KR102629162B1 - 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오의약품을 액체크로마토그래피/질량분석법(LC-MS/MS)으로 정성 및 정량 분석하여 바이오의약품의 제조과정에서 사용된 숙주세포 단백질의 잔류량을 측정할 수 있는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법은, a) 바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득하는 단계; b) 정량기가 단백질 정량을 통해 정제기로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득하는 단계; c) 전처리기가 상기 단백질 시료 용액을 전처리하며, 시료 전처리 후 남은 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득하는 단계; d) 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료를 정성 및 정량 분석하는 단계; 및 e) 데이터 처리기가 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 상기 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하는 단계;를 포함하고, 상기 전처리기는, 상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 전체를 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 전처리한다.
Description
본 발명은 단백질 기반의 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바이오의약품을 액체크로마토그래피/질량분석법(LC-MS/MS)으로 정성 및 정량 분석하여 바이오의약품의 제조과정에서 사용된 숙주세포 단백질의 잔류량을 측정할 수 있는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템에 관한 것이다.
바이오의약품의 생산과정에서 세포주(Cell line)로는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포를 가장 많이 사용하고 있다.
CHO 세포를 숙주세포로 주로 사용하는 것은 바이오의약품 생산에 많이 사용되어 연구 데이터가 축적되어 있고, 그 의약품들이 FDA 허가를 받고 시판되고 있어 안정성 측면에서 이미 검증되어 있기 때문이다.
세포주(Cell line)의 종류가 중요한 이유는 세포주의 유래에 따라 글리코실화(glycosylation)가 다르기 때문이며, 사람과 다른 글리코실화를 가진 바이오의약품은 면역원성에 의한 항-약물 항체(Anti-Drug Antibodies; ADA)의 생성 가능성이 그만큼 증가할 수 있다.
세포주는 세포은행에 저장되거나 세포 배양(Cell culture)을 진행하게 된다. 이때, 세포 배양과 업스케일링(upscaling)을 하고, 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 대용량으로 배양된 후 정제(purification) 단계에서 순도, 회수율, 불순물의 종류나 오염 정도를 고려하여 바이오의약품 생산 단계의 최적화를 진행되어야 하며, 생산 단계의 과정에서는 바이러스나 숙주세포 단백질(Host Cell Protein; HCP)와 같은 불순물이 제거되었음을 증명할 필요가 있다.
숙주세포 단백질은 재조합 단백질을 CHO 세포와 같은 비인간세포로부터 재조합단백질을 과발현시켜 생성함으로써, 재조합단백질을 정제하는 공정과정에 남아있는 불순물로 프로파일링(Profiling)을 통해 정제 공정 단계에서 숙주세포 단백질을 제거하는데 필요한 단계의 최적화가 이루어진다면, 안전한 바이오의약품(또는 단백질 치료제)를 생산하는 것이 가능하다.
이때 만약, 숙주세포 단백질의 제거가 최소화 되지 않는 경우, 최종 제품에 잔류하고 있는 경우, 바이오의약품의 품질에 영향을 미치거나 제품 안정성을 손상시킬 수 있고, 바이오의약품은 투여 과정에서 예상치 못한 면역반응이 발생될 수 있으므로, 이러한 제품의 품질 향상, 안정성 증가 및 면역반응의 발생 가능성을 최소화하기 위해서는 바이오의약품에서 숙주세포 단백질이 최소로 정성 및 정량화 될 필요가 있으므로, 일반적인 기준인 바이오의약품내의 숙주세포 단백질 전체가 100ppm 이하인 기준을 만족하는지를 확인하는 것도 중요할 뿐만 아니라, 정확한 숙주세포의 단백질 종류를 정성 및 정량할 필요가 있다.
본 발명은 바이오의약품 내 숙주세포 단백질을 정성하고, 잔류량을 정량분석하여 확인하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 바이오의약품을 트립신 등의 효소를 이용하여 펩타이드 및 당펩타이드로 조각화한 후 LC-MS/MS의 정성 및 정량 분석을 통해 바이오의약품의 제조과정에서 사용된 숙주세포 단백질의 잔류량을 측정할 수 있는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템을 제공함에 있다.
다만, 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법은, a) 바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득하는 단계; b) 정량기가 단백질 정량을 통해 정제기로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득하는 단계; c) 전처리기가 상기 단백질 시료 용액을 전처리하며, 시료 전처리 후 남은 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득하는 단계; d) 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료를 정성 및 정량 분석하는 단계; 및 e) 데이터 처리기가 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 상기 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하는 단계;를 포함하고, 상기 전처리기는, 상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 전체를 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 전처리하고, 질량분석전에 전체 시료양을 측정하여 최종 ppm 산출에 활용할 수 있다.
또한, 숙주세포 단백질 정량 분석 방법을 수행하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템은, 바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득하는 정제기; 단백질 정량을 통해 상기 정제기로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득하는 정량기; 상기 단백질 시료 용액을 전처리하며, 시료 전처리 후 남은 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득하는 전처리기; 상기 분석 시료를 정성 및 정량 분석하는 액체 크로마토그래피/질량분석기; 및 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 상기 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하는 데이터 처리기;를 포함하고, 상기 전처리기는, 상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 전처리 단계에 따른 단백질 총량, 펩타이드 총량을 측정하고 획득된 시료중 숙주세포가 포함된 바이오의약품 전체의 일정량을 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 전처리하고, 질량분석전에 전체 시료양을 측정하여 최종 ppm 산출에 활용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법 및 시스템을 이용하면, 바이오의약품의 제조과정에서 사용된 숙주세포 단백질의 잔류량을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 바이오의약품 내 숙주세포 단백질의 정성 및 정량 분석을 통해 바이오의약품 내 숙주세포 단백질이 최소화될 수 있도록 바이오의약품 정제공정과정을 모니터링하고 최적화하여, 안전한 단백질 기반 바이오의약품 생산이 효율적으로 이루어지도록 한다.
다만, 본 발명에서 얻을 수 있는 효과는 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템의 구성요소를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법의 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 도 2에 도시된 숙주세포에서 발현된 바이오의약품 정제 단계와 단백질 정량 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 도 2에 도시된 단백질 전처리 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 표준 단백질을 기반으로 하는 검량선이다.
도 6은 표준 펩타이드를 기반으로 하는 검량선이다.
도 7은 도 2에 도시된 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 액체 크로마토그래피/질량분석기를 이용한 LC-MS 크로마토그램의 일례이다.
도 9는 도 2에 도시된 데이터 처리 및 정성 분석 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 10은 염기서열로 이루어진 단백질 서열 정보의 일례이다.
도 11은 각 바이오의약품에서 분석된 HCP의 수를 나타내는 도면이다.
도 12는 식별된 HCP 총 강도 및 각 바이오의약품에서의 HCP 및 바이오의약품의 백분율 강도를 나타내는 도면이다.
도 13은 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 ppm 분포를 나타내는 도면이다.
도 14는 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 변동 계수(CV)% 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법의 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 도 2에 도시된 숙주세포에서 발현된 바이오의약품 정제 단계와 단백질 정량 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 도 2에 도시된 단백질 전처리 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 표준 단백질을 기반으로 하는 검량선이다.
도 6은 표준 펩타이드를 기반으로 하는 검량선이다.
도 7은 도 2에 도시된 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 액체 크로마토그래피/질량분석기를 이용한 LC-MS 크로마토그램의 일례이다.
도 9는 도 2에 도시된 데이터 처리 및 정성 분석 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 10은 염기서열로 이루어진 단백질 서열 정보의 일례이다.
도 11은 각 바이오의약품에서 분석된 HCP의 수를 나타내는 도면이다.
도 12는 식별된 HCP 총 강도 및 각 바이오의약품에서의 HCP 및 바이오의약품의 백분율 강도를 나타내는 도면이다.
