KR20210111243A

KR20210111243A - 단백질을 식별 및 정량화하는 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR20210111243A
Application number: KR1020217016329A
Authority: KR
Inventors: 위에티안 얀; 순하이 왕
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-09-10
Also published as: AU2019369421A1; CN113056676A; IL282778A; JP2022514122A; EP4270009A3; ES2962578T3; SG11202103628PA; EP3874276A1; JP2023052110A; EP3874276B1; CA3116717A1; WO2020092499A1; EP4270009A2

Abstract

단백질을 식별 및/또는 정량화하기 위한 방법 및 시스템이 본 명세서에서 제공된다.

Description

단백질을 식별 및 정량화하는 방법 및 시스템

본 발명은 일반적으로 단백질을 식별 및/또는 정량화하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.

단백질 기반 바이오의약 제품은 매우 높은 순도 기준을 충족해야 한다. 바이오의약품에서 발견되는 몇 가지 공정-관련 불순물 및 생성물-관련 불순물이 있다. 이들 불순물은 활성, 효능 및 안전성과 관련하여 원하는 생성물의 특성에 맞먹는 특성을 가지지 않는다. 한 가지 예는 치료적 적용과 관련된 단백질 특성에 엄청난 영향을 미치는 단백질의 번역후 변형(PTM)이다. 또 다른 이와 같은 예는 이상적으로 하류 정제에 의해 제거되어야 하는 이중특이적 항체의 생성 동안 존재할 수 있는 동종이량체 오염물질을 포함한다. 이들 불순물은 생성물과 비교하여 상이한 작용 방식과 잠재적인 독성 또는 면역원성을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 이들 불순물은 응집 및 면역원성에 대하여 더 높은 위험을 나타내는 생성물보다 안정성이 더 낮을 수 있다. 최근의 발전에도 불구하고, 이와 같은 불순물의 정량적 평가를 위한 순도 분석 방법의 개발에 대한 난제가 여전히 남아 있다. 추가적으로, 이중특이적 항체에 대한 분석 방법 개발의 핵심 난제는 해당 방법이 원하는 주요 종에 비하여 2% 이하 수준으로 존재하는 불순물을 정확하고 재현가능하게 검출해야 한다는 것일 수 있다. 따라서, 약물 개발 및 생산의 여러 단계 동안 이와 같은 불순물을 모니터링하고 특성화하는 것이 중요하다. 생물학적 기능에 대한 불순물의 중요성에도 불구하고, 대규모 연구는 적합한 방법의 부족으로 인해 방해를 받았다.

순도 분석을 위한 분석 방법은 원하는 생성물과 이의 불순물을 검출하고 정량화하기에 충분한 정확도와 분해능을 나타내어야 한다. 항체에서 PTM 및 이중특이적 항체에서 동종이량체와 같은 불순물의 평가는 이와 같은 불순물 및 원하는 생성물의 구조적 및 물리화학적 특성 사이의 유사성으로 인해 어려울 수 있다. 이와 같은 불순물의 직접적인 분석은 분석을 위해 충분히 많은 양의 원하는 생성물의 단리를 요구하는데, 이는 바람직하지 않으며 선택된 경우에만 가능하였다.

따라서, 단백질 기반 바이오의약품에서 단백질-불순물 및/또는 원하는 생성물을 식별하고 정량화하기 위한 방법 및/또는 시스템에 대한 당업계의 오랜 요구가 있다.

단백질-기반 바이오의약 제품의 개발, 제조 및 판매의 증가로 생성물 중 불순물의 식별 및 정량화를 위한 방법 및/또는 시스템에 대한 수요가 점점 더 증가하게 되었다.

본 명세서에 개시된 실시형태는 단백질의 신속한 특성화를 위한 방법 및 시스템을 제공함으로써 상기 언급한 요구를 충족시킨다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법을 제공한다.

예시적인 일 실시형태에서, 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계, 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계, 및 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하여 용리액 중 불순물의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 소수성 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 전하-전하 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 질량분석기와 양립 가능할 수 있는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 최대 600mM의 총 염 농도를 포함하는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 정량화하기 위한 방법은 0.2 ㎖/분 내지 0.4 ㎖/분의 유속으로 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 생성물-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 공정-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 분해 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 소화 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 다중특이적 항체 생성물의 동종이량체 종일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 번역후 변형일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 불순물의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 직렬(tandem) 질량분석기일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 정량화하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 불순물의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 네이티브(native) 질량분석기일 수 있다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법을 제공한다.

예시적인 일 실시형태에서, 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계, 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계, 및 질량분석기를 사용하여 용리액 중 불순물의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 소수성 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 전하-전하 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 질량분석기와 양립 가능할 수 있는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 최대 600mM의 총 염 농도를 포함하는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 불순물을 검출하기 위한 방법은 0.2 ㎖/분 내지 0.4 ㎖/분의 유속으로 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 생성물-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 공정-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 분해 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 소화 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 다중특이적 항체 생성물의 동종이량체 종일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 불순물은 단백질의 번역후 변형일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 용리액 중 불순물의 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 직렬 질량분석기일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 불순물을 검출하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 불순물의 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 네이티브 질량분석기일 수 있다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법을 제공한다.

예시적인 일 실시형태에서, 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계, 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 표적 단백질을 포함하는 용리액을 제공하는 단계, 및 질량분석기를 사용하여 용리액 중 표적 단백질의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 소수성 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 전하-전하 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 질량분석기와 양립 가능할 수 있는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 방법은 최대 600mM의 총 염 농도를 포함하는 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 샘플 중 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 0.2 ㎖/분 내지 0.4 ㎖/분의 유속으로 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 항체일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 이중특이적 항체일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 치료용 단백질일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 단백질을 제조하는 바이오의약 공정의 공정-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 단백질을 제조하는 바이오의약 공정의 생성물-관련 불순물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 단백질의 분해 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 단백질의 소화 생성물일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 표적 단백질은 다중특이적 항체 생성물의 동종이량체 종일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 직렬 질량분석기일 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 표적 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량분석기는 네이티브 질량분석기일 수 있다.

예시적인 일 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 부분적으로 혼합형 크로마토그래피 시스템에 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지 및 질량분석기를 갖는 크로마토그래피 칼럼을 제공한다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 소수성 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 전하-전하 상호작용 기능성이 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 샘플의 용리에 사용될 수 있는 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 이동상을 수용할 수 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 추가로 표적 단백질을 갖는 샘플을 수용할 수 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 이동상으로 세척될 수 있는 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 칼럼에 결합된 질량분석기를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 직렬 질량분석기를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 네이티브 질량분석기를 포함할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있고, 여기서 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지는 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 이동상과 양립 가능할 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있고, 여기서 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지는 최대 600mM의 총 염 농도를 포함하는 이동상을 사용하여 세척될 수 있다.

이 실시형태의 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있고, 여기서 크로마토그래피 칼럼은 0.2 ㎖/분 내지 0.4 ㎖/분의 유속으로 이동상을 이용하여 세척될 수 있다.

도 1은 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정량화 및/또는 검출하는 데 사용되는 시스템의 예를 도시한다.
도 2는 예시적인 실시형태를 사용하여 동종이량체 종으로부터 이중특이적 항체를 정제하려는 시도를 나타낸다.
도 3은 단백질 침전(또는 소수성 상호작용 촉진)에 대한 음이온 및 양이온의 효과를 나타내는 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈를 도시한다.
도 4는 예시적인 실시형태에 따른 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 질량 분석 시스템을 도시한다.
도 5는 30mM 내지 300mM 범위의 이동상 농도 하에서 수행한 BEH200 SEC 칼럼 상에서 샘플 혼합물 중 8가지 mAb의 보유 시간의 플롯을 도시하며, 여기서 2개의 삽화는 예시적인 실시형태에 따라 상응하는 농도에서 8가지 mAb의 MM-SEC-MS 분석으로부터의 기준 피크 크로마토그램(base peak chromatogram: BPC)을 나타낸다.
도 6은 이동상(150mM 총 염 농도 및 450mM 총 염 농도)을 사용하는 예시적인 혼합형 크기 크로마토그래피 질량 분석 시스템을 사용한 이중특이적 항체 샘플의 크로마토그래피 프로파일을 도시한다.
도 7은 예시적인 실시형태에 따른 혼합형 크기 배제 크로마토그래 질량 분석을 사용하여 분리 및 분석한 이중특이적 항체, 동종이량체 1 및 동종이량체 2의 추출 이온 크로마토그램(extracted ion chromatogram: XIC) 및 네이티브 질량 스펙트럼(native mass spectra)을 도시한다.
도 8은 예시적인 실시형태에 따른 항체 검출 분광법의 루모스(Lumos) 상의 RP LC-MS, EMR 상의 SEC-MS, 및 EMR 상의 MM-SEC-MS에 대한 총 이온 크로마토그램(TIC) 및 네이티브 MS 스펙트럼의 비교를 도시한다.
도 9는 예시적인 실시형태에 따른 Zenix SEC-300, 3㎛, 300Å, 7.8×300㎜를 사용하여 항체의 MM-SEC-MS 검출의 연속 실행의 추출 이온 크로마토그램(XIC) 및 네이티브 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 10은 예시적인 실시형태에 따른 이중특이적 항체 생성물에서 동종이량체 종의 검출을 수행하여 얻은 추출 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
도 11은 예시적인 실시형태에 따라 0.4 ㎖/분의 유속에서 Zenix SEC-300, 3㎛, 300Å, 7.8×300㎜, 및 0.3 ㎖/분의 유속에서 Zenix SEC-300, 3㎛, 300Å, 4.6×300㎜를 사용하여 이중특이적 항체 생성물에서 동종이량체 종의 검출을 수행하여 얻은 추출 이온 크로마토그램(XIC)의 비교를 도시한다.
도 12는 예시적인 실시형태에 따른 상이한 염 농도를 갖는 이동상을 사용하여 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 MM-SEC-MS를 수행하여 얻은 추출 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
도 13은 예시적인 실시형태에 따라 MM-SEC-MS 분석을 수행할 때 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물에 대한 단백질의 보유 시간(분) 대 이동상의 총 염 농도의 차트를 도시한다.
도 14는 예시적인 실시형태에 따라 MM-SEC-MS 분석을 수행할 때 총 염 농도 변화를 기반으로 한 보유 시간의 경향을 나타내는 차트를 도시한다.
도 15는 예시적인 실시형태에 따라 MM-SEC-MS 분석을 수행할 때 총 염 농도 변화에 대한 보유 시간 차이의 경향을 나타내는 차트를 도시한다.
도 16은 예시적인 실시형태에 따른 Waters BEH SEC 칼럼 상에서 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 MM-SEC-MS 분석을 수행하여 얻은 추출 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
도 17은 예시적인 실시형태에 따른 Waters BEH SEC 칼럼 상에서 MM-SEC-MS 분석을 수행할 때 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물에 대한 단백질의 보유 시간(분) 대 이동상의 총 염 농도의 차트를 도시한다.
도 18은 예시적인 실시형태에 따른 Waters BEH SEC 칼럼 상에서 항체 및 이의 산화된 변이체의 MM-SEC-MS 분석을 수행하여 얻은 추출 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
도 19는 예시적인 실시형태에 따른 Waters BEH SEC 칼럼 상에서 MM-SEC-MS 분석을 수행할 때 항체 및 이의 산화된 변이체에 대한 단백질의 보유 시간(분) 대 이동상의 총 염 농도의 차트를 도시한다.
도 20은 예시적인 실시형태에 따른 이중특이적 항체 및 이의 동종이량체 종을 포함하는 혼합물의 샘플 제조 방법을 도시한다.
도 21은 예시적인 실시형태에 따른 300mM 염 농도를 갖는 이동상을 사용하여 이중특이적 항체 및 이의 동종이량체 종의 온전한 수준에서 혼합물의 MM-SEC-MS 분석 결과를 도시한다.
도 22는 예시적인 실시형태에 따른 70mM 염 농도를 갖는 이동상을 사용하여 이중특이적 항체 및 이의 동종이량체 종의 서브유닛 수준에서 혼합물의 MM-SEC-MS 분석 결과를 도시한다.
도 23은 예시적인 실시형태에 따른 이중특이적 항체 및 이의 동종이량체 종의 온전한 수준에서 MM-SEC-MS 분석으로부터의 동종이량체 정량화 결과.
도 24는 예시적인 실시형태에 따른 이중특이적 항체 및 이의 동종이량체 종의 서브유닛 수준에서 MM-SEC-MS 분석으로부터의 동종이량체 정량화 결과를 도시한다.
도 25는 예시적인 실시형태에 따라 수행된 BEH 칼럼(좌측) 또는 Zenix 칼럼(우측)에서 MM-SEC-MS에 의한 이중특이적 항체 혼합물[4가지 상이한 bsAb/H2L2 동종이량체/H*2L2 동종이량체 혼합물]의 분석을 도시하되, 여기서 각각의 BPC 추적은 표시된 이동상 염 농도를 사용한 하나의 개별 분석을 나타낸다.
도 26은 예시적인 실시형태에 따라 수행된 분석에 있어서 각각 0.01% 및 0.1% 스파이킹-인(spiked-in) 표준을 사용하는 bsAb2(좌측 패널) 및 bsAb4(우측 패널) 중 동종이량체 불순물에 대하여 MM-SEC-MS에 의한 검출 연구의 한계를 도시하되, 여기서 네이티브 MS 스펙트럼(a, b, c, d, e 및 f)은 해당하는 TIC 영역 전체에 걸쳐 평균화되었고, 가장 풍부한 2가지 전하 상태가 도시되었다.
도 27은 연속 희석된 알려진 비율(좌측 패널 상의 회색 선 및 표시된 값)로 bsAb2에 스파이킹된 동종이량체를 사용하여 예시적인 실시형태에 따라 수행된 정량화 연구를 도시하고, 또한 미가공(raw) 질량 스펙트럼에서 가장 풍부한 4가지 전하 상태(우측 패널에 나타낸 예와 같이, 각각의 동종이량체의 0.1% 상대적인 풍부도)의 XIC 강도를 기반으로 한 bsAb2에 대한 H2L2 동종이량체(빨강색) 및 H*2L2 동종이량체(파랑색)의 측정된 비율을 도시한다.

