KR100710418B1 - 디엔에이 추출 스트립 및 이를 포함하는 디엔에이 추출방법 - Google Patents

디엔에이 추출 스트립 및 이를 포함하는 디엔에이 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 추출 스트립 및 이를 포함하는 DNA 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법을 대체할 수 있는 스트립타입의 DNA 추출 스트립 및 그 제조방법을 제공하고, 샘플의 배양 및 원심분리과정을 생략할 수 있는 상기 DNA 추출 스트립을 포함하는 DNA 추출방법 및 DNA 추출키트를 제공한다.
본 발명의 DNA 추출 스트립은 스트립상에 용해 완충액 및 결합 완충액을 모두 포함하고 있으므로, 용액상태에서 초기작업을 수행할 필요가 없고 냉동보관이 가능하므로, 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법에 비하여 보관 및 운송이 편리하다. 또한 스트립상에서 혈액속의 세포가 용해된 후, 세포에서 분출된 DNA가 반응성이 좋은 유리섬유에 결합되므로, 세포의 초기배양 및 상등액을 얻기 위한 원심분리과정을 생략할 수 있어 추출비용 및 추출시간이 현저하게 줄어드는 효과를 가진다.
스트립, DNA 추출, 완충액

Description

디엔에이 추출 스트립 및 이를 포함하는 디엔에이 추출방법{DNA EXTRACTION STRIP AND DNA EXTRACTION METHOD COMPRISING THE SAME}
도 1은 종래 컬럼타입의 DNA 추출방법에 관한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 DNA 추출 스트립의 정면도이다.
도 3은 본 발명에 의한 DNA 추출방법에 관한 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 DNA 추출방법을 통해 추출한 PCR 산물의 전기영동결과를 나타내는 사진이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
100 : 지지대 스틱 110 : 섬유
120 : 용해 및 결합 완충액
본 발명은 DNA 추출 스트립 및 이를 포함하는 DNA 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법을 대체할 수 있는 스트립타입의 DNA 추출 스트립 및 그 제조방법을 제공하고, 샘플의 배양 및 원심분리과정을 생략할 수 있는 상기 DNA 추출 스트립을 포함하는 DNA 추출방법 및 DNA 추출키트에 관한 것이다.
전통적으로 인간 혈액유래의 세포의 희석, 파쇄 및 중화로 대표되는 세가지 완충액을 사용한 후 에탄올 침전 방법(Lis 및 Schleif, Nucleic AcidsRes., 2:383-389(1975)) 등이 사용되어 왔다. 그러나 상기 방법은 다루기가 불편하고 순도가 낮았으므로, 미국등록특허 제5,707,812호에서는 컬럼을 포함하는 DNA 추출 및 정제키트가 개발되었다. (Horn 등, Human Gene Ther., 6:565-573(1995); ; Chandra 등, Anal. Biochem., 203: 169-172 (1992); Marquet 등, BioPharm.:26-37 (1995) 등 참조)
이와 같은 컬럼을 사용한 플라스미드 DNA 추출의 원리는 DNA와 특이적으로 결합하는 유리섬유나 실리카 멤브레인을 사용하여 물분자와 DNA 사이의 구조적 상호작용의 원리를 이용하여 DNA 분자를 단백질 및 기타 세포내 물질로부터 정제하는 것으로 이를 위해서는 원심분리 공정이 반드시 필요하였다.
이와 같은 컬럼의 사용을 포함하는 현재 사용되고 있는 종래의 DNA 추출키트는 도 1에 도시된 바와 같이, (1) 결합 완충액에 혈액을 투입하는 단계, (2) 제1 원심분리단계, (3) 원심분리된 샘플을 결합하는 단계, (4) 제2 원심분리단계, (5) 원심분리된 샘플을 세척하는 단계, (6) 제3 원심분리단계, (7) 상기 샘플에서 DNA 를 용출하는 단계 (8) 제4원심분리단계를 거쳐 DNA를 추출하였다.