도 13은 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 ppm 분포를 나타내는 도면이다.
도 14는 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 변동 계수(CV)% 분포를 나타내는 도면이다.
이하에서는, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 본 발명의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 본 발명의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명에서 제시된 목적 또는 효과는 특정 실시예가 이를 전부 포함하여야 한다거나 그러한 효과만을 포함하여야 한다는 의미는 아니므로, 본 발명의 권리범위는 이에 의하여 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 될 것이다.
본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다.
"제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결될 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다고 언급된 때에는 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 한편, 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용되는 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석될 수 없다.
정량 분석 시스템
이하에서는, 숙주세포 단백질의 정량 분석을 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템의 구성요소를 나타내는 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)은 바이오의약품의 제조과정에서 사용된 숙주세포 단백질(이하, HCP)의 잔류량이 최적화된 상태인지 여부를 확인하기 위해, 정제기(110), 정량기(120), 전처리기(130), 액체 크로마토그래피/질량분석기(140) 및 데이터 처리기(150)를 포함한다.
정제기(110)는 데이터 처리기(150)에서 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하기 위해 바이오의약품내의 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 바이오의약품 내에 존재하는 숙주세포 단백질을 획득한다.
정량기(120)는 단백질 정량을 통해 정제기(110)로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득한다.
이러한 정량기(120)는 정제기(110)로부터 정제된 바이오의약품이 투입 가능하면서 바이오의약품의 염을 제거하기 위한 필터가 구비 또는 탈부착이 가능한 단백질 농축튜브, 단백질 시료 용액의 원심분리가 가능하면서 필터(예: 10K cut off filter)가 구비 또는 탈부착이 가능한 원심분리기, 단백질 시료의 농도를 측정하기 위한 단백질 농도 측정 키트(예: BCA Protein Assay Kit), 96 웰 플레이트(96 well plate), 펩타이드의 건조를 위한 건조수단(예: speedvac)를 포함한다.
전처리기(130)는 정량기(120)에서 획득된 단백질 시료 용액을 전처리하여 시료 전처리 후 남은 양은 총량측정을 통해 일정량의 분석 시료를 획득한다.
이때, 전처리기(130)는 전체 바이오의약품 내 존재하는 HCP의 ppm을 계산하기 위해 분석 시료의 양이 확정될 필요가 있으나, 분석 시료의 양에 제한은 없으므로 분석 시료의 양을 한정하지 아니한다.
또한, 전처리기(130)는 데이터 처리기(150)에서 산출되는 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 바이오의약품의 면역반응 발생 가능성을 최소화하는 것이 가능한 조건으로 산출되는지에 따라 단백질 정제과정의 최적화에 대한 여부를 판단할 수 있다.
이러한 전처리기(130)는 단백질 시료 용액의 원심분리가 가능한 원심분리기, 단백질 시료를 펩타이드로 가수분해하는 과정에 사용되는 시약들 및 기구들, 펩타이드를 탈염(desalting)하기 위한 카트리지가 결합된 진공챔버, 시료 전처리후 펩타이드 시료의 농도를 측정하기 위한 펩타이드 농도 측정 키트(예: Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Kit), 펩타이드의 건조를 위한 건조수단(예: speedvac), 급랭(quenching)수단을 포함한다.
액체 크로마토그래피/질량분석기(140)는 전처리기(130)에서 전처리된 분석 시료를 펩타이드 농도 측정키트를 통해 획득된 양을 바탕으로 일정량 사용하여 질량 정성 및 정량 분석을 진행한다.
이때, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)는 질량측정정확도를 향상시키기 위해 분해능 30,000 이상의 고분해능질량분석기가 사용되는데 구체적인 일례로 nanoflow LC-Orbitrap 질량분석기가 적용될 수 있으나 이를 한정하는 것은 아니며, 다양한 유속을 지원하는 HPLC (micro, conventional flow)및 다양한 방식의 질량분석기 (TOF, Orbitrap, triple quadruple 등) 가 적용될 수도 있으며 trapped ion mobility spectrometry (TIMS), field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) 등의 장치가 결합된 질량분석기도 적용가능하다.
또한, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)는 Label free와 TMT method 정량 분석법을 이용하여 전처리된 분석 시료의 정량 분석을 진행할 수 있다.
데이터 처리기(150)는 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)에서 정성 및 정량 분석된 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하여 사용자에게 제공한다.
이때, 데이터 처리기(150)는 Mascot, MaxQuant, proteome discoverer (PD), integrated proteome pipeline (IP2) 등의 자동정성 및 정량 소프트웨어로부터 산출할 수도 있고, 이런 소프트웨어로부터 얻어진 정성결과를 바탕으로 획득된 spectral count 수 또는 수동으로 질량분석기에서 얻어진 데이터로부터 강도(area 또는 intensity) 값을 추출하는 등 정량분석가능한 데이터를 산출하는 다양한 종류의 방법을 적용하여 활용할 수 있다.
더 나아가, 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)은 도면에 미도시되었으나 정성 및 정량 분석을 위한 이동상을 제조하기 위한 이동상 제조기(미도시)가 구비될 수 있다.
정량 분석 방법
이하에서는, 상기 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 의해 수행되는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)의 과정에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법의 과정을 나타내는 도면이다.
숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 의해 수행되는 본 발명의 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)은 도 2에 도시된 바와 같이 HCP가 포함된 바이오의약품 정제 단계(S110), 단백질 정량 단계(S120), 단백질 전처리 단계(S130), 정성 및 정량 분석 단계(S140) 및 데이터 처리 단계(S150)를 포함한다.
먼저, 정제기(110)는 바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득할 수 있다(S110).
그 후, 정량기(120)는 단백질 정량을 통해 정제기(110)로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 일정량을 취하여 단백질 시료 용액을 획득할 수 있다(S120).
그 후, 전처리기(130)는 데이터 처리기(150)에서 분석 시료 내 각 HCP의 ppm을 산출할 수 있도록 정량기(120)에서 획득된 단백질 시료 용액 일정량을 전처리하여 확보된 펩타이드 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득할 수 있다(S130).
그 후, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)는 전처리기(130)에서 전처리된 분석 시료의 정성 및 정량 분석을 진행할 수 있다(S140).
그 후, 데이터 처리기(150)는 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)에서 정성 및 정량 분석된 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출할 수 있다(S150).
단백질 정량
이하에서는, 상기 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)의 숙주세포에서 발현된 바이오의약품 정제 단계(S110)와 단백질 정량 단계(S120)의 세부적인 과정에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 3은 도 2에 도시된 숙주세포에서 발현된 바이오의약품 정제 단계와 단백질 정량 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 3을 참조하면, 숙주세포에서 발현된 바이오의약품 정제 단계(S110)는 단백질 시료 용액 내의 염을 제거하고 용액 교환 및 농축단계(S111)와 상측액 획득 단계(S112)를 포함한다.
단백질 시료 용액 내 염 제거, 용액 교환 및 농축단계(S111)에서, 단백질 농축튜브에 바이오의약품용액을 투입하며, 단백질 농축튜브 내 구비된 필터를 이용하여 상기 바이오의약품의 염을 제거할 수 있다.
이때, 단백질 농축튜브 내 구비된 필터의 기공 크기는 3~30 KDa일 수 있으나, 바람직하게는 10 KDa(10,000 Da) 이상의 분자량을 가진 바이오의약품 내 단백질이 농축되도록 하는 기공 크기가 설정될 수 있다.
단백질 시료 용액 내 염 제거, 용액 교환 및 농축 단계(S111)에서, 정제기 (S110)은 원심분리기 내 필터와 제1 완충액을 이용하여 단백질 시료 용액을 원심분리시켜 바이오의약품내에 포함된 염을 제거하고, 제1 완충액을 교환 및 농축하며, 제1 완충액으로부터 단백질 시료를 취득할 수 있다.
