KR20190038896A - 숙주 세포 단백질의 프로테오믹 분석 - Google Patents

숙주 세포 단백질의 프로테오믹 분석 Download PDF

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Abstract

산물, 예를 들어, 재조합 단백질, 예를 들어, 항체의 생산 동안 숙주 세포 단백질을 검출 및/또는 정량화하는데 유용한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다.

Description

숙주 세포 단백질의 프로테오믹 분석
관련 출원
본 출원은 2016년 8월 12일에 출원된 미국 일련 번호 62/374,489를 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 산물, 예를 들어, 재조합 단백질, 예를 들어, 항체의 생산 동안 숙주 세포 단백질 불순물을 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다.
숙주 세포 단백질 (HCP)은 다양한 제작 공정 후에 최종 산물 내에 존재할 수 있는 숙주 단백질들의 원치 않는 복합적인 혼합물이다. 특히, 이러한 HCP들은 산물 효능 및 환자 안전성에 위험을 일으킬 수 있다.
이전에는, ELISA-기반 방법 및/또는 프로테오믹스 분야에서의 발전을 사용하여 HCP 불순물 테스트가 달성되었다. 프로테오믹스를 이용하는 HCP 불순물 테스트는 2차원 크로마토그래피 분리를 기초로 하였다. 이러한 접근법은 강력하지만, 일상적인 공정 개발 도구로서 사용되기에는 충분한 처리량이 결여된다. 이같은 도구의 결여는 프로테오믹 HCP 사정이 종종 반응성이고, 개발 결정이 기초로 할 수 있는 정보의 출처로서보다는 공정 개발 후의 산물의 분석에 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 간단하고 신속한 고처리량 방식으로 생물제약 제품 내의 HCP를 검출 및 정량화하는 방법이 요구된다.
본 발명은, 부분적으로, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 공정 또는 방법에 의해 생산된 단백질, 예를 들어, 단백질들, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편을 포함하는 샘플, 예를 들어, 복수의 샘플을 신속하게 분석하여, 단백질이 최종 제형 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드에서 오염물로서 야기하는 위험을 사정하는 방법의 개발에 관한 것이다. 예를 들어, 제작 공정 또는 방법에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드의 샘플을 임의의 단백질, 예를 들어, 단백질들, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편이 오염물로서 야기할 수 있는 위험을 신속하게 사정하기 위해 본원에 기재된 방법에 의해 분석할 수 있다. 이같은 예시적인 방법에서, 제작 공정 또는 방법과 연관된 오염물의 위험을 비교를 허용하는 방식으로, 다수의 단백질의 위험을 사정하도록 다수의 샘플이 신속하게, 그리고 정확하게 사정될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 제작 공정 또는 방법을 평가하고, 구별하며, 이들 사이에서 선택하는데 유용할 수 있다. 추가로 본 발명의 방법은 단백질과 연관된 위험의 사정을 기초로 하여 샘플을 평가하고, 구별하며, 이들 사이에서 선택하는데, 뿐만 아니라 제작 공정 또는 방법을 모니터링하여 단백질 및 연관된 오염물 위험에 대한 진행 중인 개발을 결정하는데 유용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 샘플을 신속하게 분석하여, 예를 들어, 단백질의 위험 (예를 들어, 제제, 예를 들어, 대상체에게 투여될 제제, 예를 들어, 제약 제제 내에 오염물로서 존재하는 경우에 단백질이 제시하는 위험)의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정을 통해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인)을 포함하는 샘플; 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플을 신속하게 분석하여 단백질의 위험의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 제1 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정을 통해 생산된, 단백질 (예를 들어, HCP) 및 임의적으로 치료용 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드)을 포함하는 샘플; 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물;
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소, 또는 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어,재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물);
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인을 제작하는 방법을 평가하여, 위험 (예를 들어, 산물의 제제 내에 산물 이외의 단백질을 포함하는 것에 의해 제시되는 위험)의 사정을 제공하는 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 제작 방법을 통해 생산된, 하나 이상의 단백질 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드; 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
임의적으로, (d)를 복수의 단백질, 예를 들어, 단백질 소화 산물에 의해 식별된 모든 단백질에 대해 반복하고;
e) 제작 방법에 공정 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법을 평가하여, 위험 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인을 제작하는 방법을 평가하여, 위험 (예를 들어, 산물의 제제 내에 산물 이외의 단백질을 포함하는 것에 의해 제시되는 위험)의 사정을 제공하는 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고"
i) 제작 방법을 통해 생산된, 하나 이상의 단백질 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드; 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물);
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
임의적으로, (d)를 복수의 단백질, 예를 들어, 단백질 소화 산물에 의해 식별된 모든 단백질에 대해 반복하고;
e) 제작 방법에 공정 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법을 평가하여, 위험 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 산물을 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함하며, 샘플이 본원에 기재된 샘플 분석 방법에 의해 분석되는, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HCP 또는 단백질 소화 산물에 대한 식별 특성 및 세포 배양물 (예를 들어, CHO, 예를 들어, GS-CHO 세포 배양물)의 세포 배양 상청액으로부터 유래된 단백질 위험 점수의 라이브러리를 포함하는 (예를 들어, 컴퓨터 판독가능 매체 상에 메모리화 또는 기록된) 데이터베이스를 제공한다.
본 발명의 장점 중 하나는 본원에 개시된 방법이 게놈이 공지되어 있는 임의의 생산 시스템, 또는 이러한 생산 시스템의 특정한 변이체 (예를 들어, 특히, CHO의 서브세트로서의 GS CHO)에 대해 간단하고 신속한 위험 사정, 예를 들어, 면역원성, 해리, 산물 안정성 사정이 수행되게 허용한다는 것이다. 위험, 예를 들어, 면역원성 사정이 (예를 들어, 지리학적 지역 또는 민족성에 의해) 상이한 환자 집단들에 대해 수행될 수 있다. 이는 전체 집단에 대한 단백질 오염물, 예를 들어, HCP에 대한 전반적인 평균 점수가 단일한 특히 감수성인 군에 대한 높은 점수를 차폐할 수 있기 때문에 중요하다. 위험, 예를 들어, 면역원성 계산은 개발 공정에 완전히 통합된다.
도 1은 본 발명에 따른 분석 공정의 최상위 개관이다.
도 2는 pDADMAC-매개 HCP 제거가 단백질 pI와 상관되었는지를 결정하기 위해 정량화된 각각의 단백질에 대한 pI 값을 제시하는 그래프식 표현이다.
도 3은 단백질 SET에 대한 LC-MS 프로파일이다.
도 4는 상이한 정제 조건 하에 가공된 상이한 산물 및 세포주에 대한 전반적인 산물 분해 위험 점수의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 5는 상이한 정제 조건 하에 가공된 상이한 산물 및 세포주에 대한 포스포리파제 B 존재비의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 6은 상이한 정제 조건 하에 가공된 상이한 산물 및 세포주에 대한 카텝신 D 존재비의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 7은 상이한 정제 조건 하에 가공된 상이한 산물 및 세포주에 대한 전반적인 면역원성 위험 점수의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 8은 대안적인 단백질 제거 방법들로 처리된 배양 상청액에서의 총 HCP 존재비의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 9는 대안적인 단백질 제거 방법들로 처리된 배양 상청액에서의 산물 해리 위험 점수의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 10은 대안적인 단백질 제거 방법들로 처리된 배양 상청액에서의 산물 분해 위험 점수의 비교를 제시한다.
도 11은 총 HCP 수준에 비교된, 대안적인 단백질 제거 방법들로 처리된 배양 상청액에서의 예시적인 특정한 HCP 존재비의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 12는 메탄올 해독 경로 및 pAOX 유도에서의 단백질 발현의 변화를 나타내는 개략도이다.
재조합 생물제약 단백질이 인간 환자에게 투여하는 것에 대해 허용될 수 있기 위해, 제조 및 정제 공정으로부터 초래되는 잔류 오염물이 최종 생물학적 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드로부터 제거되는 것이 중요하다. 이러한 공정 오염물은 배양 배지 단백질, 면역글로불린 친화성 리간드, 바이러스, 내독소, DNA, 및 단백질, 예를 들어, 숙주 세포 단백질 (HCP)을 포함한다. 오염물 단백질, 예를 들어, HCP는 면역 반응, 아주반트 활성, 직접적인 생물학적 활성 또는 산물 상호작용/분해를 포함하는 산물의 안전성 프로파일에 영향을 미칠 수 있는 광범위한 바람직하지 않은 효과를 생성시킬 수 있다. 이러한 숙주 세포 오염물은 공정-특이적 단백질, 예를 들어, HCP를 포함하고, 이는 재조합 DNA 기술로부터 유래된 생물제제 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드) 내의 공정-관련 불순물/오염물이다.
미국 및 외국 규정은 종종 이같은 오염물의 제거를 요구한다. 예를 들어, 미국 식품의약청(Food and Drug Administration) (FDA)은 생체내 인간 용도로 의도되는 생물약제에 외래 면역글로불린 및 비-면역글로불린 불순물이 가능한 한 없어야 하는 것을 요구하고, 잠재적인 불순물, 예컨대 단백질, 예를 들어, HCP의 검출 및 정량화를 위한 테스트를 요구한다. 또한, 국제 조화 협의회(International Conference on Harmonization) (ICH)는 생물공학적/생물학적 산물용 테스트 절차 및 허용 기준에 대한 지침을 제공한다.
미량 수준으로 존재하는 불순물 단백질의 검출 및 정량화에서의 분석적 난제를 주로 기초로 하여, 생물치료법에서의 오염물 단백질, 예를 들어, HCP의 측정은 역사적으로 ELISA 방법론을 사용하여 총체적으로 수행되었고, 결과는 단백질, 예를 들어, 정체 및 집단 내에서의 상대 수준에 대한 정보 없이 HCP의 총 평량으로서 보고되었다. 오염물 단백질, 예를 들어, HCP의 ELISA는 널-형질감염 세포주로부터의 총 단백질 및 단백질 분획의 조합을 기초로 하여 개발되고, 분석물 내의 오염물 단백질, 예를 들어, HCP의 로드가 조성이 아니라 존재비 면에서만 다르다는 고유의 가정 하에 수행된다.
현재의 프로테오믹스 기반 방법은 제작 및 공정 개발, 산물 모니터링, 및 분석을 위한 일상적인 도구로서 사용되기에는 처리량이 충분하지 않기 때문에 적용 면에서 제한된다. 규제 당국은 위험 사정이 각각의 오염 단백질과 연관되는 것을 요구하고, 기존의 프로테오믹스 기반 방법은 이를 신속하고 확장가능한 방식으로 다루지 않았다. 이같은 신속한 고-처리량 도구의 결여는 프로테오믹 단백질, 예를 들어, HCP의 오염물 사정이 종종 반응성이고, 개발 결정이 기초로 할 수 있는 일상적인 도구로서보다는 공정 개발에서의 소수의 샘플의 분석에 제한된다는 것을 의미한다.
생물약제 제조업자가 직면하는 특정 문제는 각각의 단백질, 예를 들어, HCP가 유사한 총 존재비에서 상이한 단백질들, 예를 들어, HCP의 집단에 대한 고도로 가변적인 위험 프로파일을 초래하는 특이적인 개별 활성을 갖는다는 것이다. 특히, 단백질 치료제에 직접적으로 결합하는 것에 의해 정제를 통해 단백질, 예를 들어, HCP가 "피기백"될 수 있는 것으로 공지되어 있는 바와 같이, 불순물로서 존재하는 단백질, 예를 들어, HCP의 혼합물은 산물들 사이에서 실질적으로 다를 수 있다. 이는 산물 및 계면활성제 분해, 아주반트 활성, 및 치료제가 투여되는 경우의 유해 면역 반응을 포함하여 다수의 쟁점을 초래할 수 있다.
본 발명은 일상적인 공정 개발을 지지하는 충분한 처리량으로 모든 제작 규모, 뿐만 아니라 치료 단백질의 모든 제작 및 정제 단계에서 어떤 특정한 단백질, 예를 들어, HCP가 단백질 치료제 내에 존재하는지를 식별할 수 있게 한다.
본 개시내용은 제작 공정 개발, 생산 모니터링, 및 최종 산물의 분석을 예를 들어 포함하여, 상업적 요구와 양립성인 형식으로 프로테오믹스를 사용하는, 산물, 예를 들어, 정제된 치료용 산물 또는 재조합 폴리펩티드 내의 단백질, 예를 들어, HCP의 프로테오믹 분석을 기재한다.
이러한 공정은 면역원성의 인 실리코 예측을 기초로 하는 각각의 단백질, 예를 들어, HCP에 대한 통합형 임상 위험 사정을 수반한다. 이러한 예측은 특정 생산 시스템을 기초로 하고, 특정한 단백질, 예를 들어, HCP 에피토프에 대해 특히 감수성일 수 있는 규정된 환자 하위집단 (예를 들어, 지리학적 지역 또는 민족성에 의함)에 대해 이루어질 수 있다. 고-처리량 분석 방법 및 통합형 불순물 위험 사정의 특정한 조합은 제작 공정 개발 동안 계산된 임상 위험을 기초로 하여 일상적인 결정을 내릴 수 있게 한다. 이러한 결론은 생산 시스템의 특정한 게놈 및 전체 범위의 잠재적인 환자 반응 둘 다가 고려되기 때문에 높은 신뢰도로 이루어질 수 있다.
본원에 개시된 단백질, 예를 들어, HCP의 프로테오믹 기반 분석은 전체 제작 공정에 걸쳐 사용될 수 있고, 따라서 제작의 확장성 동안 단백질, 예를 들어, HCP를 검출하기 위한 상이한 검정법을 개발하는 것을 방지하며, 즉 방법이 규모와 독립적이다. 소규모부터 대규모까지 전체 제작 공정에 걸쳐 동일한 모니터링 방법을 사용하는 것은 다수의 쟁점 예컨대 상이한 제작 규모들에서 다중 모니터링 방법을 개발해야하는 필요성과 함께 하나의 규모에서 또 다른 규모로 출력물을 변환하는 것에서의 동반 오류를 방지한다. 그보다는, 프로테오믹 방법은 제작 규모와 독립적으로 사용될 수 있는 간단하고, 일관적이며, 재현성이 있고 신속한 방법을 제공한다. 예를 들어, 세포 배양, 단백질 발현 동안, 뿐만 아니라 정제 전 및 후에, 단백질, 예를 들어, HCP의 변화를 나타내도록 공정의 상이한 단계들에서 동일한 세트의 단백질, 예를 들어, HCP가 모니터링되는 것이 또한 보장된다.
본 개시내용은, 특히, 프로테오믹 분석의 핵심 단계를 최적화함으로써, 예를 들어, 하기에 의해 수백개의 샘플 (예를 들어, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드 또는 치료용 산물을 제작하는 공정 및 방법으로부터 유래된 샘플)을 신속하게 분석하는 방법을 기재한다:
변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트, 요소, 및 구아니딘 히드로클로라이드를 특정 조합 및 수준으로 적용하는 것;
개별적인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소만 사용하는 것과 대조적으로, 다수의 상이한 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소를 선택된 pH (예를 들어, 낮은 pH, 예를 들어, 산성 조건)에서 사용하는 것; 및
결과 품질의 손실 없이 알킬화 단계(들)를 생략하는 것.
본 개시내용의 방법은 샘플 혼합물 내에 매우 낮은 수준으로 존재하는 수천개의 단백질 (예를 들어, HCP)의 검출, 식별 및 그의 존재비의 정량화가 가능하다. 본 개시내용의 방법은, 정제된 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 분석하는데만 적절하기보다는, 제작 및 공정을 시작할 때, 예를 들어, 세포 상청액을 사용하여 적용할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 통상적으로 사용되는 방법보다 유의하게 더 빠르게, 그리고 더 많은 개수의 샘플 상에서 수행될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 방법은 3 내지 5일 내에 100개의 샘플을 분석할 수 있는 반면, 통상적으로 사용되는 방법은 6개의 샘플을 분석하는데 5-10일이 필요하다. 어림하여, 이는 적어도 10배의 처리량 증가를 나타낸다. 한 실시양태에서, 처리량이 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 또는 90배만큼 개선된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행에서 및/또는 본 발명의 테스트를 위해 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 기재하고 청구하는데 있어서, 정의가 제공되는 경우에, 하기의 전문용어가 어떻게 정의되는지에 따라 사용될 것이다.
본원에 사용된 전문용어는 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 것이고, 제한적으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.
단수형은 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 문법적 대상물을 지칭하도록 본원에 사용된다. 예를 들어, "세포"는 1개의 세포 또는 1개를 초과하는 세포를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 경우, 샘플의 문맥에서의 용어 "단백질" 또는 "단백질들"은 원하는 산물, 예를 들어, 원하는 재조합 산물, 예를 들어, 치료용 산물이 아닌, 제작 공정 또는 방법에 의해 생산된 샘플 내의 임의의 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 숙주 세포 단백질 (HCP) 또는 그의 단편일 수 있다.
본원에 사용된 경우, 용어 "숙주 세포 단백질" 또는 "HCP"는 재조합 폴리펩티드 산물을 생산하는데 사용된 생물에 의해 생산 또는 코딩되고, 의도된 재조합 산물에 관련되지 않은 임의의 단백질을 지칭한다. HCP는 최종 약물 물질에서 바람직하지 않다.
본원에 사용된 경우, 용어 "반-정량적"은 각각의 개별적인 종에 대한 특정한 표준을 참조하지 않으면서 질량 분광측정법에 의해 상이한 화학 종들을 비교 사정하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "내인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의 것이거나 또는 그의 내부에서 천연적으로 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "외인성"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로 도입되거나 또는 그의 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다. 따라서, "외인성 핵산"은 생물, 세포, 조직 또는 시스템으로 도입되거나 그의 외부에서 생산되는 핵산을 지칭한다. 한 실시양태에서, 외인성 핵산의 서열은 외인성 핵산이 도입되는 생물, 세포, 조직 또는 시스템의 내부에서 천연적으로 생산되지 않거나 또는 천연적으로 발견될 수 없다. 한 실시양태에서, 외인성 핵산의 서열은 비-천연 발생 서열이거나, 또는 비-천연 발생 산물을 코딩한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "이종성"은 상이한 종으로부터의 생물, 세포, 조직 또는 시스템에 도입될 때의 한 종으로부터의 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 또는 "핵산 분자"는 상호교환가능하게 사용되고, 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 또는 그의 DNA 또는 RNA의 조합물, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 그의 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, 또는 mRNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 합성이거나 (예를 들어, 화학적으로 합성되거나 또는 인공적임), 또는 재조합이다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이러한 용어는 참조 핵산과 결합 성질이 유사하고 천연 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 분자를 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 명백하게 지시된 서열 뿐만 아니라, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 또는 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 또한 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
본원에 사용된 경우, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질" (예를 들어, 본 발명의 방법의 맥락에서 사용되지 않은 경우의 단백질)은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유결합으로 연결된 아미노산 잔기들로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 이룰 수 있는 아미노산들의 최대 개수는 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 단백질은 1개 초과, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 공유 또는 비-공유 결합/상호작용에 의해 서로 회합된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 경우, 이러한 용어는 짧은 사슬 (예를 들어, 통상적으로 관련 기술분야에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭됨), 및 더 긴 사슬 (일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되고, 다수의 유형이 있음) 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 특히 포함한다.
본원에 사용된 경우, "산물"은 산물을 생산하도록 변형 또는 조작된 세포에 의해 생산된, 예를 들어, 발현된 분자, 핵산, 폴리펩티드, 또는 그의 임의의 하이브리드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 산물은 천연 발생 산물 또는 비-천연 발생 산물, 예를 들어, 합성 산물이다. 한 실시양태에서, 산물의 일부분은 천연 발생인 한편, 산물의 또 다른 일부분은 비-천연 발생이다. 한 실시양태에서, 산물은 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 산물은 진단 또는 전-임상 용도에 적합하다. 또 다른 실시양태에서, 산물은 치료 용도, 예를 들어, 질환 치료에 적합하다. 한 실시양태에서, 산물은 표 1 또는 표 2로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 변형 또는 조작된 세포는 발현을 제어하거나 또는 산물을 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 변형 또는 조작된 세포는 세포 내에서의 산물의 발현 또는 구축을 제어하는 다른 분자, 예를 들어, 핵산이 아닌 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포의 변형은 내인성 핵산 서열, 예를 들어, 내인성 유전자의 발현을 제어하거나 변경시키는, 예를 들어, 증가시키는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산의 도입을 포함한다. 이같은 실시양태에서, 변형된 세포는 세포에 의해 천연적으로 또는 내인성으로 발현되는 내인성 폴리펩티드 산물을 생산하지만, 변형이 미변형 세포에 비교하여, 예를 들어, 폴리펩티드의 내인성 생산 또는 품질에 비교하여 산물의 생산 및/또는 산물의 품질을 증가시킨다.
또 다른 실시양태에서, 세포의 변형은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 도입을 포함한다. 이같은 실시양태에서, 변형된 세포는 천연 발생 또는 비-천연 발생일 수 있는 재조합 폴리펩티드 산물을 생산한다. 이같은 실시양태에서, 변형된 세포는 세포에 의해 내인성으로 또한 생산될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 재조합 폴리펩티드 산물을 생산한다. 재조합 폴리펩티드 산물이 세포에 의해 내인성으로 또한 발현되는 실시양태에서, 변형은 미변형 세포에 비교하여, 예를 들어, 폴리펩티드의 내인성 생산 또는 품질에 비교하여 산물의 생산 및/또는 산물의 품질을 증가시킨다.
본원에 사용된 경우, "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 본원에 기재된 세포에 의해 생산될 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 제어하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 (세포 또는 전구체 세포의) 유전자 조작에 의해 형성된 것이다. 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변경되었고, 예를 들어, 세포 내로 도입되었거나 또는 유전자 조작 재배열의 산물이다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 서열은 폴리펩티드 또는 단백질의 천연 발생 이소형과 상이하지 않다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드 또는 단백질의 천연 발생 이소형의 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 및 세포는 동일한 종으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 세포에 대해 내인성이고, 달리 말하면, 세포가 제1 종으로부터의 것이고, 재조합 폴리펩티드가 이러한 제1 종에 대해 선천적이다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 세포의 내인성 게놈이 코딩하는 폴리펩티드와 동일하거나 또는 실질적으로 동일하거나, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이하만큼 상이하다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드 및 세포는 상이한 종들로부터의 것이고, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드이고, 세포는 비-인간, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, CHO, 또는 곤충 세포이다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 세포에 대해 외인성이고, 달리 말하면, 세포는 제1 종으로부터의 것이고, 재조합 폴리펩티드는 제2 종으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-천연 발생 공급원으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 또는 단백질의 천연 발생 이소형과 아미노산 서열 면에서 상이하지 않은 인간 폴리펩티드 또는 단백질이다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드 또는 단백질의 천연 발생 이소형과 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개 이하의 아미노산 잔기에서 상이하다. 한 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드의 천연 발생 이소형과 그의 아미노산 잔기의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15% 이하만큼 상이하다.