상술한 방법은 순도가 높은 DNA 추출방법으로 각광받고 있으나, 배양단계와 원심분리 단계를 거쳐야 하므로 많은 시간 및 비용이 소요될 뿐 아니라, DNA 추출을 위해서는 비교적 많은 혈액이 필요한 문제가 있었다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법을 대체할 수 있는 스트립타입의 DNA 추출 스트립 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 추출 스트립을 포함하여, 샘플의 배양 및 원심분리과정을 생략할 수 있는 순도높은 DNA 추출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 추출 스트립을 포함하는 DNA 추출키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위한, 본 발명의 한 특징에 따른 DNA 추출 스트립은, 지지대 스틱과 지지대 스틱의 일면에 부착되는 섬유 및 섬유에 흡착되는 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함한다.
상기 지지대 스틱은 바람직하게는 코팅처리된 것을 사용할 수 있다.
상기 섬유는 바람직하게는 유리섬유(glass fiber filter), 음이온 교환수지 및 실리카 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인인 것을 사용할 수 있다.
상기 용해 완충액은, 바람직하게는 요소(Urea) 및 Tris-HCl의 단독 또는 혼합용액을 포함하며, 더욱 바람직하게는 15 ~ 25 mM의 요소(Urea) 및 5 ~ 15 mM Tris-HCl을 단독 또는 혼합용액을 포함한다.
상기 결합 완충액은, 바람직하게는 구아니딘-HCl, 구아니딘-SCN 및 NaI로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 캐오트로픽 염을 포함하며, 상기 캐오트로픽 염의 농도는 4 ~ 8M을 유지한다.
상기 섬유에 바람직하게는 계면활성제를 더 흡착시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 계면활성제는 Triton X-100, 트윈, 2- 메르캡토에탄올, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate) 및 SDS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하며, 더욱 바람직하게는 5 ~ 10 중량%의 Triton X-100를 포함한다.
한편, 상기 섬유는 바람직하게는 상기 지지대 스틱의 일단에 부착시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따른 DNA 추출 스트립을 제조하는 방법에 있어서, (1) 코팅처리된 지지대 스틱의 일단에 유리섬유(glass fiber filter)를 부착하는 단계, (2) 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함하는 용액을 제조하는 단계, (3) 상기 제조된 용액에 상기 유리섬유를 침지하는 단계, 및 (4) 상기 용액에 침지된 유리섬유를 건조하는 단계를 포함한다.
상기 (2) 단계의 용액에 계면활성제를 더 첨가하는 것도 가능하다.
상기 (2)단계의 용액은 바람직하게는 상기 (2)단계의 용액은 6 ~ 7M의 구아니딘-HCl , 5 ~ 20 mM Tris-HCl , 10 ~ 30 mM 요소 및 6 ~ 7 중량%의 Triton X-100으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 이 경우 바람직하게는 pH 4 ~ 5.5 를 유지한다.
한편, 바람직하게는 상기 (3) ~ (4)단계를 1 ~ 5회 반복하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따른, DNA를 추출하는 방법은 (1) 상기 DNA 추출 스트립에 혈액을 투입하는 단계, (2) 상기 DNA 추출 스트립을 세척 완충액(washing buffer)에 침지하는 단계, (3) 상기 세척 완충액(washing buffer)에 침지된 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 용출 완충액(elution buffer)에 침지하여 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
상기 (1)단계에서 투입되는 혈액의 양은 바람직하게는 2 ~ 30 ㎕이며, (1)단계 이후 상기 DNA 추출 스트립을 10 ~ 30 ℃에서 1 ~ 5분간 배양하는 단계를 더 포함하는 것도 가능하다.
상기 세척 완충액(washing buffer)은 바람직하게는 에탄올을 포함하며, 더욱 바람직하게는 염화나트륨과 Tris-HCl을 단독 또는 혼합하여 더 포함할 수 있으며, 이 경우 pH 6 ~ 7.5 인 것을 사용할 수 있다.