이때, 제1 완충액은 단백질 정제기 단계(S110)가 진행되기 전에 정제기(S110)에서 생성될 수 있는데, 제1 완충액은 1M urea(요소)가 950 mL 정제수에 50 mL 1M Tris-HCl을 추가한 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 녹여져 있도록 제조할 수 있고, 이와 동등한 역할을 하는 완충용액도 사용가능하다.
이러한 단백질 시료 용액 내 염 제거, 용액 교환 및 농축 단계(S111)의 바람직한 과정은 이하와 같다.
먼저, 정제기(S110)는 원심분리기 내 필터에 제1 완충액을 투입하는 것으로 필터를 세척시킬 수 있다.
이때, 요소는 0~8M Urea 농도범위로 사용될 수 있으며, 0~8M Urea 농도를 Tris-HCl (pH 8)등의 완충용액에 제조하고 Urea 및 Tris-HCl와 동등한 기능을 하는 버퍼에 녹여서 생성될 수 있다.
바람직한 필터 세척 과정에서, 정제기(S110)는 6 mL의 제1 완충액을 원심분리기 내 필터에 투입한 후 4000 xg, 4 ℃ 조건에서 원심분리를 20분동안 진행하며, 이 과정을 3회 반복하여 원심분리기 내 필터를 세척시킬 수 있다.
그 후, 정제기(S110)는 원심분리기에 일정량의 제1 완충액, 바이오의약품 단백질 시료 용액, 제1 완충액 순으로 로딩한 후, 일정시간동안 상기 단백질 시료 용액의 원심분리를 진행할 수 있다.
바람직한 단백질 시료 용액의 원심분리 과정에서, 정제기(S110)는 3 mL의 제1 완충액과 10 mL의 단백질 시료 용액, 다시 3 mL의 제1 완충액 순으로 로딩 후 4000 xg, 4 ℃ 조건에서 원심분리를 20분동안 진행할 수 있는데, 이때 제1 완충액과 단백질 시료 용액의 부피 합은 최대 18 mL을 넘지 않도록 로딩되며, 1회 진행 때 단백질 시료 용액이 최소 500 ㎕ 남을 때까지 진행되며, 500 ㎕ 이상 남는 경우 시간을 10분씩 늘려가며 단백질 시료 용액 모두 로딩될 때까지 원심분리가 반복진행될 수 있다.
그 후, 정제기(S110)는 원심분리기에 일정량의 제1 완충액을 추가하여 원심분리기에 로딩된 제1 완충액을 교환 및 농축시킬 수 있다.
바람직한 제1 완충액 교환 및 농축 과정에서, 12 mL의 제1 완충액을 원심분리기에 추가한 후 4000 xg, 4 ℃ 조건에서 원심분리를 20분동안 진행하며, 이 과정을 3회 반복하여 제1 완충액을 교환 및 농축하고, 단백질 시료 용액이 500 ㎕ 남을 때까지 진행되며, 500 ㎕ 이상 남는 경우 시간을 10분씩 늘려가며 제1 완충액의 교환 및 농축 과정이 진행되고, 이때 시간을 10분씩 늘려가는 과정을 3번 진행하여도 단백질 시료 용액의 부피가 감소하지 않는 경우 과정이 종료될 수 있다.
상층액 취득 단계(S112)에서, 단백질 농축튜브 내 구비된 필터를 통해 바이오의약품과 HCP가 혼합된 상태의 상층액을 취득할 수 있다.
도 3을 참조하면, 단백질 정량 단계(S120)는 단백질 총량 측정 단계(S121), 단백질 시료 용액 획득 단계(S122)를 포함한다.
단백질 총량 측정 단계(S121)에서, 표준 단백질에 의해 산출되는 검량선 및 단백질 시료의 흡광도값을 이용하여 단백질 시료 내 단백질의 양을 측정할 수 있다.
이러한 단백질 총량 측정 단계(S121)의 바람직한 과정은 이하와 같다.
먼저, 정량기(120)는 정제기(110)에서 취득된 단백질 시료의 희석 전에 단백질 시료의 농도를 측정할 수 있다.
이때, 정량기(120)가 희석 전 단백질 시료의 농도 측정은 단백질 농도 측정기기에서 획득된 측정 농도값의 단위인 ㎍/mL와 희석 배율(dilution factor)을 고려하여 환산해 주어야 한다.
그 후, 정량기(120)는 단백질 시료의 예상 농도에 따라 단백질 농도 측정 키트의 측정농도범위에 맞춰 증류수(DW)로 단백질 시료를 희석(dilution)시키며, 바람직하게는 단백질 농도 측정 키트의 측정농도범위 중간 범위(예: 500 ㎍/mL)로 설정될 수 있다.
그 후, 정량기(120)는 96 웰 플레이트의 각 웰(well)에 희석된 단백질 시료를 10 ㎕씩 로딩할 수 있다.
그 후, 정량기(120)는 단백질 농도 측정 키트의 working reagent(WR) A, B를 50:1의 비율로 혼합하여 working solution을 준비하는데, 측정할 단백질 시료 1개당 200 ㎕의 working solution을 준비할 수 있다.
그 후, 정량기(120)는 단백질 시료의 로딩이 완료된 각 웰에 200 ㎕의 working solution을 로딩한 후, 37 ℃ 에서 30분간 반응시킬 수 있다.
그 후, 정량기(120)는 도 5와 같이 표준 단백질에 의해 산출되는 검량선과 흡광도값을 이용하여 단백질 시료의 농도값을 계산할 수 있다.
구체적인 일례로, 바이오의약품 중 하나인 허셉틴(Herceptin)로부터 전처리된 단백질 시료의 흡광도값이 0.773로 측정되었으며, 정량기(120)는 이하의 [수학식 1] 및 [수학식 2]와 같이 단백질 시료의 농도값을 계산할 수 있다.
정량기(120)는 상기 [수학식 1, 2]과 같이 계산된 단백질 시료의 농도값에 희석 배율을 적용하여 희석 전 단백질 시료의 농도값을 이하의 [수학식 3]과 같이 측정할 수 있다.
단백질 총량 측정 단계(S121) 및 단백질 시료 용액 획득 단계(S122)에서, 정량기(120)는 단백질 정량을 통해 상층액 내 단백질의 총량을 측정하고, 일정량의 단백질 시료 용액을 획득할 수 있다.
이때, 단백질 정량 방법은 한정하지 아니하나, 바람직하게는 정량기(120)가 장치 내 구비된 비신코닌산(BCA) 단백질 분석 키트를 통해 단백질 정량이 진행될 수 있다.
단백질 전처리
이하에서는, 상기 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)의 단백질 전처리 단계(S130)의 세부적인 과정에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 4는 도 2에 도시된 단백질 전처리 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 4를 참조하면, 단백질 전처리 단계(S130)는 단백질 시료 환원 단계(S131), 시료 알킬화 단계(S132), 가수분해 단계(S133), 탈염 단계(S134), 건조 단계(S135), 펩타이드 정량 단계(S136), 분석 시료 획득 단계(S137)를 포함한다.
전처리기(130)는 단백질 시료의 농도값과 희석 전 단백질 시료의 농도 값을 계산한 후, 계산한 농도 값에 따라 각 단백질 시료별로 일정량(200 ㎍)씩 취하여 소화(digestion)를 진행할 수 있다.
전처리기(130)는 단백질 시료 환원 단계(S131), 알킬화 단계(S132), 가수분해 단계(S133)는 단백질 정량단계 (S120)에서, 단백질 정량이 완료된 일정량(200 ㎍)의 각 단백질 시료를 펩타이드 및 당펩타이드로 가수분해시킬 수 있다.
이러한 전처리기(130)의 바람직한 과정은 이하와 같다.