본원에 사용된 경우의 용어 "획득하다" 또는 "획득하는 것"은 물리적 실체 또는 값을 "직접적으로 획득하는 것" 또는 "간접적으로 획득하는 것"에 의해 물리적 실체, 또는 값, 예를 들어, 수치를 입수하는 것을 지칭한다. "직접적으로 획득함"은 물리적 실체 또는 값을 수득하는 공정을 수행하는 것 (예를 들어, 합성 또는 분석 방법을 수행하는 것)을 의미한다. "간접적으로 획득하는 것"은 또 다른 단체 또는 공급원 (예를 들어, 물리적 실체 또는 값을 직접적으로 획득한 제3자의 실험실)으로부터 물리적 실체 또는 값을 제공받는 것을 지칭한다. 물리적 실체를 직접적으로 획득하는 것은 물리적 물질, 예를 들어, 출발 물질의 물리적 변화를 포함하는 공정을 수행하는 것을 포함한다. 예시적인 변화는 2개 이상의 출발 물질로부터 물리적 실체를 제조하는 것, 물질을 전단하거나 단편화시키는 것, 물질을 분리 또는 정제하는 것, 2개 이상의 별개의 실체를 혼합물로 조합하는 것, 공유 또는 비-공유 결합을 절단하거나 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것은 샘플 또는 또 다른 물질의 물리적 변화를 포함하는 공정을 수행하는 것, 예를 들어, 물질, 예를 들어, 샘플, 분석물 또는 시약의 물리적 변화를 포함하는 분석 공정 (때때로 본원에 "물리적 분석"으로 지칭됨)을 수행하는 것, 분석 방법, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법을 수행하는 것을 포함한다: 물질, 예를 들어, 분석물 또는 그의 단편 또는 다른 유도체를 또 다른 물질로부터 분리 또는 정제하는 것; 분석물 또는 그의 단편 또는 다른 유도체를 또 다른 물질, 예를 들어, 완충제, 용매 또는 반응물과 조합하는 것; 또는, 예를 들어, 분석물의 제1 원자와 제2 원자 사이의 공유 또는 비-공유 결합을 절단하거나 형성함으로써, 분석물 또는 그의 단편 또는 다른 유도체의 구조를 변화시키는 것; 또는, 예를 들어, 시약의 제1 원자와 제2 원자 사이의 공유 또는 비-공유 결합을 절단하거나 형성함으로써, 시약 또는 그의 단편 또는 다른 유도체의 구조를 변화시키는 것.
본원에 사용된 경우의 용어 "샘플을 획득하는 것"은 샘플을 "직접적으로 획득하는 것" 또는 "간접적으로 획득하는 것"에 의해 샘플, 예를 들어, 조직 샘플 또는 핵산 샘플을 입수하는 것을 지칭한다. "샘플을 직접적으로 획득하는 것"은 샘플을 수득하는 공정을 수행하는 것 (예를 들어, 물리적 방법 예컨대 수술 또는 추출을 수행하는 것)을 의미한다. "샘플을 간접적으로 획득하는 것"은 또 다른 단체 또는 공급원 (예를 들어, 샘플을 직접적으로 획득한 제3자의 실험실)으로부터 샘플을 제공받는 것을 지칭한다. 샘플을 직접적으로 획득하는 것은 물리적 물질, 예를 들어, 출발 물질, 예컨대 조직, 예를 들어, 인간 환자 내의 조직 또는 이전에 환자로부터 단리된 조직의 물리적 변화를 포함하는 공정을 수행하는 것을 포함한다. 예시적인 변화는 출발 물질로부터 물리적 실체를 제조하는 것, 조직을 절개하거나 긁어내는 것; 물질 (예를 들어, 샘플 조직 또는 핵산 샘플)을 분리 또는 정제하는 것; 2개 이상의 별개의 실체를 혼합물로 조합하는 것; 공유 또는 비-공유 결합을 절단하거나 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 샘플을 직접적으로 획득하는 것은, 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같이, 샘플 또는 또 다른 물질의 물리적 변화를 포함하는 공정을 수행하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 경우, "단백질 소화 산물"은 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소의 작용에 의해 생산된 단백질의 단편, 예를 들어, 펩티드를 지칭한다. 효소의 예는 트립신, lysC, GluC, AspN, 및 관련 분야에 공지된 다른 효소를 포함한다.
본원에 사용된 경우, "단백질 위험 점수"는 산물, 예를 들어, 치료용 산물, 예를 들어, 치료용 산물의 최종 제형 내의 오염물 또는 불순물로서의 단백질, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편과 연관된 위험의 사정을 포함한다. 단백질 위험 점수는 단백질 및 산물을 포함하는 제제를 제공받은 대상체에서의 원치 않는, 예를 들어, 표적 벗어남 성질, 예를 들어, 면역원성, 예를 들어, 원치 않는 면역 반응; 산물의 제제, 예를 들어, 약물의 제제 내에서의 단백질의 원치 않는 효과, 예를 들어, 변성, 침전, 색상 또는 냄새를 야기하는 성향; 및 샘플 내에 존재하는 단백질의 존재비에 대한 값 중 하나 이상의 함수일 수 있다. 예를 들어, 제작 공정 또는 방법에 의해 생산된, 임의적으로 산물을 포함하는 샘플은 하나 이상의 단백질 오염물을 포함한다. 본 발명의 방법은 샘플 내의 단백질 또는 그의 단편을 분석할 수 있고, 샘플 내에서 각각의 식별된 단백질에 하나 이상의 단백질 위험 점수를 할당할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 위험 점수는 에피베이스(Epibase)®에 의해 생산된 값, 예를 들어, 면역원성 점수이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 위험 점수는 샘플 내의 단백질 존재비의 값이다.
본원에 사용된 경우, "공정 위험 점수"는 제작 공정 또는 방법과 연관된 위험의 사정을 포함하고, 제작 공정 또는 방법에 의해 생산된 샘플 내에 존재하는 단백질의 단백질 위험 점수의 함수이다. 예를 들어, 샘플 A는 공정 A에 의해 생산될 수 있고, 샘플 B는 공정 B에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여, 샘플 A 및 B를 분석할 수 있고, 이들의 단백질 오염물의 단백질 위험 점수를 사정할 수 있으며, 공정 A 및 B의 공정 위험 점수를 결정할 수 있고, 이는 공정 A 및 B의 신속한 비교를 허용한다.
본원에 사용된 경우, "공정"은 단백질 또는 복수의 단백질, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편을 특히 포함하는 샘플을 생산하는 일련의 하나 이상의 조작 및/또는 조건이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 또는 치료용 산물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 예시적인 공정은 복수의 세포를 재조합 폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건 하에 배양하고, 따라서 하나 이상의 단백질, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편, 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 샘플, 예를 들어, 세포 배양물, 상청액 또는 세포 용해물을 생산하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우, "제작 방법"은 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드 또는 치료용 산물, 및 단백질 또는 복수의 단백질, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편을 포함하는 샘플을 생산하는 일련의 하나 이상의 조작 및/또는 조건이다. 예를 들어, 예시적인 제작 방법은 복수의 세포를 재조합 폴리펩티드의 발현에 도움이 되는 조건 하에 배양하고, 따라서 하나 이상의 단백질, 예를 들어, HCP 또는 그의 단편, 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 샘플, 예를 들어, 세포 배양물, 상청액 또는 세포 용해물을 생산하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우, MS1은 질량 분광측정법을 의미한다.
본원에 사용된 경우, MS2는 탠덤 질량 분광측정법을 의미한다.
본원에 사용된 경우, "실질적으로 활성인" 또는 "실질적인 활성"은 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 활성인, 예를 들어, 참조 효율/반응 속도, 예를 들어, 이상적인 조건, 예를 들어, 효소 공급자가 권장하는 조건 또는 변성제, 환원제 또는 비-권장 pH가 존재하지 않는 조건 하에서의 이러한 효소의 최고 효율/반응 속도에 비교하여 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 효율/반응 속도로 작동하는, 예를 들어, 조건 세트 하의 또는 본원에 기재된 방법 또는 공정의 단계에서의 샘플 내의 효소, 예를 들어, 복수의 효소를 기재한다.
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시내용은 이에 의해 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명이 구체적인 측면들을 참조로 개시되었지만, 본 발명의 다른 측면 및 변형이 본 발명의 진정한 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 구상될 수 있다는 것이 명백하다. 첨부된 청구범위는 모든 이같은 측면 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
샘플 제조
본원에 기재된 방법은, 부분적으로, 샘플, 예를 들어, 제작 공정 또는 방법에 의해 생성된 단백질, 예를 들어 HCP를 포함하는 샘플, 예를 들어, 세포 배양물, 상청액 또는 세포 용해물을 포함하는 샘플을 분석하는 방법을 상술한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 분석용 샘플을 제조하는 것을 상술한다. 일부 실시양태에서, 분석은 질량 분광측정법, 단백질, 예를 들어, 샘플 내의 HCP의 식별, 및/또는 단백질, 예를 들어 HCP 및/또는 샘플을 생산한 제작 공정/방법에 위험 점수를 할당하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 단백질, 예를 들어 HCP를 변성제에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변성제는 무질서유발제, 산, 염기, 환원제, 또는 세제이다. 일부 실시양태에서, 변성제는 구아니딘 히드로클로라이드, 요소, 및 데옥시콜레이트로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변성제는 다중 유형의 변성제 또는 다중 변성제의 조합물, 예를 들어, 요소 및 데옥시콜레이트, 또는 구아니딘 히드로클로라이드 및 요소이다. 일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 하나의 단계에서 제공된 변성제가 제2 단계에서 제공된 변성제와 상이하거나, 또는 변성제의 농도가 변화되는, 예를 들어, 단계마다 변경되는 다중 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조의 다중 단계는 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드의 농도를, 예를 들어, 희석에 의해, 변경, 예를 들어, 감소시킬 수 있고, 제2 변성제, 예를 들어, 요소를 도입하거나 이의 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 변성제의 농도는 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.5, 또는 8 M이다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드의 농도는 1-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 6-6.6 M, 6 M, 6.6 M, 또는 8 M이다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 요소의 농도는 0-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 0.5-5 M, 0.5-2 M, 0.5 M, 1 M, 또는 2 M이다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트의 농도는 적어도 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 0.7%, 0.9%, 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% (m/v), 예를 들어, 0.1%-2%이다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트의 농도는 0.01%-50%, 1%-40%, 1%-20%, 0.5%-10%, 0.01%-5%, 또는 0.1%-2% (m/v)이다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 샘플 혼합물)은 요소 및 데옥시콜레이트 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 샘플 혼합물)은 요소 및 데옥시콜레이트 둘 다를 포함하고, 요소의 농도는 적어도 8 M (예를 들어, 8 M)이고, 데옥시콜레이트의 농도는 적어도 1% (예를 들어, 1%) (m/v)이다. 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 샘플 혼합물)은 요소 및 데옥시콜레이트 둘 다를 포함하고, 요소의 농도는 적어도 8 M (예를 들어, 8 M)이고, 데옥시콜레이트의 농도는 적어도 0.01% (예를 들어, 0.01%) (m/v)이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도는 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드의 농도는 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 요소의 농도는4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 2 M 이하 또는 0.5 M 이하이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물 내의 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트의 농도는 2%, 1%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.0025%, 0.001%, 또는 0.0001% 이하, 예를 들어, 본질적으로 0% (m/v)이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물은 요소 및 데옥시콜레이트 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물은 요소 및 데옥시콜레이트 둘 다를 포함하고, 요소의 농도는 2 M 이하 (예를 들어, 2 M 또는 0.5 M)이고, 데옥시콜레이트의 농도는 0.0025% (m/v) 이하이다. 일부 실시양태에서, 데옥시콜레이트를 포함하는 샘플, 예를 들어, 샘플 혼합물 및/또는 샘플/효소 혼합물은 아세토니트릴, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 또는 90%의 아세토니트릴 (예를 들어, 80% 아세토니트릴) (m/v)을 또한 포함한다.
일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 단백질을 환원제에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 단백질 내에 존재하는 디술피드 결합이 단백질을 변성시키기 위해 환원될 필요가 있을 수 있다. 구상되는 환원제는 관련 기술분야에 공지된 것들이고, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올 (즉, 2-메르캅토에탄올)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물 내의 환원제의 농도는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mM, 예를 들어, 적어도 10 mM, 예를 들어, 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물 내의 환원제의 농도는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 mM 이하, 예를 들어, 1 mM 이하, 예를 들어, 1 mM이다.
일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 단백질을 알킬화제에 노출시키는 것을 포함하지 않을 수 있다. 알킬화제, 예를 들어, 아이오도아세트아미드는 디술피드 결합의 재형성을 방지하는 하나의 방식으로서 시스테인 티올 기를 알킬화시키는데 사용될 수 있다. 이론에 의해 제한되기를 원치 않으면서, 환원제의 존재, 예를 들어, 낮은 농도의 환원제 (예를 들어, 1 mM 환원제, 예를 들어, 1 mM TCEP)를 샘플 제조 전반에 걸쳐 유지하는 것이, 예를 들어, 단백질 변성에 기여하도록, 알킬화제에 대한 요구를 완화할 수 있다. 추가적으로, 알킬화 단계를 생략하는 것은 샘플 제조 시간을 진척시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 샘플 혼합물 또는 샘플/효소 혼합물 내에 특정한 pH를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물의 pH는 5, 5.25, 5.5, 5.75, 6, 6.25, 6.5, 6.75, 7, 7.25, 7.5, 또는 8이다. 일부 실시양태에서, 샘플 혼합물의 pH는 5.5이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물의 pH는 6, 6.25, 6.5, 6.75, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.75, 8, 8.25, 또는 8.5이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물의 pH는 7, 7.2, 7.3, 또는 8이다. 일부 실시양태에서, 샘플/효소 혼합물의 pH는 7.3이다. 출원인은 본 발명의 방법을 사용하는데 있어서, 효소 반응에 대한 효과가 최소이면서, 그러나, 예를 들어, 6개의 샘플 실행에서 96 또는 192개의 샘플 실행으로, 전체적인 분석에서의 속도가 증가될 뿐만 아니라, 전체 분석을 3-5일 (예를 들어, 3일, 4일, 또는 5일) 내에 수행하면서, 효소 반응에 대한 최적값 미만의 pH가 사용될 수 있다는 것을 뜻밖에 발견하였다.
일부 실시양태에서, 샘플 제조는 실온에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조, 예를 들어, 변성 조건은 30 내지 60 ℃, 예를 들어, 45-55 ℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 샘플 제조, 예를 들어, 변성 조건은 10 내지 30 ℃, 예를 들어, 18-26 ℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 분석용 샘플을 제조하는 것은 샘플/효소 혼합물 내에 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소는 트립신, lysC, GluC, AspN, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 효소일 수 있다; 상기 효소의 사용 방법 및 특성이 관련 기술분야에서 또한 입수가능하다. 일부 실시양태에서, 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소는 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:15, 1:10, 1:8, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 또는 1:1 비 (효소 대 단백질)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소는 1:20 비 (효소 대 단백질)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소는 1:40 비 (효소 대 단백질)로 존재한다.
1차원 크로마토그래피
본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 1차원 (1D) 크로마토그래피 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하나. 일부 실시양태에서, 1차원 크로마토그래피 방법은 HPLC 역상 크로마토그래피이다. 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 모세관 전기영동, 이온 이동성을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk 2011 John Wiley & Sons ISBN: 1118210743]; [Antibodies Vol 1 Production and Purification, G. Subramanian 2013 Springer Science & Business Media]; [Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Gary C. Howard 2000 CRC Press]을 또한 참조한다.
추가적인 예시적인 크로마토그래피 방법은 강한 음이온 교환 크로마토그래피 (SAX), 액체 크로마토그래피 (LC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 아미드 칼럼 크로마토그래피, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 질량 분광측정법 (MS)은 탠덤 MS, LC-MS, LC-MS/MS, 매트릭스 보조 레이저 흡착 이온화 질량 분광측정법 (MALDI-MS), 푸리에 변환 질량 분광측정법 (FTMS), 이온 이동성 분리와 질량 분광측정법 (IMS-MS), 전자 전달 해리 (ETD-MS), 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 전기영동 방법은 모세관 전기영동 (CE), CE-MS, 겔 전기영동, 아가로스 겔 전기영동, 아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 후의 특정한 글리칸 구조를 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 핵 자기 공명 (NMR)은 1차원 NMR (1D-NMR), 2차원 NMR (2D-NMR), 상관 분광분석 자기-각도 스피닝 NMR (COSY-NMR), 총 상관 분광분석 NMR (TOCSY-NMR), 이핵성 단일 양자 결맞음 NMR (HSQC-NMR), 이핵성 다중 양자 결맞음 (HMQC-NMR), 회전 핵 오버하우저 효과 분광분석 NMR (ROESY-NMR), 핵 오버하우저 효과 분광분석 (NOESY-NMR), 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
질량 분광측정법
본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 질량 분광측정법 방법은 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 전기분무 이온화 MS, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 MS, 비행 시간 MS, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 MS, 사중극자 비행 시간 MS, 선형 사중극자, 사중극자 이온 트랩 MS, 오비트랩, 실린더형 이온 트랩, 3차원 이온 트랩, 사중극자 질량 필터, 탠덤 질량 분광측정법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질량 분광측정법은 탠덤 질량 분광측정법이다. 예를 들어, 문헌 [Protein Mass Spectrometry, Julian Whitelegge 2008, Elsevier]; [Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, Michael Kinter 2005, John Wiley & Sons]; [Characterization of Protein Therapeutics using Mass Spectrometry, Guodong Chen 2014, Springer Science & Business Media]을 또한 참조한다.
생산 파라미터
본원에 사용된 바와 같은 생산 파라미터는 생산 공정에서의 파라미터 또는 요소이다. 선택될 수 있는 생산 파라미터는, 예를 들어, 당단백질 제제를 생산하는데 사용되는 세포 또는 세포주, 배양 배지, 배양 공정, 또는 바이오리액터 변수 (예를 들어, 배치, 페드-배치, 또는 관류), 정제 공정, 및 당단백질 제제의 제형을 포함한다.
1차 생산 파라미터는 1) 숙주의 유형; 2) 숙주의 유전학; 3) 배지 유형; 4) 발효 플랫폼; 5) 정제 단계; 및 6) 제형을 포함한다. 본원에 사용된 경우에, 2차 생산 파라미터는 각각의 1차 생산 파라미터 내의 조정가능하거나 가변적인 생산 파라미터이다. 예는 원하는 글리칸 성질을 기초로 하는 숙주 서브클론의 선택; 구성적이거나 또는 유도성인 숙주 유전자 수준의 조절; 신규 유전자 또는 프로모터 요소의 도입; 배지 첨가물 (예를 들어, 표 IV의 부분적인 목록); 생리화학적 성장 성질; 성장 용기 유형 (예를 들어 바이오리액터 유형, T 플라스크); 세포 밀도; 세포 주기; 원하는 글리칸 유형이 있는 산물의 강화 (예를 들어, 렉틴 또는 항체-매개 강화, 이온-교환 크로마토그래피, CE, 또는 유사한 방법에 의함); 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 유사한 2차 생산 파라미터를 포함한다.
배지
본원에 기재된 방법은 원하는 글리칸 성질 또는 성질들에 대한 양성 상관관계가 있는 배지 성분 및/또는 배지 성분의 농도를 결정 및/또는 선택하는 것을 포함할 수 있다. 배양 조건에 따라, 배지 성분은 당단백질 생산 과정에 걸쳐 또는 배지 변화가 있을 때 첨가 또는 투여될 수 있다. 배지 성분은 배양물에 직접적으로 투여되는 성분, 뿐만 아니라 세포 배양의 분산물인 성분을 포함한다.
배지 성분은, 예를 들어, 완충제, 아미노산 내용물, 비타민 내용물, 염 내용물, 미네랄 내용물, 혈청 내용물, 탄소원 내용물, 지질 내용물, 핵산 내용물, 호르몬 내용물, 미량 원소 내용물, 암모니아 내용물, 보조인자 내용물, 지시인자 내용물, 소형분자 내용물, 가수분해물 내용물 및 효소 조정인자 내용물을 포함한다.
다양한 배지 성분의 예가 하기에서 제공된다:
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예시적인 완충제는 트리스(Tris), 트리신(Tricine), HEPES, MOPS, PIPES, TAPS, 바이신, BES, TES, 카코딜레이트, MES, 아세테이트, MKP, ADA, ACES, 글리신아미드 및 아세트아미도글리신을 포함한다. 배지는 무혈청일 수 있거나, 또는 동물 유래 산물, 예를 들어, 소 태아 혈청 (FBS), 송아지 태아 혈청 (FCS), 말 혈청 (HS), 인간 혈청, 동물 유래 혈청 대용품 (예를 들어, 울트로저(Ultroser) G, SF 및 HY; 무지방 분유; 보바인 엑스-사이트(Bovine EX-CYTE)), 페투인, 소 혈청 알부민 (BSA), 혈청 알부민, 및 트랜스페린을 포함할 수 있다. 무혈청 배지가 선택된 경우, 지질, 예를 들어, 팔미트산 및/또는 스테아르산이 포함될 수 있다.
지질 성분은 오일, 포화 지방산, 불포화 지방산, 글리세리드, 스테로이드, 인지질, 스핑고지질 및 지질단백질을 포함한다. 포함되거나 또는 배지로부터 제거될 수 있는 예시적인 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 프롤린, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다. 배지 내에 존재할 수 있거나 또는 배지로부터 제거될 수 있는 비타민의 예는 비타민 A (레티노이드), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B5 (판토텐산), 비타민 B6 (피록시돈), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B9 (엽산), 비타민. B12 (시아노코발라민), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K를 포함한다.