상기 (3)단계에서, 바람직하게는 세척 완충액(washing buffer)에서 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 용출 완충액(elution buffer)은 바람직하게는 Tris-HCl를 포함하며, pH 7 ~ 9인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 DNA 추출 키트는, 상기 기재의 DNA 추출 스트립, 세척 완충액(washing buffer), 용출 완충액(elution buffer) 및 사혈기를 포함한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 스트립을 도 2에 도시된 내용을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 지지대 스틱(100)과 지지대 스틱(100)의 일면에 부착되는 섬유(110) 및 섬유(110)에 흡착되는 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)(120)을 포함한다.
먼저, 지지대 스틱(100)을 설명한다.
상기 지지대 스틱(100)은 DNA 추출 스트립의 골격으로서, 내부식성 및 내마 모성을 가지며 통상의 검사용도로 사용되는 재질이면 종류를 불문하고 사용될 수 있으나, 바람직하게는 소변검사시 사용되는 통상의 스트립을 사용한다. 또한 혈액 및 이물질 등이 스며드는 것을 방지하고, 완충액 등에 침지하는 경우에도 모양 및 강도를 유지하기 위하여, 바람직하게는 상기 지지대 스틱(100)은 코팅처리하여 사용할 수 있다. 한편 본 발명에서 사용되는 지지대 스틱(100)은 통상의 검사용도로 사용할 수 있는 것이면 모양 및 크기를 불문하나 바람직하게는 직사각형 모양을 일반적으로 사용할 수 있다.
다음으로, 섬유(110)에 대해 설명한다.
상기 섬유(110)는 지지대 스틱(100)의 일면에 부착되는 것으로, 투입되는 혈액으로부터 분리되는 DNA를 저장하는 기능을 수행한다. 상기 섬유는 투입되는 혈액의 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 종류를 불문하고 사용할 수 있으나, 바람직하게는 유리섬유(glass fiber filter), 음이온 교환수지 및 실리카 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 섬유를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 왓츠만 GF/B 또는 C를 사용한다.
한편 상기 섬유(110)는 지지대 스틱(100)상에 어느 곳에도 부착될 수 있으나, 바람직하게는 지지대 스틱(100)의 일단에 부착되며, 섬유(110)의 크기 역시 지지대 스틱(100)상에 부착될 수 있는 정도면 족하나 바람직하게는 지지대 스틱(100)의 크기의 절반 이하인 것이 보관 및 운송에 유리하다.
다음으로, 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)(120)에 관해 설명한다.
본 발명의 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)(120)은 상기 섬유(110)에 흡착된다. 상기 섬유에 흡착되는 방법으로, 통상의 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 지지대 스틱(100)에 부착된 섬유(110)를 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)(120)의 혼합용액에 침지한 후 건조하여 흡착한다. 이 경우 침지 및 건조단계를 여러번 거쳐 보다 효과적인 흡착을 도모할 수 있다.
상기 용해 완충액은 화학적 방법을 이용하여 세포를 용해하여 DNA를 포함하여 오염물질인 단백질, RNA 및 기타물질들을 세포 밖으로 용출시키는 용액으로서 통상의 DNA 추출에 사용되는 것이면, 종류의 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 요소(Urea) 및 Tris-HCl을 단독 또는 혼합한 용액을 포함하며, 더욱 바람직하게는 15 ~ 25 mM의 요소(Urea) 및 5 ~ 15 mM의 Tris-HCl을 포함한다.
상기 결합 완충액(binding buffer)은 DNA를 포함한 세포용해물중에서 다른 세포 내 물질과는 결합하지 않고 DNA와 특이적으로 결합하기 때문에 DNA를 순수하게 분리할 수 있는 용액이다. 본 발명에 사용되는 결합 완충액은 DNA와 친화성 결합을 통해 상기 DNA를 고정할 수 있는 것이면 당업계에서 사용되는 어떠한 캐오트로픽 염도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 구아니딘-HCl, 구아니딘-SCN 및 NaI로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 캐오트로픽 염을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 구아니딘-HCl을 사용한다. 상기 캐오트로픽 염의 농도는 바람직하게는 4 ~ 8M 이며, 보다 바람직하게는 5.5 ~ 7M이다.