먼저, 단백질 시료 환원단계(S131)는 정량기 (120)의 단백질 시료 용액 획득 (S122)에서 획득된 단백질 시료에 제1 완충액을 추가하여 단백질 시료의 부피를 조절할 수 있다.
그 후, 단백질 시료 환원단계(S131)는 단백질 시료 내 환원제의 농도가 10 mM이 되도록 환원제를 단백질 시료에 투입한 후, vortex-spin down 하고, 25 ℃ 및 850 rpm 조건에서 1시간동안 반응시킬 수 있다.
이때, 환원제는 디티오트레이톨(DTT) 77.125 mg를 2.5 mL 증류수에 첨가한 200mM 농도의 DTT일 수 있으며, TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) 등의 동일한 기능을 하는 환원제가 사용될 수 있다.
반응 후, 단백질 시료 알킬화단계(S132)는 환원제가 투입된 단백질 시료 내 알킬화제의 농도가 40 mM이 되도록 단백질 시료에 알킬화제를 투입한 후에 vortex-spin down 하고, 25 ℃, 850 rpm 및 암조건(in dark)에서 1시간동안 반응시킬 수 있다.
이때, 단백질 시료 알킬화단계(S132)에서 알킬화제는 인돌-3-알킬카복실산(IAA) 369.92 mg를 5 mL 증류수에 첨가한 400mM 농도의 IAA일 수 있으며, 유사한 기능을 하는 알킬화제가 사용될 수 있다.
반응 후, 가수분해 단계(S133)는 단백질 시료를 가수분해시키는 과정에서 단백질 시료와 효소의 비율이 25:1이 되도록 단백질 시료에 효소를 투입한 후, vortex-spin down 하고, 25 ℃ 및 850 rpm 조건에서 16시간동안 반응시켜 단백질 시료를 펩타이드 및 당펩타이드로 가수분해시킬 수 있다.
이때, 가수분해 단계(S133)에서 효소는 100 ㎍ 트립신(Trypsin)과 100 ㎕ 50mM Tris-HCl를 넣어 녹인 1 ㎍/㎕ Trypsin in 50mM Tris-HCl일 수 있으며, 단백질을 가수분해하는 효소는 종류에 관계없이 사용될 수 있다. 가수분해 효소를 단백질 시료에 투입하기 전에 단백질을 녹이고 있는 요소(Urea) 의 농도는 2M 이하가 되도록 필요시 희석하여 준비한 후 가수분해 효소를 투입한다. 가수분해 효소를 단백질 시료에 투입하기 전에 단백질을 녹이고 있는 요소(Urea) 의 농도는 2M 이하가 되도록 필요시 희석하여 준비한 후 가수분해 효소를 투입한다.
반응 후, 가수분해 단계(S133)에서 각 단백질 시료의 포름산(Formic acid) 최종 농도가 1 %가 되도록 100% 포름산 4.5 ㎕을 단백질 시료에 추가한 후에 급랭수단을 통해 급랭(quenching)시켜 효소의 작용을 멈추게 할 수 있다.
이때, 탈염 단계(S134)에서는 포름산의 추가 과정에서 각 단백질 시료의 산도(pH)가 pH 3 미만인지 여부를 확인할 수 있으며, 3 pH 미만의 단백질 시료를 탈염시킬 수 있다.
탈염 단계(S134)에서, 전처리기(130)는 진공챔버에 결합된 카트리지, 제2 완충액 및 제3 완충액을 이용하여 단백질 시료를 펩타이드로 탈염할 수 있다.
이러한 탈염 단계(S134)의 바람직한 과정은 이하와 같다.
먼저, 탈염 단계(S134)는 단백질 시료의 pH를 기설정된 pH인 3 pH 미만으로 유지하면서 진동챔버에 15 mL의 코니칼 튜브(conical tube)를 꽂고 펌프와 연결할 수 있다.
그 후, 탈염 단계(S134)는 진공챔버에 카트리지를 꽂고, 펌프를 온(on) 상태로 전환한 후 압력을 5mmHg로 설정할 수 있다.
그 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 아세토나이트릴(ACN)을 카트리지(예: Sep-Pak)에 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시킬 수 있다.
이때, 탈염 단계(S134)는 아세토나이트릴 투입 과정에서 카트리지의 충진물이 마르지 않도록 100 ㎕ 정도 남을 때까지 내리고, 진공챔버의 밸브를 폐쇄시킬 수 있다.
또한, 탈염 단계(S134)는 아세토나이트릴이 카트리지에 투입되는 과정을 2회 반복하여 진행할 수 있다.
밸브 폐쇄 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 카트리지에 1 mL의 제2 완충액을 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시킬 수 있다.
이때, 제2 완충액은 14,895 ㎕의 증류수에 15 ㎕의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하는 것으로 생성될 수 있다.
또한, 탈염 단계(S134)는 제2 완충액 투입 과정에서 카트리지의 충진물이 마르지 않도록 100 ㎕ 정도 남을 때까지 내리고, 진공챔버의 밸브를 폐쇄시킬 수 있다.
그리고 탈염 단계(S134)는 제2 완충액이 카트리지에 투입되는 과정을 3회 반복하여 진행할 수 있다.
밸브 폐쇄 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 오프(off) 상태로 전환한 후 코니칼 튜브를 교체하며, 코니칼 튜브의 교체가 완료되면 펌프를 다시 온 상태로 전환한 후 압력을 5mmHg로 설정할 수 있다.
그 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 단백질 시료를 카트리지에 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시킬 수 있다.
이때, 탈염 단계(S134)는 단백질 시료 투입 과정에서 카트리지의 충진물이 마르지 않도록 100 ㎕ 정도 남을 때까지 내리고, 진공챔버의 밸브를 폐쇄시킬 수 있다.
또한, 탈염 단계(S134)는 단백질 시료의 부피가 카트리지의 최대 부피보다 큰 경우, 단백질 시료 투입 과정을 반복하여 진행할 수 있다.
밸브 폐쇄 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 1 mL의 제2 완충액을 카트리지에 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시킬 수 있다.
이때, 탈염 단계(S134)는 제2 완충액 투입 과정에서 카트리지의 충진물이 마르지 않도록 100 ㎕ 정도 남을 때까지 내리고, 진공챔버의 밸브를 폐쇄시킬 수 있다.
또한, 탈염 단계(S134)는 제2 완충액이 카트리지에 투입되는 과정을 4회 반복하여 진행할 수 있다.
밸브 폐쇄 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 1 mL의 1% 포름산이 포함된 3차 증류수를 카트리지에 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시키고, 이 과정에서 카트리지에 남은 단백질 시료를 내릴 수 있다.
그 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 오프 상태로 전환한 후 코니칼 튜브를 교체하며, 코니칼 튜브의 교체가 완료되면 펌프를 다시 온 상태로 전환한 후 압력을 5mmHg로 설정할 수 있다.
그 후, 탈염 단계(S134)는 펌프를 통해 1 mL의 제3 완충액을 카트리지에 투입한 후 진공챔버의 밸브를 개방시키며, 이 과정에서 카트리지에 남은 단백질 시료가 완전히 내릴 때까지 용리(elution)되도록 하고, 이를 통해 단백질 시료를 펩타이드로 탈염시킬 수 있다.
이때, 제3 완충액은 2,400 ㎕의 아세토나이트릴에 597 ㎕의 증류수 및 3 ㎕의 포름산을 첨가하는 것으로 생성될 수 있다.
건조 단계(S135)에서, 전처리기(130)는 진공챔버로부터 용리된 펩타이드를 건조수단으로 건조시킬 수 있다.
펩타이드 정량 단계(S136)에서, 전처리기(130)는 표준 펩타이드를 이용한 검량선 및 상기 펩타이드의 흡광도값을 이용하여 펩타이드를 정량할 수 있다.