바이오의약품 중 불순물은 원하는 생성물의 효능, 청소율, 안전성, 및 면역원성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 변화를 유발할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 측쇄의 산화는 Fc 수용체 및 항원에 결합하는 항체에 영향을 미칠 수 있다(Bertolotti-Ciarlet et al. Mol. I㎜unol. (2009) 46: 1878-1882; Pan et al. Protein Sci. (2009) 18: 424-433; Wei et al. Anal. Chem. (2007) 79: 2797-2805; 및 Wang et al. Mol. I㎜unol. (2011) 48: 860-866).

전통적인 분리-기반 항체 순도 분석, 예컨대 전기영동-기반 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-기반 방법은 원하는 생성물로부터 이러한 불순물을 구별하는 데 필요한 분해능이 부족하다. RP-LC-MS를 위한 샘플 준비 공정이 길고, 일부 경우에 크로마토그래피 조건, 예컨대 고온, 유기 용매, 및 산성 pH가 산화 인공산물을 유도할 수 있으므로, PTM을 모니터링하는 데 사용되는 질량분석법과 결합된 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)를 통한 펩타이드 맵핑은 일부 한계가 있다.

추가적으로, 일부 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피 방법은 또한 원하는 생성물로부터 불순물을 분리하는 데 사용될 수 있다. 분리된 불순물 및 원하는 생성물은 질량분석기를 사용하여 추가로 분석될 수 있다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피 칼럼 유래의 이동상은 질량분석기에 직접 주입될 수 없으며 이동상의 변경을 포함한 추가적인 단계를 필요로 한다(도 1 참조).

기존 방법의 한계를 고려하여, 본 명세서에 개시된 바와 같이 신규한 혼합형 - 크기 배제 크로마토그래피 - 질량 분석 시스템을 사용하여 불순물의 식별 및 정량화를 위한 효과적이고 효율적인 방법을 개발하였다. 혼합형 - 크기 배제 크로마토그래피 - 질량 분석 시스템은 다른 전형적인 분석에 의해 달성할 수 없는 효율적인 혼합형 분리 및 민감한 온라인 MS 검출로 인해 매우 낮은 수준으로 존재하는 불순물을 정량화하는 감도 및 능력을 개선시킨다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 기재된다. 언급된 모든 간행물은 본 명세서에 참조로 포함된다.

용어 "하나"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 변형을 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.

표적 단백질

바이오의약 제품은 높은 수준의 효능, 순도, 및 낮은 수준의 구조적 이질성을 나타내도록 요구된다. 구조적 이질성은 종종 약물의 대생물활성 및 효능에 영향을 미친다. 따라서, 치료용 단백질 및/또는 불순물을 특성화 및 정량화하는 것은 의약품 개발에 중요하다. 단백질의 구조적 이질성은 번역후 변형뿐만 아니라 제조 및 저장 조건 동안 내재된 화학적 변형으로 인해 발생할 수 있다. 생물공학 산업에서 생산되는 단백질의 경우, 표적 단백질을 정제하고 최종 생성물의 품질에 대한 정확한 그림을 제공하기 위해 보완적인 분리 기법이 필요할 수 있다. 생성물의 복잡성은 단순한 1차원 분리 전략의 사용을 배제시킨다. 따라서, 치료용 단백질 및/또는 불순물을 검출 및/또는 정량화하는 정확하고 효율적인 방법이 필요하다.

예시적인 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 샘플 중 단백질 및/또는 불순물을 정량화 및/또는 검출하기 위한 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 공유 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은, 일반적으로 당업계에 "폴리펩타이드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩타이드"는 아미노산 잔기, 펩타이드 결합을 통해 연결된 이의 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 합성 비-자연 발생 유사체, 이의 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 말한다. "합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드"는 비-자연 발생 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말한다. 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 예를 들어 자동화 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고상 펩타이드 합성 방법이 당업자에게 알려져 있다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩타이드를 포함하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 단백질은 생체치료용 단백질, 연구 또는 치료법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩타이드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포-기반 생성 시스템, 예컨대 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피키아(Pichia) 종), 포유동물 시스템(예를 들어, CHO 세포, 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)을 사용하여 생산될 수 있다. 생체치료용 단백질 및 이의 생산을 논의하는 최근 검토에 대해서는 문헌[Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (2012) 147-75)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 변형, 부가물, 및 다른 공유결합된 모이어티를 포함한다. 이러한 변형, 부가물 및 모이어티는, 예를 들어 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스, 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, 플래그태그(FLAGtag), 말토스 결합 단백질(MBP), 키틴 결합 단백질(CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성과 용해도를 기준으로 분류될 수 있으므로, 따라서 단순 단백질, 예컨대 구상 단백질 및 섬유성 단백질; 접합 단백질, 예컨대 핵단백질, 당단백질, 뮤코단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지방단백질; 및 유도 단백질, 예컨대 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질을 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(C_L1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 본 발명의 상이한 실시형태에서, 항-빅(big)-ET-1 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석을 기반으로 정의될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 단백질분해 소화 또는 재조합 유전자 조작 기법과 같은 임의의 적합한 표준 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이와 같은 DNA는 알려져 있고/거나, 예를 들어 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 입수 가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하거나 코돈을 도입하거나 시스테인 잔기를 생성하거나 아미노산을 변형, 추가 또는 결실시키는 등의 분자 생물학 기법을 사용함으로써 또는 화학적으로 서열결정되거나 조작될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은, 예를 들어 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역뿐만 아니라, 항체 단편으로부터 형성된 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 다중특이적 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자이다. 예시적인 일부 실시형태에서, 항체 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합하는 단편인 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 포함하고; 예시적인 일부 실시형태에서, 단편은 모 항체와 비슷한 친화도로 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합을 위해 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/거나 부분 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은, 예를 들어 이황화 연결에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함하고 보다 전형적으로 적어도 약 200개의 아미노산을 포함한다.

어구 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 2개의 상이한 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 상의 또는 동일한 분자 상의(예를 들어, 동일한 항원 상의) 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있고, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 1 내지 2 자릿수 또는 3 자릿수 또는 4 자릿수 더 작을 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 존재할 것이다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이와 같은 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이적 항체는, 각각 3개의 중쇄 CDR, 그 다음에 C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인, 및 C_H3 도메인을 갖는 2개의 중쇄, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄와 회합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합하고 하나 또는 2개의 에피토프에 하나 또는 2개의 중쇄의 결합을 가능하게 할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 가진다. BsAb는, Fc 영역을 보유하는 것(IgG-유사)과 Fc 영역이 없는 것의 2가지 주요 부류로 나뉠 수 있으며, 후자는 일반적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이적 분자보다 더 작다. IgG-유사 bsAb는 상이한 형태, 예컨대 트리오맙(triomab), 노브 인투 홀(knobs into hole) IgG(kih IgG), 크로스맙(crossMab), 오르트(orth)-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig(DVD-Ig), 투-인-원(Two-in-one) 또는 이중 작용 Fab(DAF), IgG-단일-사슬 Fv(IgG-scFv), 또는 κλ-바디(이들로 제한되지 않음)를 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형태는 탠덤(Tandem) scFv, 디아바디 형태, 단일-사슬 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), 이중-친화도 재표적화 분자(DART), DART-Fc, 나노바디, 또는 독-앤-락(dock-and-lock: DNL) 방법에 의해 생성된 항체를 포함한다. 팬(Fan)외 다수 및 콘테르만(Kontermann)과 브링크만(Brinkmann)은 이중특이적 항체에 대한 상세한 검토를 제시한다(Fan et al. "Bispecific antibodies and their applications" J. Hematol. Oncol. (2015) 8:130; Kontermann and Brinkmann. "Bispecific antibodies" Drug Discov. Today (2015) 20: 838-847). BsAb를 생성하는 방법은 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합, 화학적 가교결합제를 포함하는 화학적 접합, 및 재조합 DNA 기술을 이용하는 유전적 접근을 기반으로 하는 쿼드로마(quadroma) 기술로 제한되지 않는다. bsAb의 예는 다음 특허 출원에 개시된 것을 포함하며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다: 2010년 6월 25일자로 출원된 미국 특허 제8,586,713호; 2012년 6월 5일자로 출원된 미국 특허 공개 2013/0045492; 2013년 9월 19일자로 출원된 미국 특허 제9,657,102호; 2015년 7월 24일자로 출원된 미국 특허 공개 2016/0024147; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 특허 공개 2018/0112001; 2017년 9월 22일자로 출원된 미국 특허 공개 2018/0104357; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 특허 공개 2017/0174779; 2016년 12월 21일자로 출원된 미국 특허 공개 2017/0174781; 2016년 7월 29일자로 출원된 미국 특허 제10,179,819호; 및 2017년 11월 15일자로 출원된 미국 특허 공개 2018/0134794. 낮은 수준의 동종이량체 불순물은 이중특이적 항체의 제조 동안 여러 단계에서 존재할 수 있다. 이와 같은 동종이량체 불순물의 검출은 보통의 액체 크로마토그래피 방법(도 2에 예시됨)을 사용하여 수행될 때 주요 종과 이들 불순물의 공동 용리 및 동종이량체 불순물의 낮은 풍부도로 인해 온전한 질량 분석을 사용하여 수행될 때 어려울 수 있다.

치료용 이중특이적 항체(bsAb)는 2개의 별개의 표적에 동시에 결합할 수 있고 이중 기능성 또는 신규한 작용 메커니즘을 제공함으로써 향상된 치료 효능을 달성하려는 공약을 지킬 수 있다(Marie Godar et al.,　Therapeutic bispecific antibody formats: a patent applications review (1994-2017), 28　Expert Opinion on Therapeutic Patents　251-276 (2018)). 현재까지, 다양한 질환을 치료하기 위해 60가지 초과의 이중특이적 분자가 개발되었고 평가되었으며, 이들 중 다수는 치료적 응용에서 알려진 장점(안정성, 혈청 반감기 등)으로 인해 IgG-유사 아키텍처를 채택한다(Christoph Spiess, Qianting Zhai & Paul J. Carter,　Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies, 67　Molecular Immunology　95-106 (2015); M X Sliwkowski & I Mellman,　Antibody therapeutics in cancer., 341　Science　1192-1198 (2013); Paul J. Carter,　Potent antibody therapeutics by design, 6　Nature Reviews Immunology　343-357 (2006)). 이중특이적 항체는 종종 상이한 경쇄 및 중쇄를 공동 발현함으로써 단일 세포에서 생성된다. 그 후에, bsAb 작제물의 조립은 동족 경쇄 및 중쇄의 올바른 쌍형성뿐만 아니라, 2가지 상이한 반-분자의 이종이량체화를 필요로 한다. 불행하게도, 이 공정은 또한 잘못 조립된 분자 작제물, 예컨대 단일특이적 분자(예를 들어, 동종이량체 종)의 형성을 초래할 수 있다. 다른 불순물과 달리, 하류 정제를 통한 동종이량체 종의 제거는 어려울 수 있는데, 이는 동종이량체 종이 종종 예상되는 bsAb 제품과 매우 유사한 물리화학적 특성을 나타내기 때문이다. 폴리펩타이드 사슬 쌍형성의 충실도를 개선하고 이에 따라 bsAb의 형성을 선호하도록, 최근 몇 년 동안 다양한 전략이 개발되었다(Shixue Chen et al.,　I㎜unoglobulin Ga㎜a -Like Therapeutic Bispecific Antibody Formats for Tumor Therapy, 2019　Journal of I㎜unology Research　1-13 (2019)). 예를 들어, 경쇄와 중쇄 사이의 쌍형성의 잘못을 회피하기 위해 bsAb의 각각의 항원-결합 암(arm)에 대한 동일한 경쇄의 사용은 특히 성공적이었다(A. Margaret Merchant et al.,　An efficient route to human bispecific IgG, 16　Nature Biotechnology677-681 (1998)). 추가적으로, 상이한 중쇄의 이종이량체화는 노브-인투-홀(John B.b. Ridgway, Leonard G. Presta & Paul Carter,　'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization, 9　"Protein Engineering, Design and Selection"　617-621 (1996)) 설계를 사용하여 크게 촉진될 수 있으며, 여기서 특정 돌연변이는 이종이량체 형성을 선호하도록 항체의 Fc 부분으로 조작되었다. 대안적으로, Fc 부분에서 아미노산 치환을 통해 단백질 A 결합 친화도를 조절함으로써, bsAb는 또한 단백질 A 정제 단계 동안 동종이량체 불순물로부터 효과적으로 단리될 수 있다(Adam Zwolak et al.,　Rapid Purification of Human Bispecific Antibodies via Selective Modulation of Protein A Binding, 7　Scientific Reports　15521 (2017)). 이러한 전략은 이미 성공적으로 수행되어 임상 연구를 지원하기 위한 bsAb의 대량 생산을 달성하였다(Andrew D. Tustian et al.,　Development of purification processes for fully human bispecific antibodies based upon modification of protein A binding avidity, 8　mAbs　828-838 (2016)).