또한, 상기 섬유에 흡착될 수 있는 성분은 상기 용해 및 결합 완충액 외에도 계면활성제를 더 첨가하는 것도 가능하다. 본 발명에 첨가되는 계면활성제는 용해 완충액을 보조하여 혈액속의 세포를 분해하는 기능을 수행하는 것으로 폴리에틸렌글리콜형 비이온성 계면활성제나 다가 알콜형 비이온성 계면활성제가 모두 사용될 수 있으나, 바람직하게는 Triton X-100, 트윈(Tween; 솔비탄 에스테르의 산화 에틸렌부가물) 또는 2-메르캡토에탄올, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate) 및 SDS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 계면활성제를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 ~ 10 중량%의 Triton X-100을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용해 완충액(lysis buffer), 결합 완충액(binding buffer) 및 첨가되는 계면활성제를 포함하는 용액의 pH는 바람직하게는 pH 4 ~ 5.5 를 유지한다.
상기와 같은 구성을 포함하는 DNA 추출 스트립은, 스트립상에 용해 완충액 및 결합 완충액을 모두 포함하고 있으므로, 용액상태에서 초기작업을 수행할 필요가 없고 냉동보관이 가능하므로, 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법에 비하여 보관 및 운송이 편리하다. 또한 스트립상에서 혈액속의 세포가 용해된 후, 세포에서 분출된 DNA가 반응성이 좋은 유리섬유에 결합되므로, 세포의 초기배양 및 상등액을 얻기 위한 원심분리과정을 생략할 수 있어 추출비용 및 추출시간이 현저하게 줄어드는 효과를 가진다.
또한, 종래의 컬럼타입의 경우 투입되는 혈액의 양이 100 ~ 200 ㎕ 정도였으므로 시린지를 사용하여야 하나, 본 발명의 스트립타입은 투입되는 혈액의 양이 2 ~ 30 ㎕ 정도면 DNA를 추출할 수 있으므로 시린지를 사용하지 않고도 인체로부터 혈액을 채취할 수 있다.
다음으로 상기 DNA 추출 스트립의 제조방법을 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 추출 스트립을 제조하는 방법은, (1) 코팅처리된 지지대 스틱(100)의 일단에 유리섬유(110)(glass fiber filter)를 부착하는 단계, (2) 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함하는 용액을 제조하는 단계, (3) 상기 제조된 용액에 상기 유리섬유(110)를 침지하는 단계, 및 (4) 상기 용액에 침지된 유리섬유를 건조하는 단계를 포함한다.
상기 (1) 단계에서 지지대 스틱(100)에 부착되는 섬유는 유리섬유(glass fiber filter)외에도 음이온 교환수지 및 실리카 멤브레인 등을 사용할 수 있으며, 코팅처리된 지지대 스틱상의 어느곳에도 위치할 수 있으나, 혈액투여 및 운반의 편리성을 위해 바람직하게는 상기 섬유는 지지대 스틱상의 일단에 위치한다.
상기 (2) 단계에서는 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함하는 용액을 제조한다. 본 발명에서 사용되는 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)은 상술한 바와 같지만 DNA 추출 스트립의 섬유에 흡착되어 혈액속의 세포 등을 용해하여 DNA를 용출시키고, DNA만을 특이적으로 결합할 수 있는 것이면 당업자간에 사용되는 어떠한 용해 및 결합 완충액도 사용할 수 있으나 상술한 조성의 효율이 가장 높다.
한편, 바람직하게는 혈액내의 세포의 용해를 보다 용이하게 하기 위하여 상술한 구성의 계면활성제를 상기 용액에 더 첨가하는 것도 가능하며, 이 경우 용액의 산도는 바람직하게는 pH 4 ~ 5.5를 유지한다.
상기 (3) 단계에서는 상기 제조된 용액에 상기 유리섬유(110)를 침지한다. 침지시간은 용액에 포함된 용해 완충액 및 결합 완충액 성분이 유리섬유에 흡착될 수 있는 정도면 족하나, 바람직하게는 3 ~ 7 분 정도 침지한다. 또한 상기 유리섬유만 침지되면 족하므로 지지대 스틱을 전부 침지하지 않아도 무방하다.
상기 (4) 단계에서는 상기 용액에 침지된 DNA 추출 스트립을 건조한다. DNA 추출 스트립이 충분히 건조될 수 있는 정도면, 건조시간 및 건조온도에 제한이 없으나, 바람직하게는 35 ~ 50 ℃ 오븐에서 15 ~ 40분 정도 건조한다.
한편, 용해 완충액 및 결합 완충액 성분이 유리섬유에 충분히 흡착되도록 하기 위하여, 상기 (3) 단계와 (4) 단계를 반복하는 것도 가능하며, 이 경우 바람직하게는 1 ~ 5회 반복하여 DNA 추출 스트립을 제조할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조되는 DNA 추출 스트립은, 섬유내에 DNA 추출과정에서 반드시 필요한 구성인 용해 완충액과 결합 완충액 성분 등이 흡착되어 있으므로 DNA 추출과정에서 혈액샘플의 배양 및 원심분리과정을 생략할 수 있다. 또한 스트립에 혈액을 투입하므로 상기 혈액이 투입된 스트립을 냉동보관을 할 수 있으므로, 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법에 비하여 보관 및 운송이 유리하다.
다음으로, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 DNA 추출 스트립을 포함하는 DNA 추출방법에 관해 설명한다.
본 발명의 DNA를 추출하는 방법은, (1) 상술한 구성의 DNA 추출 스트립에 혈액을 투입하는 단계, (2) 상기 혈액이 투입된 DNA 추출 스트립을 세척 완충액(washing buffer)에 침지하는 단계, (3) 상기 세척 완충액(washing buffer)에 침지된 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 용출 완충액(elution buffer)에 침지하여 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
상기 (1) 단계에서 상술한 구성의 DNA 추출 스트립에 투입되는 혈액의 양은 바람직하게는 2 ~ 30 ㎕이다. 따라서 종래의 컬럼타입 DNA 추출방법에 투입되는 100 ~ 200 ㎕에 비하여 극히 적은 혈액을 투입하여도 DNA 추출이 가능하다.
한편, 상기 (1) 단계 이후 스트립에 흡착되어 있는 용해 완충액과 결합 완충액에 혈액을 일정시간 동안 배양함으로써 세포가 용해되고 세포용해물질 중 DNA가 스트립에 충분히 결합할 수 있도록, 상기 DNA 추출 스트립을 10 ~ 30 ℃에서 1 ~ 5분간 배양하는 단계를 더 포함하는 것도 가능하다.
상기 (2) 단계에서는 상기 혈액이 투입된 DNA 추출 스트립을 세척 완충액(washing buffer)에 침지한다.
상기 세척 완충액(washing buffer)은 통상의 DNA 추출과정에서 사용되는 세척 완충액을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올을 포함하며, 더욱 바람직하게는 염화나트륨과 트리스(Tris)-HCl을 단독 또는 혼합하여 더 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 10 ~ 30mM NaI, 1 ~ 5mM Tris-HCl 및 10 ~ 30mM의 80% 에탄올을 혼합하여 사용할 수 있다. 이 경우 산도는 바람직하게는 pH 6 ~ 7.5 를 유지하며 1 ~ 3 초 정도 침지한다.
한편 상기 (2) 단계는 반복하여 실시할 수 있으며, 바람직하게는 2 ~ 3회 실시하는 것이 불순물을 제거하는데 유리하다.
상기 (3) 단계에서는 상기 세척 완충액(washing buffer)에 침지된 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 용출 완충액(elution buffer)에 침지하여 DNA를 추출한다.
이 경우, 바람직하게는 세척 완충액(washing buffer)에서 DNA 추출스트립을 꺼낸 후 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 세척 완충액에 포함되어 있는 에탄올이 용액상에 남아 있으면 PCR반응이 잘 가지 않기 때문으로 바람직하게는 완 건조를 실시한다. 건조온도 및 건조시간은 바람직하게는 35 ~ 55 ℃의 드라이오븐에서 1 ~ 3분간 건조할 수 있다.
한편, 상기 용출 완충액(elution buffer)은 통상의 DNA 추출과정에서 사용되는 용출 완충액을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 Tris-HCl를 포함하며, 더욱 바람직하게는 5 ~ 20mM의 Tris-HCl을 포함한다. 이 경우 산도는 바람직하게는 pH 7 ~ 9를 유지하며, 1 ~ 3 분간 침지한다.
결국, 본 발명의 DNA 추출 스트립을 포함하는 DNA 추출방법은 스트립상에 용해 완충액 및 결합 완충액을 모두 포함하고 있으므로, 용액상태에서 초기작업을 수행할 필요가 없고 냉동보관이 가능하므로, 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법에 비하여 보관 및 운송이 편리하다. 또한, 종래의 컬럼타입에의 원심분리 과정은 용해된 세포추출물을 컬럼을 통과시키고 DNA만 필터에 결합한 상태에서 세척 완충액을 첨가한 후 원심분리를 통해 DNA만을 순수하게 정제하는 것이지만, 스트립 타입에서는 이미 스트립에 용해 완충액과 결합 완충액이 흡착되어 있으므로 세포 용해와 DNA의 결합이 동시에 일어나며, 세척과정에서도 원심분리가 필요하지 않게 되어 추출시간 및 추출비용이 현저하게 줄어드는 효과를 가진다.
또한, 투입되는 혈액의 양이 2 ~ 30 ㎕ 정도면 DNA를 추출할 수 있으므로 시린지를 사용하지 않고도 인체로부터 혈액을 채취할 수 있어 매우 유리하다. 나아가, 추출시간도 종래의 1/3인 약 10분 정도만 소요되면서도 순도가 매우 우수하다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 DNA 추출 키트는, 상기 기재의 DNA 추출 스트립, 세척 완충액(washing buffer), 용출 완충액(elution buffer) 및 사혈기를 포함한다.
이 중, 사혈기는 예를 들면 혈당검사용 키트에 포함된 바늘이 포함된 사혈기와 같은 통상의 추출키트에 사용되는 것을 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 본 실시예는 가장 바람직한 실시형태를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위함이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] DNA 추출 스트립의 제조
(1) 가로×세로가 5㎝×1㎝인 지지대 스틱의 일단에 가로×세로가 0.8㎝×0.8㎝ 왓츠만 GF/B(glass fiber filter)를 부착하였다.
(2) 300 ㎕의 구아니딘-HCl, 10mM의 Tris-HCl, 20mM의 요소 및 6 중량%의 Triton X-100을 포함하는 용해 완충액, 혼합 완충액 및 계면활성제가 혼합된 수용액(pH 4.8)을 제조하였다.
(3) 상기 유리섬유가 부착된 지지대 스틱에서 유리섬유부분을 상기 수용액에 1차로 5분간 침지 후, 드라이오븐에서 45℃로 15분간 건조하였다.
(4) 1차 침지와 건조과정을 거친 유리섬유가 부착된 지지대 스틱을 동일한 조건에서 2차로 5분간 침지하고 15분간 건조한 뒤, 3차로 5분간 침지하고 30분간 건조하여 본 발명의 DNA 추출 스트립을 제조하였다.
[ 실시예 2] 혈액에서의 DNA 추출
(1) 상기 실시예 1의 DNA 추출 스트립에 인체로부터 유래된 혈액 10㎕을 투입한 후, 상기 혈액이 투입된 DNA 추출 스트립을 2분간 상온에서 배양하였다.
(2) 상기 배양을 거친 DNA 추출 스트립을, 500㎕의 80% 에탄올, 20mM의 NaI 및 2mM의 Tris-HCl을 함유하는 세척 완충액(pH 6.8)에 1분간 침지하고 이를 1회 더 반복하였다.
(3) 상기 세척 완충액에 침지된 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후, 45℃ 드라이오븐에서 DNA 추출 스트립을 2분간 건조하였다.
(4) 건조된 DNA 추출 스트립을 50㎕의 10mM Tris-HCl을 함유하는 용출 완충액(pH 8.5)에 1분간 침지하여 DNA를 추출하였다.
한편 본 발명에 의한 DNA를 추출하는데는 평균 10분정도 소요되었다.
[ 실시예 3] 혈액에서의 DNA 추출
실시예 2에서 수득한 유전체 DNA에서 SLC11A1 유전자의 엑손 15에 대하여 표1 기재의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 구체적으로 하기 표 2의 구성을 통해 PCR 기기(Perkin-Elmer사, GeneAmp PCR System 2700)를 이용하여 244bp의 PCR 산물을 얻었다.
Forward primer(primer 1) 5'-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3'
Reverse primer(primer 2) 5'-AACTGTCCCACTCTATCCTG-3'
구성 DNA 10×완충액 dNTP (2.5mM) primer 1 (10pM) primer 2 (10pM) Taq (5unit) 증류수 합계
첨가량(㎕) 2 2.5 2 0.8 0,8 0,1 16.6 25
[ 실시예 4] 전기영동
2% 아가로스겔 및 1X TBE 완충액을 준비하여, 10V/cm의 전기영동조건으로 상기 PCR 결과 산물을 전기 영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 그 결과를 도 4에 도시하였다.
레인 1 2 3 4 5 6 7 8 9
혈액양(㎕) 10 20 200
용출완충액 부피(㎕) 50 100 50 100 50 100 50 100 200
침지횟수 3 5 3 5
도 4에서 레인 M은 사이즈 마커이다. 레인 1 ~ 8은, 실시예 1 ~ 3에서 투입된 혈액양, 용출 완충액의 부피 및 스트립의 침지횟수에 따른 샘플의 전기영동의 결과이다. 레인 9는 종래 시중에서 구입가능한 바이오니아사의 "AccuPrep Plasmod Eztraction Kit)를 제공된 사용법에 따라 사용하여 추출한 DNA를 이용한 PCR 결과이다. 한편 상기 바이오니아사의 "AccuPrep Genomic Dna Extraction Kit"를 이용하여 DNA를 추출하는데 걸린 시간은 27분이 소요되었다.
도 4를 통해 알 수 있듯이, 레인 1 ~ 8 의 전기영동 결과와 레인 9의 전기영동 결과가 일치하였다. 결국 본 발명의 DNA 추출 스트립은 종래의 컬럼타입의 DNA 추출키트에 비하여 추출시간이 약 1/3로 줄어들면서 동시에 극미량의 추출량만으로도 정밀한 분석을 실시할 수 있었다.
스트립상에 용해 완충액 및 결합 완충액을 모두 포함하고 있으므로, 용액상 태에서 초기작업을 수행할 필요가 없고 냉동보관이 가능하므로, 종래의 컬럼타입의 DNA 추출방법에 비하여 보관 및 운송이 편리하다. 또한 스트립상에서 혈액속의 세포가 용해된 후, 세포에서 분출된 DNA가 반응성이 좋은 유리섬유에 결합되므로, 세포의 초기배양 및 상등액을 얻기 위한 원심분리과정을 생략할 수 있어 추출비용 및 추출시간이 현저하게 줄어드는 효과를 가진다.