이러한 펩타이드 정량 단계(S136)의 바람직한 과정은 이하와 같다.
먼저, 펩타이드 정량 단계(S136)는 펩타이드 정량을 위한 시약(예: Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay)과 96 웰 플레이트를 셋팅할 수 있다.
그 후, 펩타이드 정량 단계(S136)는 탈염 수율을 50%로 설정(또는 예상)하여 건조된 펩타이드의 농도가 1 ㎍/㎕가 되도록 증류수에 녹일 수 있다.
그 후, 펩타이드 정량 단계(S136)는 증류수에 녹인 펩타이드를 측정농도범위에 맞춰 증류수로 희석시킬 수 있다.
그 후, 96 웰 플레이트의 각 웰(well)에 희석된 펩타이드를 10 ㎕씩 로딩할 수 있다.
그 후, 펩타이드 정량 단계(S136)는 단백질 농도 측정 키트의 working reagent(WR) A, B, C를 50: 48: 2의 비율로 혼합하여 working solution을 준비하는데, 측정할 펩타이드 1개당 180 ㎕의 working solution을 준비할 수 있다.
그 후, 펩타이드 정량 단계(S136)는 펩타이드의 로딩이 완료된 각 웰에 180 ㎕의 working solution을 로딩한 후, 37 ℃ 에서 15분간 반응시킬 수 있다.
그 후, 펩타이드 정량 단계(S136)는 도 6과 같이 표준 펩타이드를 이용한 검량선과 흡광도값을 이용하여 펩타이드의 농도값을 계산할 수 있다.
구체적인 일례로, 바이오의약품 중 하나인 허셉틴(Herceptin)로부터 전처리된 펩타이드의 흡광도값이 0.855로 측정되었으며, 펩타이드 정량 단계(S136)는 이하의 [수학식 4] 및 [수학식 5]와 같이 펩타이드의 농도값을 계산할 수 있다.
전처리기(130)는 상기 [수학식 4, 5]와 같이 계산된 펩타이드의 농도값에 희석 배율을 적용하여 희석 전 펩타이드의 농도값을 측정하는 것이 바람직하다.
분석 시료 획득 단계(S137)에서, 전처리기(130)는 펩타이드를 채취함으로써, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)에서 정성 및 정량 분석될 일정량의 분석 시료를 획득할 수 있다.
펩타이드 정량 단계(S136)는 상기 [수학식 4, 5]와 같이 계산된 펩타이드의 농도 값에 희석 배율을 적용하여 희석 전 펩타이드의 농도 값을 측정하는 것이 바람직하다.
분석 시료 획득 단계(S137)에서, 전처리기(130)는 펩타이드를 채취함으로써, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)에서 정성 및 정량 분석될 일정량의 분석 시료를 획득할 수 있다.
액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산
이하에서는, 상기 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)의 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계(S140)의 세부적인 과정에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 7은 도 2에 도시된 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 7을 참조하면, 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계(S140)는 분석 시료 투입 단계(S141), 분석 준비 단계(S142), 액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143), 액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 질량 분석조건 설정 단계(S144)를 포함한다.
분석 시료 투입 단계(S141)에서, 액체 크로마토그래피/질량분석기는 전처리기(130)를 통해 획득된 분석 시료를 투입할 수 있다.
분석 준비 단계(S142)에서, 액체 크로마토그래피/질량분석기(140)는 분석 시료의 펩타이드의 양에 따라 분석 시료의 농도가 0.5 ㎍/㎕가 되도록 제1 이동상에 녹이고 LC-바이알에 투입하여 질량 분석 수행할 시료를 준비할 수 있다.
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143)에서 시료주입은 5~10uL 를 사용하여 일정량의 시료를 주입하고, 액체크로마토그래피의 이동상 조성은 제1 이동상과 제2 이동상을 이용하여 표1을 기본으로 하는 용매구배를 사용하고 이동상의 유속은 일정하게 유지되도록 한다. 이때 유속은 다양한 유속 (nano, micro, conventional flow)을 지원하는 액체크로마토그래피를 사용할 수 있다.
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143)에서 사용되는 제1 이동상과 제2 이동상의 제조 과정은 다음과 같다.
제1 이동상은 24,975 ㎕의 증류수에 25 ㎕의 포름산을 첨가한 후, 20분동안 초음파 처리 및 탈기하는 것으로 생성될 수 있다.
제2 이동상은 20,000 ㎕의 아세토나이트릴에 4,975 ㎕의 증류수 및 25 ㎕의 포름산을 첨가한 후, 20분동안 초음파 처리 및 탈기하는 것으로 생성될 수 있다.
이동상은 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계(S140)전에 제1 이동상과 제2 이동상을 제조한 후, 제1 이동상과 제2 이동상을 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계에 활용한다.
이때, 제조된 제1 및 제2 이동상은 이하의 [표 1]과 같이 아래와 동등한 구배로 HPLC 에서 작동되어 복잡한 펩타이드를 분리하는데 적용될 수 있다.
| 용매 구배 | 시간(분) | 제1 이동상(%) | 제2 이동상(%) |
| 0 | 95 | 5 | |
| 5 | 93 | 7 | |
| 85 | 75 | 25 | |
| 98 | 60 | 40 | |
| 99 | 5 | 95 | |
| 109 | 5 | 95 | |
| 110 | 95 | 5 | |
| 120 | 95 | 5 |
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143)에서는 바이오의약품시료의 가수분해를 통해 획득된 복잡한 펩타이드시 료를 분리하기 위한 역상컬럼(C18 충진물 기반)을 분리용 컬럼으로 사용한다.
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143)의 실시 예는 [표 2]와 같다.
| 액체크로마토그래피 조건 | |
| 기기 | Easy nLC-1200 |
| 시료 주입 | 5L (about ug) |
| 이동상 | 제1 이동상 : 0.1% Formic acid in DW |
| 제2 이동상 : 0.1% Formic aicd in ACN | |
| 정지상 | 분석컬럼: C18충진물, 75um i.d, X 50cm |
| 농축컬럼 : C18충진물, 75um i.d., 20mm | |
| 농축조건 | 4uL/min 로 5분간 농축 |
| 이동상유속 | 250nL/min |
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 질량 분석조건 설정 단계(S144)는 액체크로마토그래피 분석조건 설정 단계(S143)를 통해 분리된 시료들이 질량분석에서 검출될 수 있는 조건을 설정한다.
이때, 액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 질량 분석조건 설정(S144)는 질량측정정확도를 향상시키기 위해 분해능 30,000 이상의 고분해능질량분석기가 사용되는데 구체적인 일례로 Orbitrap 질량분석기가 적용될 수 있으나 이를 한정하는 것은 아니며, 다양한 방식의 질량분석기 (TOF, Orbitrap, triple quadruple 등) 가 적용될 수도 있으며 trapped ion mobility spectrometry (TIMS), field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) 등의 장치가 결합된 질량분석기도 적용가능하다.
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 질량 분석조건 설정(S144)에서는 아래와 같은 조건을 기본설정하여 변형 적용가능한다. 기본설정조건 : 전구체 이온 (precursor ion)을 측정하는 MS1의 측정 범위는 400 m/z에서 2000 m/z로, 오비트램(Orbitrap) 분해능 120,000, 최대 이온 주입 시간 100 ms, 자동 주입 이온 조절(AGC (automatic gain control)) 1.0×106로 설정하여 분석 및 측정한다. 전구체 이온의 파편 이온 (fragment ion)을 생성하고 측정하는 MS2의 설정조건은 오비트랩(Orbitrap) 질량 분석기의 분해능 30,000, 정규화된 고에너지 충돌 해리(higher-energy collisional dissociation, HCD) 30 %, 자동 주입 이온 조절 (AGC (automatic gain control) 1.0×105, 최대 이온 주입 시간은 150 ms, 이전에 측정된 전구체 이온 질량분석측정정확도 10 ppm 질량 허용 오차로 30초 동안 제외되도록 설정하여 분석 및 측정한다.