단백질 조작 및 공정 개발을 통한 신규 bsAb 형태의 발전은 고순도의 치료용 bsAb의 대규모 생산을 가능하게 하였다. 그러나, bsAb 약품 중 소량의 동종이량체 불순물이 존재하는 것은 여전히 가능할 수 있으며, 개발 동안 및 출시 테스트에서 일상적으로 모니터링되어야 한다. 생성물-관련 불순물로 간주되는, 동종이량체 항체는 많은 특성에서 원하는 bsAb와 매우 유사할 수 있으므로, 이는 상기 동종이량체 항체의 검출 및 정량화를 현재 분석 기법에서 독특하고 까다로운 작업으로 만든다. 동종이량체 종은 보통 해당하는 bsAb와 비교하여 특유의 분자량을 나타내므로, LC-MS-기반 기법을 사용한 온전한 단백질 수준에서의 질량 측정은 특성화를 위한 선택 방법이었다(R. Jeremy Woods et al.,　LC-MS characterization and purity assessment of a prototype bispecific antibody, 5　mAbs　711-722 (2013); Wolfgang Schaefer et al.,　Heavy and light chain pairing of bivalent quadroma and knobs-into-holes antibodies analyzed by UHR - ESI - QTOF mass spectrometry, 8　mAbs　49-55 (2015); Frank D. Macchi et al.,　Absolute Quantitation of Intact Recombinant Antibody Product Variants Using Mass Spectrometry, 87　Analytical Chemistry　10475-10482 (2015); Luis Schachner et al.,　Characterization of Chain Pairing Variants of Bispecific IgG Expressed in a Single Host Cell by High-Resolution Native and Denaturing Mass Spectrometry, 88　Analytical Chemistry　12122-12127 (2016); Yiyuan Yin et al.,　Precise quantification of mixtures of bispecific IgG produced in single host cells by liquid chromatography-Orbitrap high-resolution mass spectrometry, 8　mAbs　1467-1476 (2016); Chunlei Wang et al.,　A systematic approach for analysis and characterization of mispairing in bispecific antibodies with asymmetric architecture, 10　mAbs　1226-1235 (2018); Markus Haberger et al.,　Rapid characterization of biotherapeutic proteins by size-exclusion chromatography coupled to native mass spectrometry, 8　mAbs　331-339 (2015);

Debaene et al.,　Time Resolved Native Ion-Mobility Mass Spectrometry to Monitor Dynamics of IgG4 Fab Arm Exchange and " Bispecific " Monoclonal Antibody Formation, 85　Analytical Chemistry　9785-9792 (2013)). 예를 들어, 고분해능 정밀 질량(HRAM) 질량분석기와 결합된 역상 크로마토그래피(RPLC)의 사용은 bsAb 샘플 중 동종이량체 불순물을 정량화하는 여러 실험실에 의해 보고되었다(상기 문헌[Woods et al, 2013]; 상기 문헌[Schachner et al, 2016]; 상기 문헌[Yin et al, 2016]). 이러한 연구의 대부분에서, 동종이량체 불순물은 주요 bsAb 종으로부터 크로마토그래피 분리없이 검출 및 정량화될 수 있었다. 실제로, 큰 크기(약 150 kDa)뿐만 아니라 물리화학적 특성의 유사성을 고려할 때, RPLC 방법을 사용하여 동종이량체 항체 및 bsAb 사이의 충분한 분리를 달성하는 것은 종종 어려운 작업일 수 있다. 결과적으로, RPLC-MS-기반 방법은, 일반적으로 공동 용리로부터 이온 억제 및 압도적으로 더 풍부한 bsAb 종으로 인해, 낮은 수준으로(보고된 가장 낮은 LLOQ는 약 1%임(상기 문헌[Schachner et al, 2016]; 상기 문헌[Yin et al, 2016]) 존재하는 동종이량체 종을 검출하는 데 있어 감도가 부족한 경우가 종종 있다. 더욱이, PTM으로부터 bsAb의 변이체 형태(예를 들어, C-말단 Lys에 대하여 +128 Da 및 당화반응에 대하여 +162) 또는 내전(adduction) 형성이 잠재적으로 분석을 방해할 수 있으므로, 크로마토그래피 분리 없이, 분자량이 bsAb에 가까운 동종이량체 종의 검출은 특히 어려울 수 있다. 마지막으로, 동종이량체와 bsAb 사이의 크로마토그래피가 RPLC 방법에 의해 달성되는 경우, MS-기반 정량화는 여전히 상이한 용매 조성물 내에서 상이한 보유 시간에 용리시키는 항체의 이온화 효율의 불일치에 의해 손상될 수 있었으며, 이는 정량화를 수행할 때 스파이크-인 표준을 사용하여 외부 검량선을 생성하는 것을 필요로 한다(Risto Kostiainen & Tiina J. Kauppila,　Effect of eluent on the ionization process in liquid chromatography-mass spectrometry, 1216　Journal of Chromatography A　685-699 (2009)). 대안적으로, 네이티브 질량분석은 온전한 단백질의 분석에서 또 다른 귀중한 기법을 나타내며, 단클론성 항체(mAb) 이질성 평가를 위해 다수의 일상적인 분석 워크플로에 통합되었다(상기 문헌[Haberger et al, 2016]; Sara Rosati et al.,　Qualitative and Semiquantitative Analysis of Composite Mixtures of Antibodies by Native Mass Spectrometry, 84　Analytical Chemistry　7227-7232 (2012); Anthony Ehkirch et al.,　Hyphenation of size exclusion chromatography to native ion mobility mass spectrometry for the analytical characterization of therapeutic antibodies and related products, 1086　Journal of Chromatography B　176-183 (2018); Guillaume Terral, Alain Beck & Sarah

,　Insights from native mass spectrometry and ion mobility-mass spectrometry for antibody and antibody-based product characterization, 1032　Journal of Chromatography B　79-90 (2016); Oscar Hernandez-Alba et al.,　Native Mass Spectrometry, Ion Mobility, and Collision-Induced Unfolding for Conformational Characterization of IgG4 Monoclonal Antibodies, 90　Analytical Chemistry　8865-8872 (2018)). 더 적은 전하 상태로부터 생성되는 더 집중된 신호로 인해, 네이티브 MS는 RPLC-MS에 비해 개선된 감도를 가질 수 있다. 예를 들어, 로사티(Rosati)외 다수(상기함)는 2가지 공동 발현 IgG1 항체의 2원 혼합물을 연구하기 위한 네이티브 MS의 사용을 보고하였다. 그러나, 효율적인 크로마토그래피 분리 없이, 낮은 수준으로 존재하는 동종이량체 종의 검출 및 정량화는 상기 논의된 것과 동일한 이유로 계속 어려움이 있다.

현재까지, bsAb 샘플 중 동종이량체 종의 검출 및 정량화를 위해 크로마토그래피 분리에 의존하는 분석 방법에 대한 제한된 보고가 있었다. 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)(상기 문헌[Wang et al., 2018]) 또는 이온 교환 크로마토그래피(IEX)(A. F. Labrijn et al.,　Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab -arm exchange, 110　Proceedings of the National Academy of Sciences　5145-5150 (2013); Michael J Gramer et al.,　Production of stable bispecific IgG1 by controlled Fab -arm exchange, 5　mAbs　962-973 (2013))는 각각 소수성 또는 등전점(pI)에서 충분히 상이한 값을 나타내는 경우 동종이량체로부터 bsAb를 분리하는 것으로 나타났다. 추가적으로, 온라인 IEX-네이티브 MS 기술에서 최근 발전(Yuetian Yan et al.,　Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native Mass Spectrometry, 90　Analytical Chemistry　13013-13020 (2018); Florian

et al.,　Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry, 90　Analytical Chemistry　4669-4676 (2018); Aaron O. Bailey et al.,　Charge variant native mass spectrometry benefits mass precision and dynamic range of monoclonal antibody intact mass analysis, 10　mAbs　1214-1225 (2018))은 bsAb에서 낮은 수준의 동종이량체 종의 민감한 검출을 위한 효과적인 접근법을 제공한다. 그러나, 높은 분해능으로 인해, IEX는 보통, 서로 겹칠 가능성이 있는 전하 이질성을 기반으로 각각의 항체에 대한 복잡한 전하 프로파일을 생성한다. 더욱이, 이 접근법을 사용하는 MS-기반 정량화는, 각 분자로부터 분리된 모든 전하 변이체 형태가 계산을 위해 집계되어야 하므로, 복잡할 수 있다. 추가적으로, RPLC-기반 접근법과 유사하게, IEX 방법은 구배 용리를 이용하는데, 이는 상이한 용매 조건(예를 들어, pH 또는 염 농도) 하에서 용리시키는 항체의 상이한 이온화 효율로 인해 MS-기반 정량화를 손상시킬 가능성이 있을 것이다. 최근에는, 유체역학적 부피 및 칼럼 매트릭스와의 소수성 상호작용 둘 다에 의해 분석물을 분리하는 SEC-기반 혼합형 크로마토그래피(MM-SEC) 방법이 항체 이질성의 연구에 적용되었다(Xiaoyu Yang et al.,　Analysis and purification of IgG4 bispecific antibodies by a mixed-mode chromatography, 484　Analytical Biochemistry　173-179 (2015); Cintyu Wong, Camille Strachan-Mills & Sudhir Burman,　Facile method of quantification for oxidized tryptophan degradants of monoclonal antibody by mixed mode ultra performance liquid chromatography, 1270　Journal of Chromatography A　153-161 (2012); Jorge Alexander Pavon et al.,　Analysis of monoclonal antibody oxidation by simple mixed mode chromatography, 1431　Journal of Chromatography A　154-165 (2016)). UV 또는 형광 검출과 결합된, MM-SEC 방법은 bsAb 샘플 중 동종이량체 종의 상대적인 정량화에 성공적으로 적용되었다(상기 문헌[Yang et al, 2015]). 그러나, 이 방법의 유용성은 기준선 분리가 UV-기반 또는 형광-기반 정량화를 위해 달성될 수 있도록 동종이량체 및 bsAb 종이 소수성이 충분히 상이한 경우로 제한될 수 있음이 분명하다. 더욱이, 동종이량체 종의 식별은 오로지 표준에 대한 보유 시간 정렬을 기반으로 하므로, 동종이량체 종이 bsAb 분자의 올리고머 또는 절단된 형태와 함께 공동 용리시키는 경우, 항상 상대적 풍부도를 과대평가할 위험이 있었다.

SEC 칼럼을 사용하는 혼합형 크로마토그래피의 개념은 단백질 분석물과 칼럼 매트릭스 사이의 원치않는 2차 상호작용에서 비롯된다. 이상적으로, SEC는 유체역학 부피만을 기반으로 하여 단백질 분석물을 분리해야 한다. 실제로, 정전기, 소수성 및 수소-결합 상호작용은 모두 칼럼 매트릭스, 완충액 조건 및 단백질 특징에 따라 단백질의 보유 및 분리에 상이한 정도로 기여할 수 있다(Alexandre Goyon et al.,　Unraveling the mysteries of modern size exclusion chromatography - the way to achieve confident characterization of therapeutic proteins, 1092　Journal of Chromatography B　368-378 (2018); Tsutomu Arakawa et al.,　The critical role of mobile phase composition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals, 99　Journal of Pharmaceutical Sciences　1674-1692 (2010)). 크로마토그래피 조건을 적절하게 최적화함으로써 SEC 분리 동안 이러한 2차 상호작용을 이용하면 유체역학 부피는 유사하지만 표면 특징(예를 들어, 전하 및 소수성)은 상이한 항체의 분리를 개선시키는 기회를 제공한다. MS-호환 이동상을 사용함으로써, 혼합형 SEC와 네이티브 MS 검출(MM-SEC-MS)의 온라인 결합은 정밀 질량 측정에 의해 동종이량체 종의 명확한 식별, 공동 용리 종으로부터의 간섭 최소화 및 크로마토그래피 분해능에 대한 덜 엄격한 필요조건을 포함하여 UV-기반 방법에 비해 많은 장점을 가질 수 있다(상기 문헌[Terral et al., 2016]; 상기 문헌[Goyon et al., 2017]).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "다중특이적 항체" 또는 "Mab"는 적어도 2가지 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 말한다. 이와 같은 분자는 일반적으로 2가지 항원에만 결합할 것이지만(즉, 이중특이적 항체, BsAb), 삼중특이적 항체 및 KIH 삼중특이적과 같은 추가적인 특이성을 갖는 항체가 또한 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 의해 처리될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 단클론성 항체는, 당업계에서 이용가능하거나 알려진 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 알려진 매우 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.

바이오의약품 생산의 다수 단계 동안, 불순물이 형성될 수 있다. 생명공학-유래 불순물은 종종 매우 낮은 수준으로 존재하고, 매우 복잡한 종 또는 종의 혼합물을 나타낼 수 있기 때문에, 이를 특성화 및 정량화하는 것이 매우 어려울 수 있다. 또한 불순물 피크의 정확한 참조 표준을 얻는 것도 매우 어려울 수 있다. 그러나, 미량의 불순물 단백질을 완전히 특성화하는 것은 시간이 많이 소요되고, 오래 걸리며, 종종 매우 비용이 많이 드는 공정이 된다. 종종 불순물은 온전한 재조합 단백질의 변이체, 동형단백질, 분해 생성물, 생성물-관련 불순물, 공정-관련, 번역후 사소한 변형, 응집체, 또는 짧게 잘린 단편을 포함할 수 있다. 거의 무한한 수의 가능한 불순물이 있으며, 이들 대부분은 알려져 있을 수 있지만 전부는 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 단백질"은 원하는 생성물 또는 불순물 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원하는 생성물"은 원하는 구조, 기능, 또는 효능 프로파일을 갖는 단백질을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 바이오의약 제품에 존재하는 임의의 바람직하지 않은 단백질을 포함할 수 있다. 불순물은 공정 및 생성물-관련 불순물을 포함할 수 있다. 불순물은 추가로 알려진 구조, 부분적으로 특성화, 또는 식별되지 않은 구조를 가질 수 있다. 공정-관련 불순물은 제조 공정으로부터 유래될 수 있고 3가지 주요 카테고리, 즉 세포 기질-유래, 세포 배양물-유래 및 하류 유래의 카테고리를 포함할 수 있다. 세포 기질-유래 불순물은 숙주 유기체 및 핵산(숙주 세포 게놈, 벡터, 또는 총 DNA)으로부터 유래되는 단백질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 세포 배양물-유래 불순물은 유도물질, 항생제, 혈청, 및 기타 배지 구성요소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 하류-유래 불순물은 효소, 화학적 및 생화학적 가공 시약(예를 들어, 사이아노젠 브로마이드, 구아니딘, 산화 및 환원제), 무기 염(예를 들어, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드(예를 들어, 단클론성 항체), 및 기타 침출물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 생성물-관련 불순물(예를 들어, 전구체, 특정 분해 생성물)은 활성, 효능, 및 안전성과 관련하여 원하는 생성물의 특성과 비슷한 특성을 가지지 않는 제조 및/또는 저장 동안 발생하는 분자 변이체일 수 있다. 이와 같은 변이체는 변형(들)의 유형을 식별하기 위해 단리 및 특성화에 상당한 노력을 필요로 할 수 있다. 생성물-관련 불순물은 절단된 형태, 변형된 형태, 및 응집체를 포함할 수 있다. 절단된 형태는 펩타이드 결합의 절단에 촉매작용을 미치는 가수분해 효소 또는 화학물질에 의해 형성된다. 변형된 형태는 탈아미드화, 이성질체화, 매스매치 S-S 연결, 산화, 또는 변경된 접합 형태(예를 들어, 글리코실화, 인산화)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 변형된 형태는 또한 임의의 번역후 변형 형태를 포함할 수 있다. 응집체는 원하는 생성물의 이량체 및 더 높은 다량체를 포함한다. (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH August 1999, U.S. Dept. of Health and Humans Services).