또한, 투입되는 혈액의 양이 2 ~ 30 ㎕ 정도면 DNA를 추출할 수 있으므로 시린지를 사용하지 않고도 인체로부터 혈액을 채취할 수 있고 나아가 제조단가를 크게 절감할 수 있는 장점을 가진다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술적 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이다.

Claims (26)

  1. 지지대 스틱;
    상기 지지대 스틱의 일면에 부착되는 유리섬유(glass fiber filter), 음이온 교환수지 및 실리카 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 섬유; 및
    상기 섬유에 흡착되는 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 스트립.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지지대 스틱은 코팅처리된 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 용해 완충액은 요소(Urea) 및 Tris-HCl을 단독 또는 혼합한 것을 포함 하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 용해 완충액은 15 ~ 25 mM의 요소(Urea) 및 5 ~ 15 mM Tris-HCl을 단독 또는 혼합한 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결합 완충액은 구아니딘-HCl, 구아니딘-SCN 및 NaI로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 캐오트로픽 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 캐오트로픽 염의 농도는 4 ~ 8M인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 섬유에 계면활성제가 더 흡착되는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 계면활성제는 Triton X-100, 트윈, 2- 메르캡토에탄올, 사코실 설페이트(sarcosyl sulfate) 및 SDS로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 계면활성제는 5 ~ 10 중량%의 Triton X-100인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 섬유는 상기 지지대 스틱의 일단에 부착되는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립.
  12. DNA 추출 스트립을 제조하는 방법에 있어서,
    (1) 코팅처리된 지지대 스틱의 일단에 유리섬유(glass fiber filter)를 부착하는 단계;
    (2) 용해 완충액(lysis buffer) 및 결합 완충액(binding buffer)을 포함하는 용액을 제조하는 단계
    (3) 상기 제조된 용액에 상기 유리섬유를 침지하는 단계; 및
    (4) 상기 용액에 침지된 유리섬유를 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 스트립의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 용액에 계면활성제를 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 스트립의 제조방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 (2)단계의 용액은 6 ~ 7M의 구아니딘-HCl , 5 ~ 20 mM Tris-HCl , 10 ~ 30 mM 요소 및 6 ~ 7 중량%의 트리톤(Triton) X-100으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립의 제조방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 용액은 pH 4 ~ 5.5인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립의 제조방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 (3) ~ (4)단계를 1 ~ 5회 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출 스트립의 제조방법.
  17. DNA를 추출하는 방법에 있어서,
    (1) 제1항 내지 제11항 중 어느 한항 기재의 DNA 추출 스트립에 혈액을 투입하는 단계;
    (2) 상기 DNA 추출 스트립을 세척 완충액(washing buffer)에 침지하는 단계
    (3) 상기 세척 완충액(washing buffer)에 침지된 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 용출 완충액(elution buffer)에 침지하여 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 투입되는 혈액의 양은 2 ~ 30 ㎕인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 (1)단계 이후 상기 DNA 추출 스트립을 10 ~ 30 ℃에서 1 ~ 5분간 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 세척 완충액(washing buffer)은 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 세척 완충액(washing buffer)은 염화나트륨과 트리스(Tris)-HCl을 단독 또는 혼합하여 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 세척 완충액(washing buffer)은 pH 6 ~ 7.5 인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 (3)단계에서, 세척 완충액(washing buffer)에서 DNA 추출 스트립을 꺼낸 후 건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  24. 제17항에 있어서,
    상기 용출 완충액(elution buffer)은 Tris-HCl를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  25. 제17항에 있어서,
    상기 용출 완충액(elution buffer)은 pH 7 ~ 9인 것을 특징으로 하는 상기 DNA 추출방법.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항 기재의 DNA 추출 스트립, 세척 완충액(washing buffer), 용출 완충액(elution buffer) 및 사혈기를 포함하는 DNA 추출 키트.
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