액체크로마토그래피 및 질량분석을 위한 질량 분석조건 설정 단계(S144)에서 질량분석기는 MS2 측정을 위해 data dependent acquisition(DDA), SWATH와 같은 data independent acquisition (DIA), BoxCar, SRM (single reaction moniotoring), MRM(multiple reaction monitoring), parallel reaction monitoring (PRM)을 활용, 적용가능하다.
구체적인 일례로, 액체크로마토그래피 및 질량분석 데이터 생산 단계(140)는 단백질 전처리 단계(S130)에서 바이오의약품 중 하나인 허셉틴(Herceptin)으로부터 획득된 분석 시료를 'Herception-O-1', 'Herception-O-2', 'Herception-O-3'으로 동일 시료를 3회 이상 분석수행하고, 확보된 질량분석데이터의 크로마토그램은 도 8에 도시된 바와 같다.
데이터 처리/정성 및 정량 분석
이하에서는, 상기 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)의 데이터 처리/정성 및 정량 분석 단계(S150)의 세부적인 과정에 대해 자세히 설명하도록 하겠다.
도 9는 도 2에 도시된 데이터 처리 및 정성 분석 단계의 세부적인 과정을 나타내는 도면이다.
도 9을 참조하면, 데이터 처리/정성 및 정량 분석 단계(S150)는 데이터베이스 생성 단계(S151), 소프트웨어에 질량분석결과 생성된 데이터 저장 단계(S152), 정성 분석단계 (S153), 정량 분석단계 (S154), 분석 시료별 정량된 전체 단백질의 강도를 합하여 %로 정규화하는 단계(S155) 및 전체 정량강도를 100으로 두고 각 HCP 단백질별 ppm 계산 단계(S156)를 포함한다.
데이터베이스 생성 단계(S151)에서, 데이터 처리/정성 및 정량분석기(150)는 전처리기(130)를 통해 획득된 분석 시료의 정성 분석을 위한 바이오의약품 데이터베이스와 HCP 데이터베이스를 생성하여 바이오의약품의 단백질 서열 데이터 및 HCP의 염기서열 데이터를 확보할 수 있다.
이때, 데이터 처리/정성 및 정량분석기(150)는 도 10에 도시된 바와 같이 바이오의약품의 단백질 서열을 확보한 후 *.fasta 파일로 저장하여 바이오의약품 데이터베이스를 생성할 수 있으며, 이와 동일한 방식으로 HCP의 염기서열 데이터를 확보한 후 *.fasta 파일로 저장하여 HCP 데이터베이스를 생성할 수 있다.
질량분석결과 생성된 데이터 저장 단계(S152)에서는 액체크로마토그래피 및 질량분석기에서 생산된 데이터를 정성분석에 사용하고자 하는 소프트웨어에 저장한다.
이때, 단백질의 정성분석(S153)은 액체크로마토그래피 및 질량분석기에서 생산된 데이터를 저장(S152)하고 데이터베이스 생성 단계(S151)에서 입력된 데이터베이스를 활용하여 서치 조건을 설정하여 단백질을 정성분석 한다.
단백질을 정성분석(S153)을 위해 전구체 질량 오류가 5ppm이고 단편 이온 질량 오류가 50ppm인 펩타이드를 식별하도록 설정하고, 단백질을 펩타이드로 가수분해하는데 사용한 효소로는 트립신을 선택하고, 생성된 펩타이드조각의 N-term과 C-term 모두 트립신에 의해 아미노산이 절단된 펩타이드만 정성되는 것을 허용하고, 시스테인에서의 카르바미도메틸화 및 메티오닌에서의 산화는 각각 정적 및 가변 변형으로 선택하였다. 데이터베이스 생성 단계(S151)에서 입력된 단백질의 데이터 베이스는 모든 단백질의 역순서열을 데이터베이스에 추가하여 FDR(False Discover Rate)를 계산하는데 사용되도록 하고, FDR 1% 이하만 포함되는 단백질 정성결과 리스트를 확보하도록 설정하여 정성 단백질 결과를 확보한다. 소프트웨어를 활용하여 단백질 정성분석하는 조건은 질량분석기의 설정조건에 따라 또는 목적에 맞게 변형가능하다.
단백질을 정성분석(S153)하는데 사용하는 소프트웨어로는 Mascot, MaxQuant, proteome discoverer (PD), integrated proteome pipeline (IP2) 등 단백질을 가수분해하여 얻어진 펩타이드의 질량분석데이터로부터 단백질을 정성분석 가능한 기능을 가진 모든 소프트웨어에 적용하여 정성된 단백질의 리스트를 확보할 수 있다.
단백질 정량 분석단계 (S154)는 Mascot, MaxQuant, proteome discoverer (PD), integrated proteome pipeline (IP2) 등의 범용으로 사용 가능한 자동정성 및 정량 소프트웨어로부터 산출할 수도 있고, Skyline 을 활용한 정량결과 추출, 또는 다양한 소프트웨어로부터 얻어진 정성결과를 바탕으로 획득된 spectral count 수 또는 동등한 기능으로 추출된 정량값 또는 질량분석기에서 획득된 데이터로부터 수동으로 강도(area 또는 intensity) 값을 추출하여 단백질의 정량분석가능한 데이터를 산출하는 다양한 종류의 방법을 적용하여 획득된 데이터가 정량분석에 사용될 수 있다.
이후, 데이터 처리기(150)는 분석 시료별 정량된 전체 단백질의 강도를 합하여 % 로 정규화하는 단계(S155)에서 정성된 단백질의 정량 분석 결과 데이터에 포함된 분석 시료별 정량된 전체 단백질의 정량값을 합하여 100%로 하고, 각각의 단백질 별 정량 %를 전체 단백질의 정량값으로 부터 산출한다.
이후, 데이터 처리기(150)는 이하의 [수학식 6]과 같이, HCP 단백질별 ppm 계산 단계(S156)에서 전체 단백질의 정량강도를 100으로 두고 각 숙주세포 단백질의 정량강도 값을 나눠서 106을 곱하여 숙주세포 단백질별 ppm 정량값을 산출한다.
실시예 1에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 의해 전처리된 바이오의약품(도 11~14의 'Original')과 정량 분석 결과의 비교를 위한 제1 비교 바이오의약품(도 11~14의 'batch 1') 및 제2 비교 바이오의약품(도 11~14의 'batch 2')의 정량 분석을 진행하였다.
도 11은 각 바이오의약품에서 분석된 HCP의 수를 나타내는 도면이며, 도 12는 식별된 HCP 총 강도 및 각 바이오의약품에서의 HCP 및 바이오의약품의 백분율 강도를 나타내는 도면이다.
도 11 및 도 12를 참조하면, 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 의해 전처리된 바이오의약품은 HCP가 0 %에 가까운 1 % 미만으로 검출되었으나, 제1, 2 비교 바이오의약품의 경우 각각 8 %, 40 %의 HCP가 검출되었다. 또한, 제1, 2 비교 바이오의약품의 경우 HCP의 수가 비슷하였으나 정량적으로는 차이가 있었다.
도 13은 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 ppm 분포를 나타내는 도면이다.
도 13을 참조하면, Label-free(비표지 정량분석방법)로 HCP를 바이오의약품, 제1 비교 바이오의약품, 제2 비교 바이오의약품의 정량 분석을 진행한 결과, 바이오의약품은 HCP가 10 ppm 미만이나, 제1, 2 비교 바이오의약품은 HCP가 높은 농도가 정량되었다.
도 14는 각 바이오의약품에서 정량화된 HCP의 변동 계수(CV)% 분포를 나타내는 도면이다.