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 일반적인 용어 "번역후 변형" 또는 "PTM"은 리보솜 합성 동안(동시 번역 변형) 또는 리보솜 합성 후(번역후 변형)에 폴리펩타이드가 겪는 공유 변형을 말한다. PTM은 일반적으로 특정 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 다수 PTM이 단백질 백본 내의 특정 특징적인 단백질 서열(지문 서열(signature sequence))의 부위에서 일어난다. 수백 가지의 PTM이 보고되었으며, 이러한 변형은 단백질의 구조 또는 기능의 일부 측면에 변함없이 영향을 미친다(Walsh, G. “Proteins” (2014) second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). 다양한 번역후 변형은 절단, N-말단 연장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화(비오틴을 이용한 리신 잔기의 아실화), C-말단의 아미드화, 글리코실화, 요오드화, 보결분자단의 공유 부착, 아세틸화(보통 단백질의 N-말단에서 아세틸기의 추가), 알킬화(보통 리신 또는 아르기닌 잔기에서 알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필)의 추가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩타이드 사슬 내 또는 사이의 공유 가교결합, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존성 변형(프롤린 및 리신 하이드록실화 및 카복시 말단 아미드화), 비타민 K 의존성 변형(여기서, 비타민 K는 글루탐산 잔기의 카복실화에서 보조인자로서 γ-카복시글루타메이트(glu 잔기), 글루타밀화(글루탐산 잔기의 공유결합), 글리실레이션(글리신 잔기의 공유결합), 글리코실화(아스파라긴, 하이드록시리신, 세린, 또는 트레오닌에 글리코실기를 추가하여 당단백질을 생성함), 아이소프레닐화(아이소프레노이드기, 예컨대 파네솔 및 제라닐제라니올의 추가), 리포일화(리포에이트 작용기의 부착), 포스포판테테이닐화(지방산, 폴리케타이드, 비-리보솜 펩타이드 및 류신 생합성에서와 같이 코엔자임 A 유래의 4'-포스포판테테이닐 모이어티의 추가), 인산화(보통 세린, 타이로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 포스페이트기의 추가), 및 황산화(보통 타이로신 잔기에 황산염의 추가)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 아미노산의 화학적 성질을 변화시키는 번역후 변형은 시트룰린화(탈이민화에 의한 아르기닌의 시트룰린으로의 전환), 및 탈아미드화(글루타민의 글루탐산 또는 아스파라긴의 아스파르트산으로의 전환)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 구조적 변화를 포함하는 번역후 변형은 이황화 가교의 형성(2개 시스테인 아미노산의 공유결합) 및 단백질분해 절단(펩타이드 결합에서 단백질의 절단)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 번역후 변형은 다른 단백질 또는 펩타이드의 추가, 예컨대 ISG화(ISGylation)(ISG15 단백질(인터페론-자극 유전자)에 대한 공유결합), SUMO화(SUMOylation)(SUMO 단백질(작은 유비퀴틴-관련 개질제)에 대한 공유결합) 및 유비퀴틴화(단백질 유비퀴틴에 대한 공유결합)를 포함한다. 유니프롯(UniProt)이 관리하는 PTM의 보다 상세한 통제 어휘집에 대하여 http://www.uniprot.org/docs/ptmlist를 참조한다.

혼합형 크기-배제 크로마토그래피

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학물질 혼합물이 정지된 액상 또는 고상 주위 또는 위로 흐를 때 화학물질 실체의 차등 분포의 결과로 구성요소로 분리될 수 있는 공정을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼합형 크로마토그래피(MMC)" 또는 다중모드 크로마토그래피"는 용질이 하나 초과의 상호작용 방식 또는 메커니즘을 통해 정지상과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 포함한다. MMC는 전통적인 역상(RP), 이온 교환(IEX) 및 순상 크로마토그래피(NP)에 대한 대안적 또는 보완적 도구로서 사용될 수 있다. RP와 달리, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온성 상호작용이 각각 지배적인 상호작용 방식인 NP 및 IEX 크로마토그래피는 이러한 상호작용 방식 중 2가지 이상의 조합을 이용할 수 있다. 혼합형 크로마토그래피 매체는 단일형 크로마토그래피에 의해 재현할 수 없는 고유한 선택성을 제공할 수 있다. 혼합형 크로마토그래피는 또한 친화도 기반 방법과 비교하여 잠재적인 비용 절감 및 운영 유연성을 제공할 수 있다.

어구 "크기 배제 크로마토그래피" 또는 "SEC" 또는 "겔 여과"는 용액에서 분자의 크기에 따라 분자를 분류할 수 있는 액체 칼럼 크로마토그래피 기법을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "SEC 크로마토그래피 수지" 또는 "SEC 크로마토그래피 매체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 원하는 생성물로부터 불순물(예를 들어, 이중특이적 항체 생성물에 대한 동종이량체 오염물질)을 분리하는 SEC에서 사용되는 임의의 종류의 고상을 포함할 수 있다. 수지의 부피, 사용되는 칼럼의 길이 및 직경뿐만 아니라 동적 용량 및 유속은 처리할 유체의 부피, 본 발명의 공정이 적용되는 유체 중 단백질의 농도 등과 같은 여러 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 각각의 단계에 대한 이들 매개변수의 결정은 당업자의 평균 기술의 범위 내에 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼합형-크기 배제 크로마토그래피" 또는 "MM-SEC"는 크기를 기반으로 한 분리이외의 추가적인 상호작용을 통해 단백질을 분리하는 임의의 크로마토그래피 방법을 포함한다. 추가적인 또는 2차 상호작용은 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 전하-전하 상호작용, 수소 결합, 파이(pi)-파이 결합, 및 금속 친화도의 메커니즘 중 하나 이상을 활용할 수 있다. 혼합형-크기 배제 크로마토그래피 수지는 MM-SEC 분리에 사용되는 임의의 종류의 고상을 말할 수 있다. 비제한적인 예에는 Sepax Zenix SEC-300, Waters BEH 300, 또는 아질런트 바이오(Agilent Bio) SEC-3이 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소수성 작용기"는 2차 상호작용으로서 SEC 크로마토그래피 수지와 단백질의 소수성 상호작용을 말한다. 소수성 작용기는 또한 피크 형상에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 이는 공정의 분해능에 확연한 영향을 미칠 수 있다. 소수성 상호작용은 이동상의 높은 이온 강도에서 가장 강하다. 수지에 소수성 작용기를 포함하도록 이동상을 선택하기 위해, 소수성 상호작용을 촉진시키거나(염석 효과) 물의 구조를 파괴하고(카오트로픽 효과) 소수성 상호작용의 약화를 야기하는지 여부에 따라 소위 용해성(soluphobic) 시리즈로 다양한 이온이 배열될 수 있다(도 3에 예시된 바와 같음). 양이온은 Ba⁺⁺; Ca⁺⁺; Mg⁺⁺; Li⁺; Cs⁺; Na⁺; K⁺; Rb⁺; NH4⁺로서 염석 효과를 증가시키는 관점에서 순위가 매겨지는 반면, 음이온은 PO^-; SO₄ ^-; CH₃CO₂ ^-; Cl^-; Br^-; NO₃ ^-; ClO₄ ^-; I^-; SCN^-로서 카오트로픽 효과를 증가시키는 관점에서 순위가 매겨질 수 있다. 일반적으로, Na, K 또는 NH₄ 설페이트는 HIC에서 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진시킨다. (NH₄)₂SO₄>Na₂SO₄>NaCl>NH₄Cl>NaBr>NaSCN의 관계에 의해 제공되는 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 미치는 염이 공식화될 수 있다.

질량분석법

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질량분석기(mass spectrometer)"는 특정 분자 종을 검출하고 이의 정밀 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 상기 용어는 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 검출 및/또는 특성화를 위해 용리될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량분석기는 이온 공급원, 질량 분석기(mass analyzer), 및 검출기의 3가지 부분을 포함할 수 있다. 이온 공급원의 역할은 기상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자, 또는 클러스터는 기상으로 운반되고 동시에 (전자분무 이온화에서와 같이) 이온화될 수 있다. 이온 공급원의 선택은 적용에 따라 크게 달라진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질량 분석기(mass analyzer)"는 질량에 따라 원자, 분자, 또는 클러스터인 종을 분리할 수 있는 장치를 포함한다. 빠른 단백질 서열결정에 이용될 수 있는 질량 분석기의 비제한적인 예에는 비행시간(time-of-flight; TOF), 자기/전기 섹터, 사중극자 질량 필터(Q), 사중극자 이온 트랩(QIT), 오비트랩(orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTICR), 및 또한 가속기 질량 분석(AMS) 기법이 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "직렬 질량분석법"은 질량 선택 및 질량 분리의 다중 단계를 사용함으로써 샘플 분자에 대한 구조 정보를 얻는 기법을 포함한다. 전제조건은 샘플 분자가 기상으로 운반되어 온전하게 이온화될 수 있고 첫번째 질량 선택 단계 후 일부 예측가능하고 제어가능한 방식으로 분해되도록 유도될 수 있다는 것이다. 다단계 MS/MS, 또는 MSⁿ은 의미있는 정보를 얻을 수 있거나 단편 이온 신호가 검출가능한 한 먼저 전구체 이온(MS²)을 선택하고 분리한 다음, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온(MS³)을 단리한 다음, 이를 단편화하고, 2차 단편(MS⁴)을 단리하는 등에 의해 수행될 수 있다. 직렬 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 응용을 위해 결합하는 분석기는 다수의 다양한 인자, 예컨대 감도, 선택성, 및 속도뿐만 아니라, 크기, 비용, 및 가용성에 의해 결정된다. 직렬 MS 방법의 2가지 주요 카테고리는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 또한 탠덤-인-타임 분석기가 공간 내에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합된 하이브리드도 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 질량분석은 네이티브 조건 하에서 수행될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "네이티브 조건" 또는 "네이티브 MS" 또는 "네이티브 ESI-MS"는 분석물에서 비-공유 상호작용을 보존하는 조건 하에서 질량분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 네이티브 MS에 대한 상세한 검토에 대해서, 보고서[Elisabetta Boeri Erba & Carlo Petosa,　The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes, 24　Protein Science 1176-1192 (2015)]를 참조한다. 네이티브 ESI와 일반 ESI 사이의 차이점 중 일부는 표 1에 예시되어 있다(Hao Zhang et al.,　Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes, 587　FEBS Letters　1012-1020 (2013)).

예시적인 실시형태

본 명세서에 개시된 실시형태는 샘플 중 단백질의 신속한 특성화를 위한 조성물, 방법, 및 시스템을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(include)", "포함한다(includes)", 및 "포함하는(including)"은 비제한적인 것을 의미하며, 각각 "포함하다(comprise)", "포함한다(comprises)", 및 "포함하는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.

본 개시내용은 혼합형 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계; 이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및 질량분석기를 사용하여 용리액 중 불순물을 검출하는 단계를 포함하는 샘플 중 불순물을 검출 또는 정량화하기 위한 방법을 제공한다.

본 개시내용은 혼합형 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계, 이동상을 사용하여 혼합형 크로마토그래피 수지를 세척하여 표적 단백질을 포함하는 용리액을 제공하는 단계, 및 질량분석기를 사용하여 용리액 중 표적 단백질을 검출 또는 정량화하는 단계를 포함하는 샘플 중 표적 단백질을 검출 또는 정량화하기 위한 방법을 제공한다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템은 추가적인 상호작용이 있는 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템은 소수성 상호작용 기능성이 있는 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템은 전하-전하 상호작용 기능성이 있는 크기 배제 크로마토그래피 수지를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 샘플 중 불순물을 검출 또는 정량화하기 위한 방법은 적어도 하나의 바람직하지 않은 단백질을 포함할 수 있는 불순물을 포함할 수 있다. 불순물(들)은 알려진 구조를 가질 수 있거나, 부분적으로 특성화될 수 있거나, 식별되지 않을 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 불순물은 생성물-관련 불순물일 수 있다. 생성물 관련 불순물은 분자 변이체, 전구체, 분해 생성물, 단편화 단백질, 소화 생성물, 응집체, 번역후 변형 형태, 또는 이들의 조합일 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 불순물은 공정-관련 불순물일 수 있다. 공정-관련 불순물은 제조 공정으로부터 유래된 불순물, 즉 핵산 및 숙주 세포 단백질, 항생제, 혈청, 기타 배지 구성요소, 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약, 무기 염, 용매, 담체, 리간드, 및 제조 공정에서 사용되는 기타 침출물을 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 불순물은 pI가 약 4.5 내지 약 9.0의 범위인 단백질일 수 있다. 일 양태에서, 불순물은 pI가 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0인 단백질일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 불순물은 동종이량체 종일 수 있다. 일 양태에서, 불순물은 동종이량체 종일 수 있으며, 이는 이중특이적 항체의 생성 동안 형성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 샘플 중 불순물의 수는 적어도 2가지일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템 상에 로딩된 샘플의 양은 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 범위일 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템 상에 로딩된 샘플의 양은 약 10㎍, 약 12.5㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25㎍, 약 30㎍, 약 35㎍, 약 40㎍, 약 45㎍, 약 50㎍, 약 55㎍, 약 60㎍, 약 65㎍, 약 70㎍, 약 75㎍, 약 80㎍, 약 85㎍, 약 90㎍, 약 95㎍, 또는 약 100㎍일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 불순물을 용리시키는 데 사용되는 이동상은 질량분석기와 양립 가능할 수 있는 이동상일 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 양태에서, 이동상의 총 농도는 최대 약 600mM의 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 이동상의 총 농도는 약 5mM, 약 6mM, 7mM, 약 8mM, 9mM, 약 10mM, 12.5mM, 약 15mM, 17.5mM, 약 20mM, 25mM, 약 30mM, 35mM, 약 40mM, 45mM, 약 50mM, 55mM, 약 60mM, 65mM, 약 70mM, 75mM, 약 80mM, 75mM, 약 95mM, 100mM, 약 1100mM, 120mM, 약 130mM, 140mM, 약 150mM, 160mM, 약 170mM, 180mM, 약 190mM, 200mM, 약 225mM, 250mM, 약 275mM, 300mM, 약 325mM, 350mM, 약 375mM, 400mM, 약 425mM, 450mM, 약 475mM, 500mM, 약 525mM, 550mM, 약 575mM, 또는 약 600mM일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 이동상은 유속이 약 0.1 ㎖/분 내지 약 0.4 ㎖/분일 수 있다. 예시적인 일 실시형태에서, 이동상의 유속은 약 0.1 ㎖/분, 약 0.15 ㎖/분, 약 0.20 ㎖/분, 약 0.25 ㎖/분, 약 0.30 ㎖/분, 약 0.35 ㎖/분, 또는 0.4 ㎖/분일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 불순물을 검출 또는 정량화하기 위한 방법은 질량분석기를 사용하여 용리액 중 불순물을 검출 또는 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 질량분석기는 직렬 질량분석기일 수 있다. 또 다른 양태에서, 질량분석기는 나노-스프레이를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 용리액은 불순물에 추가적으로 표적 단백질을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 표적 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 또는 다중특이적 항체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 단클론성 항체일 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 치료용 항체일 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 면역글로불린 단백질일 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, 면역글로불린 단백질은 IgG1일 수 있다. 또 다른 특정 양태에서, 면역글로불린 단백질은 IgG4일 수 있다. 일 양태에서, 표적 단백질은 이중특이적 항체일 수 있다. 특정 양태에서, 이중특이적 항체는 항-CD20/CD3 단클론성 항체일 수 있다. 일 양태에서, 표적 단백질은 마우스 섬유아세포 세포주 MG87을 사용하여 생성된 항체일 수 있다. 일 양태에서, 표적 단백질은 항체의 소화시 형성되는 항체 단편일 수 있다.