배지 내에 존재할 수 있거나 또는 배지로부터 제거될 수 있는 미네랄은 비스무트, 붕소, 칼슘, 염소, 크로뮴, 코발트, 구리, 플루오린, 아이오딘, 철, 마그네슘, 망가니즈, 몰리브데넘, 니켈, 인, 칼륨, 루비듐, 셀레늄, 구소, 나트륨, 스트론튬, 황, 텔루륨, 티타늄, 텅스텐, 바나듐, 및 아연을 포함한다. 예시적인 염 및 미네랄은 CaCl2 (무수), CuSO4 5H2O, Fe(NO3).9H2O, KCl, KNO3, KH2PO4, MgSO4 (무수), NaCl, NaH2PO4H2O, NaHCO3, Na2SE3 (무수), ZnSO4.7H2O; 리놀레산, 리포산, D-글루코스, 하이포크산틴 2Na, 페놀 레드, 푸트레신 2HCl, 피루브산나트륨, 티미딘, 피루브산, 숙신산나트륨, 숙신산, 숙신산.Na.6수화물, 글루타티온 (환원형), 파라-아미노벤조산 (PABA), 메틸 리놀레에이트, 박토 펩톤 G, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 2'-데옥시아데노신 HCl, 2'-데옥시시티딘 HCl, 2'-데옥시구아노신 및 우리딘을 포함한다. 원하는 글리칸 특성이 푸코실화 감소인 경우, 생산 파라미터는 세포, 예를 들어, CHO 세포, 예를 들어, dhfr 결핍 CHO 세포를 망가니즈, 예를 들어, 약 0.1 μM 내지 50 μM의 농도로 존재하는 망가니즈의 존재 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다. 푸코실화 감소는, 예를 들어, 세포 (예를 들어, CHO 세포, 예를 들어, dhfr 결핍 CHO 세포)를 약 350 내지 500 mOsm의 오스몰농도에서 배양함으로써 또한 수득될 수 있다. 오스몰농도는 염을 배지에 첨가함으로써 또는 생산 동안 증발이 발생함에 따라 부산물로서 염이 발생되는 것에 의해 조정될 수 있다.
호르몬은, 예를 들어, 소마토스타틴, 성장 호르몬-방출 인자 (GRF), 인슐린, 프로락틴, 인간 성장 호르몬 (hGH), 소마토트로핀, 에스트라디올, 및 프로게스테론을 포함한다. 성장 인자는, 예를 들어, 골 형태형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 신경 성장 인자 (NGF), 골-유래 성장 인자 (BDGF), 전환 성장 인자-베타1 (TGF-베타1), [미국 특허 번호 6,838,284 B2로부터의 성장 인자], 헤민 및 NAD를 포함한다. 존재하거나 또는 배지로부터 제거될 수 있는 계면활성제의 예는 트윈-80 및 플루로닉 F-68을 포함한다. 소형 분자는, 예를 들어, 부티레이트, 암모니아, 비-천연 당, 비-천연 아미노산, 클로로퀸, 및 베타인을 포함할 수 있다.
생리화학적 파라미터
생산 파라미터는 생리화학적 파라미터를 또한 포함할 수 있다. 이같은 조건은 온도, pH, 오스몰농도, 전단력 또는 진탕 속도, 산화, 스퍼지 속도, 성장 용기, 접선 유동, DO, CO2, 질소, 공급된 배치, 산화환원, 세포 밀도 및 공급 전략을 포함할 수 있다. 선택될 수 있는 생리화학적 파라미터의 예는, 예를 들어, pH, 오스몰농도, 전단력 또는 진탕 속도, 산화, 스퍼지 속도, 성장 용기, 접선 흐름, 배치에 용해된 O2, CO2, 질소, 공급된 배치, 산화환원, 세포 밀도, 관류 배양, 공급 전략, 온도 및 배양 시간을 포함한다.
추가적인 생산 파라미터가 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Antibody Expression and Production (2011) Ed. Mohamed Al-Rubeai; Springer Publishing]을 참조한다.
산물 및 그를 코딩하는 핵산
산물, 예를 들어, 본 발명의 방법에서 상술된 바와 같은 세포 및 산물을 생산할 수 있는 세포 또는 세포주를 식별, 선별 또는 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용에 포함되는 산물은 세포에서 생산될 수 있는, 예를 들어, 발현될 수 있는 분자, 핵산, 폴리펩티드 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체), 또는 그의 하이브리드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 산물을 생산하도록 세포가 조작 또는 변형된다. 이같은 변형은 산물의 생산을 제어 또는 초래하는 분자를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 도입함으로써 세포를 변형시키고, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 생산, 예를 들어, 발현 및 분비에 적합한 조건 하에 세포를 배양한다.
실시양태에서, 배양된 세포는 치료 용도를 위한 단백질, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 및/또는 재조합 단백질을 생산하는데 사용된다. 실시양태에서, 배양된 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사산물을 생산한다. 예를 들어, 실시양태에서, 분자량이 약 4000 돌턴 내지 약 140,000 초과인 분자가 생산될 수 있다. 실시양태에서, 이러한 분자들은 광범위한 복잡성을 가질 수 있고, 글리코실화를 포함하는 번역후 변형을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어, 보톡스(BOTOX), 마이오블록(Myobloc), 뉴로블록(Neurobloc), 다이스포트(Dysport) (또는 다른 혈청형의 보툴리늄 신경독소), 알글루코시다제 알파, 답토마이신, YH-16, 융모성 고나도트로핀 알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테셀류린, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3 (주사), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 선토리(Suntory) (감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, 디기팹(DigiFab), 바이페라탭(ViperaTAb), 에키탭(EchiTAb), 크로팹(CroFab), 네시리티드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프(Rebif), 엡토테르민알파, 테리파라티드, 칼시토닌, 에타너셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자, DWP401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌(Mononine), 엡타코그 알파 (활성화형), 재조합 인자 VIII+VWF, 리컴비네이트(Recombinate), 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합), 알파네이트(Alphanate), 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 나테플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카펀진, PEG필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나티드, 프람린티드, 이니글루세라제, 갈설파제, 류코트로핀(Leucotropin), 몰그라모스팀, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (하이드론(Hydron)), 데스로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤리드 (아트리젤(ATRIGEL)), 류프롤리드 (듀로스(DUROS)), 고세렐린, 유트로핀(Eutropin), 소마트로핀, 메카세르민, 엔푸비르티드, Org-33408, 인슐린 글라르긴, 인슐린 글루리신, 인슐린 (흡입형), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테머, 인슐린 (래피드미스트(RapidMist)), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀모류킨, 99 mTc-앱시티드, 미엘로피드, 베타세론(Betaseron), 글라티라머 아세테이트, 제폰(Gepon), 사르그라모스팀, 오프렐베킨, 인간 백혈구-유래 알파 인터페론, 바이라이브(Bilive), 인슐린 (재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파트, 메카세닌, 로페론(Roferon)-A, 인터페론-알파 2, 알파페론(Alfaferone), 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스(Avonex)의 재조합 인간 황체형성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페르민, 지코노티드, 탈티렐린, 디보테르민알파, 아토시반, 베카플레르민, 엡티피바티드, 제마이라(Zemaira), CTC-111, 샨백(Shanvac)-B, 옥트레오티드, 란레오티드, 안세스팀, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자티드 구리 아세테이트, 라스부리카제, 라니비주맙, 액티뮨(Actimmune), PEG-인트론(Intron), 트리코민(Tricomin), 재조합 인간 부갑상선 호르몬 (PTH) 1-84, 에포에틴 델타, 트랜스제닉 항트롬빈 III, 그란디트로핀(Granditropin), 비트라제(Vitrase), 재조합 인슐린, 인터페론-알파, GEM-21S, 바프레오티드, 이두르술파제, 옴나파트릴랏, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카르피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 억제제, 라노테플라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르티드, VGV-1, 인터페론 (알파), 루시낙탄트, 아비프타딜, 이카티반트, 에칼란티드, 오미가난, 오로그랩(Aurograb), 펙시가나나세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레델린베수도톡스, 패블드(Favld), MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루티드, 테리파라티드, 티파코긴, AA4500, T4N5 리포솜 로션, 카투막소맵, DWP413, ART-123, 크리살린(Chrysalin), 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀알파, TH-9507, 테두글루티드, 디아미드(Diamyd), DWP-412, 성장 호르몬, 재조합 G-CSF, 인슐린, 인슐린 (테크노스피어(Technosphere)), 인슐린 (AERx), RGN-303, DiaPep277, 인터페론 베타, 인터페론 알파-n3, 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 제레셉트(Xerecept), 오페바칸, AIDSVAX, GV-1001, 림포스캔(LymphoScan), 란피르나제, 리폭시산(Lipoxysan), 루수풀티드, MP52, 시풀류셀-T, CTP-37, 인세기아(Insegia), 비테스펜, 인간 트롬빈, 트롬빈, 트랜스MID(TransMID), 알피메프라제, 퓨리카제(Puricase), 테를리프레신, EUR-1008M, 재조합 FGF-I, BDM-E, 로티갭티드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 듀라마이신, SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴(Endostatin), 안지오스타틴(Angiostatin), ABT-510, 보우만 버크 억제제(Bowman Birk Inhibitor), XMP-629, 99 mTc-하이닉(Hynic)-애넥신(Annexin) V, 카할랄리드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스, 오자렐릭스, 로르니뎁신, BAY-504798, 인터류킨4, PRX-321, 펩스캔(Pepscan), 이보크타데킨, rh락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렌기티드, 알부페론(Albuferon), 비파식스(Biphasix), IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오티드, huN901-DMI, SB-249553, 온코백스(Oncovax)-CL, 온코백스-P, BLP-25, 세르백스(CerVax)-16, MART-1, gp100, 티로시나제, 네미피티드, rAAT, CGRP, PEG수너셉트, 티모신베타4, 플리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 연어 칼시토닌 (엘리젠), 이그재모렐린, 카프로모렐린, 카르데바(Cardeva), 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 울라리티드, 데펠레스탯, 헤마티드, 크리살린(Chrysalin), rNAPc2, 재조합 인자 V111 (PEG화 리포솜), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, 소노라이시스 프로라이스(SonoLysis Prolyse), 뉴로백스(NeuroVax), CZEN-002, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나티드 (제어 방출, 메디소르브(Medisorb)), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리나클로티드 에아세테이트, CETi-1, 헤모스판(Hemospan), VAL, 속효성 인슐린 (주사용, 비아델(Viadel)), 인슐린 (엘리젠), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라, 멀티카인(Multikine), RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10, 탈락토페린, rEV-131, rEV-131, 재조합 인간 인슐린, RPI-78M, 오프렐베킨, CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3, IRX-3, RDP-58, 타우페론(Tauferon), 담즙산염-자극 리파제, 메리스파제(Merispase), 알칼리성 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄(Melanotan)-II, 브레멜라노티드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, ALTU-135, 재조합 뉴라미니다제, Vacc-5q, Vacc-4x, Tat 톡소이드(Toxoid), YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) (노바솜(Novasome)), 오스타볼린(Ostabolin)-C, PTH 유사체, MBRI-93.02, MTB72F, MVA-Ag85A, FARA04, BA-210, 재조합 플라그 FIV, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7, PR1 펩티드 항원, 돌연변이체 ras 백신, HPV-16 E7 리포펩티드 백신, 라비린틴, WT1-펩티드, IDD-5, CDX-110, 펜트리스(Pentrys), 노렐린(Norelin), 사이토팹(CytoFab), P-9808, VT-111, 이크로캡티드, 텔베르민, 루핀트리비어, 레티쿨로스, rGRF, HA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07, DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 면역독소, DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스(Combotox), 콜레시스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩티드, 111In-hEGF, AE-37, 트래스니주맙-DM1, 안타고니스트(Antagonist) G, IL-12, PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647, L-19 기반 ra, Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH, VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 (펩티드), NA17.A2 펩티드, CBP-501, 재조합 인간 락토페린, FX-06, AP-214, WAP-8294A, ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36], FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34, F-18-CCR1, AT-1100, JPD-003, PTH(7-34) (노바솜)), 듀라마이신, CAB-2, CTCE-0214, 글리코PEG화 에리트로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스, EP-51216, hGH, OGP-I, 시푸비르티드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴, r(m)CRP, 간-선택적 인슐린, 수발린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 효능제, AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제, SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 테리파라티드 (엘리젠), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합물, EP-1043, gpE1, gpE2, MF-59, hPTH(1-34), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스큐민, BIM-23190, 다중-에피토프 티로시나제 펩티드, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관-표적화 TNF, 데스모프레신, 오너셉트, 및 TP-9201이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)), 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)™), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)™/맵 테라(MAB THERA)™), 에타너셉트 (엔브렐(ENBREL)™), 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)™), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)™), PEG필그라스팀 (뉴라스타(NEULASTA)™), 또는 바이오시밀러 및 바이오베터를 포함하는 임의의 다른 적합한 폴리펩티드이다.
다른 적합한 폴리펩티드는 하기 및 US2016/0097074의 표 1에 열거된 것들이다:
표 1
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2에 제시된 바와 같은 호르몬, 혈액 응고 인자, 시토카인/성장 인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신, 또는 펩티드이다.
표 2. 예시적인 산물
Figure pct00005
Figure pct00006
실시양태에서, 단백질은 표 3에 제시된 바와 같은 다중특이적 단백질, 예를 들어, 이중특이적 항체이다.
표 3: 이중특이적 양식
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 암 세포가 발현하는 항원이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 치료용 폴리펩티드는 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 치료용 폴리펩티드는 HER2, CD20, 9-O-아세틸-GD3, βhCG, A33 항원, CA19-9 마커, CA-125 마커, 칼레티쿨린, 카르보안히드라제 IX (MN/CA IX), CCR5, CCR8, CD19, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD63, CD70, CC123, CD138, 암종 배아 항원 (CEA; CD66e), 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 엔도시알린, 에프린 A2 (EphA2), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), ErbB2, 태아 아세틸콜린 수용체, 섬유모세포 활성화 항원 (FAP), 푸코실 GM1, GD2, GD3, GM2, 강글리오시드 GD3, 글로보(Globo) H, 당단백질 100, HER2/neu, HER3, HER4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, 루이스(Lewis)-Y, LG, Ly-6, 흑색종-특이적 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 (MCSCP), 메소텔린, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, 뮬러관 억제 물질 (MIS) 수용체 II형, 형질 세포 항원, 폴리 SA, PSCA, PSMA, 소닉 헷지호그 (SHH), SAS, STEAP, sTn 항원, TNF-알파 전구체, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, 2B4 (CD244), α4β1 인테그린, β2 인테그린, CD2, CD16, CD27, CD38, CD96, CDlOO, CD160, CD137, CEACAMl (CD66), CRTAM, CSl (CD319), DNAM-1 (CD226), GITR (TNFRSF18), 활성화 형태의 KIR, NKG2C, NKG2D, NKG2E, 하나 이상의 천연 세포독성 수용체, NTB-A, PEN-5, 및 그의 조합으로부터 선택되며, 임의적으로 β2 인테그린은 CD11a-CD 18, CD11 b-CD 18, 또는 CD11c-CD 18을 포함하고, 임의적으로 활성화 형태의 KIR은 KIR2DS1, KIR2DS4, 또는 KIR-S를 포함하며, 임의적으로 천연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46, 또는 NKp80을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제성 수용체이고, KIR, ILT2/LIR-l/CD85j, 억제성 형태의 KIR, KLRG1, LAIR-1, NKG2A, NKR-P1A, 시글렉(Siglec)-3, 시글렉-7, 시글렉-9, 및 그의 조합으로부터 선택되며, 임의적으로 억제성 형태의 KIR은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, 또는 KIR-L을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, CD3, CD2 (LFA2, OX34), CD5, CD27 (TNFRSF7), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD40L, CD84 (SLAMF5), CD137 (4-1BB), CD226, CD229 (Ly9, SLAMF3), CD244 (2B4, SLAMF4), CD319 (CRACC, BLAME), CD352 (Lyl08, NTBA, SLAMF6), CRTAM (CD355), DR3 (TNFRSF25), GITR (CD357), HVEM (CD270), ICOS, LIGHT, LTβR (TNFRSF3), OX40 (CD134), NKG2D, SLAM (CD150, SLAMF1), TCRα, TCRβ, TCRδγ, TIM1 (HAVCR, KIM1), 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제성 수용체이고, PD-1 (CD279), 2B4 (CD244, SLAMF4), B71 (CD80), B7Hl (CD274, PD-L1), BTLA (CD272), CD160 (BY55, NK28), CD352 (Ly108, NTBA, SLAMF6), CD358 (DR6), CTLA-4 (CD152), LAG3, LAIR1, PD-1H (VISTA), TIGIT (VSIG9, VSTM3), TIM2 (TIMD2), TIM3 (HAVCR2, KIM3), 및 그의 조합으로부터 선택된다.
다른 예시적인 단백질은 문헌 [Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39] (본원에 참조로 포함됨)의 표 1-10에 기재된 임의의 단백질; 또는 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체, 또는 기능성 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
다른 재조합 산물은 DARPin, 아피바디 및 애드넥틴과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 비-항체 스캐폴드 또는 대안적인 단백질 스캐폴드를 포함한다. 이같은 비-항체 스캐폴드 또는 대안적인 단백질 스캐폴드는 1 또는 2개, 또는 그 초과, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 상이한 표적 또는 항원을 인식하거나 이에 결합하도록 조작될 수 있다.
산물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 예를 들어, 외인성 핵산이 본원에 또한 제공된다. 표준 기술을 사용하여, 예를 들어, 원하는 핵산 서열, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 그를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 핵산 서열을 유도함으로써, 또는 그를 함유하는 세포 또는 조직으로부터 직접적으로 단리함으로써, 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여 원하는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 수득할 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 클로닝하기보다는 합성에 의해 생산할 수 있다. 재조합 DNA 기술 및 기법이 고도로 발달되어 있고, 관련 기술분야에 잘 확립되어 있다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 지식이 있는 통상의 기술자는 재조합 폴리펩티드를 코딩할 핵산 서열을 용이하게 구상하거나 생성시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 숙주 세포에 의해 내인성으로 발현되는 산물의 발현을 제어한다. 이같은 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 산물의 발현을 증가시키는 하나 이상의 핵산 서열 (본원에 "내인성 산물 전사활성화 서열"로도 지칭됨)을 포함한다. 예를 들어, 내인성 산물의 발현을 증가시키는 핵산 서열은 구성적으로 활성인 프로모터, 또는 더 강력한, 예를 들어, 원하는 부위에서 전사를 증가시키는, 예를 들어, 원하는 내인성 유전자 산물의 발현을 증가시키는 프로모터를 포함한다. 내인성 산물 전사활성화 서열을 포함하는 외인성 핵산의 도입 후, 상기 외인성 핵산이, 예를 들어, 내인성 산물을 코딩하는 게놈 서열에 인접한 미리 선택된 장소에서, 세포의 염색체 게놈 내로 통합되어, 내인성 산물 전사활성화 서열이 원하는 내인성 산물의 전사활성화 또는 발현을 증가시킨다. 내인성 산물의 발현을 증가시키기 위해 세포를 변형시키는, 예를 들어, 외인성 핵산을 도입하는 다른 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,272,071에 기재되어 있고, 상기 특허는 이에 의해 전문이 참조로 포함된다.
본원에 기재된 산물의 발현은 재조합 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결시키고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 전형적으로 달성된다. 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물에서의 복제 및 통합체에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 다른 조절 요소, 예컨대 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.
산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 내인성 산물의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 핵산 서열이 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 흥미로운 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 시퀀싱 벡터를 포함한다. 실시양태에서, 바이러스 벡터의 형태로 발현 벡터가 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자생물학 책자에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 생물에서 기능성인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별가능 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193). 바이러스로부터 유래된 벡터는 트랜스진의 장기간의 안정적인 통합 및 딸 세포에서의 그의 번식을 허용하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구이다.
또한 벡터는, 예를 들어, 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (예를 들어, 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자로부터의 것), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 허용하는 요소 (예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 요소) 및/또는 선별을 허용하는 요소, 예를 들어, 선별 마커 또는 리포터 유전자를 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 발현을 위한 전사 개시를 가능하게 하도록 폴리머라제를 동원하는 것을 담당하는 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 적합한 프로모터 서열은 일반적으로 인핸서와 회합되어, 다량의 전사를 구동시키고, 따라서 표적 외인성 mRNA의 다수의 카피를 전달한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 주요 극초기 프로모터 (Xia, Bringmann et al. 2006) 및 SV40 프로모터 (Chernajovsky, Mory et al. 1984)를 포함하고, 이들은 둘 다 동명의 바이러스 또는 이로부터 유래된 프로모터로부터 유래된다. 라우스 육종 바이러스 긴말단 반복부 (RSV-LTR) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV) LTR을 포함하여, 몇몇 다른 덜 통상적인 바이러스 프로모터들이 발현 벡터에 포함되었을 때 전사를 구동시키도록 성공적으로 사용되었다 (Papadakis, Nicklin et al. 2004). 또 다른 실시양태에서, 특이적 내인성 포유동물 프로모터가 관심 유전자의 구성적 전사를 구동시키는데 이용될 수 있다 (Pontiller, Gross et al. 2008). CHO 특이적 차이니즈 햄스터 신장 인자 1-알파 (CHEF1α) 프로모터가 바이러스 기반 서열에 대안적으로 높은 수율을 제공하였다 (Deer, Allison 2004). 프로모터에 더하여, 본원에 기재된 벡터는 상기 기재된 바와 같은 인핸서 영역; 전사 속도를 상향조절하도록 전사 인자를 동원할 수 있는, 코어 프로모터에 인접한 특이적 뉴클레오티드 모티프 영역을 추가로 포함한다 (Riethoven 2010). 프로모터 서열과 유사하게, 이러한 영역들은 종종 바이러스로부터 유래되고, 프로모터 서열 예컨대 hCMV 및 SV40 인핸서 서열 내에 포함되거나, 또는 아데노바이러스 유래 서열과 같이 추가적으로 포함될 수 있다 (Gaillet, Gilbert et al. 2007).
한 실시양태에서, 본원에 기재된 산물, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 선별 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 선별가능 마커는 글루타민 신테타제 (GS); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX)에 대한 내성을 부여하는 효소; 또는 항생제 마커, 예를 들어, 히그로마이신, 네오마이신 (G418), 제오신, 퓨로마이신 또는 블라스티시딘과 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 효소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 셀렉시스(Selexis) 선별 시스템 (예를 들어, 셀렉시스 에스에이(Selexis SA)가 시판하는 슈어테크놀로지 플랫폼(SUREtechnology Platform)™ 및 셀렉시스 제네틱 엘러먼츠(Selexis Genetic Elements)™) 또는 카탈란트(Catalant) 선별 시스템을 포함하거나, 또는 그와 상용성이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 본원에 기재된 재조합 산물을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포들을 식별하는데 유용한 선별 마커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 본원에 기재된 바와 같이 재조합 산물을 코딩하는 핵산 서열이 게놈 내로 통합된 것을 포함하는 세포 또는 세포들을 식별하는데 유용하다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 통합된 세포 또는 세포들을 식별하는 것은 산물을 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주의 선별 및 조작에 유용할 수 있다.