도 14를 참조하면, 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템(100)에 의해 전처리된 바이오의약품 시료를 각각 3회 반복 실험하여 비표지 정량 분석법(label free quantification)으로 정량 값을 추출하여 정량적 재현성을 변동 계수(CV)확인한 결과로 제1, 2 비교 바이오의약품의 경우 70 % 이상의 숙주세포 단백질에서 30 % 미만의 변동 계수로 재현성 높은 결과가 도출되었다.
또한, 이하의 [수학식 7]과 같이 HCP 중 강도(intensity)가 높은 단백질을 기준으로 정렬해본 결과, 제2 비교 바이오의약품, 제1 비교 바이오의약품, 바이오의약품 순으로 HCP가 감소됨에 확인되었다.
상기 [수학식 7]에서, 'intensity of each host cell protein(HCP)'는 '각 HCP의 강도'를 의미하며, 'sum of bio-product intensity'는 '각 바이오의약품의 강도'를 의미하는 것으로 상기 [수학식 6]과 같은 의미로 활용된다.
실시예 2에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)과 비교를 위한 제1 비교 정량 분석 방법('Improved Host Cell Protein Analysis in Monoclonal Antibody Products through Molecular Weight Cutoff Enrichment', I-Hsuan Chen 외 다수)와 제2 비교 정량 분석 방법('A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies', Lihua Huang 외 다수)를 이하의 [표 3]과 같이 비교하였다.
| 본 발명 | 제1 비교 정량 분석 방법 | 제2 비교 정량 분석 방법 | |
| MWCT(Molecular Weight Cut-Off) | O | O | O |
| 가수분해 후 바이오의약품 존재 | O(10 KDa MWCT 후 바이오의약품이 포함된 상층액 사용) | 최소화(50 KDa 이상의 MWCT 후 바이오의약품이 포함되지 않은 하층액 사용) | 최소화 |
| 외부표준물질 | X | O | O |
| 농도범위 | 1-105 | 1-104 | 1-104 |
| LC-MS/MS | O | O | O |
상기 [표 3]과 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)은 외부표준물질(숙주세포로 CHO세포를 사용하였다면 CHO세포에 존재하지 않는 표준단백질을 확보하여 이 표준단백질을 숙주세포를 최대한 제거한 공정과정을 거친 바이오의약품에 주입하여, 주입된 알고 있는 외부표준 단백질이 검출된 양으로 바탕으로 숙주세포단백질의 양을 추측하는 방법)을 사용하지 않는 반면, 제1, 2 비교 정량 분석 방법은 모두 외부표준물질을 사용하는 점과 HCP의 농도를 측정할 수 있는 농도범위에 차이가 있는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 시료전처리 과정에서 발생하는 시료손실을 고려하여 액체크로마토그래피 및 질량분석 수행전 단계에서 시료 전처리를 위해 사용하는 단백질의 총량을 정량하고, 시료전처리가 완료된 후 획득된 펩타이드의 총량을 정량하여 액체크로마토그래피 및 질량분석에 주입되는 시료의 양을 확인함으로써 질량분석에서 측정된 데이터의 정량분석결과를 바탕으로 시료전체에서 숙주세포 단백질별 정량분석결과를 ppm으로 산출할 수 있다.
이러한 차이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주세포 단백질 정량 분석 방법(S100)은 바이오의약품의 단백질 정량 분석 측면에서 제1, 2 비교 정량 분석 방법보다 더 효율적인 정량 분석 방법이라는 것이 확인되었다.
상술한 바와 같이 개시된 본 발명의 바람직한 실시예들에 대한 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 구현하고 실시할 수 있도록 제공되었다. 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 본 발명의 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 상술한 실시예들에 기재된 각 구성을 서로 조합하는 방식으로 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 여기에 나타난 실시형태들에 제한되려는 것이 아니라, 여기서 개시된 원리들 및 신규한 특징들과 일치하는 최광의 범위를 부여하려는 것이다.
본 발명은 본 발명의 기술적 사상 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있다. 따라서, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니 되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명은 여기에 나타난 실시형태들에 제한되려는 것이 아니라, 여기서 개시된 원리들 및 신규한 특징들과 일치하는 최광의 범위를 부여하려는 것이다. 또한, 특허청구범위에서 명시적인 인용 관계가 있지 않은 청구항들을 결합하여 실시예를 구성하거나 출원 후의 보정에 의해 새로운 청구항으로 포함할 수 있다.
100: 정량 분석 시스템,
110: 정제기,
120: 정량기,
130: 전처리기,
140: 액체 크로마토그래피/질량분석기,
150: 데이터 처리기.
110: 정제기,
120: 정량기,
130: 전처리기,
140: 액체 크로마토그래피/질량분석기,
150: 데이터 처리기.
Claims (20)
- 숙주세포 단백질 정량 분석 방법에 있어서,
a) 바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득하는 단계;
b) 정량기가 단백질 정량을 통해 정제기로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득하는 단계;
c) 전처리기가 상기 단백질 시료 용액을 전처리하며, 시료 전처리 후 남은 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득하는 단계;
d) 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료를 정성 및 정량 분석하는 단계; 및
e) 데이터 처리기가 분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 상기 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하는 단계;를 포함하고,
상기 전처리기는,
상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 전체를 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 전처리하고, 질량분석전에 전체 시료양을 측정하여 최종 ppm 산출에 활용하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 a) 단계는,
a-1) 상기 정제기가 단백질 농축튜브에 상기 정제기로부터 바이오의약품을 투입하며, 상기 단백질 농축튜브 내 구비된 필터를 이용하여 상기 바이오의약품의 염을 제거하고 용액을 교환한 후 농축하는 단계;
a-2) 상기 정제기가 상기 필터를 통해 상기 바이오의약품과 HCP가 혼합된 상태의 상층액을 취득하는 단계; 및
a-3) 상기 정제기가 원심분리기 내 필터와 제1 완충액을 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 원심분리시켜 상기 제1 완충액을 교환 및 농축하고, 상기 제1 완충액으로부터 단백질 시료를 취득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 a-3) 단계는,
상기 정제기가 상기 원심분리기 내 필터에 제1 완충액을 투입하여 상기 필터를 세척시키며,
상기 필터의 세척이 완료되는 경우, 상기 원심분리기에 일정량의 제1 완충액, 상기 단백질 시료 용액, 제1 완충액 순으로 로딩한 후, 일정시간동안 상기 단백질 시료 용액의 원심분리를 진행하고,
상기 단백질 시료 용액의 원심분리가 완료되는 경우, 상기 원심분리기에 일정량의 제1 완충액을 추가하여 상기 원심분리기에 로딩된 제1 완충액을 교환 및 농축하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 b) 단계는,
b-1) 상기 정량기가 표준 단백질에 의해 산출되는 검량선 및 상기 단백질 시료의 흡광도값 이용하여 상기 단백질 시료 내 단백질의 양을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 c) 단계는,
c-1) 상기 전처리기가 원심분리기 내 필터와 제1 완충액을 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 원심분리시켜 상기 제1 완충액을 교환 및 농축하고, 상기 제1 완충액으로부터 단백질 시료를 취득하는 단계;
c-2) 상기 전처리기가 표준 단백질에 의해 산출되는 검량선 및 상기 단백질 시료의 흡광도값 이용하여 상기 단백질 시료 내 단백질의 양을 측정하는 단계;
c-3) 상기 전처리기가 상기 제1 완충액과 효소를 이용하여 상기 단백질 시료를 펩타이드 및 당펩타이드로 가수분해시키는 단계;