일 양태에서, 표적 단백질은 번역후 변형된 단백질일 수 있다. 특정 양태에서, 번역후 변형된 단백질은 절단, N-말단 연장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화, C-말단의 아미드화, 산화, 글리코실화, 요오드화, 보결분자단의 공유 부착, 아세틸화, 알킬화, 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩타이드 사슬 내 또는 사이의 공유 가교결합, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존성 변형, 비타민 K 의존성 변형, 글루타밀화, 글리실레이션, 글리코실화, 탈글리코실화, 아이소프레닐화, 리포일화, 포스포판테테이닐화, 인산화, 및 황산화, 시트룰린화, 탈아미드화, 이황화 가교의 형성, 단백질분해 절단, ISG화, SUMO화 또는 유비퀴틴화(단백질 유비퀴틴에 대한 공유결합)에 의해 형성될 수 있다.

또 다른 양태에서, 표적 단백질은 단백질의 분해 생성물일 수 있다.

또 다른 양태에서, 표적 단백질은 바이오의약품 제품에서 발견되는 불순물일 수 있다. 특정 양태에서, 표적 단백질은 바이오의약 제품의 제조 동안 발견되는 불순물일 수 있다.

일 양태에서, 표적 단백질은 pI가 약 4.5 내지 약 9.0의 범위인 단백질일 수 있다.

일 양태에서, 표적 단백질은 생성물-관련 불순물일 수 있다. 생성물 관련 불순물은 분자 변이체, 전구체, 분해 생성물, 단편화 단백질, 소화 생성물, 응집체, 번역후 변형 형태, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 양태에서, 표적 단백질은 공정-관련 불순물일 수 있다. 공정-관련 불순물은 제조 공정으로부터 유래된 불순물, 즉 핵산 및 숙주 세포 단백질, 항생제, 혈청, 기타 배지 구성요소, 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약, 무기 염, 용매, 담체, 리간드, 및 제조 공정에서 사용되는 기타 침출물을 포함할 수 있다.

일 양태에서, 샘플 중 불순물의 수는 적어도 2가지일 수 있다.

일 양태에서, 번역후 변형된 단백질은 단백질의 산화시 형성될 수 있다.

또 다른 양태에서, 표적 단백질은 분해 생성물을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 분해 생성물은 치료용 단백질의 번역후 변형을 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 이동상을 사용하여 혼합형 크로마토그래피 수지를 세척하는 단계는 약 30분 미만이 소요된다. 일 양태에서, 이동상을 사용하여 혼합형 크로마토그래피 수지를 세척하는 데 필요한 시간은 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분, 약 19분, 약 20분, 약 21분, 약 22분, 약 23분, 약 24분, 약 25분, 약 26분, 약 26분, 약 27분, 약 28분, 약 29분, 또는 약 30분일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 시스템은 세정없이 적어도 약 3회의 샘플 실행에 사용될 수 있다. 일 양태에서, 크로마토그래피 시스템은 세정없이 적어도 약 3회의 샘플 실행, 적어도 약 4회의 샘플 실행, 적어도 약 5회의 샘플 실행, 적어도 약 6회의 샘플 실행, 적어도 약 7회의 샘플 실행, 또는 적어도 약 8회의 샘플 실행에 사용될 수 있다.

방법은 상기 단백질, 불순물, 칼럼 중 임의의 것에 제한되지 않으며 검출 또는 정량화하기 위한 방법은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있음이 이해된다.

예시적인 일부 실시형태에서, 개시내용은 이동상을 사용하여 세척되어 표적 단백질을 포함하는 용리액을 제공할 수 있는 크로마토그래피 칼럼(110) 및 크로마토그래피 칼럼에 결합된 질량분석기(120)를 포함하는 혼합형 크로마토그래피 시스템을 제공한다(도 4에 예시된 바와 같음). 일 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)은 샘플 로딩 장치(100)를 사용하여 샘플과 접촉될 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 칼럼(110) 상에 로딩될 수 있는 샘플의 양은 약 10㎍ 내지 약 100㎍의 범위일 수 있다. 일 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110) 상에 로딩될 수 있는 샘플의 양은 약 10㎍, 약 12.5㎍, 약 15㎍, 약 20㎍, 약 25㎍, 약 30㎍, 약 35㎍, 약 40㎍, 약 45㎍, 약 50㎍, 약 55㎍, 약 60㎍, 약 65㎍, 약 70㎍, 약 75㎍, 약 80㎍, 약 85㎍, 약 90㎍, 약 95㎍, 또는 약 100㎍일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)은 이동상으로 세척될 수 있다. 일 양태에서, 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)과 함께 사용될 수 있는 이동상의 총 농도는 최대 약 600mM의 범위일 수 있다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)과 함께 사용될 수 있는 이동상의 총 농도는 약 5mM, 약 6mM, 7mM, 약 8mM, 9mM, 약 10mM, 12.5mM, 약 15mM, 17.5mM, 약 20mM, 25mM, 약 30mM, 35mM, 약 40mM, 45mM, 약 50mM, 55mM, 약 60mM, 65mM, 약 70mM, 75mM, 약 80mM, 75mM, 약 95mM, 100mM, 약 1100mM, 120mM, 약 130mM, 140mM, 약 150mM, 160mM, 약 170mM, 180mM, 약 190mM, 200mM, 약 225mM, 250mM, 약 275mM, 300mM, 약 325mM, 350mM, 약 375mM, 400mM, 약 425mM, 450mM, 약 475mM, 500mM, 약 525mM, 550mM, 약 575mM, 또는 약 600mM일 수 있다. 또 다른 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)과 함께 사용될 수 있는 이동상은 유속이 0.1 ㎖/분 내지 0.4 ㎖/분일 수 있다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)과 함께 사용될 수 있는 이동상의 유속은 약 0.1 ㎖/분, 약 0.15 ㎖/분, 약 0.20 ㎖/분, 약 0.25 ㎖/분, 약 0.30 ㎖/분, 약 0.35 ㎖/분, 또는 약 0.4 ㎖/분일 수 있다. 또 다른 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)과 함께 사용될 수 있는 이동상은 불순물을 용리시키는 데 사용될 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)은 질량분석기(120)와 결합될 수 있다. 일 양태에서, 질량분석기(120)는 나노-스프레이를 포함할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 질량분석기(120)는 직렬 질량분석기일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 질량분석기(120)는 네이티브 질량분석기일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다(도 4 참조). 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 하나의 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)에 사용될 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 단클론성 항체의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 치료용 항체의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 면역글로불린 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 IgG1 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 IgG4 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 이중특이적 항체의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 항-CD20/CD3 단클론성 항체의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 항체의 소화시 형성되는 항체 단편의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 일 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 번역후 변형된 단백질일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 단백질의 분해 생성물일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 바이오의약 제품에서 발견되는 불순물일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 바이오의약 제품의 제조 동안 발견되는 불순물일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 pI가 약 4.5 내지 약 9.0의 범위인 단백질일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 생성물-관련 불순물일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 생성물 관련 불순물은 분자 변이체, 전구체, 분해 생성물, 단편화 단백질, 소화 생성물, 응집체, 번역후 변형 형태, 또는 이들의 조합일 수 있다.

예시적인 일부 특정 실시형태에서, 혼합형 크로마토그래피 시스템은 공정-관련 불순물일 수 있는 표적 단백질의 검출(140) 및/또는 정량화(130)가 가능할 수 있다. 공정-관련 불순물은 제조 공정으로부터 유래된 불순물, 즉 핵산 및 숙주 세포 단백질, 항생제, 혈청, 기타 배지 구성요소, 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약, 무기 염, 용매, 담체, 리간드, 및 제조 공정에서 사용되는 기타 침출물을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 샘플 중 불순물의 수는 적어도 2가지일 수 있다.

예시적인 일부 실시형태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)은 세정없이 적어도 약 3회의 샘플 실행에 사용이 가능하다. 일 양태에서, 크로마토그래피 칼럼(110)은 세정없이 적어도 약 3회의 샘플 실행, 적어도 약 4회의 샘플 실행, 적어도 약 5회의 샘플 실행, 적어도 약 6회의 샘플 실행, 적어도 약 7회의 샘플 실행, 또는 적어도 약 8회의 샘플 실행에 사용될 수 있다.

시스템은 상기 단백질, 불순물, 이동상, 또는 크로마토그래피 칼럼 중 임의의 것으로 제한되지 않음이 이해된다.

숫자 및/또는 문자로 본 명세서에서 제공되는 방법 단계의 연속적인 표지는 방법 또는 이의 임의의 실시형태를 지시된 특정 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다.

특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함한 다양한 간행물이 본 명세서 전체에서 인용된다. 이들 인용된 참고문헌은 각각 본 명세서에서 전문이 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.

본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이며, 하기 실시예는 본 개시내용을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공된다. 하기 실시예는 예시를 위한 것이며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재료. 밀리팩 익스프레스(MilliPak Express) 20 필터(밀리포어시그마(MilliporeSigma), 미국 매사추세츠주 벌링턴 소재)가 설치된 밀리-Q(Milli-Q) 통합 정수 시스템으로 탈이온수를 제공하였다. 아세트산암모늄(LC/MS 등급), 아세트산 및 중탄산암모늄(LC/MS 등급)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였다. 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F)를 뉴 잉글랜드 바이오랩 인코포레이티드(New England Biolabs Inc)(미국 매사추세츠주 입스위치 소재)에서 구입하였다. Invitrogen^TM UltraPure^TM 1M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)(미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 입수하였다. IgG1 및 IgG4 하위부류를 포함하여 모든 단클론성 항체 및 이중특이적 항체를 리제네론(Regeneron)에서 생산하였다.

샘플 준비. Fc 부분에 2개의 N-연결 글리칸의 존재에 의해 도입된 질량 이질성을 감소시키기 위해, 각각의 항체 또는 항체 혼합물 샘플을 100mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 1시간 동안 45℃에서 PNGase F(단백질 10㎍ 당 1 IUB 밀리유닛)로 처리하였다. bsAb 혼합물의 스파이크-인 표준을 준비하기 위해, 먼저 bsAb 약물 물질을 분석용 강 양이온 교환 크로마토그래피(SCX)를 사용하여 추가로 정제하여 대규모 제조 공정에서 임의의 잔류 동종이량체 불순물을 제거하였다. SCX 분별에 대한 상세 조건은 하기 나타내어져 있다. 분별 후, 정제된 BsAb 및 해당하는 동종이량체 표준을 둘 다 50mM의 Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 완충액을 교환하고 Nanodrop(써모 피셔 사이언티픽, 독일 브레멘 소재)에 의해 결정된 농도를 기준으로 각각 6㎍/㎕로 조정하였다. 이어서, bsAb와 2가지 상응하는 동종이량체를 1:1:1의 비율로 혼합하였다. 마지막으로, 2㎍/㎕ bsAb 용액을 사용하여 연속 희석을 수행하여 동종이량체 수준이 0.1% 내지 10% 범위인 일련의 스파이크-인 표준을 준비하였다.

SCX에 의한 bsAb 약물 물질로부터 bsAb의 정제. 각각의 bsAb 샘플로부터 bsAb의 추가 정제를 위해, 포토다이오드 어레이(PDA) 검출기가 장착된 Waters I-클래스 UPLC 시스템(Waters, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재) 상에서 분석 강 양이온 교환 크로마토그래피(SCX)를 수행하였다. 샘플 주입 전에, 칼럼 구획 온도를 45℃로 설정하고 0.4 ㎖/분의 유속으로 이동상 A(20mM 아세트산암모늄, 20mM 아세트산을 이용하여 pH를 5.6으로 조정함)를 이용하여 YMC-BioPro SP-F 강 양이온 교환 칼럼(100㎜×4.6㎜, 5㎛)(YMC 컴퍼니 리미티드(YMC Co., LTD.), 일본 교토 소재)을 미리 조정하였다. 단백질 샘플의 분취량(200㎍)의 주입시, 100% 이동상 A에서 2분 동안, 그 다음 16분 내에 100% 이동상 B(140mM 아세트산암모늄, 10mM 중탄산암모늄, pH 7.4)로 선형 증가시킴으로써 구배를 유지하였다. 구배를 100% 이동상 B에서 4분 동안 유지한 다음, 100% 이동상 A로 되돌려 다음 주입 전에 7분 동안 칼럼을 재조정하였다. 그 다음 분별된 BsAb를 혼합하기 전 쌍형성이 잘못된 동종이량체 샘플과 동일한 완충액으로 완충액을 교환하여 스파이크-인 표준을 준비하였다.

MM-SEC-MS 방법. 포토다이오드 어레이(PDA) 검출기가 장착된 Waters I-클래스 UPLC 시스템(Waters, 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재) 상에서 혼합형 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. Nanospray Flex™ 이온 공급원이 장착된 써모 이그잭티브 플러스 EMR 질량분석기(써모 피셔 사이언티픽, 독일 브레멘 소재)를 질량 측정에 사용하였다. 샘플 주입 전에, 0.2 ㎖/분의 유속으로 다양한 농도(30mM 내지 450mM)의 아세트산암모늄-기반 및 중탄산암모늄-기반 이동상을 사용하여 칼럼(Waters BEH200 SEC 4.6×300㎜, 200Å, 1.7㎛ 또는 Sepax Zenix SEC-300 4.6×300㎜, 300Å, 3㎛)을 미리 평형화시켰다. 이중 용매 시스템(이동상 A: 물; 이동상 B: 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄)을 사용하여 고정된 백분율의 이동상 B에서 실행함으로써 이를 달성하였다. 항체 샘플(2 내지 10㎍)의 주입 시, 등용매 용리 방법을 24분 동안 실행하였다. UV 및 MS 검출을 동시에 가능하게 하기 위해, SEC 분리 후 칼럼 후 스플리터(약 200:1 비율)를 적용하여 나노-ESI-MS 분석을 위해 유량을 약 1 ㎕/분으로 감소시키고, 나머지 높은 유량을 280㎚에서 UV 모니터링을 위해 PDA 검출기로 전환시켰다. 나노-ESI를 달성하는 데 일회용 PicoTip Emitter(비코팅, 팁: 10±1㎛)(뉴 오브젝티브 인코포레이티드, 미국 매사추세츠주 워번 소재)를 사용하였다. 질량 분석을 위해, 분해능을 17,500으로 설정하고, 모세관 스프레이 전압을 1.5 kV로 설정하였으며, 공급원 내 단편화 에너지를 100으로 설정하고, 충돌 에너지를 10으로 설정하였으며, 모세관 온도를 350℃러 설정하고, S-렌즈 RF 수준을 200으로 설정하였으며, HCD 포획 가스 압력을 3으로 설정하였다. 2000 내지 15000 사이의 m/z 범위 윈도우로 질량 스펙트럼을 획득하였다.

실시예 1. MS -호환 완충액을 사용한 SEC 동안 2차 상호작용.

단백질 표면은 매우 이질적이며 실리카-기반 또는 다당류-기반 SEC 칼럼 매트릭스와의 수소 결합(하이드록실, 아민 및 아미드 기), 정전기(하전된 기), 및 소수성(소수성 기) 상호작용에 기여할 수 있는 다수의 상이한 작용기로 이루어진다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상이한 결합 강도를 가지고, SEC 적용에서 사용되는 pH, 온도 및 이동상 조성에 크게 의존한다. 예를 들어, 거의 중성 pH에서 수행될 때, 실리카-기반 SEC 칼럼 유래의 실란올 기는 음으로 하전될 수 있으므로, 염기성 단백질과의 정전기 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 이와 같은 상호작용을 억제하기 위해, 과거에는 중간 정도의 이온 강도(상기 문헌[Goyon et al, 2018]) 또는 낮은 pH(5 미만)(상기 문헌[Pavon et al, 2016])를 갖는 이동상이 종종 요구되었다.

보다 최근에, 실리카 표면 유도체화(예컨대, 짧은 알킬 사슬 또는 작용기의 연결)를 통해, 최신 SEC 칼럼 유래의 잔류 실란올 기를 효과적으로 차폐시킬 수 있으므로, 정전기 상호작용의 존재를 극적으로 감소시킬 수 있다. 그러나, 새로 도입된 화학기는 또한 최근 연구에서 보고된 바와 같이, 단백질 분석물과의 다른 향상된 2차 상호작용(예를 들어, 소수성 상호작용)을 초래할 수 있다(상기 문헌[Yang et al, 2015]; Yan He et al.,　On-line coupling of size exclusion chromatography with mixed-mode liquid chromatography for comprehensive profiling of biopharmaceutical drug product, 1262　Journal of Chromatography A　122-129 (2012)). 아라카와(Arakawa)외 다수에 의해 요약된 바와 같이, 정전기 상호작용은 낮은 염 농도에서 우세한 반면, 소수성 상호작용은 높은 이온 강도 이동상에서, 특히 호프마이스터 시리즈에서 더 높은 순위의 염(도 3 참조)이 사용될 때 선호된다. 온라인 SEC-MS 적용과 호환되는 염의 선택은 일반적으로 제한적이지만(예를 들어, 폼산암모늄, 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄), 단백질 분석물과 칼럼 매트릭스 사이의 상이한 유형의 2차 상호작용은 여전히 염 농도를 다양화함으로써 조절되고 단백질 분리 목적을 위해 탐색될 것이다.

염 농도와 연관된 혼합형 상호작용을 평가하기 위해, 후속 네이티브 MS 분석에 있어서 실현가능한 범위인 30mM에서 300mM까지 다양한 농도의 아세트산암모늄-기반 및 중탄산암모늄-기반 이동상을 사용하여 Waters BEH200 SEC 칼럼 상에서 상이한 표면 특징을 갖는 8가지 항체(IgG1 및 IgG4 하위부류 모두)의 혼합물을 분석하였다. 아세트산암모늄와 중탄산암모늄 사이의 몰비를 14:1로 일정하게 유지시켜 대략 7.4의 pH 값을 달성하였다. 이동상 농도에 대해 추출 이온 크로마토그램(XIC)에 의해 결정된 SEC 보유 시간을 플롯팅함으로써 8가지 mAb의 크로마토그래피 거동을 예시하였다(도 5). 전반적으로, 30mM의 이동상 염 농도를 사용하여 SEC를 수행할 때 8가지 mAb가 가장 잘 분리되었다. 염 농도가 증가함에 따라, 8가지 mAb의 용리 프로파일은 더 수렴되고 분해능이 떨어졌다(도 5의 삽화). 보유 시간에서 이러한 변화는 mAb 분자와 칼럼 매트릭스 사이의 2차 상호작용의 변화에 의해 설명될 수 있다. 한편, 칼럼 매트릭스 유래의 잔류 실란올 기가 pH 7.4에서 음으로 하전됨에 따라, 이들 기는 정전기 상호작용을 통해 양으로 하전된 단백질 표면과 상호작용할 수 있었다. 더 낮은 염 농도가 사용될 때 이러한 상호작용은 향상된다. 반면, mAb 분자와 칼럼 매트릭스 사이의 소수성 상호작용은 더 높은 염 농도가 사용될 때 촉진될 수 있었다. 흥미롭게도, pI 값을 기반으로, 이들 8가지 mAb는 3가지 상이한 그룹으로 분류될 수 있으며, 여기서 보유 시간과 염 농도 사이의 유사한 관계가 관찰되었다. 제1 그룹은 3가지 산성 mAb 분자, 즉 mAb5(pI = 6.3), mAb6(pI 6.4) 및 mAb1(pI = 6.7)을 포함하며, 이는 pH 7.4에서 단백질 표면 상에 더 적은 양 전하를 보유할 것으로 예측되므로, 칼럼 매트릭스와의 가장 적은 정전기 상호작용을 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이들 3가지 분자는 모두 염 농도가 증가함에 따라 보유 시간의 증가 경향을 나타내었으며, 이는 약한 정전기 상호작용이 더 높은 이온 강도에서 제거됨에 따라 소수성 상호작용은 SEC 분리 동안 우세한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 반대로, pH 7.4에서 단백질 표면 상에 더 많은 양 전하를 보유할 것으로 예측되는 3가지 염기성 mAb 분자, 즉 mAb3(pI = 8.0), mAb4(pI = 8.3) 및 mAb8(pI = 7.6)은 모두 염 농도가 증가함에 따라 보유 시간의 감소 경향을 나타내었다. 염 농도와 보유 시간 사이의 이러한 역 상관관계는 주로 지배적인 정전기 상호작용에 기인하였으며, 이는 낮은 염 농도에서 촉진되고 높은 염 농도에서 억제되었다. 마지막으로, 산성 또는 염기성 mAb와 달리, mAb2(pI = 7.3) 및 mAb7(pI = 6.9)은 "중성" 그룹을 나타내며, 이는 단백질 표면 상에서 적당한 양의 양 전하를 보유할 가능성이 있으므로, 칼럼 매트릭스와의 중간 수준의 정전기 상호작용을 나타내었다. 이러한 분자 그룹은 다양한 염 농도(30mM 내지 300mM)에서 상대적으로 변하지 않는 보유 시간을 유지하였다. 이 경우에, 염 농도가 증가함에 따라, 소수성 상호작용의 증가는 정전기 상호작용의 감소에 가까워지고 이에 대해 반작용할 가능성이 있으며, 이는 보유 시간의 변화가 거의 없었다. 이러한 결과는 염 농도를 적절하게 조절함으로써 후속 MS 분석을 위해 SEC 칼럼 상에서 혼합형 상호작용을 사용하여 상이한 항체(예를 들어, bsAb 대 동종이량체)를 분리하거나 부분적으로 분리할 수 있음을 나타내었다.

Waters BEH 칼럼 상에서 낮은 염 농도에서 더 큰 크로마노그래피 분해능이 달성되는 것으로 보이지만, 이러한 조건 하에서 심각한 피크 테일링이 발생할 수 있고 단백질 회수에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, 염기성 mAb에 대해 주의해야 한다(Alexandre Goyon et al.,　Characterization of 30 therapeutic antibodies and related products by size exclusion chromatography: Feasibility assessment for future mass spectrometry hyphenation, 1065-1066　Journal of Chromatography B　35-43 (2017)).

실시예 2. MM-SEC-MS를 사용한 이중특이적 항체 이중특이적 Ab의 O- 글리칸 변이체의 검출

2.1 이중특이적 항체의 샘플 준비

항-CD20× 항-CD3 이중특이적 항체(BsAb1)는 Fc 결합을 감소시키기 위해 변형된 IgG4 아이소타입을 기반으로 한 힌지-안정화된 CD20×CD3 이중특이적 전장 항체(Ab)이다. 이는 (CD3을 통해) T 세포 및 CD20-발현 세포에 결합하도록 설계된다. 문헌[Smith et al., Sci. Rep. (2015) 5:17943]에 기재된 바와 같은 방법론을 따름으로써 이중특이적 항체를 생성하였다.

2.2 MM-SEC-MS

상기 기재된 바와 같은 시스템 상의 Zenix SEC-300 MK 칼럼(7.8×300㎚, 3㎛)을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 분석을 등용매 조건으로 수행하였다. 280㎚에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다.

2가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 140mM 아세트산암모늄 및 10mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.4 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다. 이동상을 사용하여 평형화를 수행하였다.

분석 실행에 있어서, 주입 로딩물은 100㎍의 총 단백질로 이루어졌다. 아세트산암모늄(완충액 A) 및 중탄산암모늄(완충액 B)로 이루어진 등용매 구배를 사용하여 용리를 수행하였다. 프로틴 메트릭스(Protein Metrics)의 Intact 소프트웨어를 사용함으로써 질량 분석 데이터를 분석하였다.

상이한 농도의 이동상을 이용한 2가지 실행은 상이한 이동상에서 이중특이적 항체의 용리 시간으로부터 관찰된 바와 같이 더 높은 염 농도가 SEC 분리 동안 소수성 상호작용을 향상시킬 수 있음을 나타내었다. 이러한 효과는 이중특이적 항체와 이의 O-글리칸 변이체 사이의 분리 증가를 야기하였다(도 6 참조).

실시예 3. Zenix SEC-300, 3㎛ , 300Å, 7.8× 300㎜를 사용한 동종이량 체 종의 검출

3.1 이중특이적 항체 및 동종이량체 혼합물 표준의 샘플 준비

이중특이적 항체(BsAb1)(Fc*/Fc): 동종이량체 1(Fc*-Fc*) 및 동종이량체 2(Fc/Fc)의 생산 동안 2가지 동종이량체 불순물을 생성하였다(도 2 참조).

3.2 MM-SEC-MS

상기 기재된 바와 같은 시스템 상의 Zenix SEC-300 MK 칼럼(7.8×300㎚, 3㎛)을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 획득을 등용매 조건으로 수행하였다. 280㎚에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다.

2가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 140mM 아세트산암모늄 및 10mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.4 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다.

분석 실행에 있어서, 주입 로딩물은 50㎍의 총 단백질로 이루어졌다. 아세트산암모늄(완충액 A) 및 중탄산암모늄(완충액 B)로 이루어진 등용매 구배를 사용하여 용리를 수행하였다. 2.2에서 수득한 결과와 유사하게, 상이한 농도의 이동상을 이용한 2가지 실행은 상이한 이동상에서 이중특이적 항체 및 동종이량체의 용리 시간으로부터 관찰된 바와 같이 더 높은 염 농도가 SEC 분리 동안 소수성 상호작용을 향상시킬 수 있음을 나타내었다. 총 염 농도가 450mM인 이동상은 이중특이적 항체로부터 동종이량체 1 및 동종이량체 2의 개선된 분리를 수행하였다(도 7 참조).

실시예 4. MM-SEC-MS, SEC-MS 및 RP LC-MS를 사용한 이중특이적 항체에서 동종이량체 불순물의 검출 비교.

4.1 이중특이적 항체 및 동종이량체 혼합물 표준의 샘플 준비

실시예 3에 예시된 방법론을 사용하여 샘플을 준비하였다.