사용하기 위한 적합한 벡터는 시판되고, GS 발현 시스템™, GS 엑시드(Xceed)™ 유전자 발현 시스템, 또는 포텔리전트(Potelligent)® CHOK1SV 기술 (론자 바이올로직스, 인크((Lonza Biologics, Inc.)로부터 입수가능함)과 연관된 벡터, 예를 들어, 문헌 [Fan et al., Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5):487-502] (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 벡터를 포함한다. GS 발현 벡터는 GS 유전자 또는 그의 기능성 단편 (예를 들어, GS 미니-유전자), 및 관심 유전자의 발현을 위한 하나 이상, 예를 들어, 1, 2 또는 3개, 또는 그 초과의 고도로 효율적인 전사 카세트, 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. GS 미니-유전자는 게놈 CHO GS 유전자의 인트론 6을 포함하고, 예를 들어, 이것으로 이루어진다. 한 실시양태에서, GS 벡터는 SV40L 프로모터 및 1개 또는 2개의 폴리A 신호에 작동가능하게 연결된 GS 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, GS 벡터는 SV40E 프로모터, SV40 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 GS 유전자를 포함한다. 이같은 실시양태에서, 전사 카세트, 예를 들어, 본원에 기재된 관심 유전자 또는 재조합 폴리펩티드의 발현을 위한 카세트는 hCMV-MIE 프로모터, 및 제1 인트론을 포함하는 hCMV-MIE 유전자로부터의 5' 비번역 서열을 포함한다. GS 발현 벡터를 기반으로 다른 벡터가 구축될 수 있고, 예를 들어, 여기서 다른 선별 마커는 본원에 기재된 발현 벡터 내의 GS 유전자를 치환한다.
본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 벡터는 다른 시판되는 벡터, 예컨대 pcDNA3.1/Zeo, pcDNA3.1/CAT, pcDNA3.3TOPO (써모 피셔(Thermo Fisher), 기존의 인비트로젠(Invitrogen)); pTarget, HaloTag (프로메가(Promega)); pUC57 (진스크립트(GenScript)); pFLAG-CMV (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)); pCMV6 (오리진(Origene)); pEE12 또는 pEE14 (론자 바이올로직스), 또는 pBK-CMV/ pCMV-3Tag-7/ pCMV-Tag2B (스트라타진(Stratagene))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포 및 세포 배양
실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 이외의 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터, 시리안 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 족제비, 또는 고양이이다. 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 설치류 세포, 예를 들어, 햄스터 세포, 마우스 세포, 또는 래트 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 오리, 앵무새, 어류, 곤충, 식물, 진균 또는 효모로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 고세균이다. 한 실시양태에서, 세포는 악티노박테리아 종, 예를 들어, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)이다.
한 실시양태에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1SV GS 녹아웃 세포 (론자 바이올로직스, 인크.)이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트® CHOK1 SV (론자 바이올로직스, 인크.)이다
또 다른 실시양태에서, 세포는 HeIa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 및 CHOZN, 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포 중 임의의 것의 분화된 형태이다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중인 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.
한 실시양태에서, 세포는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 표 1 또는 2로부터 선택된 재조합 폴리펩티드를 발현하는 본원에 기재된 세포 중 임의의 것이다.
대규모 생산
본원에 기재된 장치, 설바 및 방법은 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포주를 포함하는 임의의 원하는 세포주를 배양하는데 적합하다. 추가로, 실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 현탁 세포 또는 앵커리지-의존적 (부착성) 세포를 배양하는데 적합하고, 제약 및 생물제약 제품 - 예컨대 폴리펩티드 산물, 핵산 산물 (예를 들어 DNA 또는 RNA), 또는 세포 및/또는 바이러스 예컨대 세포 및/또는 바이러스 요법에서 사용되는 것들의 생산을 위해 구성된 생산 공정에 적합하다.
실시양태에서, 세포는 산물, 예컨대 치료용 또는 진단용 재조합 산물을 발현 또는 생산한다. 세포가 생산하는 산물의 예는 항체 분자 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체), 항체 모방체 (항체에 특이적으로 결합하지만, 구조적으로 항체와 관련되지 않는 폴리펩티드 분자, 예를 들어 DARPin, 아피바디, 애드넥틴, 또는 IgNAR), 융합 단백질 (예를 들어, Fc 융합 단백질, 키메라 시토카인), 다른 재조합 단백질 (예를 들어, 글리코실화 단백질, 효소, 호르몬), 바이러스성 치료제 (예를 들어, 항암 종양용해 바이러스, 유전자 요법 및 바이러스 면역요법용 바이러스 벡터), 세포 치료제 (예를 들어, 다능성 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 성체 줄기 세포), 백신 또는 지질-캡슐화 입자 (예를 들어, 엑소솜, 바이러스-유사 입자), RNA (예를 들어 siRNA) 또는 DNA (예를 들어 플라스미드 DNA), 항생제 또는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 바이오시밀러를 생산하는데 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 또는 하등 진핵생물 세포 예컨대 효모 세포 또는 필라멘트성 진균 세포, 또는 원핵생물 세포 예컨대 그람-양성 또는 그람-음성 세포, 및/또는 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 산물, 예를 들어, 진핵생물 세포에 의해 대규모 방식으로 합성되는 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산, 핵산 (예컨대 DNA 또는 RNA)의 생산을 허용한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은 벤치-규모, 파일럿-규모 및 완전 생산 규모 용적을 포함하여 임의의 원하는 부피 또는 생산 용적을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 장치 및 방법은 세포 및 세포 산물, 특히 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에 의해 대규모 방식으로 합성되는 단백질, 펩티드 (상기에서 상세하게 논의됨), 항생제 또는 아미노산의 생산을 허용한다.
다수의 플라스크, 병, 반응기, 및 제어기가 세포 배양 시스템의 생산 및 규모 증진을 허용한다. 시스템은, 적어도 부분적으로, 이와 원하는 글리칸 성질 또는 성질들의 상관관계를 기초로 하여 선택될 수 있다. 세포는, 예를 들어, 배치, 페드-배치, 관류, 또는 연속 배양물로서 성장될 수 있다. 선택될 수 있는 생산 파라미터는, 예를 들어, 배지가 언제 (배양 시간 동안의 초기, 중기 또는 후기) 및 얼마나 자주 수확되는지를 포함하는, 배지의 첨가 또는 제거; 세포 배양물이 진탕되는 속도를 증가시키거나 또는 감소시키는 것; 세포가 배양되는 온도를 증가시키거나 또는 감소시키는 것; 배양 밀도가 조정되도록 배지를 첨가하거나 또는 제거하는 것; 세포 배양물이 시작 또는 정지되는 시간을 선택하는 것; 및 세포 배양 파라미터가 변화되는 시간을 선택하는 것을 포함한다. 이같은 파라미터들은 배치, 페드-배치, 관류 및 연속 배양 조건 중 임의의 것에 대해 선택될 수 있다.
실시양태에서, 배양된 대규모 생산용 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 동물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는, 예를 들어, 인간 세포주, 마우스 골수종 (NSO)-세포주, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)-세포주 또는 하이브리도마-세포주일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 CHO-세포주이다.
실시양태에서, 배양된 대규모 생산용 세포는 상기에서 상세하게 논의된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 및/또는 재조합 단백질, 예를 들어, 치료 용도를 위한 재조합 단백질을 생산하는데 사용된다. 실시양태에서, 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산, 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사산물을 생산한다.
실시양태에서, 대규모 생산용 세포는 의학, 연구 또는 상업 목적을 위한, 진핵생물 세포, 생화학적 마커, 관심 대상인 재조합 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열, 단백질, 효모, 곤충 세포, 안정적이거나 바이러스로 감염된 조류 세포 또는 포유동물 세포 예컨대 CHO 세포, 원숭이 세포, 용해성 산물 등이다.
실시양태에서, 대규모 생산용 세포는 원핵생물 세포, 그람-양성 세포 예컨대 바실루스(Bacillus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 세포이고, 예를 들어, 숙주 세포는 바실루스이다. 사용될 수 있는 바실루스는, 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 나토(B. natto), 비. 메가테리움(B.megaterium) 등의 계통이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 비. 서브틸리스, 예컨대 비. 서브틸리스 3NA 및 비. 서브틸리스 168이다. 예를 들어, 바실루스 제네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center) (미국 오하이오주 43210-1214 콜럼버스 웨스트 12 애비뉴 484 바이올로지컬 사이언시즈 556)로부터 바실러스를 수득할 수 있다.
실시양태에서, 대규모 생산용 원핵생물 세포는 그람 음성 세포, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 종 또는 이. 콜라이(E. coli), 예를 들어, TG1, W3110, DH1, XL1-블루(Blue) 및 오리가미(Origami) 계통이며, 이들은 상업적으로 입수가능하다.
적합한 숙주 세포가, 예를 들어, 배양 컬렉션 예컨대 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), 독일 브라운슈바이크)로부터 상업적으로 입수가능하다.
한 실시양태에서, 세포 배양은 배치 배양, 페드-배치 배양, 배출 및 충전 배양, 또는 연속 배양으로서 수행된다. 한 실시양태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 한 실시양태에서, 세포 또는 세포 배양은 재조합 폴리펩티드의 발현을 위해 생체 내에 놓이고, 예를 들어, 모델 생물 또는 인간 대상체 내에 놓인다.
한 실시양태에서, 배양 배지는 무혈청이다. 예를 들어, 론자 바이올로직스로부터, 무혈청 및 무단백질 배지가 시판된다.
예를 들어 미국 특허 번호 5,633,162에 기재된 바와 같이, 포유동물 세포주에 대한 적합한 배지 및 배양 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 실험 플라스크 또는 저밀도 세포 배양을 위한 것이고 특정한 세포 유형의 요구에 따라 개조되고 있는 표준 세포 배양 배지의 예는, 예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 이글 최소 필수 배지 (MEM), 햄 F12 배지 (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965), 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결여된 이스코베스 변형 DMEM (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978)이다. 예를 들어, 햄 F10 또는 F12 배지는 특히 CHO 세포 배양용으로 디자인되었다. CHO 세포 배양에 대해 특수하게 개조된 다른 배지가 EP-481 791에 기재되어 있다. 이같은 배양 배지에 소 태아 혈청 (FBS; 송아지 태아 혈청 (FCS)으로도 지칭됨)이 보충될 수 있는 것으로 공지되어 있고, 후자는 다량의 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공한다. 오늘날, 포유동물 세포의 세포 배양은 과학 교재 및 책자에 잘 기재되어 있는 일상적인 작업이고, 예를 들어, 문헌 [R. Ian Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 4th edition, Wiley-Liss/N.Y., 2000]에 상세하게 다뤄진다.
다른 적합한 배양 방법이 숙련된 기술자에게 공지되어 있고, 재조합 폴리펩티드 산물 및 사용된 숙주 세포에 좌우될 수 있다. 세포에 의해 발현될 재조합 폴리펩티드의 발현 및 생산에 적합한 조건을 결정 또는 최적화하는 것은 통상의 기술자의 기술 내에 속한다.
한 측면에서, 대규모 생산용 세포 또는 세포주는 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 또는 세포주는 산물, 예를 들어, 치료용 또는 진단용 산물을 발현한다. 원하는 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하도록 세포를 유전적으로 변형시키거나 조작하는 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, 형질감염, 형질도입 (예를 들어, 바이러스 형질도입), 또는 전기천공을 포함한다.
핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 외인성 핵산 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 포격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다.
핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 외인성 핵산 또는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구체, 비드, 및 지질-기반 시스템 (수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함함)을 포함한다. 시험관-내 및 생체-내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 다른 최신식 표적화 전달 방법, 예컨대 표적화 나노입자 또는 다른 적합한 서브마이크론 크기의 전달 시스템으로 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것이 이용가능하다.
실시양태에서, 외인성 핵산이 숙주 세포의 핵산, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈 또는 염색체 핵산 내로 통합되는 것이 요망된다. 외인성 핵산이 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 것이 발생하였는지 여부를 결정하는 방법은 GS/MSX 선별 방법을 포함할 수 있다. GS/MSX 선별 방법은 재조합 GS 유전자에 의한 글루타민 영양요구성의 보완을 사용하여, 세포로부터의 단백질의 고수준 발현에 대해 선별한다. 간략하게, GS/MSX 선별 방법은 재조합 폴리펩티드 산물을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하는 벡터 상에 글루타민 신테타제를 코딩하는 핵산을 포함시키는 것을 포함한다. 메티오닌 술폭시민 (MSX)의 투여로, 재조합 폴리펩티드 및 GS 둘 다를 코딩하는 외인성 핵산이 게놈 내로 안정적으로 통합된 세포를 선별한다. GS가 일부 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포에 의해 내인성으로 발현될 수 있기 때문에, MSX의 농도 및 MSX로 선별하는 기간를 최적화하여, 재조합 폴리펩티드 산물을 코딩하는 외인성 핵산이 숙주 게놈 내로 안정적으로 통합된 고-생산 세포를 식별할 수 있다. GS 선별 및 그의 시스템이 문헌 [Fan et al., Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5):487-502]에 추가로 기재되어 있고, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.
외인성 핵산이 숙주 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 세포를 식별 및 선별하기 위한 다른 방법은 리포터 유전자를 외인성 핵산 상에 포함시키고 세포 내의 리포터 유전자의 존재를 평가하는 것, 및 외인성 핵산의 PCR 분석 및 검출을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 선별, 식별 또는 생성된 세포는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 안정적인 발현, 예를 들어, 통합에 대한 선별 방법만 사용하여 선별된 세포보다 더 높은 수율의 단백질 산물을 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 선별, 식별 또는 생성된 세포는 단백질 분해 억제제와 접촉되지 않은 세포, 또는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 안정적인 발현, 예를 들어, 통합에 대해서만 선별된 세포에 비교하여, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 또는 그 초과 배수의 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 생산한다.
세포주 및 재조합 폴리펩티드 생산을 위한 방법
포유동물 및 미생물 선별 시스템 둘 다에서의 현재의 기술 상태는 DNA가 RNA로 전사되는 것의 수준에서 선별압을 적용하는 것이다. 관심 유전자를 선별 마커에 단단하게 연결시켜, 선별 마커의 높은 수준의 발현이 관심 유전자의 높은 발현을 초래하기 쉽게 한다. 선별 마커를 높은 수준으로 발현하는 세포는 생존 및 증식할 수 있고, 그렇지 않은 것은 생존 및 증식할 가능성이 더 낮고, 예를 들어, 아폽토시스가 일어나고/나거나 사망한다. 이러한 방식으로, 선별 마커 및 함축적으로 관심 유전자를 높은 수준으로 발현하는 세포에 대해 세포 집단이 강화될 수 있다. 이러한 방법은 수월한 단백질을 발현하는데 매우 성공적인 것으로 증명되었다. 실시양태에서, 본원에 기재된 공정은 실질적으로 순수한 단백질 산물을 제공한다. 본원에 사용된 경우, "실질적으로 순수한"은 발열원성 물질을 실질적으로 함유하지 않는 것, 핵산을 실질적으로 함유하지 않는 것, 및/또는 숙주 세포로부터의 내인성 세포 단백질, 효소 및 성분, 예컨대 폴리머라제, 리보솜 단백질 및 샤페론 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 단백질 산물은, 예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 오염성인 내인성 단백질, 핵산, 또는 숙주 세포로부터의 다른 거대분자를 함유한다.
산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 회수 및 정제 방법이 관련 기술분야에 잘 확립되어 있다. 재조합 폴리펩티드 산물을 회수하기 위해, 물리적 또는 화학적 또는 물리화학적 방법이 사용된다. 물리적 또는 화학적 또는 물리화학적 방법은 여과 방법, 원심분리 방법, 초원심분리 방법, 추출 방법, 동결건조 방법, 침전 방법, 결정화 방법, 크로마토그래피 방법, 또는 이들 중 2가지 이상의 방법의 조합일 수 있다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 방법은 크기-배제 크로마토그래피 (또는 겔 여과), 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 다중모드 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기재된 장치, 설비 및 방법은 원핵생물 세포 및/또는 진핵생물 세포를 포함하는 임의의 원하는 세포를 배양하는데 적합하다. 방법은, 예를 들어, 반응기, 예를 들어, 바이오리액터에서 수행될 수 있다. 추가로, 실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 현탁 세포 또는 앵커리지-의존적 (부착성) 세포를 배양하는데 적합하고, 산물 - 예컨대 폴리펩티드 - 또는 세포 및/또는 바이러스 예컨대 세포 및/또는 바이러스 요법에서 사용되는 것들의 생산을 위해 구성된 생산 공정에 적합하다.
실시양태에서, 세포는 산물, 예컨대 치료용 또는 진단용 재조합 산물을 발현 또는 생산한다. 하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 세포가 생산하는 산물의 예는 항체 분자 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체), 융합 단백질 (예를 들어, Fc 융합 단백질, 키메라 시토카인), 다른 재조합 단백질 (예를 들어, 글리코실화 단백질, 효소, 호르몬), 또는 지질-캡슐화 입자 (예를 들어, 엑소솜, 바이러스-유사 입자)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 바이오시밀러를 생산하는데 사용될 수 있다.
실시양태에서, 장치, 설비 및 방법은 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 또는 진핵생물 세포의 산물, 예를 들어, 진핵생물 세포에 의해 대규모 방식으로 합성되는 단백질, 펩티드, 항생제 또는 아미노산의 생산을 허용한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은 벤치-규모, 파일럿-규모 및 완전 생산 규모 용적을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 부피 또는 생산 용적을 포함할 수 있다.
또한, 그리고 본원에 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비, 및 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 미세섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층, 분출층, 및/또는 교반 탱크 바이오리액터를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 반응기(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 예시적인 바이오리액터 유닛은 하기 중 하나 이상 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양분 및/또는 탄소원의 공급, 적합한 기체 (예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 유동, 기체 및 액체 상의 분리, 온도 유지, pH 수준 유지, 진탕 (예를 들어, 교반), 및/또는 세척/멸균. 예시적인 반응기 유닛, 예컨대 발효 유닛은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개, 또는 그 초과의 바이오리액터를 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 바이오리액터는 배치, 세미 페드-배치, 페드-배치, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 바이오리액터는 부피가 약 100 mL 내지 약 50,000 L일 수 있다. 비제한적인 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 부피를 포함한다. 추가적으로, 적합한 반응기는 다회용, 1회용, 처분성, 또는 비-처분성일 수 있고, 금속 합금 예컨대 스테인레스 스틸 (예를 들어, 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인레스 스틸) 및 인코넬(Inconel), 플라스틱, 및/또는 유리를 포함하는 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 원형, 예를 들어, 실린더형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 사각형, 예를 들어, 직사각형일 수 있다. 일부 경우에 사각형 반응기는 원형 반응기에 비해 이점 예컨대 사용 용이성 (예를 들어, 통상의 기술자에 의한 로딩 및 설정), 반응기 내용물의 더욱 양호한 혼합 및 균질성, 및 더 낮은 바닥 공간을 제공할 수 있다.
실시양태에서, 그리고 본원에 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 장치, 설비 및 방법은 달리 언급되지 않은 임의의 적합한 유닛 작업 및/또는 기구, 예컨대 이같은 산물의 분리, 정제 및 단리를 위한 작업 및/또는 기구를 또한 포함할 수 있다. 임의의 적합한 설비 및 환경, 예컨대 전통적인 스틱-빌트 설비, 모듈형 설비, 또는 임의의 다른 적합한 구조물, 설비, 및/또는 레이아웃이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 모듈형 클린룸이 사용될 수 있다. 추가적으로, 그리고 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 장치, 시스템 및 방법은 단일 장소 또는 설비에서 수용 및/또는 수행될 수 있거나, 또는 대안적으로 별개이거나 다수인 장소 및/또는 설비에서 수용 및/또는 수행될 수 있다.
비제한적인 예로서, 그리고 비제한적으로, 적합할 수 있는 예시적인 설비, 기구 및/또는 시스템이 본원에 전문이 참조로 포함된 미국 공개 번호 2013/0280797; 2012/0077429; 2011/0280797; 2009/0305626; 및 미국 특허 번호 8,298,054; 7,629,167; 및 5,656,491에 기재되어 있다.
실시양태에서, 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 예를 들어 인간 또는 설치류 또는 소 세포주 또는 세포 계통일 수 있다. 이같은 세포, 세포주 또는 세포 계통의 예는, 예를 들어, 마우스 골수종 (NS0)-세포주, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)-세포주, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, YB2/0, Y0, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, HEK-293, VERO, PER.C6, HeLA, EBl, EB2, EB3, 종양용해성 또는 하이브리도마-세포주이다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 CHO-세포주이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트® CHOK1 SV (론자 바이올로직스, 인크.)이다. 진핵생물 세포는 또한 조류 세포, 세포주 또는 세포 계통, 예를 들어, EBx® 세포, EB14, EB24, EB26, EB66, 또는 EBvl3일 수 있다.
한 실시양태에서, 진핵생물 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는, 예를 들어, 배아 줄기 세포 (ESC), 성체 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC), 조직 특이적 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포) 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함하는 다능성 줄기 세포일 수 있다.
실시양태에서, 배양된 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는 예를 들어 인간 세포주, 마우스 골수종 (NSO)- 세포주, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)-세포주 또는 하이브리도마-세포주일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 CHO-세포주이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트® CHOK1 SV (론자 바이올로직스, 인크.)이다.
실시양태에서, 세포는 효모 세포 (예를 들어, 에스. 세레비지아에(S. cerevisae), 티. 레에세이(T. reesei)), 곤충 세포 (예를 들어, Sf9), 조류 세포 (예를 들어, 시아노박테리아, 또는 식물 세포 (예를 들어, 담배, 알팔파, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens))이다. 한 실시양태에서, 세포는 설치류 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 HeLa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHO-K1이다.
실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포 중 임의의 것의 분화된 형태이다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중인 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.
실시양태에서, 세포는 간세포 예컨대 인간 간세포, 동물 간세포, 또는 비-실질 세포이다. 예를 들어, 세포는 도말성 대사 적격 인간 간세포, 도말성 유도 적격 인간 간세포, 도말성 퀄리스트 트랜스포터 서티파이드(Qualyst Transporter Certified)™ 인간 간세포, 현탁 적격 인간 간세포 (10-도너 및 20-도너 풀링된 간세포 포함), 인간 간 쿠퍼 세포, 인간 간 성상 세포, 개 간세포 (단일 및 풀링된 비글 간 세포 포함), 마우스 간세포 (CD-1 및 C57BI/6 간세포 포함), 래트 간세포 (스프라그-돌리, 위스타 한, 및 위스타 간세포 포함), 원숭이 간세포 (시노몰구스 또는 레서스 원숭이 간세포 포함), 고양이 간세포 (도메스틱 숏헤어 간세포 포함), 및 토끼 간세포 (뉴질랜드 화이트 간세포)일 수 있다. 예시적인 간세포가 트라이앵글 리서치 랩스 엘엘씨(Triangle Research Labs, LLC) (미국 27709 노스 캐롤라이나주 데이비스 드라이브 리서치 트라이앵글 파크 6)로부터 상업적으로 입수가능하다.
한 실시양태에서, 진핵생물 세포는 하등 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포 (예를 들어, 피키아(Pichia) 속 (예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri), 및 피키아 안구스타(Pichia angusta)), 코마가타엘라(Komagataella) 속 (예를 들어 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris) 또는 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii)), 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 (예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속(예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)), 칸디다(Candida) 속 (예를 들어 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii)), 게오트리쿰(Geotrichum) 속 (예를 들어 게오트리쿰 퍼멘탄스(Geotrichum fermentans)), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)이다. 피키아 파스토리스 종이 바람직하다. 피키아 파스토리스 계통의 예는 X33, GS115, KM71, KM71H; 및 CBS7435이다.
한 실시양태에서, 진핵생물 세포는 진균 세포 (예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus) (예컨대 에이. 니거(A. niger), 에이. 푸미가투스(A. fumigatus), 에이. 오리자에(A. orzyae), 에이. 니둘라(A. nidula)), 아크레모니움(Acremonium) (예컨대 에이. 써모필룸(A. thermophilum)), 카에토미움(Chaetomium) (예컨대 씨. 써모필룸(C. thermophilum)), 크리소스포리움(Chrysosporium) (예컨대 씨. 써모파일(C. thermophile)), 코르디셉스(Cordyceps) (예컨대 씨. 밀리타리스(C. militaris)), 코리나스쿠스(Corynascus), 크테노마이세스(Ctenomyces), 푸사리움(Fusarium) (예컨대 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum)), 글로메렐라(Glomerella) (예컨대 지. 그라미니콜라(G. graminicola)), 하이포크레아(Hypocrea) (예컨대 에이치. 제코리나(H. jecorina)), 마그나포르테(Magnaporthe) (예컨대 엠. 오리자에(M. orzyae)), 마이셀리오프토라(Myceliophthora) (예컨대 엠. 써모파일(M. thermophile)), 네크트리아(Nectria) (예컨대 엔. 헤아마토코카(N. heamatococca)), 뉴로스포라(Neurospora) (예컨대 엔. 크라사(N. crassa)), 페니실리움(Penicillium), 스포로트리쿰(Sporotrichum) (예컨대 에스. 써모파일(S. thermophile)), 티에라비아(Thielavia) (예컨대 티. 테레스트리스(T. terrestris), 티. 헤테로탈리카(T. heterothallica)), 트리코더마(Trichoderma) (예컨대 티. 레에세이(T. reesei), 또는 베르티실리움(Verticillium) (예컨대 브이 달리아(V. dahlia)))이다.
한 실시양태에서, 진핵생물 세포는 곤충 세포 (예를 들어, Sf9, 미믹(Mimic)™ Sf9, Sf21, 하이 파이브(High Five)™ (BT1-TN-5B1-4), 또는 BT1-Ea88 세포), 조류 세포 (예를 들어, 암포라(Amphora), 바실라리오피세아에(Bacillariophyceae), 두나리엘라(Dunaliella), 클로렐라(Chlorella), 클라마이도모나스(Chlamydomonas), 시아노피타(Cyanophyta) (시아노박테리아), 나노클로롭시스(Nannochloropsis), 스피룰리나(Spirulina) 또는 오크로모나스(Ochromonas) 속의 세포), 또는 식물 세포 (예를 들어, 외떡잎 식물 (예를 들어, 옥수수, 벼, 밀 또는 세타리아(Setaria) 또는 쌍떡잎 식물 (예를 들어, 카사바, 감자, 대두, 토마토, 담배, 알팔파, 피스코미트렐라 파텐스 또는 아라비돕시스(Arabidopsis))로부터의 세포)이다.
한 실시양태에서, 세포는 박테리아 또는 원핵생물 세포이다.
실시양태에서, 원핵생물 세포는 그람-양성 세포 예컨대 바실루스, 스트렙토마이세스, 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 또는 락토바실루스(Lactobacillus)이다. 사용될 수 있는 바실루스는, 예를 들어, 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 나토 또는 비. 메가테리움이다. 실시양태에서, 세포는 비. 서브틸리스, 예컨대 비. 서브틸리스 3NA 및 비. 서브틸리스 168이다. 바실루스 제네틱 스톡 센터 (미국 오하이오주 43210-1214 콜럼버스 웨스트 12 애비뉴 484 바이올로지컬 사이언시즈 556)로부터 바실러스를 수득할 수 있다.
한 실시양태에서, 원핵생물 세포는 그람-음성 세포, 예컨대 살모넬라 종 또는 에쉐리키아 콜라이, 예를 들어, TG1, TG2, W3110, DH1, DHB4, DH5a, HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, C600, HB101, JM109, MC4100, XL1-블루 및 오리가미, 뿐만 아니라 이. 콜라이 B-계통으로부터 유래된 것들, 예를 들어 BL-21 또는 BL21 (DE3)이고, 이들 모두는 상업적으로 입수가능하다.
적합한 숙주 세포가, 예를 들어, 배양 컬렉션 예컨대 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하) 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 상업적으로 입수가능하다.
실시양태에서, 배양된 세포는 치료 용도를 위한 단백질, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 및/또는 재조합 단백질을 생산하는데 사용된다. 실시양태에서, 배양된 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사산물을 생산한다. 예를 들어, 실시양태에서, 분자량이 약 4000 돌턴 내지 약 140,000 초과인 분자가 생산될 수 있다. 실시양태에서, 이러한 분자들은 광범위한 복잡성을 가질 수 있고, 글리코실화를 포함하는 번역후 변형을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 공정은 개발 공정 내로 완전히 통합되어 다수의 장점을 제공하는 면역원성 계산을 제공하고, 이는 (1) 게놈이 공지되어 있는 임의의 생산 시스템 또는 이러한 생산 시스템의 특정한 변이체 (예를 들어, 구체적으로 CHO의 서브세트로서의 GS CHO)에 대해 면역원성이 수행되게 허용되게 하는 방법, 및 (2) (예를 들어, 지리학적 지역 또는 민족성에 의해) 상이한 환자 집단들에 대해 수행될 면역원성 사정을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이는 전체 집단에 대한 HCP에 대한 전반적인 평균 점수가 단일한 특히 감수성인 군에 대한 높은 점수를 차폐할 수 있기 때문에 중요하다.
번호매김 실시양태
1. 샘플을 신속하게 분석하여, 예를 들어, 단백질의 위험 (예를 들어, 제제, 예를 들어, 대상체에게 투여될 제제, 예를 들어, 제약 제제 내에 오염물로서 존재하는 경우에 단백질이 제시하는 위험)의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정을 통해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인)을 포함하는 샘플; 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법.
2. 샘플을 신속하게 분석하여 단백질의 위험의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 제1 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정을 통해 생산된, 단백질 (예를 들어, HCP) 및 임의적으로 치료용 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드)을 포함하는 샘플; 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물;
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법.
3. 1항 또는 2항에 있어서, 각각 상이한 공정에 의해 제조된 복수의 상이한 샘플을 평가하는 것, 예를 들어, 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 96, 100, 192, 200, 500 또는 1,000개의 상이한 샘플을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
4. 3항에 있어서, 상이한 제1 및 제2 샘플에 대한 위험의 사정을 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
5. 4항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 산물을 생산하는 공정을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
6. 4항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 샘플 중 하나를 선택하거나, 분류하거나, 또는 추가로 가공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
7. 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소, 또는 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
를 포함하는 방법.
8. 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어,재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물);
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
를 포함하는 방법.
9. 7항 또는 8항에 있어서, 산물을 제조하는 복수의 상이한 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 96, 100, 192, 200, 500 또는 1,000개의 상이한 공정을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
10. 9항에 있어서, 상이한 제1 및 제2 공정에 대한 평가를 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
11. 10항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 산물의 제조 공정을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
12. 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인을 제작하는 방법을 평가하여, 위험 (예를 들어, 산물의 제제 내에 산물 이외의 단백질을 포함하는 것에 의해 제시되는 위험)의 사정을 제공하는 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 제작 방법을 통해 생산된, 하나 이상의 단백질 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드; 및
ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물); 및
ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
임의적으로, (d)를 복수의 단백질, 예를 들어, 단백질 소화 산물에 의해 식별된 모든 단백질에 대해 반복하고;
e) 제작 방법에 공정 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법을 평가하여, 위험 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법.
13. 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인을 제작하는 방법을 평가하여, 위험 (예를 들어, 산물의 제제 내에 산물 이외의 단백질을 포함하는 것에 의해 제시되는 위험)의 사정을 제공하는 방법이며,
a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 제작 방법을 통해 생산된, 하나 이상의 단백질 및 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드; 및
ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물);
ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
임의적으로, (d)를 복수의 단백질, 예를 들어, 단백질 소화 산물에 의해 식별된 모든 단백질에 대해 반복하고;
e) 제작 방법에 공정 위험 점수를 할당하고,
이에 의해 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법을 평가하여, 위험 사정을 제공하는 것
을 포함하는 방법.
14. 12항 또는 13항에 있어서, 산물을 제작하는 복수의 상이한 방법을 평가하는 것, 예를 들어, 산물을 제작하는 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 96, 100, 192, 200, 500 또는 1,000개의 상이한 방법을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
15. 14항에 있어서, 산물을 제작하는 상이한 제1 및 제2 방법에 대한 위험의 사정을 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
16. 14항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 산물을 제작하는 방법을 선택 또는 분류하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 오염물 또는 다른 바람직하지 않은 성분 (예를 들어, 조건 세트에 의해 생산되는 산물의 단편, 변성 또는 미스-폴딩된 버전, 또는 숙주 세포 단백질 (HCP) 또는 그의 단편)인 방법.
18. 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제, 제1 변성제, 또는 제2 변성제가 데옥시콜레이트 및 요소, 구아니딘 히드로클로라이드, 또는 요소 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 것인 방법.
19. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제 또는 제1 변성제가 구아니딘 히드로클로라이드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 것인 방법.
20. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제 또는 제1 변성제가 요소 및 데옥시콜레이트를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 것인 방법.
21. 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제 또는 제2 변성제가 요소를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 것인 방법.
22. 1항 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도보다 더 높은 것인 방법.
23. 1항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 단백질을 변성시키기에 충분히 높고, 예를 들어, 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 변성되고;
샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도가 효소를 변성시키지 않도록 충분히 낮고, 예를 들어, 효소의 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만이 변성되는 것인
방법.
24. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 제제와 샘플 혼합물의 조합이 변성제가 효소를 변성시키지 않도록 변성제를 희석시키는 (즉, 변성제의 농도를 감소시키는) 방법.
25. 1항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 하기인 방법:
i) 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.5, 또는 8;
ii) 1-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 6-6.6 M, 6 M, 6.6 M, 또는 8 M;
iii) 0-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 0.5-5 M, 0.5-2 M, 0.5 M, 1 M, 또는 2 M; 또는
iv) 0.01%-50%, 1%-40%, 1%-20%, 0.5%-10%, 0.01%-5%, 또는 0.1%-2% (m/v).
26. 1항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도가 하기인 방법:
i) 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하;
ii) 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M;
iii) 2 M 또는 0.5 M 이하; 또는
iv) 2%, 1%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.0025%, 0.001%, 또는 0.0001% 이하, 예를 들어, 본질적으로 0% (m/v).
27. 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물이 제1 변성제 (즉, (a)(ii)의 변성제)를 포함하고, 샘플/효소 혼합물이 제1 변성제 및 제2 변성제를 포함하는 것인 방법.
28. 27항에 있어서, 제1 변성제가 구아니딘 히드로클로라이드이고, 제2 변성제가 요소인 방법.
29. 27항 또는 28항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 제1 변성제의 농도가 1-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 6-6.6 M, 6 M, 6.6 M, 또는 8 M인 방법.
30. 27항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 제1 변성제의 농도가 하기인 방법:
i) 0-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 0.5-5 M, 0.5-2 M, 0.5 M, 1 M, 또는 2 M;
ii) 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하; 또는
iii) ii) 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M.
31. 27항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 제2 변성제의 농도가 하기인 방법:
i) 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하;
ii) 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M; 또는
iii) 2 M 또는 0.5 M 이하.
32. 1항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플 혼합물의 pH가 탈아미드화 반응이 억제되도록 충분히 낮고, 예를 들어, 단백질의 아스파라긴 및 글루타민 측쇄의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 변경되지 않고,
샘플/효소 혼합물의 pH가 효소가 활성이도록 충분히 높고, 예를 들어, 효소가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 활성이고, 예를 들어, 최대 효율에 비교하여 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 효율로 작동하는 것인
방법.
33. 1항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물의 pH가 샘플/효소 혼합물의 pH보다 더 낮고, 예를 들어, 적어도 1, 1.5, 또는 2 단위가 더 낮은 방법.
34. 1항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물의 pH가 5.5±1, 0.75, 0.5, 또는 0.25 (예를 들어, 5.5±0.5)이고, 샘플/효소 혼합물의 pH가 7.3±1, 0.75, 0.5, 또는 0.25 (예를 들어, 7.3±0.5)인 방법.
35. 1항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물의 pH가 5.5이고, 샘플/효소 혼합물의 pH가 7.3인 방법.
36. 1항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 단백질 또는 단백질 소화 산물의 시스테인 잔기의 알킬화를 포함하지 않는 것인 방법.
37. 1항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 샘플, 샘플 혼합물, 또는 샘플/효소 혼합물 중 하나 이상 (예를 들어, 모두)을 단백질 또는 단백질 소화 산물의 시스테인 잔기를 알킬화시키는 조건에 노출시키는 것, 예를 들어, 시약, 예를 들어, 알킬화제, 예를 들어, 아이오도아세트아미드의 첨가를 포함하지 않는 것인 방법.
38. 1항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 및/또는 샘플/효소 혼합물이 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 것인 방법.
39. 38항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 샘플/효소 혼합물 내의 농도보다 더 높은 것인 방법.
40. 38항 또는 39항에 있어서,
샘플 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 단백질의 시스테인을 실질적으로 환원시키도록 충분히 높고, 예를 들어, 단백질의 시스테인 잔기의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 환원되고;
샘플/효소 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 방법 또는 제작 방법의 다른 단계를 방해하지 않도록 충분히 낮고, 예를 들어, 환원제가 유의하게 기구 (예를 들어, 질량 분광계 또는 분석 칼럼) 내에 축적되거나 또는 데이터 (예를 들어, 질량 분광측정법 데이터)에서의 추가 신호를 생성하지 않는 것인
방법.
41. 38항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 환원제의 농도가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mM, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mM인 방법.
42. 38항 내지 41항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 환원제의 농도가 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 mM 이하, 예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 mM인 방법.
43. 38항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)인 방법.
44. 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화 산물이 크기, 전하 또는 친화성 중 1가지 이상 (예를 들어, 1, 2, 3가지 또는 그 초과)을 기초로 하여 분리되는 것인 방법.
45. 1항 내지 44항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화 산물을 분리하는 것이 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 모세관 전기영동, 이온 이동성, 또는 본원에 기재된 임의의 크로마토그래피 방법을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
46. 1항 내지 45항 중 어느 한 항에 있어서, (c)가, 예를 들어, 질량 분광분석, 예를 들어, LC/MS, 탠덤 질량 분광측정법, 또는 RP-LCMS2에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
47. 1항 내지 46항 중 어느 한 항에 있어서, c)가 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS, 탠덤 질량 분광측정법, 또는 1D RP-LCMS2에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
48. 1항 내지 47항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것이 하나 또는 복수의 단백질 소화 산물 또는 각각의 단백질 소화 산물에 대한 질량, 전하, 체류 또는 방출 시간, 및 임의적으로 강도 (예를 들어, 존재비 또는 양)를 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.
49. 1항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 소화 산물, 또는 복수의 단백질 소화 산물 각각에 대해, 단백질 소화 산물의 질량, 전하, 체류 또는 방출 시간, 및 임의적으로 강도 (예를 들어, 존재비 또는 양) 중 하나 이상 또는 모두의 함수인 값 (예를 들어, 수치 또는 복수의 단백질의 소화 산물의 디스플레이 상에서의 위치에 관련된 값)을 할당하는 것을 포함하는 방법.
50. 49항에 있어서, 값을 3차원 표현, 예를 들어, 하나의 축, 예를 들어, y 축은 질량 대 전하의 비의 함수인 값을 나타내고, 제2 축, 예를 들어, x 축은 체류 또는 방출 시간의 함수인 값을 나타내며, 제3 축, 예를 들어, z 축은 단백질 소화 산물의 강도 (예를 들어, 존재비 또는 양)를 나타내는 표현으로 디스플레이하는 것을 포함하는 방법.
51. 49항 또는 50항에 있어서, 값이 질량, 전하, 체류 시간, 및 강도 (예를 들어, 존재비 또는 양)의 함수인 방법.
52. 49항 내지 51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 샘플로부터의 단백질 소화 산물의 값을 제2 샘플로부터의 단백질 소화 산물의 값과 비교하는 것을 포함하는 방법.
53. 52항에 있어서, 제1 샘플 내의 단백질 소화 산물의 양이 제2 샘플로부터의 단백질 소화 산물의 양보다 더 크고, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000% 더 큰 것인 방법.
54. 52항에 있어서, 제2 샘플 내의 단백질 소화 산물의 양이 제1 샘플로부터의 단백질 소화 산물의 양보다 더 크고, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 또는 1000% 더 큰 것인 방법.
55. 49항 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 복수의 단백질 소화 산물에 대한 값과 정체 사이의 상관관계를 제공하는 것을 포함하는 방법.
56. 1항 내지 55항 중 어느 한 항에 있어서,
테스트 샘플로부터의 단백질 소화 산물의 값, 예를 들어, 질량, 전하, 체류 또는 방출 시간, 및 임의적으로 강도 (예를 들어, 존재비 또는 양)의 함수인 값을 제공하고;
이러한 값에 대한 반응으로, 테스트 샘플로부터의 단백질 소화 산물을 식별 또는 분류하는 것
을 포함하는, 테스트 샘플로부터의 단백질 소화 산물을 식별 또는 분류하는 것을 추가로 포함하는 방법.
57. 56항에 있어서, 테스트 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대한 값을 참조 값, 예를 들어, 정체, 구조 또는 조성이 공지된 단백질 소화 산물에 대한 값과 비교하는 것을 포함하는 방법.
58. 57항에 있어서, 제1 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대한 값 및 참조 값의 비교에 대한 반응으로, 제1 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대해 정체, 구조 또는 조성을 분류 또는 할당하는 것을 포함하는 방법.
59. 1항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내의 복수의 단백질 소화 산물, 예를 들어, 단백질 소화 산물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%에 대해 정체, 구조 또는 조성이 분류 또는 할당되는 것인 방법.
60. 49항 내지 59항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것이 적어도 2, 10, 20, 96, 100, 192, 1,000, 또는 10,000개의 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대한 값을 참조 값, 예를 들어, 정체, 구조 또는 조성이 공지된 단백질 소화 산물에 대한 값과 비교하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
61. 49항 내지 60항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어, 질량 분광측정법에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것이, 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대한 값 및 참조 값의 유사성에 반응하여, 적어도 2, 10, 20, 96, 100, 192, 1,000, 또는 10,000개의 샘플로부터의 단백질 소화 산물에 대해 정체, 구조 또는 조성을 분류 또는 할당하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
62. 1항 내지 61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2, 10, 20, 96, 100, 192, 1,000, 또는 10,000개의 샘플 내의 복수의 단백질 소화 산물, 예를 들어, 단백질 소화 산물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%에 대해 정체, 구조 또는 조성이 분류 또는 할당되는 것인 방법.
63. 1항 내지 62항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 복수의 샘플에 대해 수행되고, 복수의 샘플 중 하나 이상이 상이한 제작 공정 또는 방법에 의해 생산되어, 예를 들어, 하나 이상의 단백질 소화 산물의 수준을 최적화, 예를 들어, 최소화 또는 최대화하는 조건 또는 조건 세트 (예를 들어, 변성제 선택, 변성제 농도, pH, 온도, 환원제, 인큐베이션 시간, 및 본원에 기재된 다른 조건 중 하나 이상)가 식별되게 허용하는 방법.
64. 1항 내지 63항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 샘플을 분석하도록 반복되고, 여기서 각각의 샘플이 복수의 조건, 예를 들어, 적어도 2, 10, 50, 96, 100, 192, 1,000, 또는 10,000개의 조건 하에 분석되고, 방법이 복수의 샘플의 분석에 반응하여 상기 복수의 조건 각각으로부터의 샘플을 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
65. 1항 내지 64항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 제작 공정 또는 방법, 예를 들어, 미리 선택되거나 최적화된 수준의 하나 이상의 단백질 소화 산물을 초래하는 제작 공정 또는 방법을 분류 또는 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
66. 1항 내지 65항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 제작 공정 또는 방법, 예를 들어, 미리 선택되거나 최적화된 수준의 하나 이상의 단백질을 초래하는 제작 공정 또는 방법을 분류 또는 선택하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
67. 1항 내지 66항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 위험 점수가 하기 중 하나 이상의 함수인 방법:
단백질 및 임의적으로 산물을 포함하는 제제를 제공받은 대상체에서의 원치 않는, 예를 들어, 표적 벗어남 성질, 예를 들어, 면역원성;
산물의 제제, 예를 들어, 약물의 제제 내의 단백질의 원치 않는 효과, 예를 들어, 변성, 침전 또는 색상을 야기하는 성향; 및
샘플 내에 존재하는 단백질의 존재비에 대한 값.
68. 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 샘플 내에서 식별된 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 적어도 2, 10, 50, 100, 200, 500, 1000개의 단백질 또는 모든 단백질)에 대한 단백질 위험 점수를 제공하도록 반복되는 것인 방법.
69. 1항 내지 68항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 단백질 위험 점수, 예를 들어, 면역원성 위험 점수, 예를 들어, 에피베이스® 플랫폼에 의해 생성된 바와 같은 점수를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
70. 1항 내지 69항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 에피베이스® 플랫폼에 의해 생성된 바와 같은 면역원성 위험 점수를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
71. 1항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 공정 위험 점수를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
72. 71항에 있어서, 공정 위험 점수가 샘플의 단백질의 하나 이상의 단백질 위험 점수의 함수인 방법.
73. 71항 또는 72항에 있어서, 공정 위험 점수가 하기 식을 기초로 하여 계산되는 것인 방법:
공정 위험 점수 = ∑([단백질 존재비]×[면역원성 위험 점수]).
74. 71항 내지 73항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 샘플, 예를 들어, 적어도 2, 10, 50, 96, 10, 192, 또는 1000개를 분석하도록 반복되며,
여기서 2개 이상의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)이 상이한 제작 공정 또는 방법을 사용하여 제공되고, 복수의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)에 대해 공정 위험 점수가 제공되거나, 또는
여기서 2개 이상의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)이 제작 공정 또는 방법 동안의 상이한 시점에 제공되고, 복수의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)에 대해 공정 위험 점수가 제공되는 것인
방법.
75. 71항 내지 74항 중 어느 한 항에 있어서, 제작 공정 또는 방법, 예를 들어, 샘플을 제공하도록 사용된 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수를 참조물과 비교하는 것을 포함하는 방법.
76. 71항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수를 제2 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수와 비교하는 것을 포함하는 방법.
77. 71항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시점의 공정의 공정 위험 점수를 제2 시점의 공정의 공정 위험 점수와 비교하는 것을 포함하는 방법.
78. 76항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 예를 들어, 추가 분석 또는 추가 사용을 위해, 예를 들어, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위해, 제작 공정 또는 방법 중 하나를 선택하는 것을 포함하는 방법.
79. 75항 또는 77항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 제작 공정 또는 방법의 파라미터, 예를 들어, 배지 보충물, 산소, 다가 양이온, 암모늄, 철, 질소, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘, 망가니즈, 응집 또는 정화 작용제 (예를 들어, 백반, 알루미늄, 클로로히드레이트, 황산알루미늄, 산화칼슘, 수산화칼슘, 황산철(II) (황산제1철), 염화철(III) (염화제2철), 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 알루민산나트륨, 규산나트륨), 선별 시약 (예를 들어, 항생제, 예를 들어, 네오마이신, 블라스티시딘, 히그로마이신, 퓨로마이신, 제오신, 미코페놀산), 부티르산나트륨, 또는 아미노산의 수준 또는 존재를 변경시키는 것을 포함하는 방법.
80. 75항 또는 77항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 제작 공정 또는 방법의 파라미터, 예를 들어, 배지 보충물, 산소, 다가 양이온, 암모늄, 철, 질소, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘, 망가니즈, 응집 또는 정화 작용제 (예를 들어, 백반, 알루미늄, 클로로히드레이트, 황산알루미늄, 산화칼슘, 수산화칼슘, 황산철(II) (황산제1철), 염화철(III) (염화제2철), 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 알루민산나트륨, 규산나트륨), 선별 시약 (예를 들어, 항생제, 예를 들어, 네오마이신, 블라스티시딘, 히그로마이신, 퓨로마이신, 제오신, 미코페놀산), 부티르산나트륨, 또는 아미노산의 수준 또는 존재를 변경시키지 않으면서 제작 공정 또는 방법을 계속하는 것을 포함하는 방법.
81. 산물을 포함하는 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 여기서 샘플이 1항 내지 6항, 및 17항 내지 80항 중 어느 한 항의 샘플 분석 방법에 의해 분석되는, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 방법.
82. 1 내지 81항 중 어느 한 항에 있어서, 제작 공정 또는 방법이 복수의 세포 (예를 들어, 복수의 CHO 세포, 예를 들어, 복수의 GS-CHO 세포)로부터의 발현 및 분비를 포함하는 것인 방법.
83. 재조합 폴리펩티드 샘플 내의 숙주 세포 단백질 (HCP)를 검출, 모니터링, 식별 또는 정량화하는 방법이며,
a) 세포 배양물 (예를 들어, CHO 세포 배양물, 예를 들어, GS-CHO 세포 배양물)로부터 발현 및 분비된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 생성시키거나 또는 수득하고;
b) 복수의 HCP 성분 (예를 들어, 분획화 또는 절단된 HCP 성분)을 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 분리하고, 복수의 분리된 HCP 성분 중 각각의 HCP 성분의 식별 특성을 결정하고;
c) 복수의 것 중 각각의 HCP의 식별 특성을 평가하고;
이에 의해 재조합 폴리펩티드 샘플 내의 숙주 세포 단백질 (HCP)를 검출, 모니터링, 식별 또는 정량화하고;
임의적으로, d) 복수의 샘플, 예를 들어, 제작 공정 또는 방법으로부터의 상이한 시점에 제공된 샘플에 대해 (a)-(c)를 반복하고, 복수의 샘플에 걸쳐 식별 특성, 예를 들어, 단백질 또는 단백질들의 위험을 평가하는 것
을 포함하는 방법.
84. 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 제작 방법을 평가하는 방법이며,
a) 세포 배양물 (예를 들어, CHO 세포 배양물, 예를 들어, GS-CHO 세포 배양물)로부터 발현 및 분비된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 생성시키거나 또는 수득하고;
b) 복수의 HCP 성분 (예를 들어, 분획화 또는 절단된 HCP 성분)을 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 분리하고, 복수의 분리된 HCP 성분 중 각각의 HCP 성분의 식별 특성을 결정하고;
c) 복수의 것 중 각각의 HCP의 식별 특성을 평가하고;
임의적으로, d) 복수의 샘플, 예를 들어, 산물을 제작하는 상이한 방법들에 의해 제공된 샘플에 대해 (a)-(c)를 반복하고, 복수의 제작 방법에 걸쳐 식별 특성, 예를 들어, 단백질 또는 단백질들의 위험을 평가하고,
이에 의해 제작 방법을 평가하는 것
을 포함하는 방법.
85. 1항 내지 84항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 배양 상청액을 포함하는 방법.
86. 1항 내지 84항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 세포 용해물을 포함하는 방법.
87. 1항 내지 86항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 배양 상청액 및 세포 용해물을 포함하는 방법.
88. 1항 내지 87항 중 어느 한 항에 있어서, 산물 또는 재조합 폴리펩티드가 동종중합체성 또는 이종중합체성 폴리펩티드, 예를 들어, 호르몬, 성장 인자, 수용체, 항체, 시토카인, 수용체 리간드, 전사 인자 또는 효소, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 그의 단편, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양 또는 소 항체로부터 유래된 인간화 항체 또는 그의 단편, 전형적으로는 토끼 기원의 것인 방법.
89. 1항 내지 88항 중 어느 한 항에 있어서, 산물 또는 재조합 폴리펩티드가 치료용 폴리펩티드인 방법.
90. 1항 내지 89항 중 어느 한 항에 있어서, 산물 또는 재조합 폴리펩티드가 표 1, 표 2, 표 3, 또는 표 4에 개시된 것인 방법.
91. 1항 내지 90항 중 어느 한 항에 있어서, 산물 또는 재조합 폴리펩티드가 항체인 방법.
92. 91항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
93. 92항에 있어서, 모노클로날 항체가 치료용 항체인 방법.
94. 82항 내지 93항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
95. 94항에 있어서, 숙주 세포가 마우스, 래트, 차이니즈 햄스터, 시리안 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 흰족제비 또는 고양이인 방법.
96. 95항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포인 방법.
97. 96항에 있어서, CHO 세포가 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS 세포, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포, CHOZN 세포, 또는 CHO-유래 세포인 방법.
98. 82항 내지 97항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 HeIa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포인 방법.
99. 1항 내지 98항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 120, 96, 72, 48, 24, 12, 6, 4, 또는 3시간 이하로 실시되는 것인 방법.
100. HCP 또는 단백질 소화 산물에 대한 식별 특성 및 세포 배양물 (예를 들어, CHO, 예를 들어, GS-CHO 세포 배양물)의 세포 배양 상청액으로부터 유래된 단백질 위험 점수의 라이브러리를 포함하는 (예를 들어, 컴퓨터 판독가능 매체 상에 메모리화 또는 기록된) 데이터베이스.
실시예
하기의 실험적 실시예를 참조로 본 발명이 추가로 상세하게 기재된다. 이러한 실시예들은 설명을 목적으로만 제공되고, 달리 상술되지 않는 한 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 하기의 실시예에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하고, 오히려, 본원에 제공된 교시내용의 결과로서 명백해지는 임의의 모든 변동을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이전의 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 이용할 수 있고 청구된 방법을 실행할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기의 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 언급하고, 어떠한 방식으로도 나머지 개시내용을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 방법
하기는 실시예 2, 3, 및 4 전반에 걸쳐 사용 및 언급된 방법을 기재한다.
테스트 샘플
cB72.3 IgG4k 항체가 1000L 규모 발효 바이오리액터 배양으로부터 생산되었다. 물질을 표준 1차 회수 여과 절차를 사용하여 수확하거나, 또는 0.1% (최종) 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드를 첨가하여 처리하고, 밀리포어(Millipore)의 클래리졸브(Clarisolve) 필터를 사용하여 수확하였다. 물질의 각각의 배치에 대해, (1) 정화된 세포 배양 상청액, (2) 단백질 A (맵셀렉트 슈어(MAbSelect SuRe)) 크로마토그래피로부터의 중화된 용출물, (3) 음이온 교환 (사르토바인드(Sartobind) Q) 크로마토그래피로부터의 용출물의 샘플이 제공되었다.
HCP ELISA
고정화된 항-CHO HCP 폴리클로날 항체 (널-형질감염 CHO 세포주로부터 유래된 단백질에 대해 생성됨)를 사용하여 테스트 샘플 내의 잔여 HCP를 포착하였다. 결합된 HCP를 비오틴에 접합된 동일한 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였고, 차례로 이를 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 엑스트라바딘에 의해 검출하였다. 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 (TMB)을 색원성 기질로서 사용하였다.
샘플 제조
단백질 치료제의 구조 분석을 위한 일반적인 트립신 소화 프로토콜을 샘플 제조에 사용하였다. 각각의 샘플 내의 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도 측정에 의해, 그리고 cB72.3에 대한 이론적으로 계산된 흡광 계수를 참조하여 결정하였다. 별개의 샘플 제제들로부터의 3개의 기술적 사본을 각각의 샘플에 대해 분석하였다. 모든 미가공 데이터를 PEAKS 스튜디오(PEAKS Studio) (펩티드 및 단백질 식별용) 및 프로테오믹스용 프로제네시스 QI (샘플 전체에 걸친 정규화를 포함하여, 라벨이 없는 정량화용)를 사용하여 병렬로 프로세싱하였다. 펩티드 식별물을 데이터 대조를 위해 프로제네시스 QI 내로 이입하였다. 각각의 단백질에 대해 3개의 가장 높은 강도의 펩티드에 대한 모든 검출된 전하 상태의 합계되고 정규화된 강도를 기초로 하여 수동으로 Hi3 정량화를 수행하였다. 적어도 3개의 펩티드가 검출된 경우에만 단백질을 정량화에 적용하였다. 제안된 분석 공정의 최상위 개관이 도 1에 제시된다.
LC-MS/MS용 샘플 제조
샘플을 6.6 M 구아니딘 HCl에서 변성시키고, TCEP로 환원시키고, 트립신으로 소화시킨 후 분석하였다. 각각의 샘플에 대해 3개의 사본을 제조하였다. 단백질 혼합물로부터 질량 분광측정법과 상용성인 완충제 매트릭스 내로 펩티드를 효과적으로 생산할 수 있는 임의의 샘플 제조 방법이 이러한 분석 접근법과 함께 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
LC-MS/MS 데이터 획득
써모 퓨전 트리브리드(Thermo Fusion Tribrid) Q-OT-qIT 질량 분광계에 커플링된 디오넥스 RSSL나노(Dionex RSSLnano) 나노LC 시스템을 사용하여 데이터를 획득하였다. 각각의 샘플에 대한 1 μl 부피의 트립신처리 펩티드를 98:2 물:아세토니트릴 플러스 0.08% TFA의 로딩 완충제에서 펩맵100(PepMap100) C18 300Å 나노-트랩(Nano-Trap) 칼럼 (써모) 상에 3분 동안 12 μl/분으로 주입하였다. 3분 후, 나노LC 흐름을 역방향으로 트랩핑 칼럼을 통해 분석 칼럼 (이지스프레이(EasySpray) RSLC C18 2 μm, 100Å, 75 μm x 25 cm (써모)) 상으로 향하게 하였다. 물 내의 0.1% 포름산 내지 80:20 아세토니트릴:물 내의 0.1% 포름산의 선형 구배를 적용하였다.
소스 이온화 셋팅은 2500 V 분무 전압 및 275℃의 이송관 온도에서의 획득 동안 정적이었다. 질량 분광계는 350-1,550 m/z 범위에 걸친 사중극자 단리, 2.0e5의 AGC 표적 및 50 ms의 최대 주입 시간으로 120,000 FWHM (반치전폭) 공칭 해상도의 오비트랩에서 MS1 데이터를 획득하기 위해 양성 이온화 모드로 구성되었다. 별개의 시약 이온 소스로부터 생성된 플루오란틴 이온 고정 질량을 기초로 하는 내부 표준을 사용하여 데이터를 질량-수정하였다. z=2 내지 z=6의 전하 상태만 MS2 단편화용으로 선택하였다.
28%의 정규화된 충돌 에너지, 1.0e4의 AGC 표적, 및 "정상" 트랩 스캔 속도에서의 200 ms의 최대 스캔 시간으로 선형 이온 트랩에서 MS2 단편화를 수행하였다.
질량 분광측정법 데이터 획득
MS2 단편화를 기초로 하는 단백질 식별을 PEAKS 스튜디오 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 세포 배양 상청액 (CCCS)에 대해서만 단백질 식별을 수행하였다. 디코이 융합 방법론을 사용하여 펩티드 수준에서의 거짓 발견율을 <0.1%로 제어하였다 (Zhang, J, et al., "PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification", Mol.Cell Proteomics 4(11), 111 (2012)). 적어도 3개의 독특한 펩티드가 각각의 단백질 할당에 요구되었다. 모체 이온의 경우 <7.5 ppm, 단편 이온의 경우 <0.3 Da으로 질량 허용이 특정되었다. TrEMBL 데이터베이스 내의 로덴티아 탁사(Rodentia taxa)에 대해 식별이 이루어졌다.
모든 샘플에 대한 MS1 데이터 프로세싱을 프로테오믹스용 프로제네시스 QI 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 샘플 데이터를 이입하였고, 자동적으로 체류 시간이 정렬되었으며, 반응이 대조군 상청액 샘플에 대해 정규화되었다. "최고" 민감도 셋팅으로 피크 검출을 수행하였다. 펩티드 식별물을 이입하였고, 할당을 시각적으로 검사하여, 스펙트럼 간섭을 나타내지 않은 펩티드에 대해 배타적으로 정량화가 수행되었음을 확실히 하였다. Hi3 방법론을 기초로 하여 상대적인 정량화를 수행하였다.
인 실리코 면역원성 분석
각각의 식별된 단백질에 대한 서열을 에피베이스® 플랫폼을 사용하는 인 실리코 면역원성 사정을 위해 제출하였다. 에피베이스®는 면역원성 위험 스크리닝을 위한 인 실리코 플랫폼이다 (Walle Van, I, et al., "Immunogenicity screening in protein drug development", Expert Opin Biol Ther 7(3), 405 (2007)). 이러한 플랫폼은 서열로부터 유래된 모든 10량체 펩티드의 HLA 클래스 II 수용체에 대한 결합 친화력을 예측함으로써 단백질 서열 내의 잠재적인 T 세포 에피토프를 식별한다.
전체 집단을 표적화하는 스크리닝을 수행하였다. 전체 집단 HLA 세트는 85개의 HLA 클래스 II 동종이형, 특히 면역원성 프로파일링의 주요 초점인 43개의 DRB1 동종이형을 포함한다. 상위 25%의 가장 풍부한 인간 단백질을 포함하는 인간 프로테옴 필터를 사용하여, 자가-펩티드 (HLA 분자 상에 제시되지만 T 세포 수용체와 결합하지 않을 펩티드)를 필터링해냈다. 단백질 내의 예측되는 T 세포 에피토프의 수 및 영향을 받은 HLA 동종이형의 집단 빈도를 고려함으로써 단백질에 대한 면역원성 위험 점수가 수득된다.
실시예 2: CHO HCP 라이브러리의 생성
본 실시예에서 제공된 방법은 실시예 2에 기재된 방법에서 사용되는 CHO HCP 라이브러리의 생성을 기재한다.
CHO 세포 배양의 CCCS로부터 결정된 HCP로부터 유도된 MS1 피크의 참조 라이브러리가 생성되었다. 이러한 참조 라이브러리는 체류 시간 및 m/z 공간에서의 윈도우를 규정하였고, 그 후 이를 정제된 샘플에 대해 획득된 데이터에 적용하였다. 포유동물 세포 발현 시스템에서 생산 바이오리액터로부터 유래된 CCCS는 통합 영역에서 HCP로서 존재할 수 있는 모든 CHO 단백질을 함유하기 때문에, 이는 후속적으로 동일한 분석 내의 모든 정제된 샘플에 적용될 수 있다. 따라서 HCP 분석의 식별 및 정량화가 분리되지만, 분석 내의 모든 정제된 샘플에 대한 각각의 관련된 특정한 CCCS의 샘플이 요구되나, 일반적으로 이는 생물공정 개발에 대한 제한사항이지 않다. CCCS-유래 통합 라이브러리를 사용하는 것은 다중 분석 실행에 대한 필요성을 방지한다.
총 627개의 단백질 식별물이 모든 분석된 CCCS 샘플에 걸쳐 수득되었다. 이러한 집단 중에서, 259개의 단백질이 MS1 프로세싱 소프트웨어에서의 피크 검출 및 정량화를 허용하도록 존재비가 충분하였다. 검출 한계와 정량화 한계 사이의 감도 차이는 각각의 값을 생성시킨 상이한 메커니즘에 기인할 수 있다. 검출 한계는 이온 트랩 단편화 데이터로부터 생성된 펩티드 서열에 대한 p 값에 의해 MS2 데이터로부터 정의된다. 이러한 작업에서 사용된 트랩 내로의 상대적으로 높은 이온 주입 시간은 높은 MS2 검출 감도를 초래하였다. 추가적으로, 단일한 MS1 모체 이온 스캔만을 기초로 하여 MS2 검출이 가능하였다. 대도적으로, MS1 데이터의 정량화에 사용된 피크 검출 알고리즘은 잘 규정된 크로마토그래피 피크가 다중 스캔에 걸쳐 존재하는 것을 필요로 하였다 - 소수의 스캔에서 나타나는 신호는 전형적으로 데이터 필터링 QC 점검을 통과하지 못할 것이다. 또한 크로마토그래피 피크 검출에 대한 요구사항은 (500,000 이하의 FWHM 해상도의 더 낮은 스캔 속도보다는) 120,000 FWHM 해상도의 비교적 신속한 MS1 스캔 시간을 사용하게 하였다.
상대적인 정량화를 Hi3 접근법을 기초로 하여 수행하였다 (J. C. Silva, et al., "Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition", Mol. Cell Proteomics. 5(1), 144 (2006)). mAb 산물 펩티드 피크를 정량화 표준으로서 사용하여, 상청액 샘플에서의 MS1 피크 검출이 아래로 10 ppm의 보고된 역치까지 가능하였다. LC-MS에 의해 수득된 총 HCP 결과를 표준 CHO HCP ELISA를 사용하여 테스트된 동일한 샘플에 대해 수득된 결과에 비교하였다. 간략하게, 고정화된 항-CHO HCP 폴리클로날 항체 (널-형질감염 CHO 세포주로부터 유래된 단백질에 대해 생성됨)를 사용하여 테스트 샘플 내의 잔여 HCP를 포착하였다. 결합된 HCP를 비오틴에 접합된 동일한 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였고, 차례로 이를 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 엑스트라바딘에 의해 검출하였다. 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 (TMB)을 색원성 기질로서 사용하였다. 검정법에서 생성된 표준 곡선에 대해 HCP를 정량화하였다. 검정법간 대조군이 모든 검정법에 포함되었다. HCP의 스파이크 회복이 100%±25%의 허용가능한 기준을 충족시켰다. 결과가 표 5에 제시된다. MSS는 맵셀렉트 슈어를 지칭한다.
표 5. ELISA 및 나노LC-MS/MS에 의한 총 HCP 정량화의 비교
Figure pct00017
질량 분광측정법에 의해 결정된 보고된 총 HCP 값이 ELISA에 의해 보고된 것보다 10- 내지 100배 더 높았지만, 정제된 mAb 산물 및 부분적으로 정제된 mAb에서 611 ppm 내지 10,000 ppm으로 다른 그룹의 기존 연구에서 수득된 값과 대체로 일치하였다 (C. E. Doneanu, et al., "Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry", MAbs. 4(1), 24 (2012); A. Farrell, et al., "Quantitative Host Cell Protein Analysis Using Two Dimensional Data Independent LC-MS(E)", Anal. Chem. 87(18), 9186 (2015); M. R. Schenauer, G. C. Flynn, and A. M. Goetze, "Identification and quantification of host cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry", Anal. Biochem. 428(2), 150 (2012); Q. Zhang, et al., "Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry", MAbs. 6(3), 659 (2014)).
실시예 3: DSP로의 HCP 챌린지에 대한 (폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드)의 효과
본 실시예에서 제공된 방법은 1D 크로마토그래피를 특히 재조합 치료용 폴리펩티드, 예를 들어, 항체의 생산 공정을 모니터링 및 개발하기 위한 도구로서 사용하는 HCP의 프로테오믹 기반 분석에 관한 것이다. 본 실시예는 실황 공정 개발 연구를 기재하고, 여기에서 생산 배양물의 1차 회수 동안 사용되는 새로운 공정 화학물질, 즉 응집성 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드의 영향이 정제 공정을 위한 HCP 청소의 관점에서 결정되었다.
pDADMAC의 존재 및 부재 하의 스트림으로부터의 등가의 샘플들 사이의 HCP를 존재비의 관점에서 비교하였다. 거짓 발견율을 5%로 제어하였다. 정량화 데이터가 수득된 259개의 단백질 중에서, 121개의 단백질이 pDADMAC로 처리되지 않은 CCCS에 비교하여 pDADMAC로 처리된 CCCS 샘플에서 유의한 (p<0.05, q<0.05) 감소를 나타냈다. 실험에서 정량화된 각각의 단백질에 대한 pI 값을 계산하여, pDADMAC-매개 HCP 제거가 단백질 pI와 상관되었는지를 결정하였고, 전반적인 상관관계가 관찰되지 않았지만 (도 2), pDADMAC의 존재 하에 존재비의 2배 초과 증가를 나타내는 단백질 모두가 계산된 pI 값이 <5였다는 것이 주목되었다. pI 계산은 아미노산 서열만을 기초로 하여 수행되었다: 용매 접근성 전하 정보는 이러한 분석에 포함되지 않았고, 전하 기반 상호작용은 전체적인 전하보다는 단백질 표면 상의 특정한 패치에 의해 매개되기 쉽다.
10개의 단백질이 pDADMAC-처리 CCCS 샘플에서 유의한 (p<0.05, q<0.05) 증가를 나타냈다 (표 6). 단백질 SET (존재비에서 최고의 변화를 나타내는 단백질)의 정량화에 사용된 예시적인 펩티드에 대한 LC-MS 프로파일이 도 3에 제시된다.
표 6. pDADMAC 처리 상에서 CCCS 내의 존재비의 유의한 (p<0.05, q<0.05) 증가를 나타내는 HCP
Figure pct00018
Figure pct00019
분석에 걸쳐, pDADMAC의 존재 또는 부재로 인해 단백질 A 용출물 샘플 또는 최종 산물 샘플 내의 임의의 HCP의 존재비에서 유의한 차이 (p<0.05, q<0.05)가 결정되지 않았다 (표 7). 여기에서 취해진 통계적 접근법은 개별적인 정제 공정이 전체 집단에 비교하여 성능에서의 유의한 개선 또는 감소를 생성시켰는지를 결정하는 것인, 분석적 방법을 위한 제안된 적용을 기초로 하였다 (따라서, 모든 집단이 등가였다는 귀무 가설을 사용하였다). 따라서, pDADMAC를 포함한 공정은 특정한 HCP 수준의 관점에서 제어 공정보다 유의하게 더 양호하거나 또는 더 나쁘지 않았다.
표 7. 배양물이 pDADMAC를 사용하여 수확되었을 때 존재비 증가를 나타내는 단백질에 대한 DSP를 통한 HCP 청소 (MSS는 맵셀렉트 슈어를 지칭한다)
Figure pct00020
실시예 4: 공정 면역원성 위험 사정
정제된 산물 샘플 내의 HCP 로드의 검토에서, CCCS에서 식별된 HCP의 3%가 정제된 샘플 내의 HCP 함량의 60% 초과를 포함한다는 것이 계산되었다. 이러한 관찰은 정제를 통한 HCP의 "피기백"이 대부분의 HCP 불순물의 원인이 될 가능성이 있다는 기존의 연구와 일치하고 (N. E. Levy, et al., "Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing", Biotechnol. Bioeng. 111(5), 904 (2014); V. N. Sisodiya, et al., "Studying host cell protein interactions with monoclonal antibodies using high throughput protein A chromatography", Biotechnol. J. 7(10), 1233 (2012); R. D. Tarrant, et al., "Host cell protein adsorption characteristics during protein A chromatography", Biotechnol. Prog. 28(4), 1037 (2012)); 정제된 샘플 내에 존재하는 것과 HCP ELISA에 사용된 항혈청의 생성에 사용된 것 사이에 HCP 집단에서의 주요 차이가 존재한다는 것을 확증하였다.
CCCS 샘플에서 식별된 HCP의 전체 목록을 론자 에피베이스® 플랫폼을 사용하여 분석하여, 각각의 단백질에 할당된 위험 점수 (면역원성 위험 점수, 예를 들어, 면역원성 위험 점수)가 생성되었다. 생성된 점수는 T-세포 활성화에 대한 최악의 경우의 시나리오를 나타낸다 - MHC-결합제로서 식별된 펩티드의 서브세트만 면역원성에 기여하는 다른 인자 예컨대 단백질 내재화, 항원 프로세싱 및 T 세포 수용체 특이성으로 인해 실제로 T-세포 에피토프일 것이다. CCCS 샘플 내의 상위 20개의 가장 풍부한 단백질이 그의 각각의 공정 면역원성 위험 점수와 함께 표 8에 제시된다.
표 8. pDADMAC의 존재 및 부재 하에 수확된 정제된 산물 내의 20개의 가장 풍부한 HCP에 대한 면역원성 위험 점수.
Figure pct00021
전체적인 HCP 면역원성 위험 점수를 분석된 샘플 각각에 대해 계산하였다 (표 9). 이는 하기와 같이 계산되었다:
공정 위험 점수 = ∑([단백질 존재비]×[면역원성 위험 점수])
표 9. 공정 중의 mAb 및 정제된 mAb에 대한 전체적인 공정 면역원성 위험 점수 (MSS는 맵셀렉스 슈어를 지칭한다)
Figure pct00022
공정 위험 점수는 연구 중인 공정 변화가 면역원성 단백질의 수준을 기초로 하여 환자 위험 증가를 초래하지 않았음을 생물학적으로 관련된 방식으로 실연한다. 추가적으로, 이러한 점수는 현탁 세포 배양에서 요구될 가능성이 없을 면역원성 관점에서의 고-영향력 단백질을 식별하는데 사용되었다.
이러한 결과들은 HCP의 프로테오믹 기반 분석이 전체 제작 공정에 걸쳐 사용될 수 있고, 따라서 제작 확장성 동안 HCP를 검출하기 위한 상이한 검정법의 개발을 방지한다, 즉 방법이 규모와 독립적이다는 것을 실연한다. 소규모에서 대규모까지 전체 제작 공정에 걸쳐 동일한 모니터링 방법을 사용하는 것은 다수의 쟁점 예컨대 상이한 제작 규모들에서 다중 모니터링 방법을 개발해야하는 필요성과 함께 하나의 규모에서 또 다른 규모로 출력물을 변환하는 것에서의 동반 오류를 방지한다. 그보다는, 프로테오믹 방법은 제작 규모와 독립적으로 사용될 수 있는 간단하고, 일관적이며, 재현가능한 방법을 제공한다. 이는, 예를 들어, 세포 배양, 단백질 발현 동안, 뿐만 아니라 정제 전 및 후에 HCP에서의 변화를 모니터링하도록 공정의 상이한 단계들에서 동일한 HCP 세트가 모니터링되는 것을 확실하게 한다.
이러한 공정은 개발 공정 내로 완전히 통합되어 다수의 장점을 제공하는 면역원성 계산을 제공하고, 이는 (1) 게놈이 공지되어 있는 임의의 생산 시스템 또는 이러한 생산 시스템의 특정한 변이체 (예를 들어, 구체적으로 CHO의 서브세트로서의 GS CHO)에 대해 면역원성이 수행되게 허용되게 하는 방법, 및 (2) (예를 들어, 지리학적 지역 또는 민족성에 의해) 상이한 환자 집단들에 대해 수행될 면역원성 사정을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이는 전체 집단에 대한 HCP에 대한 전반적인 평균 점수가 단일한 특히 감수성인 군에 대한 높은 점수를 차폐할 수 있기 때문에 중요하다.
요약하면, 이전의 실시예들은 HCP 불순물의 신속하고 확장성인 정성적 및 반-정량적 분석을 실연한다. 이러한 접근법은 가장 보편적인 확립된 방법 (C. E. Doneanu, et al., "Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry", MAbs. 4(1), 24 (2012))에 비교하여 약 10배의 처리량 증가를 실연하였다. 분석은 샘플 당 1시간 미만의 분석 시간으로 트리브리드 질량 분광계를 사용하여 1차원 역상 나노LC-MS2를 사용하여 수행되었다. 이러한 접근법은 정화된 배양 상청액으로부터 결정된 HCP로부터 유도된 MS1 피크의 참조 라이브러리의 생성에 의존하였다. 이러한 참조 라이브러리는 체류 시간 및 m/z 공간에서의 윈도우를 규정하였고, 그 후 이를 정제된 샘플에 대해 획득된 데이터에 적용할 수 있다. 따라서, 정제된 항체 치료제 내의 HCP를 식별하는 테스트 방법의 능력이 최대화되고, Hi3 방법론을 사용하여 수행된 반-정량적 분석으로부터 분리된다 (J. C. Silva, et al., "Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition", Mol. Cell Proteomics. 5(1), 144 (2006)). 그 후, 정제된 물질의 HCP 프로파일이 에피베이스® 인 실리코 면역원성 예측 도구와 조합되어, 생산 공정에 대한 전반적인 HCP 면역원성 위험 점수가 생성되었다. 환자 영향, 잠재적인 산물 영향 또는 생체내 관련성의 관점에서 식별 및 사정되었으면, 특정하게 중요한 핵심 HCP가 특정한 EILSA 또는 표적화 LC-MS2 방법을 통한 일상적인 QC 분석의 일부로서 모니터링될 수 있다.
실시예 5: 방법
실시예 5-8에서, 위험-기반 공정 개발 및 단백질 발현 시스템의 기계론적 분석 둘 다를 위한 프로테오믹 접근법이 포유동물 및 효모 시스템 둘 다에서 테스트되었다. 이러한 방법은 생산 공정의 선택 및 최적화를 용이하게 하도록 전반적 및 특정한 위험 인자를 결정하였고, 샘플 수령 후 1주일 이내에 결과를 전달하였다 - 데이터의 턴어라운드가 공정 개발 환경에서 결정적으로 중요하다. 이러한 방식으로 생성된 데이터는 임의의 다른 확립된 기술에 의해 수득가능하지 않았다.
이러한 데이터세트는 이러한 방법의 일상적인 사용이 상업적인 공정 개발 프로젝트에서 실행될 수 있음을 입증한다.
하기는 실시예 6, 7 및 8 전반에 걸쳐 사용 및 참조된 방법을 기재한다. 실시예 5가 언급되지 않은 경우, 실시예 1의 방법이 실시예 6, 7, 및 8에 적용된다.
LC-MS/MS용 샘플 제조
각각의 샘플에 대해 3개의 사본을 제조하였다. 10 μl 부피의 각각의 샘플을 0.5 ml 에펜도르프 튜브 내로 옮겼다. 90 μl 0.5 M MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) pH 5.5, 6.6 M 구아니딘 HCl, 10 mM TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)를 각각의 사본에 첨가하였다. 50℃에서 30분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 이어서 모든 샘플을 제바스핀(ZebaSpin) 탈염 칼럼 (써모)을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 0.1 M 트리스 pH 8.0, 0.5M 요소, 1 mM TCEP 내로 완충제 교환하였다. 질량 분광측정법-등급 트립신 (프로메가)을 1:20 트립신:단백질 비로 첨가하고 25℃에서 18시간 동안 인큐베이션하여 소화를 수행하였다. 2% (최종) TFA (트리플루오로아세트산)를 첨가하여 소화를 켄칭시켰다.
LC-MS/MS 데이터 획득
써모 퓨전 트리브리드 Q-OT-qIT (사중극자-오비트랩-선형 이온 트랩) 질량 분광계에 커플링된 디오넥스 RSSL나노 나노LC 시스템을 사용하여 데이터를 획득하였다. 각각의 샘플에 대한 1 μl 부피의 트립신처리 펩티드를 98:2 물:아세토니트릴 플러스 0.08% TFA의 로딩 완충제에서 펩맵100 C18 300Å 나노-트랩 칼럼 (써모) 상에 3분 동안 12 μl/분으로 주입하였다. 3분 후, 나노LC 흐름을 역방향으로 트랩핑 칼럼을 통해 분석 칼럼 (이지스프레이 RSLC C18 2 μm, 100Å, 75 μm x 25 cm (써모)) 상으로 향하게 하였다. 물 내의 0.1% 포름산 내지 80:20 아세토니트릴:물 내의 0.1% 포름산의 선형 구배를 적용하였다.
소스 이온화 셋팅은 2500 V 분무 전압 및 275℃의 이송관 온도에서의 획득 동안 정적이었다. 질량 분광계는 350-1,550 m/z 범위에 걸친 사중극자 단리, 2.0e5의 AGC 표적 및 50 ms의 최대 주입 시간으로 120,000 FWHM 공칭 해상도의 오비트랩에서 MS1 데이터를 획득하기 위해 양성 이온화 모드로 구성되었다. 별개의 시약 이온 소스로부터 생성된 플루오란틴 이온 고정 질량을 기초로 하는 내부 표준을 사용하여 데이터를 질량-수정하였다. z=2 내지 z=6의 전하 상태만 MS2 단편화용으로 선택하였다.
28%의 정규화된 충돌 에너지, 1.0e4의 AGC 표적, 및 "정상" 트랩 스캔 속도에서의 200 ms의 최대 스캔 시간으로 선형 이온 트랩에서 MS2 단편화를 수행하였다.
질량 분광측정법 데이터 획득
MS2 단편화를 기초로 하는 단백질 식별을 PEAKS 스튜디오 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. CCCS (정화된 세포 배양 상청액)에 대해서만 단백질 식별을 수행하였다. 디코이 융합 방법론을 사용하여 펩티드 수준에서의 거짓 발견율을 <0.1%로 제어하였다 (Zhang, J, et al., "PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification", Mol.Cell Proteomics 4(11), 111 (2012)). 적어도 3개의 독특한 펩티드가 각각의 단백질 할당에 요구되었다. 모체 이온의 경우 <7.5 ppm, 단편 이온의 경우 <0.3 Da으로 질량 허용이 특정되었다.
존재하는 단백질을 식별하도록 PEAKS 스튜디오 7을 사용하여 UNIPROT CHO 프로테옴 (http://www.uniprot.org/)에 대해 데이터를 프로세싱하였다. 배양 상청액 샘플에 대해서만 식별을 수행하였다. 모든 샘플을 프로테오믹스용 프로제네시스 QI를 사용하여 프로세싱하였다. PEAKS로부터의 식별물을 실험 전반에 걸쳐 정량화용 프로제네시스 내로 이입하였다. 각각의 세포주에 대한 데이터를 독립적으로 프로세싱하였다. Hi5 방법론을 사용하여 정량을 수행하였다.
SBQ (사르토바인드 Q)로 정제된 세포주 각각에 대해, 프로테오믹스용 프로제네시스 QI 소프트웨어 내에서 Hi5 정량화를 수행하였다. 이러한 경우에, Hi5 정량화가 소프트웨어 (이러한 기능성을 포함하도록 업그레이드되었음) 내에서 수행되었다 - 이러한 능력은 데이터 분석의 복잡성을 크게 감소시켰다. 정량화 목적을 위해, 항체 중쇄 또는 경쇄가 정량화 표준물로서 사용되었고, 2,000,000으로 설정되었다 (소프트웨어 내의 단위는 fmol로서 특정되지만, 각각의 몰의 mAb는 2 mol의 중쇄 및 2 mol의 경쇄를 함유하기 때문에, HCP 수준이 백만분율로 보고되도록 이러한 값이 설정되었다.
인 실리코 면역원성 분석
각각의 식별된 단백질에 대한 서열을 에피베이스® 플랫폼을 사용하는 인 실리코 면역원성 사정을 위해 제출하였다.
에피베이스®는 면역원성 위험 스크리닝을 위한 인 실리코 플랫폼이다. 이러한 플랫폼은 서열로부터 유래된 모든 10량체 펩티드의 HLA 클래스 II 수용체에 대한 결합 친화력을 예측함으로써 단백질 서열 내의 잠재적인 T 세포 에피토프를 식별한다.
전체 집단을 표적화하는 스크리닝을 수행하였다. 전체 집단 HLA 세트는 85개의 HLA 클래스 II 동종이형, 특히 면역원성 프로파일링의 주요 초점인 43개의 DRB1 동종이형을 포함한다. 상위 25%의 가장 풍부한 인간 단백질을 포함하는 인간 프로테옴 필터를 사용하여, 자가-펩티드 (HLA 분자 상에 제시되지만 T 세포 수용체와 결합하지 않을 펩티드)를 필터링해냈다.
단백질 내의 예측되는 T 세포 에피토프의 수 및 영향을 받은 HLA 동종이형의 집단 빈도를 고려함으로써 단백질에 대한 면역원성 위험 점수가 수득된다.
실시예 6: 고위험 단백질의 존재를 최소화하기 위한 숙주 세포주의 정제 조건의 선택
본 실시예에서 제공된 방법은 생물제제의 정제 계획의 개발에서 유용하다. 정제 공정 단계의 최적화를 위한 전형적인 작업흐름은 조건들의 조합을 스크리닝하는 것을 수반한다. 이러한 경우에, 사르토바인드 Q 수지를 사용하는 이온 교환 단계가 절차에서 사용된 완충제 pH 및 칼럼의 로딩 용량의 관점에서 조사되었다. 일부 확립된 접근법은 이러한 조건들을 최적화하도록 AKTA-규모 정제를 사용하여, 총 9개의 샘플의 비교를 초래한다. 그러나, 정제 조건의 스크리닝을 위한 로봇 플랫폼의 사용 증가는 표준 개발 단계에서 생성될 샘플 개수의 실질적인 증가를 초래하였다. 이러한 단계들을 지원하기 위해, 단일 분석에서의 96개 이상의 샘플의 분석이 결과의 적합한 턴어라운드 속도로 수행되어 의사 결정을 허용하여야 한다.
이러한 조건을 모방하기 위해, 숙주 세포주와 산물 사이의 추가적인 비교가 실험에 또한 포함되었다. 이는 대표적인 샘플 번호가 테스트되도록 허용하였지만, 방법이 후보 생산 세포주 및 생산 계획의 통합 테스트를 지지할 수 있다는 것을 또한 실연하였다. 동일한 산물을 발현하는 세포주들이 불순물 프로파일/위험이 매우 상이할 수 있다는 것과 선택이 역가, 산물 품질 및 성장 특성의 기존 척도에 더하여 이러한 파라미터를 기초로 할 수 있다는 것이 가정되었다. 이러한 경우에, 이러한 세포주들은 최적의 정제 조건이 또한 상이할 것임이 예상될 것이다.
이러한 실험에서 조사된 인자들은 하기와 같았다:
Figure pct00023
정제 완충제 pH: pH 5, pH 6 및 pH 7
Figure pct00024
로딩 용량: 500 mg/ml, 1000 mg/ml, 1500 mg/ml
이러한 인자들을 하기 세포주 및 산물에 대해 조사하였다:
Figure pct00025
E22 - 론자 플랫폼 공정에서 높은 세포 농도로 성장하는 cB72.3 항체를 발현하는 세포주
Figure pct00026
3C12 - 론자 플랫폼 공정에서 평균 세포 농도로 성장하는 cB72.3 항체를 발현하는 세포주
Figure pct00027
A14 - 론자 플랫폼 공정에서 평균 세포 농도로 성장하는 H35k1 항체를 발현하는 세포주
이러한 인자들의 모든 조합을 3개의 기술적 사본으로서 분석하여, 총 81개의 샘플이 생성되었다. 이러한 샘플 개수는 DoE (실험 디자인) 실험 접근법에서 유래되는 것과 유사하였다 (그러나, DoE 디자인에서는, 실험 디자인에 사본이 이미 통합되었을 것이기 때문에 1개의 기술적 사본만 수행될 것이다). 추가로, 각각의 세포주에 대한 배양 상청액 샘플 또한 삼중으로 분석되었다 - 이들은 검출, HCP 식별, 및 정제된 샘플에 개별적인 HCP의 정량화를 위해 적용될 불순물 지도의 생성에 사용되었다.
그 후, 식별된 HCP의 목록을 이전에 보고된 에피베이스® 인 실리코 면역원성 사정 도구에 의해서, 뿐만 아니라 유전자 온톨로지에 의해 분석하여, 약물 제품과의 잠재적인 상호작용을 사정하였다. 이는 단백질 식별자 또는 서열의 목록으로부터 수치 인자를 생성시킬 수 있는 임의의 위험-기반 도구에 이러한 동일한 방법론이 사용될 수 있다는 것을 실연한다. 항체 생산의 경우, 단백질 A 친화력 정제가 불순물 제거를 위한 고도로 효과적인 방법이기 때문에, HCP 면역원성의 영향이 비교적 낮은 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 생물치료제 자체 또는 다른 계면활성제와의 상호작용으로 인해 약물 제품의 안정성 측면에서 HCP가 문제를 야기한 여러 사례가 보고되었다.
유전자 온톨로지 용어에서 관련 키워드를 찾는 것에 의해 산물 상호작용 위험 점수가 결정되었다. 이러한 용어들은 테스트 샘플 내에서 발견된 유전자 식별자에 대한 데이터베이스 검색으로부터 유래된다. 프로테아제 활성과 관련된 용어가 있는 단백질이 관련된 것으로 태그가 부착되었고, 1의 점수가 부여되었다. 약물 제품의 분해 (단백질 또는 계면활성제 분해)에서의 활성이 문서화된 특정한 단백질은 추가적인 더 높은 가중치 9가 부여되었다 (이러한 경우, 카텝신 D1 및 포스포리파제 B2). 약물 안정성, 효능 또는 안정성에 효과가 있는 것으로 경험적으로 나타난 다른 단백질을 포함하여 더 넓은 데이터베이스를 개발하는 것이 이러한 접근법을 확장시킬 것이고, 치료용 단백질 또는 제형에 대해 특이적으로 채점이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 포스포리파제 B만 폴리소르베이트를 함유하는 제형이 있는 제품에 관련된 것으로 고려될 것이다.
이러한 채점은 최종 약물 제품의 분해에 대한 위험이 최소인 특정한 공정 조건의 선택을 허용하였다. 상이한 세포주 및 정제 조건들에 대한 종합 제품 상호작용 위험이 도 4에 제시되고, 약물 제품 안정성에 대한 부정적인 결과가 있는 것으로 보고된 특정한 HCP에 대한 프로파일이 도 5 및 도 6에 제시된다. 에피베이스®로의 HCP 아미노산 서열 분석을 기초로 하는 면역원성 사정이 도 7에 제시된다.
세포주와 정제 조건 사이의 유의한 차이가 일반적 및 특정한 산물 상호작용 위험 둘 다, 뿐만 아니라 면역원성 사정에 대해 명확하게 구별될 수 있었다.
동일한 cB72.3 산물을 발현하는 2개의 세포주에 대해 HCP 프로파일에서의 변화가 주목되었고, 이는 이러한 접근법이 정제 계획들 사이에서 뿐만 아니라 HCP 불순물 프로파일을 기초로 하여 세포주를 선택하는데 또한 사용될 수 있다는 것을 지시한다. cB72.3 산물을 발현하는 2개의 세포주의 경우에, 대부분의 테스트 조건 하에 3C12에 비교하여 E22가 더 높은 산물 분해 위험 점수를 제공하였다. 로딩 용량 증가가 산물 분해 위험을 감소시킨 일반적인 경향이 관찰되었지만, 개별적인 관심 단백질은 조건에 대한 개별적인 반응을 나타냈다. 예를 들어, 세포주 A14의 경우 낮은 pH에서 포스포리파제 B 수준이 로딩 용량과 함께 증가하였다.
따라서 이러한 접근법은 테스트 샘플들 사이의 위험 차이를 검출하여, 각각의 특정 단백질 치료제에 대한 개별적 및 종합 위험 인자를 기초로 하는 정통 의사 결정을 용이하게 하는 것으로 실연되었다.
정제 전략을 위해 이루어질 전반적인 권장사항은 하기와 같을 것이다:
E22 - 500 mg/ml에서 pH 7
3C12 - 임의의 후보 로딩 용량에서 pH 7
H35K1 - 임의의 후보 로딩 용량에서 pH 7
그러나, 원하는 제형 (부형제와의 포스포리파제 B 상호작용을 기초로 함) 및 투여 경로 (예를 들어, 피하 투여는 면역원성 위험 인자에 대한 더 높은 가중을 필요로 할 수 있다)에 따라 권장사항이 변화할 수 있다.
이러한 방법은 세포주 선택에 또한 사용될 수 있다 - 이러한 경우에, 동일한 숙주 세포주로부터 유래되고 동일한 산물을 제조함에도 불구하고, 모든 테스트 조건 하에 E22보다 3C12가 약물 제품 안정성에 영향을 미칠 수 있는 정제된 샘플 내의 HCP를 더 낮은 수준으로 생성시키는 것으로 실연되었다. 반대로, 3C12에 비교하여 E22는 전반적인 HCP 면역원성 위험이 더 낮은 정제된 샘플을 일관되게 생성시켰다.
실시예 7: 산물 회수를 위한 상이한 공정들의 사정
1차 회수 공정의 개발에 대한 프로테오믹 방법의 적용을 또한 평가하였다. 이러한 경우에, 단백질 A 크로마토그래피 전의 HCP의 사전-청소를 위한 2가지 대안적 방법이 테스트되었다: chromatin extraction following the approach of 문헌 [Nian, R. et al. "Advance chromatin extraction improves capture performance of protein A affinity chromatography", J Chromatogr A, 1431, 1-7 (2016)]의 접근법을 따르는 염색질 추출, 및 3M 엠페이즈(Emphaze) 필터를 사용한 상청액의 정화. 양쪽 방법에 사용된 cB72.3 항체를 발현하는 배양물로부터의 배양 상청액의 샘플을 또한 분석하여 HCP 불순물 지도를 생성시켰고, 이는 정량화를 위해 테스트 샘플에 적용되었다. 모든 샘플이 삼중으로 분석되었다.
양쪽 처리 방법 모두가 대조군 샘플과 비교하여 각각의 샘플에서 HCP 로드를 감소시켰다. 염색질 제거 처리는 전반적인 HCP 로드를 대조군에서의 것의 대략 절반으로 감소시켰다. 엠페이즈 처리는 전반적인 HCP 로드를 대략 25%만큼 감소시켰다 (도 8). HCP 로드의 감소는 각각의 단백질에 대해 등가이지 않았다 - 일부 단백질은 어느 처리에도 영향을 받지 않았다. 염색질 제거가 일반적으로 엠페이즈보다 더 효과적이었다 - 단백질이 염색질 제거 공정보다 엠페이즈에 의해 더 감소되지 않았다. 영향을 미치는 특정한 성질이 있는지를 결정하기 위해 각각의 HCP의 생물물리학적 성질의 추가적인 분석을 수행할 수 있었다.
상이한 공정 대안들에 대한 위험 분석을 이전에 기재된 바와 같이 산물 상호작용에 대한 가능성에 대해 수행하였다. 또한, 추가적인 공정 위험이 사정되었다 - 산물 해리 (항체 사슬간 디술피드 결합의 환원)가 산업 전반에 걸쳐 다수의 공정 및 산물에서 관찰되었다. 이는 배양 상청액 내의 2개의 특이적 효소 시스템인 티오레록신 및 글루타레독신 시스템의 존재에 연관되었다. 이러한 실험에서, 참여할 수 있는 각각의 잠재적인 유전자 산물, 뿐만 아니라 환원 잠재력이 있는 다른 단백질, 예컨대 디술피드 결합 이성화에서 수반되는 것들의 관점에서 이러한 문서화된 효소 시스템 둘 다를 채점함으로써 해리 위험을 사정하였다.
상이한 공정 옵션들의 위험 사정은 각각의 경우에, 위험-태그 단백질에 대한 일반적인 경향이 총 HCP에 대한 것과 동일하였음을 나타냈다. 그러나, 해리 위험 채점은 일반적인 수준의 HCP 감소보다 염색질 감소 처리에 대해 대규모 감소를 나타냈다 - 총 HCP에서의 2배 미만의 감소에 비교하여 해리 위험 점수에서의 5배 감소 (p<0.03) (도 9). 분해 위험이 염색질 제거 처리에 의해 총 HCP수준으로부터 예측될 것보다 더 많이 감소되었다는 점에서, 분해 위험 점수가 유사한 패턴을 따랐다 (도 10).
총 단백질과 특정한 위험 점수 사이에서 관찰된 차이는 전통적인 종합 측정에 의해서보다는 HCP를 개별적으로 모니터링하는 것에 의해 생성된 정보에서의 이익, 및 어떻게 이러한 정보를 사용하여 공정 결정을 내리게 할 수 있는지를 강조한다. 동일한 데이터세트 내의 다수의 단백질이 처리 사이에서 존재비 차이를 나타내지 않았다 - 이러한 단백질 중 임의의 것이 위험 인자로서 식별되면, 총 HCP의 전반적인 측정이 이들을 제거하기 위한 공정을 조작할 때 오도될 것이다. 예를 들어, 카르복시펩티다제 (유전자명 I79_006816)는 임의의 샘플에 걸쳐 변화를 나타내지 않은 한편, 피루베이트 키나제 (유전자명 H671_4g13041)는 엠페이즈 처리에 의해 영향을 받지 않았지만, 염색질 제거 처리에 의해 거의 완전히 고갈되었다 (도 11).
실시예 8: 산물 회수를 위한 상이한 발현 및 발효 시스템들의 사정
피키아 파스토리스 발현 시스템으로부터의 세포 배양 상청액 샘플을 HCP 함량 및 조성에 대해 분석하였다. 샘플은 3가지 상이한 리포터 단백질, 2개의 상이한 유도 시스템, 및 표 10에 나타난 바와 같은 다양한 pH 및 온도의 상이한 발효 조건을 대표하였다. 각각의 샘플이 삼중으로 테스트되었다.
표 10 피키아 HCP 분석을 위한 샘플 상세사항
Figure pct00028
생성된 LC-MSMS 데이터를 각각의 치료용 단백질에 대해 별개로 분석하여, 프로세싱 동안 데이터의 더 양호한 정렬을 허용하였다. UniProt 데이터베이스로부터의 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii) (계통 ATCC 76273 / CBS 7435 / CECT 11047 / NRRL Y-11430 / 웨그너(Wegner) 21-1) (효모) (피키아 파스토리스)에 대한 프로테옴에 대해 데이터베이스 검색을 수행하였다. 발현 프로파일에서의 유의한 변화 (q 값 < 0.01) 및 배수 변화 > 2를 나타내는 단백질을 발현 프로파일에서의 유사성에 대해 평가하였다.
pAOX 유도
메탄올 유도 시스템 pAOX 및 론자의 제한된 글루코스 유도 시스템 pG1.3을 사용하여 단백질 3이 발현되었다. pAOX 시스템이 혼입된 샘플은 메탄올 대사 (알콜 옥시다제, 포르메이트 데히드로게나제, 알콜 데히드로게나제), 뿐만 아니라 메탄올 대사 동안에 생성되는 반응성 산소 종의 대사 (수퍼옥시드 디스뮤타제, 퍼옥시레독신 PMP, 단백질 디술피드-이소머라제, 티오레독신)에 대해 특이적인 단백질의 존재비의 유의한 증가를 나타냈다. pG1.3 유도에 비교하여 pAOX 유도 배양물에서의 단백질 발현 수준에서의 관찰된 변화와 함께, 메탄올 대사 주변의 대사 프로세스가 도 12에 제시된다.
샘플 7, 8, 및 10에 비교하여 샘플 9 및 11에 대한 높은 역가와 상관되어, 추가적인 변화가 이러한 실험에서 관찰되었다. 이러한 단백질은 단백질 폴딩에서 수반되는 ATPase, GPI-앵커 세포 표면 당단백질, 펩티딜-프로필 시스 트랜스 이소머라제, 및 번역 신장 인자 EF-1 감마 (코마가타엘라 파피이) (C4R6E8)에 대한 상동성을 나타내는 비-특성화 단백질 F2QUJ0을 포함하였다.
pG1.3 시스템을 대표하는 샘플은 탄수화물 프로세싱에서 수반되는 효소 (글루카나제, 글루코시다제), 뿐만 아니라 구조 단백질의 발현 증가를 또한 나타냈다.
상청액 단백질 상에서의 온도 및 pH 효과
다양한 발효 조건이 단백질 발현 프로파일에서의 변화에 상응하였다. 증가된 온도 및 pH에서의 발혀 실행에 대해 샤페론 단백질 HSP90에 대해 존재비 증가가 관찰되었다.
조건 3은 단백질 생합성과 관련된 단백질, 예를 들어, 리보솜 단백질, 신장 인자; 세포 호흡과 관련된 단백질, 예를 들어, 데히드로게나제, ATP 신타제, 미토콘드리아 단백질을 포함하는 광범위한 단백질의 큰 증가를 나타냈다. 이는 오염 이벤트가 발생했을 수 있다는 이러한 공정 동안의 관찰과 상호관련되었다. 이러한 샘플에서 단백질 개수 증가가 식별되는 것은 이러한 방법이 바이오리액터 내의 다른 생물의 성장이 배양 상청액의 단백질 조성을 교란한 경우를 또한 검출할 수 있다는 것을 실연한다.
이러한 예에서, 공정 선택을 위한 위험-기반 사정보다는 발현 플랫폼의 더욱 기계론적인 분석을 수행하는데 프로테오믹 방법이 사용되었다. 피키아 파스토리스 샘플의 이러한 분석으로 단백질 발현의 유도 및 배양 조건에서의 변화에서 수반되는 대사 프로세스에 대한 정보가 생성되었다. 이러한 기술은 샤페론, 폴딩 단백질, 및 단백질의 번역후 변형을 위한 시스템의 생산을 위한 바이오프로세스의 최적화를 가능하게 하고, 이들 모두는 생물치료제의 성공적인 생산과 관련된다.
총괄적으로, 이러한 실시예들은 제작 공정 및 방법에 도입된 수백개의 가능한 단백질, 예를 들어, HCP, 오염물을 식별 및 사정하기 위해 수백개의 샘플을 신속하게 분석하는데 유용한 방법을 나타낸다. 본원에 제시된 방법은 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제작하는 상이한 공정 및 방법들을 평가하고, 단백질, 예를 들어, HCP, 자신이 생산하는 오염물과 연관된 위험 점수, 뿐만 아니라 제작 공정 및 방법 자체와 연관된 전반적인 위험 점수를 기초로 하여 상기 공정들 사이에서 선택하는 능력이 있다. 본원에 제시된 방법은 초기 단계, 예를 들어, 세포 상청액부터 최종 정제 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드 또는 정제된 치료용 산물까지 소정의 제작 공정 또는 방법을 모니터링하는 능력이 있다.

Claims (49)

  1. 샘플을 신속하게 분석하여, 예를 들어, 단백질의 위험 (예를 들어, 제제, 예를 들어, 대상체에게 투여될 제제, 예를 들어, 제약 제제 내에 오염물로서 존재하는 경우에 단백질이 제시하는 위험)의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
    a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 공정을 통해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인)을 포함하는 샘플; 및
    ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
    b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 (a)로부터의 샘플 혼합물); 및
    ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
    c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
    d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
    이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
    을 포함하는 방법.
  2. 샘플을 신속하게 분석하여 단백질의 위험의 사정을 제공하는 간단한 방법이며,
    a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 제1 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 공정을 통해 생산된, 단백질 (예를 들어, HCP) 및 임의적으로 치료용 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드)을 포함하는 샘플; 및
    ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
    b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 샘플 혼합물;
    ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
    iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
    c) 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
    d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
    이에 의해 샘플을 분석하고 단백질의 위험의 사정을 제공하는 것
    을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각 상이한 공정에 의해 제조된 복수의 상이한 샘플을 평가하는 것, 예를 들어, 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 96, 100, 192, 200, 500 또는 1,000개의 상이한 샘플을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상이한 제1 및 제2 샘플에 대한 위험의 사정을 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 산물을 생산하는 공정을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 샘플 중 하나를 선택하거나, 분류하거나, 또는 추가로 가공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
    a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 10 내지 30℃, 예를 들어, 18-26℃, 예를 들어, 20±3℃, 20±2℃, 20±1℃, 또는 20℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
    ii) 변성제, 예를 들어, 데옥시콜레이트 및 요소;
    b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물); 및
    ii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
    c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
    d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
    이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
    를 포함하는 방법.
  8. 산물의 제조 공정을 평가하는 방법, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가이며,
    a) 하기를 포함하는 샘플 혼합물을, 예를 들어, 30 내지 60℃, 예를 들어, 45-55℃, 예를 들어, 50±3℃, 50±2℃, 50±1℃, 또는 50℃의 온도에서 샘플 내의 단백질을 변성시키는 조건, 예를 들어, 변성제의 농도 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 공정에 의해 생산된, 단백질 및 임의적으로 산물 (예를 들어,재조합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 효소, 또는 시토카인); 및
    ii) 제1 변성제, 예를 들어, 구아니딘 히드로클로라이드;
    b) 하기를 포함하는 샘플/효소 혼합물을, 효소가 실질적인 활성을 유지하고, 단백질과 반응하여, 예를 들어, 단백질을 절단하여, 단백질 소화 산물을 제공하는 조건 하에, 제공하고, 예를 들어, 형성하고/거나 유지하고:
    i) 샘플 혼합물 (예를 들어, 분취량의 a)로부터의 샘플 혼합물);
    ii) 제2 변성제, 예를 들어, 요소; 및
    iii) 단백질이 기질인 효소, 예를 들어, 단백질분해 효소, 예를 들어, 미리 선택되거나 또는 규정된 표적 부위에서 단백질을 절단하는 효소, 예를 들어, 트립신, lysC, GluC, 또는 AspN과 함께 샘플 혼합물을 포함하는 효소 제제;
    c) 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용함으로써, 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하며, 하나 이상의 단백질 소화 산물을 사용하여 단백질 소화 산물과 연관된 단백질의 정체를 제공하고;
    d) 샘플 내에서 식별된 단백질에 단백질 위험 점수를 할당하고,
    이에 의해 산물의 제조 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 공정에 의해 생산된, 산물 이외의 단백질, 예를 들어, 오염물이 제시하는 위험의 사정을 수반하는 평가
    를 포함하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 산물을 제조하는 복수의 상이한 공정을 평가하는 것, 예를 들어, 적어도 2, 4, 8, 10, 50, 96, 100, 192, 200, 500 또는 1,000개의 상이한 공정을 평가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상이한 제1 및 제2 공정에 대한 평가를 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 산물의 제조 공정을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 오염물 또는 다른 바람직하지 않은 성분 (예를 들어, 조건 세트에 의해 생산되는 산물의 단편, 변성 또는 미스-폴딩된 버전, 또는 숙주 세포 단백질 (HCP) 또는 그의 단편)인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 변성제, 제1 변성제, 또는 제2 변성제가 데옥시콜레이트 및 요소, 구아니딘 히드로클로라이드, 또는 요소 및 구아니딘 히드로클로라이드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어지는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도보다 더 높은 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 단백질을 변성시키기에 충분히 높고, 예를 들어, 단백질의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 변성되고;
    샘플/효소 혼합물 내의 변성제의 농도가 효소를 변성시키지 않도록 충분히 낮고, 예를 들어, 효소의 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만이 변성되는 것인
    방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 변성제의 농도가 하기인 방법:
    i) 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.5, 또는 8;
    ii) 1-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 6-6.6 M, 6 M, 6.6 M, 또는 8 M;
    iii) 0-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 0.5-5 M, 0.5-2 M, 0.5 M, 1 M, 또는 2 M; 또는
    iv) 0.01%-50%, 1%-40%, 1%-20%, 0.5%-10%, 0.01%-5%, 또는 0.1%-2% (m/v).
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물이 제1 변성제 (즉, (a)(ii)의 변성제)를 포함하고, 샘플/효소 혼합물이 제1 변성제 및 제2 변성제를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제1 변성제가 구아니딘 히드로클로라이드이고, 제2 변성제가 요소인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 제1 변성제의 농도가 1-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 6-6.6 M, 6 M, 6.6 M, 또는 8 M인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 제1 변성제의 농도가 하기인 방법:
    i) 0-10 M, 2-9 M, 3-8 M, 4-7 M, 5-7 M, 0.5-5 M, 0.5-2 M, 0.5 M, 1 M, 또는 2 M;
    ii) 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하; 또는
    iii) ii) 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 제2 변성제의 농도가 하기인 방법:
    i) 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5, 또는 0.1 M 이하;
    ii) 0.5 또는 0.1 M 이하, 예를 들어, 본질적으로 0 M; 또는
    iii) 2 M 또는 0.5 M 이하.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플 혼합물의 pH가 탈아미드화 반응이 억제되도록 충분히 낮고, 예를 들어, 단백질의 아스파라긴 및 글루타민 측쇄의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 변경되지 않고,
    샘플/효소 혼합물의 pH가 효소가 활성이도록 충분히 높고, 예를 들어, 효소가 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 활성이고, 예를 들어, 최대 효율에 비교하여 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 효율로 작동하는 것인
    방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물의 pH가 5.5±1, 0.75, 0.5, 또는 0.25 (예를 들어, 5.5±0.5)이고, 샘플/효소 혼합물의 pH가 7.3±1, 0.75, 0.5, 또는 0.25 (예를 들어, 7.3±0.5)인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물의 pH가 5.5이고, 샘플/효소 혼합물의 pH가 7.3인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 단백질 또는 단백질 소화 산물의 시스테인 잔기의 알킬화를 포함하지 않는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 및/또는 샘플/효소 혼합물이 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 샘플/효소 혼합물 내의 농도보다 더 높은 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    샘플 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 단백질의 시스테인을 실질적으로 환원시키도록 충분히 높고, 예를 들어, 단백질의 시스테인 잔기의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 환원되고;
    샘플/효소 혼합물 내의 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 디티오트레이톨 (DTT), 또는 베타-메르캅토에탄올의 농도가 방법 또는 제작 방법의 다른 단계를 방해하지 않도록 충분히 낮고, 예를 들어, 환원제가 유의하게 기구 (예를 들어, 질량 분광계 또는 분석 칼럼) 내에 축적되거나 또는 데이터 (예를 들어, 질량 분광측정법 데이터)에서의 추가 신호를 생성하지 않는 것인
    방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 혼합물 내의 환원제의 농도가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mM, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 mM인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플/효소 혼합물 내의 환원제의 농도가 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 mM 이하, 예를 들어, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 mM인 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화 산물이 크기, 전하 또는 친화성 중 1가지 이상 (예를 들어, 1, 2, 3가지 또는 그 초과)을 기초로 하여 분리되는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 소화 산물을 분리하는 것이 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 모세관 전기영동, 이온 이동성, 또는 본원에 기재된 임의의 크로마토그래피 방법을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (c)가, 예를 들어, 질량 분광분석, 예를 들어, LC/MS, 탠덤 질량 분광측정법, 또는 RP-LCMS2에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, (c)가 크로마토그래피, 예를 들어, 1차원 크로마토그래피를 사용하여 단백질 소화 산물을 분리하고, 예를 들어, 질량 분광측정법, 예를 들어, LC/MS, 탠덤 질량 분광측정법, 또는 1D RP-LCMS2에 의해, 단백질 소화 산물의 정체를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2, 10, 20, 96, 100, 192, 1,000, 또는 10,000개의 샘플 내의 복수의 단백질 소화 산물, 예를 들어, 단백질 소화 산물의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%에 대해 정체, 구조 또는 조성이 분류 또는 할당되는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 위험 점수가 하기 중 하나 이상의 함수인 방법:
    단백질 및 임의적으로 산물을 포함하는 제제를 제공받은 대상체에서의 원치 않는, 예를 들어, 표적 벗어남 성질, 예를 들어, 면역원성;
    산물의 제제, 예를 들어, 약물의 제제 내의 단백질의 원치 않는 효과, 예를 들어, 변성, 침전 또는 색상을 야기하는 성향; 및
    샘플 내에 존재하는 단백질의 존재비에 대한 값.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 샘플 내에서 식별된 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 적어도 2, 10, 50, 100, 200, 500, 1000개의 단백질 또는 모든 단백질)에 대한 단백질 위험 점수를 제공하도록 반복되는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 단백질 위험 점수, 예를 들어, 면역원성 위험 점수, 예를 들어, 에피베이스(Epibase)® 플랫폼에 의해 생성된 바와 같은 점수를 제공하는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 에피베이스® 플랫폼에 의해 생성된 바와 같은 면역원성 위험 점수를 제공하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 공정 위험 점수를 제공하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 공정 위험 점수가 샘플의 단백질의 하나 이상의 단백질 위험 점수의 함수인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 공정 위험 점수가 하기 식을 기초로 하여 계산되는 것인 방법:
    공정 위험 점수 = ∑([단백질 존재비]×[면역원성 위험 점수]).
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 샘플, 예를 들어, 적어도 2, 10, 50, 96, 10, 192, 또는 1000개를 분석하도록 반복되며,
    여기서 2개 이상의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)이 상이한 제작 공정 또는 방법을 사용하여 제공되고, 복수의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)에 대해 공정 위험 점수가 제공되거나, 또는
    여기서 2개 이상의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)이 제작 공정 또는 방법 동안의 상이한 시점에 제공되고, 복수의 샘플 (예를 들어, 모든 샘플)에 대해 공정 위험 점수가 제공되는 것인
    방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제작 공정 또는 방법, 예를 들어, 샘플을 제공하도록 사용된 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수를 참조물과 비교하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수를 제2 제작 공정 또는 방법의 공정 위험 점수와 비교하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시점의 공정의 공정 위험 점수를 제2 시점의 공정의 공정 위험 점수와 비교하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 비교에 대한 반응으로, 예를 들어, 추가 분석 또는 추가 사용을 위해, 예를 들어, 산물, 예를 들어, 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위해, 제작 공정 또는 방법 중 하나를 선택하는 것을 포함하는 방법.
  49. HCP 또는 단백질 소화 산물에 대한 식별 특성 및 세포 배양물 (예를 들어, CHO, 예를 들어, GS-CHO 세포 배양물)의 세포 배양 상청액으로부터 유래된 단백질 위험 점수의 라이브러리를 포함하는 (예를 들어, 컴퓨터 판독가능 매체 상에 메모리화 또는 기록된) 데이터베이스.
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