c-4) 상기 전처리기가 진공챔버에 결합된 카트리지, 제2 완충액 및 제3 완충액을 이용하여 상기 단백질 시료를 펩타이드로 탈염하는 단계;
c-5) 상기 전처리기가 상기 진공챔버로부터 용리된 펩타이드를 건조수단으로 건조시키는 단계;
c-6) 상기 전처리기가 표준 펩타이드를 이용한 검량선 및 상기 펩타이드의 흡광도값을 이용하여 상기 펩타이드를 정량하는 단계; 및
c-7) 상기 전처리기가 상기 펩타이드를 채취하여 일정농도의 상기 분석 시료를 획득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 제1 완충액은,
0~8M 요소를 950 mL 정제수에 50 mL 1M Tris-HCl을 추가한 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 녹여서 제조하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 6 항에 있어서,
상기 요소는,
0~8M Urea 농도를 Tris-HCl (pH 8)등의 완충용액에 제조하고 Urea 및 Tris-HCl와 동등한 기능을 하는 버퍼에 녹여서 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 c-1) 단계는,
상기 전처리기가 상기 제1 완충액을 상기 단백질 시료에 추가하여 상기 단백질 시료의 부피를 조절하며,
상기 단백질 시료의 부피 조절이 완료되는 경우, 상기 단백질 시료 내 환원제의 농도가 10 mM이 되도록 상기 환원제를 상기 단백질 시료에 투입한 후, vortex-spin down 하고, 25 ℃ 및 850 rpm 조건에서 1시간동안 반응시키며,
상기 환원제에 의한 단백질 시료의 반응이 완료되는 경우, 상기 환원제가 투입된 단백질 시료 내 알킬화제의 농도가 40 mM이 되도록 상기 단백질 시료에 상기 알킬화제를 투입한 후에 vortex-spin down 하고, 25 ℃, 850 rpm 및 암조건에서 1시간동안 반응시키며,
상기 알킬화제에 의한 단백질 시료의 반응이 완료되는 경우, 단백질을 녹이고 있는 요소 (Urea)의 농도가 2M 이하로 유지된 상태에서, 상기 단백질 시료에 상기 효소를 투입한 후, vortex-spin down 하고, 25 ℃ 및 850 rpm 조건에서 16시간동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 환원제는,
디티오트레이톨(DTT) 77.125 mg를 2.5 mL 증류수에 첨가한 200mM 농도의 DTT 및 이와 동등한 기능을 하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 알킬화제는,
인돌-3-알킬카복실산(IAA) 369.92 mg를 5 mL 증류수에 첨가한 400mM 농도의 IAA 및 이와 동등한 기능을 하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 c-4) 단계는,
상기 전처리기가 상기 단백질 시료의 pH를 기설정된 pH로 유지하면서 상기 진공챔버와 연결된 펌프를 통해 아세토나이트릴(ACN)을 적어도 한 번 이상 상기 카트리지에 투입하며,
상기 아세토나이트릴의 투입이 완료되는 경우, 상기 펌프를 통해 상기 제2 완충액을 적어도 한 번 이상 상기 카트리지에 투입하고,
상기 제2 완충액의 투입이 완료되는 경우, 상기 단백질 시료를 상기 카트리지에 투입한 후 상기 제2 완충액을 상기 카트리지에 재차 투입하며,
상기 제2 완충액의 투입이 완료되는 경우, 상기 펌프를 통해 1mL의 1 % 포름산이 포함된 3차 증류수를 상기 카트리지에 투입한 후, 상기 제3 완충액을 상기 카트리지에 투입하여 상기 단백질 시료를 펩타이드로 탈염시키는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 11 항에 있어서,
상기 제2 완충액은,
14,895 ㎕의 증류수에 15 ㎕의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하는 것으로 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 11 항에 있어서,
상기 제3 완충액은,
2,400 ㎕의 아세토나이트릴에 597 ㎕의 증류수 및 3 ㎕의 포름산을 첨가하는 것으로 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
이동상은 액체크로마토그래피/질량분석기를 이용한 분석 전에, 제1 이동상과 제2 이동상을 제조한 후, 상기 제1, 2 이동상을 액체 크로마토그래피/질량분석기로 검출하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 제1 이동상은,
24,975 ㎕의 증류수에 25 ㎕의 포름산을 첨가한 후, 20분동안 초음파 처리 및 탈기하는 것으로 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 제2 이동상은,
20,000 ㎕의 아세토나이트릴에 4,975 ㎕의 증류수 및 25 ㎕의 포름산을 첨가한 후, 20분동안 초음파 처리 및 탈기하는 것으로 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 d) 단계는,
d-1) 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료를 투입한 후, 상기 분석 시료의 펩타이드의 양에 따라 상기 분석 시료가 일정한 농도가 되도록 제1 이동상에 녹이고 일정량 분취하여 LC-바이알에 담는 것으로 상기 분석 시료의 정성 및 정량 분석을 준비하는 단계;
d-2) 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료의 정성 및 정량분석을 위해 액체크로마토그래피 분석조건을 설정하는 단계; 및
d-3) 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기가 상기 분석 시료의 정성 및 정량분석을 위해 질량분석기의 분석조건을 설정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 e) 단계는,
e-1) 상기 데이터 처리기가 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기로부터 정량 분석 결과 데이터를 저장하는 단계;
e-2) 상기 데이터 처리기가 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기로부터 획득한 분석 데이터를 정성 및 정량분석을 위한 소프트웨어에 저장하는 단계;
e-3) 상기 데이터 처리기가 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기로부터 획득한 분석 데이터를 정성 및 정량분석하는 소프트웨어를 활용하여 정성분석 조건을 설정하여 데이터의 정성분석을 수행하는 단계;
e-4) 상기 데이터 처리기가 상기 액체 크로마토그래피/질량분석기로부터 획득한 분석 데이터를 정성 및 정량분석하는 소프트웨어를 활용하여 정성분석된 결과를 바탕으로 정량분석데이터를 획득하는 단계;
e-5) 상기 데이터 처리기가 상기 정량 분석 결과 데이터를 이용하여 HCP로 정성된 상기 바이오의약품 내 단백질의 ppm을 계산하는 단계; 및
e-6) 상기 데이터 처리기가 상기 정량 분석 결과 데이터에 포함된 분석 시료별 정량된 단백질의 강도를 합하여 %로 정규화하고, 전체를 100으로 두어 상기 분석 시료별 각 HCP의 ppm을 계산하는 단계;를 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 제 18 항에 있어서,
상기 e-6) 단계는,
상기 데이터 처리기가 상기 분석 시료별 각 HCP의 ppm을 이하의 수학식인,
으로 계산하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 방법. - 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템에 있어서,
바이오의약품 내 불순물을 제거하고, 바이오의약품 및 상기 바이오의약품 내에 존재하는 HCP를 획득하는 정제기;
단백질 정량을 통해 상기 정제기로부터 정제된 바이오의약품 내 단백질의 총량을 측정하여 시료 전처리할 단백질 시료 용액을 일정량 획득하는 정량기;
상기 단백질 시료 용액을 전처리하며, 시료 전처리 후 남은 총량을 측정하여 일정량의 분석 시료를 획득하는 전처리기;
상기 분석 시료를 정성 및 정량 분석하는 액체 크로마토그래피/질량분석기; 및
분석 시료별 HCP를 식별 및 정량화한 후, 상기 분석 시료별 HCP의 ppm을 산출하는 데이터 처리기;를 포함하고,
상기 전처리기는,
상기 데이터 처리기에서 상기 분석 시료 내 각 HCP의 ppm이 산출되도록 바이오의약품 전처리 단계에 따른 단백질 총량, 펩타이드 총량을 측정하고 획득된 시료중 숙주세포가 포함된 바이오의약품 전체의 일정량을 이용하여 상기 단백질 시료 용액을 전처리하고, 질량분석전에 전체 시료양을 측정하여 최종 ppm 산출에 활용하는 것을 특징으로 하는 바이오의약품 품질관리를 위한 잔류 숙주세포 단백질 정량 분석 시스템.
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| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |