一の核酸に配置されるか、又は
   （ｉｉ）前記第３の制御エレメント及び１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列が、前記第１の制御エレメント、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列、前記第２の制御エレメント及び前記レプレッサーポリペプチドをコードする配列とは別個の核酸に配置される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
5. １又は複数の核酸が、
   （ａ）安定な発現に適したベクター、例えば、プラスミド、又は
   （ｂ）一過性の発現に適したベクター
   内に含まれる、請求項４に記載の細胞。
6. （ａ）１又は複数の核酸が、同一ベクター内に含まれるか、
   （ｂ）各核酸が、異なるベクターに含まれるか、
   （ｃ）１又は複数の核酸が、単一染色体内に含まれるか、又は
   （ｄ）各核酸が異なる染色体内に含まれる、請求項５に記載の細胞。
7. （ａ）前記第１の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第２の核酸が、染色体内に含まれるか、
   （ｂ）前記第１の核酸が、染色体内に含まれ、前記第２の核酸が、ベクター内に含まれるか、
   （ｃ）前記第１の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第２の核酸が、染色体内に含まれ、前記第３の核酸が、ベクター内に含まれるか、
   （ｄ）前記第１の核酸が、染色体内に含まれ、前記第２の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第３の核酸が、ベクター内に含まれるか、
   （ｅ）前記第１の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第２の核酸が、染色体内に含まれ、前記第３の核酸が、染色体内に含まれるか、又は
   （ｆ）前記第１の核酸が、染色体内に含まれ、前記第２の核酸が、ベクター内に含まれ、前記第３の核酸が、染色体内に含まれる、請求項４に記載の細胞。
8. ストレス応答が、前記第２の制御エレメント又は前記第３の制御エレメントからのレプレッサーポリペプチドの発現を誘導する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
9. 前記レプレッサーポリペプチドが、前記治療用ポリペプチドの発現を阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
10. 前記第１の制御エレメントが、前記レプレッサーポリペプチドに対して応答性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
11. 前記第１の制御エレメントが、第１のプロモーターエレメントを含み、前記第１のプロモーターエレメントが、レプレッサーポリペプチドの不在下で、以下の特性：
    ａ）構成的である、
    ｂ）調節される、又は
    ｃ）細胞の増殖の第１の段階で第１のレベルの発現及び増殖の第２の段階で第２のレベルの発現を有する
    のうち１つを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
12. 前記第１のプロモーターエレメントが、表５から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
13. 前記治療用ポリペプチドが、
    融合タンパク質、
    マルチドメインポリペプチド、
    二重特異性抗体分子、
    多重特異性抗体分子、
    多重特異性分子及び／又は
    リガンド及び抗体分子を含む分子
    を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
14. 前記治療用ポリペプチドが、表１〜４から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
15. 前記第２の制御エレメント又は前記第３の制御エレメントが、表５若しくは表６から選択されるか、又は表５若しくは表６から選択される配列と比較して０、１、２若しくは３つの塩基置換を有する配列を含むプロモーターを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
16. （ａ）前記第２の制御エレメントが、第２のプロモーターエレメントを含み、前記第２のプロモーターエレメントが、構成的であり、前記第３の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第３のプロモーターエレメントを含むか、又は
    （ｂ）前記第２の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有する第２のプロモーターエレメントを含み、前記第３の制御エレメントが、第３のプロモーターエレメントを含み、前記第３のプロモーターエレメントが構成的である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
17. （ａ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、１つ又は複数の熱ショックエレメント（ＨＳＥ）、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、抗酸化薬応答エレメント（ＡＲＥ）又は小胞体応答エレメント（ＥＲＳＥ）を含むか、
    （ｂ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、熱ショック応答又はフォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）のエレメントによって調節されるか、
    （ｃ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積によって調節されるか、
    （ｄ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、Ｘｂｐ１応答プロモーターエレメントを含むか、
    （ｅ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、Ｇｒｐ７８プロモーターエレメントを含むか、又は
    （ｆ）前記第２の制御エレメント又は第３の制御エレメントが、ＡＴＦ６応答プロモーターエレメント、ＡＴＦ４応答プロモーターエレメント、ＮＲＦ２応答プロモーターエレメント又はＨｓｆ１応答プロモーターエレメントを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
18. 前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの活性、レベル又は発現の低減をもたらす、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
19. 前記レプレッサーポリペプチドが、標的核酸配列、例えば、制御エレメント、例えば、プロモーターと特異的に結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
20. （ａ）前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの転写の低減をもたらすか、
    （ｂ）前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドの翻訳を低減するか、
    （ｃ）前記レプレッサーポリペプチドが、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸と、又は前記外因性治療用ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている前記第１のプロモーターと結合するか、
    （ｄ）（ａ）及び（ｂ）、
    （ｅ）（ａ）及び（ｃ）、
    （ｆ）（ｂ）及び（ｃ）又は
    （ｇ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
21. 前記レプレッサーポリペプチドが、
    （ａ）Ｃａｓ９分子、
    （ｂ）天然に存在するＣａｓ９と比較して、修飾された切断活性を有するＣａｓ９分子、
    （ｃ）ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインのうち一方又は両方において切断活性を欠くＣａｓ９分子、
    （ｄ）ｄＣａｓ９分子、又は
    （ｅ）前記外因性治療用ポリペプチドの抑制を増強する異種レプレッサードメインをさらに含むＣａｓ９分子を含み、任意選択で、異種レプレッサードメインが、Ｋｏｘ１のＫＲＡＢ（クリュッペル関連ボックス）ドメイン、ＨＰ１αのＣＳ（クロモシャドウ（ｃｈｒｏｍｏｓｈａｄｏｗ））ドメイン、Ｈｅｓ１のＷＰＲＷドメイン及びｍＳｉｎ３相互作用ドメインの４連鎖状コピー（ＳＩＤ４Ｘ）からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
22. 前記Ｃａｓ９分子が、ｇＲＮＡと複合体形成すると、配列特異的様式で標的核酸：
    （ａ）非翻訳配列、
    （ｂ）第１の制御エレメント又は
    （ｃ）外因性治療用ポリペプチドをコードする配列
    と結合する、請求項２１に記載の細胞。
23. 前記細胞が、第３の制御エレメントに作動可能に連結された第ＮのｇＲＮＡをコードする第Ｎの配列をさらに含み、Ｎが２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
24. 前記第３の制御エレメントが、前記第２の制御エレメント又は前記第１の制御エレメントのさらなるコピーである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
25. 前記第３の制御エレメントが、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、ｇＲＮＡの発現が、第２の条件の存在下で調節される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
26. 前記第３の制御エレメントが、以下の特性：
    ａ）構成的である、
    ｂ）調節される、又は
    ｃ）細胞の増殖の第１の段階で第１のレベルの発現及び増殖の第２の段階で第２のレベルの発現を有する
    のうち１つを有する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
27. 前記第２のレベルの活性が、前記第１のレベルの活性よりも大きい、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
28. 前記第１の条件／第２の条件対が、
    第１のレベルのストレス及び第２のレベルのストレス、
    第１のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチド（例えば、サイトゾルにおける、又は小胞体（ＥＲ）における）及び第２のレベルのフォールディングされていない又はミスフォールディングされたポリペプチド（例えば、サイトゾルにおける、又は小胞体（ＥＲ）における）、
    第１のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチド及び第２のレベルのフォールディングされた外因性治療用ポリペプチド、
    第１のレベルのタンパク質凝集及び第２のレベルのタンパク質凝集、
    外因性治療用ポリペプチドでの第１のレベルの第１のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでの第２のレベルの第１のグリコシル化パターン、
    外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第１のグリコシル化パターン及び外因性治療用ポリペプチドでのあるレベルの第２のグリコシル化パターン、
    第１のレベルの細胞生存力及び第２のレベルの細胞生存力、
    第１のレベルの熱ショック応答（ＨＳＲ）の活性化及び第２のレベルのＨＳＲの活性化、
    第１のレベルのフォールディングされていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化及び第２のレベルのＵＰＲの活性化、
    第１のレベルの遊離ＥＲシャペロン及び第２のレベルの遊離ＥＲシャペロン、
    第１の温度及び第２の温度、
    第１のレベルの酸化ストレス及び第２のレベルの酸化ストレス、
    第１のレベルのＥＲ Ｃａ^＋２及び第２のレベルのＥＲ Ｃａ^＋２、
    第１のＥＲ酸化状態及び第２のＥＲ酸化状態、
    第１の細胞エネルギーレベル及び第２の細胞エネルギーレベル、
    第１のＡＴＰレベル及び第２のＡＴＰレベル
    第１のグルコースレベル及び第２のグルコースレベル、
    第１のレベルの活性化されたＨｓｆ１ポリペプチド及び第２のレベルの活性化されたＨｓｆ１ポリペプチド、
    第１のレベルのリン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチド及び第２のレベルのリン酸化された三量体Ｈｓｆ１ポリペプチド、
    第１のレベルの活性Ｘｂｐ１ポリペプチド及び第２のレベルの活性化されたＸｂｐ１ポリペプチド、
    第１のレベルのＡＴＦ４ポリペプチド及び第２のレベルのＡＴＦ４ポリペプチド、
    第１のレベルのＮＲＦ２ポリペプチド及び第２のレベルのＮＲＦ２ポリペプチド、並びに
    第１のレベルのＡＴＦ６ポリペプチド及び第２のレベルのＡＴＦ６ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
29. ストレス応答が、レプレッサーポリペプチドの発現を誘導し、前記レプレッサーポリペプチドが、前記治療用ポリペプチドの発現を阻害する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
30. 前記第２の条件で、前記外因性治療用ポリペプチドの発現が、前記第１の条件での発現と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％低減される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
31. 外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
    レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
    任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
    を含む核酸であって、
    ｉ）前記第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
    ｉｉ）前記第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
    前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節される、核酸。
32. 挿入部位に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
    レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
    任意選択で、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
    を含む核酸であって、
    ｉ）前記第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
    ｉｉ）前記第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
    前記挿入部位は、前記外因性治療用ポリペプチドをコードする配列の挿入に適しており、
    前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節される、核酸。
33. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞又は請求項３１若しくは３２に記載の核酸を含む治療用ポリペプチドの発現のためのキット。
34. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法であって、
    ａ）細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、
    ｂ）細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップと、
    ｃ）任意選択で、細胞において、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップと
    を含み、
    ｉ）前記第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
    ｉｉ）前記第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
    前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節され、
    それによって細胞を作製する、方法。
35. 治療用ポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞を獲得するステップと、
    ｂ）前記治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップと
    を含み、
    それによって前記治療用ポリペプチドを作製する、方法。
36. 治療用ポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）細胞を獲得するステップと、
    ｂ）細胞において、外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントをコードする第１の核酸配列を形成又は提供するステップと、
    ｃ）細胞において、レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントをコードする第２の核酸を形成又は提供するステップと、
    ｄ）任意選択で、細胞において、１又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多い）ｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントをコードする第３の核酸を形成又は提供するステップと
    を含む方法であって、
    ｉ）前記第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
    ｉｉ）前記第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
    前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節されるステップと、
    ｅ）前記治療用ポリペプチドの作製を可能にする条件下で細胞を培養するステップと
    を含み、
    それによって、治療用ポリペプチドを作製する、方法。
37. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の細胞と
    培養培地と
    を含む反応混合物であって、
    前記培養培地が、前記治療用ポリペプチドを発現するのに適している、反応混合物。
38. 外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第１の制御エレメントと、
    レプレッサーポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された第２の制御エレメントと、
    任意選択で、１又は複数のｇＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結された第３の制御エレメントと
    を含む遺伝制御回路であって、
    ｉ）前記第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有するか、又は
    ｉｉ）前記第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、
    前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節される、遺伝制御回路。
39. 表１〜４から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表５から選択される第１の制御エレメントと、
    Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表６から選択される第２の制御エレメントと
    構成的に発現される１又は複数のｇＲＮＡ配列と
    を含む細胞であって、
    第２の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節される、細胞。
40. 表１〜４から選択される外因性治療用ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表５から選択される第１の制御エレメントと、
    Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、表５から選択される第２の制御エレメントと
    １又は複数のｇＲＮＡ配列に作動可能に連結された、表６から選択される第３の制御エレメントと
    を含む細胞であって、
    第３の制御エレメントは、第１の条件下で第１のレベルの活性及び第２の条件下で第２のレベルの活性を有し、前記治療用ポリペプチドの発現は、前記第２の条件の存在下で調節される、細胞。
41. １又は複数の細胞が、第１の条件を含み、１又は複数の細胞が、第２の条件を含む、請求項１〜３０、３９及び４０のいずれか一項に記載の複数の細胞。

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