4.2 RP LC-MS

샘플을 0.5 ㎎/㎖로 희석하였다. LC-MS 분석을 위해 이 용액을 0.5㎍으로 주입하였다. 써모피셔 퓨전 루모스 트리브리드(ThermoFisher Fusion Lumos Tribrid) 질량분석기 상에서 LC-MS 실험을 수행하였다. Waters BioResolveTM mAb 폴리페닐, 450Å, 2.7㎛ 2.1×50㎜ 칼럼(P.N. 186008944)을 역상 분리에 사용하였다. 샘플 온도를 5℃로 설정하고 칼럼 온도를 80℃로 설정하였다. 이동상 A는 수 중 0.1% FA이었고, 이동상 B는 아세토나이트릴 중 0.1% FA이었다. 질량 분석 실험을 양성 모드로 수행하였다. MS 이온 공급원 조건을 다음과 같이 설정하였다: 스프레이 전압 3.8 kV, 이온 전달 튜브 온도 325℃, 기화 온도 250℃, 시스(sheath) 가스 40(Arb), 옥스(Aux) 가스 10(Arb), 스위프 가스 2(Arb), RF 렌즈(%) 60 및 공급원 단편화 에너지 40 V. m/z 범위가 1500 내지 4000인 높은 질량 범위 모드에서 오비트랩에 의해 MS 데이터를 획득하였다. 해상도를 10 마이크로스캔으로 m/z 200에서 15,000으로 설정하였고, AGC 표적은 10⁵, 최대 주입 시간은 50 ms이었다. Xaclibur 소프트웨어를 사용함으로써 질량 분석 데이터를 분석하였다.

4.3 SEC-MS

140mM 아세트산암모늄 및 10mM 중탄산암모늄을 포함한 이동상을 사용하여 ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼(200Å, 1.7㎛, 4.6㎜×300㎜) 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하였다. Waters Acquity UPLC I-클래스 시스템 상에서 실온에서 SEC 실험을 수행하였고, 이때 검출 파장은 280㎚이고, 유속은 0.2 ㎖/분이며, 단백질 주입 로딩량은 50㎍이었다.

4.4 MM-SEC-MS

실시예 3.2에 예시된 방법론을 사용하여 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄을 포함하는 이동상을 사용하여 MM-SEC-MS 시스템 상에서 분석 실행을 등용매 조건으로 수행하였다.

4.5 결과

루모스 상의 RP LC-MS(도 8 참조), EMR 상의 SEC-MS, 및 EMR 상의 MM-SEC-MS에 대한 총 이온 크로마토그래피(TIC) 및 네이티브 MS 스펙트럼의 비교는 이중특이적 항체로부터 동종이량체의 상당한 분리 및 검출을 나타낸다. RP LC-MS로부터의 미가공 질량 스페트로그램은 동종이량체와 이중특이적 항체를 구별할 수 없었다. SEC-MS로부터의 미가공 질량 스펙트럼은 동종이량체 1과 이중특이적 항체를 분리 및 검출할 수 있었지만, 분리는 동종이량체 2와 이중특이적 항체를 분리 및 검출하기에 충분하지 않았다. MM-SEC-MS로부터의 미가공 질량 스펙트럼만 동종이량체 1, 동종이량체 2 및 이중특이적 항체의 충분한 분리 및 검출을 나타내었다. 이러한 비교는 바이오의약 제품에서 불순물의 검출에 있어 SEC-MS 및 RP LC-MS보다 MM-SEC-MS의 우수성에 대한 개념 증명을 제공한다.

실시예 5. Zenix SEC-300, 3㎛ , 300Å, 7.8×3 00㎜를 사용한 MM-SEC-MS 검출의 연속 실행

연속 실행에서 검출 데이터 품질을 평가하기 위해, 이중특이적 Ab, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2(4.1에 예시된 바와 같이 준비함)를 포함하는 샘플의 3가지 분석 실행을 MM-SEC-MS 시스템을 사용하여 수행하였다. 4.2에 예시된 방법론 및 280mM 아세트산암모늄 및 20mM 중탄산암모늄을 포함하는 이동상을 사용하여 분석 실행을 수행하였다.

3가지 실행에 대한 미가공 질량 스펙트럼 및 추출 이온 크로마토그램(XIC)은 데이터 품질 및 신호 대 잡음비의 감소를 나타내었다(도 9 참조). 이러한 효과는 MS 강도를 보장하기 위해 다량의 단백질 샘플(약 50㎍)을 필요로 하는 대형 칼럼(7.8×300㎜)의 사용으로 인한 것일 수 있으며, 이는 높은 염 농도에서 단백질 침전을 야기할 수 있고, 따라서 유동 경로의 보다 빈번한 세정을 필요로 한다(세정 전 최대 3회의 샘플 실행).

또한, 나노스플리터가 처리할 수 있는 대형 칼럼 및 비교적 낮은 유속(최대 약 0.4 ㎖/분)은 광범위한 피크 폭(약 1.5분)을 야기하였고, 이는 일부 경우에 MS 강도 및 분해능에 영향을 미친다. 늦은 용리 시간은 또한 전반적인 분석 시간을 느리게 한다(각각의 샘플 당 30분).

실시예 6. Zenix SEC-300, 3㎛ , 300Å, 4.6×3 00㎜를 사용한 동종이량체 종의 검출

6.1 이중특이적 항체 및 동종이량체 혼합물 표준의 샘플 준비

3.1에 예시된 방법에 의해 이중특이적 항체 및 동종이량체 혼합물 표준을 준비할 수 있다.

6.2 MM-SEC-MS

상기 기재된 바와 같은 시스템 상의 Zenix SEC-300 MK 칼럼(4.6×300㎚, 3㎛)을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 획득을 등용매 조건으로 수행하였다. 280㎚에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다.

4가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 140mM 아세트산암모늄 및 10mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 280mM 아세트산암모늄 및 20mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제3 실험에서 이동상은 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 560mM 아세트산암모늄 및 40mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.3 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다.

분석 실행에 있어서, 주입 로딩물은 10㎍의 단백질로 이루어졌다. 아세트산암모늄(완충액 A) 및 중탄산암모늄(완충액 B)으로 이루어진 등용매 구배를 사용하여 용리를 수행하였다. 150mM 총 염 농도를 초과하는 농도의 사용은 동종이량체 및 이중특이적 항체의 개선된 분리 및 검출을 나타내었다(도 10 참조). 더 큰 칼럼(7.8×300㎚)의 사용시 분석에 대한 총 시간 및 피크 폭과 비교하여 더 작은 칼럼(4.6×300㎚)의 사용시 분석에 대한 총 시간은 약 18분으로 감소하고 피크 폭은 1분 미만으로 감소하였다. 차이의 도식은 도 11에 나타내어져 있다.

실시예 7. Zenix-SEC 칼럼 상에서 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동 종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 MM-SEC-MS 분석

7.1 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 준비

각각의 단백질을 45℃에서 1시간 동안 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F; 단백질 10㎍ 당 1 IUB 밀리유닛)로 처리하여 각각의 중쇄 불변 영역으로부터 글리칸 사슬을 완전히 제거하였다.

7.2 MM-SEC-MS

6가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 9.3mM 아세트산암모늄 및 0.7mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 46.7mM 아세트산암모늄 및 3.3mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제3 실험에서 이동상은 93.3mM 아세트산암모늄 및 6.7mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제4 실험에서 이동상은 186.7mM 아세트산암모늄 및 13.3mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제5 실험에서 이동상은 280mM 아세트산암모늄 및 20mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제6 실험에서 이동상은 420mM 아세트산암모늄 및 30mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.3 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다.

분석 실행에 있어서, 주입 로딩물은 10㎍의 단백질로 이루어졌다.

10mM 총 염 농도의 사용은 동종이량체 1, 이중특이적 항체, 및 동종이량체 2의 상당한 분리를 나타낸다. 10mM 염 농도에서, 동종이량체 2는 이중특이적 항체보다 더 늦은 보유 시간을 가졌으며, 이중특이적 항체는 동종이량체 1보다 더 늦은 보유 시간을 나타내었다. 그러나, 10mM 초과의 농도에서, 동종이량체 1은 이중특이적 항체보다 더 늦은 보유 시간을 가졌으며, 이중특이적 항체는 동종이량체 2보다 더 느린 보유 시간을 나타내었다(도 12 및 도 13 참조). 이러한 효과는 사용되는 크기 배제 크로마토그래피 수지와 상이한 유형의 상호작용, 즉 3가지 단백질의 전하, 형상, 또는 소수성에 기인한 것일 수 있다. 주어진 염 농도에서 단백질 상의 전하는 pI 값에 따라 다르다(표 2). 10mM의 낮은 염 농도를 갖는 이동상을 사용함으로써 또는 100mM 초과의 높은 염 농도를 갖는 이동상을 사용함으로써 상당한 분리가 얻어졌다. 더 낮은 염 농도에서, 전하-전하 상호작용에 의해 보유가 유도될 수 있다. 예를 들어, MM-SEC-MS 시스템에서 더 낮은 염 농도를 갖는 이동상을 사용함으로써 염기성 분자를 분리할 수 있다. 더 높은 염 농도에서, 보유는 소수성 상호작용에 의해 유도된다. 예를 들어, MM-SEC-MS 시스템에서 더 높은 염 농도를 갖는 이동상을 사용함으로써 산성 또는 소수성 분자를 분리할 수 있다(도 14 및 도 15 참조).

이상적인 SEC 분리는 단백질의 유체역학적 부피만을 기반으로 하여야 하며, 단백질과 고정상 사이의 다른 상호작용은 필요하지 않아야 한다. 실리카-기반 칼럼 매트릭스는 실란올 기(이온-교환 특징)로 인해 음 전하를 나타낼 수 있으므로, 실리카 입자의 유도체화는 실란올 효과를 감소시키는 데 도움이 되지만 동시에 새로운 상호작용 메커니즘(소수성)을 도입할 수 있다. 따라서, 이는 Zenix SEC-칼럼으로 관찰된 바와 같이, 기능성을 갖는 SEC 수지를 생성할 수 있다. 이는 Zenix-SEC 칼럼에서 수행될 때 농도가 상이한 단백질의 용리 순서의 차이를 설명한다.

실시예 8. Waters BEH SEC 칼럼 상에서 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 MM-SEC-MS 분석

8.1 이중특이적 항체, 동종이량체 1, 및 동종이량체 2의 탈글리코실화 혼합물의 준비.

7.1과 동일한 방법론을 사용하여 탈글리코실화 혼합물을 준비하였다.

8.2 MM-SEC-MS

상기 기재된 바와 같은 시스템 상의 Waters BEH SEC 칼럼을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 획득을 등용매 조건으로 수행하였다. 280㎚에서 UV에 의해 용리를 모니터링하였다.

6가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 14mM 아세트산암모늄 및 1mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 18.7mM 아세트산암모늄 및 1.3mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제3 실험에서 이동상은 28mM 아세트산암모늄 및 2mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제4 실험에서 이동상은 70mM 아세트산암모늄 및 5mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제5 실험에서 이동상은 93.3mM 아세트산암모늄 및 6.7mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제6 실험에서 이동상은 280mM 아세트산암모늄 및 20mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.2 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다.

15mM 총 염 농도의 사용은 동종이량체 1, 이중특이적 항체, 및 동종이량체 2의 상당한 분리를 나타낸다. 15mM 염 농도에서, 동종이량체 2는 이중특이적 항체보다 더 이른 보유 시간을 가졌으며, 이중특이적 항체는 동종이량체 1보다 더 이른 보유 시간을 나타내었다. 이동상의 농도를 증가시키면, 보유 시간의 차이가 감소하였다. 또한, 이동상의 300mM의 염 농도에서, 동종이량체 1은 이중특이적 항체보다 더 이른 보유 시간을 가졌으며, 이중특이적 항체는 동종이량체 2보다 더 이른 보유 시간을 나타내었다(도 16 및 도 17 참조). 도 14 및 도 15에 기재된 바와 같이, 이러한 효과는 SEC 칼럼 상의 추가적인 상호작용의 발생에 기인한다. 추가적인 상호작용은 이동상의 염 농도에 따라 다르다. 더 낮은 농도에서, 전하-전하 상호작용이 칼럼에서 우세하며, 칼럼에서 단백질의 보유를 결정한다.

실시예 9. Waters BEH SEC 칼럼 상에서 IgG1 분자 및 이의 산화 변이체의 MM-SEC-MS 분석

9.1 IgG1 분자의 산화 변이체, 즉 Ab1의 준비

Ab1을 45℃에서 1시간 동안 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F; 단백질 10㎍ 당 1 IUB 밀리유닛)로 처리하여 각각의 중쇄 불변 영역으로부터 글리칸 사슬을 완전히 제거하였다.

9.2 MM-SEC-MS

3가지 세트의 실험을 수행하였다. 제1 실험에서 이동상은 93.3mM 아세트산암모늄 및 6.7mM 중탄산암모늄을 포함하였고, 제2 실험에서 이동상은 140mM 아세트산암모늄 및 10mM 중탄산암모늄을 포함하였으며, 제3 실험, 제6 실험에서 이동상은 280mM 아세트산암모늄 및 20mM 중탄산암모늄을 포함하였다. 0.2 ㎖/분의 유속으로 용리를 수행하였다.

이동상의 100mM, 150mM, 및 300mM 염 농도의 사용시 MM-SEC-MS 시스템에서 항체 Ab1 및 이의 산화 변이체의 상당한 분리가 있었다(도 18, 상단 패널 참조). IgG1 항체 Ab1의 pI는 8.65이다. PI가 더 높은 IgG1 분자의 경우, 전하 상호작용은 낮은 pI 값을 갖는 IgG4 분자와 비교하여 보다 지배적인 역할을 한다.

실시예 10. Waters BEH SEC 칼럼 상에서 IgG1 분자의 MM-SEC-MS 분석

10.1 IgG1 분자, 즉 Ab2의 준비

Ab2를 45℃에서 1시간 동안 펩타이드 N-글리코시다제 F(PNGase F; 단백질 10㎍ 당 1 IUB 밀리유닛)로 처리하여 각각의 중쇄 불변 영역으로부터 글리칸 사슬을 완전히 제거하였다.

10.2 MM-SEC-MS

실시예 8.2에 기재된 바와 같은 시스템 상의 Waters BEH SEC 칼럼을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 획득을 등용매 조건으로 수행하였다. 2가지 IgG1 분자, 즉 Ab1 및 Ab2의 보유 시간을 비교하면, Ab2 분자가 더 낮은 보유 시간을 갖는 것으로 관찰되었다(도 18, 하단 패널 참조).

이는 Ab1과 Ab2 사이의 소수성 차이로 인한 것으로 설명될 수 있다. 보다 소수성인 분자의 경우, "염석" 효과는 덜 소수성인 분자와 비교하여 더 낮은 염 농도에서 발생하기 시작한다. 이 지점은 또한 전이점으로 지칭된다(도 19 참조).

실시예 11. MM-SEC-MS를 사용하여 이중특이적 항체에서 동종이량체 불순물의 정량화

도 20에 예시된 방법론을 사용하여 표준을 생성하였다.

기재된 바와 같은 시스템 상의 Zenix SEC-300 MK 칼럼(4.6×300㎚, 3㎛) 칼럼을 사용하여 MM-SEC-MS를 사용하는 획득을 등용매 조건으로 수행하였다. 300mM 염 농도 및 70mM 염 농도를 갖는 이동상을 사용하여 단백질을 용리시켰다. 온전한 수준뿐만 아니라 서브유닛 수준에서 농도 둘 다에 대하여, 동종이량체의 양이 더 많은 샘플에서 MM-SEC-MS를 사용한 더 높은 검출이 관찰되었다(도 21 및 도 22 참조). 이동상에 대한 70mM 염 농도에서, 이중특이적 항체의 추가적인 Fc 불순물이 또한 검출되었다.

온전한 수준에서, 동종이량체 1/이중특이적 항체 이론값 대 동종이량체 1/이중특이적 항체 검출값의 플롯, 및 동종이량체 2/이중특이적 항체 이론값 대 동종이량체 2/이중특이적 항체 검출값의 플롯은 0.1% 내지 50%로 존재하는 동종이량체의 정량화에 대하여 우수한 선형성을 나타내었다(도 23 참조).

서브유닛 수준에서, 동종이량체 1/이중특이적 항체 이론값 대 동종이량체 1/이중특이적 항체 검출값의 플롯 및 동종이량체 2/이중특이적 항체 이론값 대 동종이량체 2/이중특이적 항체 검출값의 플롯은 0.1% 내지 50%로 존재하는 동종이량체의 정량화에 대하여 우수한 선형성을 나타내었다(도 24 참조). 온전한 수준과 비교하여, 서브유닛 수준에서 더 우수한 정확도를 얻었다.

실시예 12. 네이티브 MS 검출에 대한 이중특이성 및 동종이량체 항체의 혼합형 SEC 분리.

상이한 pI 값 및 소수성을 갖는 4가지 bsAb 분자(표 3)를 이의 상응하는 동종이량체와 혼합하고 테스트 표준으로 사용하였다. 각각의 bsAb 분자(HH*L2)는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 상이한 중쇄(HC 및 HC*)를 포함하는 반면, 각각의 동종이량체 항체(H2L2 또는 H*2L2)는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄(HC 또는 HC*)를 포함한다.

* HIC에 의해 분석된 단백질 분자의 보유 시간을 기준으로 명백한 HIC 보유 인자를 계산하였다. YMC BioPro HIC BF 칼럼(4㎛, 100㎜×4.6㎜)에 3.3 M 암모늄 완충액의 이동상 "A" 및 물의 이동상 B를 적용하였다. 0.4 ㎖/분의 유속으로 18분 내에 100%에서 97% A로 구배를 수행하였다. 18분에 걸친 보유 시간을 10의 척도로 정규화함으로써 명백한 HIC 보유 인자를 계산하였다.

그 후 4가지 bsAb 혼합물을 3가지 상이한 염 농도(75mM, 150mM, 및 300mM)를 사용하는 Waters BEH 칼럼 상에서 분석한 다음, 온라인 네이티브 MS 검출을 수행하였다. 생성된 기본 피크 크로마토그램(BPC)은 도 25의 좌측 패널에 나타내어져 있다. 이전 연구의 관찰과 일치하여, 염 농도가 증가함에 따라, pI 값이 상이한 mAb 분자는 보유 시간에서 상이한 경향을 나타내었다. 따라서 다양한 염 농도에서 각각의 항체의 상이한 보유 거동을 이용하여, 본 발명자들은 염 농도를 조절함으로써 bsAb로부터 동종이량체를 분리할 수 있는 가능성을 조사하였다. 예를 들어, bsAb2 혼합물에서, 염 농도가 300　mM에서 75mM로 감소함에 따라, 2가지 산성 분자, 즉 H2L2 동종이량체(pI = 6.1) 및 HH*L2 bsAb(pI = 6.5)는, 아마도 낮은 염 농도에서 소수성 상호작용의 감소 및 낮은 정전기 상호작용으로 인해, 둘 다 보다 일찍 용리되었다. 대조적으로, 중성 분자인 H*2L2 동종이량체(pI = 7.2)는 염 농도가 조절됨에 따라 보유 시간에서 거의 변하지 않은 상태를 유지하였는데, 이는 소수성 상호작용의 감소가 낮은 염 농도에서 정전기 상호작용 향상에 의해 반작용이 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 추가적으로, H2L2 동종이량체가 HH*L2 bsAb와 비교하여 보유 시간에서 더 큰 감소를 나타내었으므로(이는 아마도 더 낮은 pI 값과 이에 따른 더 약한 정전기 상호작용으로 인한 것임), 2가지 사이의 개선된 분리가 또한 더 낮은 염 농도에서 달성되었다. 결과적으로, 두 동종이량체와 bsAb2 사이의 우수한 크로마토그래피 분리가 75mM 염 농도에서 달성되었다.

유사하게, bsAb3과 이의 2가지 동종이량체 사이의 분리는 또한 염 농도가 300mM에서 75mM로 감소했을 때에도 상당히 개선되었다. 이는 H2L2 동종이량체(pI = 6.6), HH*L2 bsAb(pI = 7.4) 및 H*2L2 동종이량체(pI = 8.3)의 보유 시간이 각각 감소하였거나, 변하지 않았거나, 증가하였기 때문이다. 2가지 예 중 어느 하나에 대해 기준선 분해능이 달성되지 않았지만, 동종이량체의 식별 및 정량화는 검출기로서 MS의 높은 특이성으로 인해 UV-기반 정량화에서와 같이 공동 용리시키는 종에 의해 크기 영향을 받지 않아야 한다는 것이 주목할 만하다.

bsAb5 혼합물에서, 고염 조건에 비하여 BEH 칼럼 상의 75mM 염 농도에서 보다 우수한 분리가 다시 달성되었다. 이는 상대적으로 염기성인 분자, 즉 HH*L2 bsAb(pI= 8.1) 및 H*2L2 동종이량체(pI = 8.5)가 둘 다 점점 더 늦은 보유 시간을 나타낸 반면, 상대적으로 중성인 H2L2 동종이량체(pI = 7.4)는 염 농도가 감소함에 따라 보유 시간에서 변화를 나타내지 않았기 때문이다. 그러나, 우수한 크로마토그래피 분리에도 불구하고, 높은 염기도로 인해, 낮은 염 농도에서 H*2L2 동종이량체에 대해 피크 테일링 및 단백질 회수 손실이 일어나기 시작하므로, 이러한 조건은 동종이량체 정량화에 이상적이지 않았다. 더욱이, bsAb4 혼합물은 300mM에서 75mM로 염 농도를 감소시킴으로써 개선된 분리를 달성할 수 없음을 입증하였다. 이는 3가지 분자 모두 거의 중성의 pI를 가지므로(표 3), 해당하는 염 농도 변화와 유사한 보유 거동을 나타내기 때문일 수 있다. 염 농도를 더 낮추어 정전기 상호작용을 향상시키면 분리를 개선시킬 수 있지만, 심각한 피크 테일링이 일어날 가능성이 높아 정량화를 약화시킬 것이다. 또한 염 농도가 증가함에 따라 bsAb4 혼합물의 용리 프로파일이 넓어졌다는 것에 주목하는 것도 흥미롭다. 300mM 염 농도에서, 3가지 분자의 용리 순서는 XIC에 의해(데이터는 나타내지 않음) H*2L2 동종이량체, HH*L2 bsAb, 및 H2L2 동종이량체인 것으로 결정되었으며, 이는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 결정된 소수성 순위와 일치하였다(표 3). 따라서, 훨씬 더 높은 염 농도를 사용함으로써 소수성 상호작용을 더 향상시키면 이러한 칼럼에서 bsAb4 혼합물의 분리를 개선시킬 가능성이 있을 것이다. 불행하게도, 본 발명자들의 경험을 기반으로 하면, 300mM보다 더 높은 염 농도는 보통 탈용매화 문제를 일으키고 네이티브 MS 감도를 크게 손상시킨다.

MS 분석에 유리한 염 농도를 사용하면서 bsAb 혼합물의 분리를 추가로 검사하기 위해, Sepax Zenix SEC-300 칼럼을 혼합형 상호작용에 대해 평가하였다. 이 칼럼에서 3㎛ 실리카 비드는 화학적으로 결합된 스탠드-업(stand-up) 단층으로 코팅되어 있으며, 이는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 이러한 칼럼의 중간 소수성에 기여할 가능성이 있다(상기 문헌[Yang et al, 2016]; 상기 문헌[Wong et al]; 상기 문헌[Pavon et al]). 150mM 및 300mM 염 농도에서, 4가지 bsAb 혼합물 각각을 후속 네이티브 MS 검출을 위해 이 칼럼에서 분리하였고, 생성된 BPC는 도 25의 우측 패널에 나타내어져 있다. 예측된 바와 같이, bsAb4 혼합물은 동일한 염 농도에서 작동했을 때 BEH 칼럼과 비교하여 Zenix 칼럼 상에서 개선된 분리를 나타내었다. 3가지 분자의 용리 순서는 또한 이들 분자의 상대적 소수성과 일치하였으며, 가장 소수성이 강한 H2L2 동종이량체가 가장 나중에 용리되었다. bsAb4 혼합물의 크로마토그래피 분해능은 150mM에서와 비교하여 300mM 염 농도에서 추가로 개선되었음에 주목하며, 이는 더 높은 염 농도가 소수성 상호작용을 촉진시키는 것으로 예상된다. 추가적으로, bsAb5 혼합물은 BEH 칼럼과 비교하여 Zenix 칼럼 상에서 더 효과적으로 분해되었는데, 이는 아마도 혼합물 구성요소 간의 칼럼 매트릭스와 소수성 상호작용의 큰 차이에 기인할 것이다. 요약하면, 상이한 특성을 갖는 2가지 SEC 칼럼 상에서 염 농도를 조절함으로써, 본 발명자들은 후속 네이티브 MS 검출에 유리한 염 농도에서 4가지 모든 bsAb 혼합물에 대하여 우수한 크로마토그래피 분리를 달성할 수 있음을 입증한다. 또한 본 연구에서 테스트하지 않은 다른 SEC 칼럼은 신규한 혼합형 상호작용을 제공함으로써 이러한 방법의 적용가능성을 추가로 확장시킬 수 있을 것이다.

실시예 13. 네이티브 MM-SEC-MS에 의한 동종이량체 불순물의 정량화.

MS-기반 접근법에 의한 상대적 정량화는 종종 각각의 분석물로부터 MS 반응의 잘 특성화된 이해(예를 들어, 이온화 효율 및 이온 전달 효율)를 필요로 한다. 유사한 크기로 인해, bsAb 및 동종이량체는 네이티브 MS 분석 동안 유사한 이온 전달 효율을 나타내어야 한다. 반면, 이온화 효율은 용리시 용매 조성물 및 공동 용리 종의 존재 둘 다에 의해 영향을 받을 수 있었다. MM-SEC-MS 방법은 등용매 용리를 이용하므로, 구배 용리 방법(예를 들어, IEX-MS)에서 일반적으로 볼 수 있는 바와 같은 상이한 용매 조성으로 인한 이온화에 대한 영향을 제거할 수 있다. 동종이량체 불순물의 상대적 정량화를 평가하기 위해 MM-SEC-MS 방법의 성능을 평가하기 위하여, 상대적 풍부도가 0.1% 내지 10% 범위의 동종이량체 불순물을 포함하는 일련의 bsAb2 스파이크-인 샘플을 분석을 위해 준비하였다. 75mM 염 농도 이동상을 사용하여 Waters BEH 칼럼을 적용하여 BsAb2와 상응하는 동종이량체 사이의 MM-SEC 분리를 달성하였다. bsAb2 샘플 내에 존재하는 각각의 동종이량체의 상대적인 정량화를 평가하기 위해, 동종이량체 종 또는 bsAb2의 가장 풍부한 4가지 전하 상태의 m/z를 기반으로 하는 XIC를 생성하고 피크 영역을 통합하여 각각의 동종이량체의 양의 정량화에 사용하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 0.1% 내지 10% 범위의 동종이량체 불순물의 신뢰성있는 정량화를 이 방법에 의해 용이하게 달성할 수 있다. 추가적으로, 심지어 0.1% 스파이크-인 수준에서도, H2L2 및 H*2L2 동종이량체 종 둘 다의 고품질 네이티브 질량 스펙트럼을 여전히 얻을 수 있으므로(도 27, 우측 패널), 높은 신뢰도 식별 및 정량화를 야기할 수 있다.

신규한 MM-SEC-MS 방법을 개발하였고, 이를 bsAb 샘플 중 동종이량체 불순물의 고감도 검출 및 정량화에 대하여 평가하였다. 본 발명자들은 먼저 상이한 염 농도에서 SEC 분리 동안 항체 분자 및 칼럼 매트릭스 사이의 혼합형 상호작용을 조사하였다. 다양한 pI의 8가지 별개의 항체를 사용하여, 정의된 pH 조건 하에서, 염기성 분자는 산성 분자와 비교하여 칼럼 매트릭스와 더 강한 정전기 상호작용을 나타내었고, 이와 같은 상호작용은 염 농도를 낮춤으로써 향상될 수 있음을 관찰하였다. 반면, SEC 분리 동안 염 농도를 증가시키면, 항체와 칼럼 매트릭스 사이의 소수성 상호작용을 촉진시키면서, 정전기 상호작용을 감소시킬 수 있다. 이러한 혼합형 상호작용은 유사한 유체역학적 부피를 가지지만 상이한 표면 특징을 갖는 항체를 분리하는 데 특별한 기회를 제공한다. 상이한 칼럼 특성을 이용하여, 4가지 bsAb 혼합물의 크로마토그래피 분리를 정전기 상호작용 또는 소수성 상호작용을 사용하는 MM-SEC 방법에 의해 달성하였으며, 이는 염 농도를 조절함으로써 용이하게 달성되었다. 본 발명자들은 또한 달성된 크로마토그래피 분리가 후속 네이티브 MS 분석에 의해 저농도 동종이량체 불순물의 개선된 검출을 얻는 데 중요하다는 것을 입증하였다. 2가지 bsAb 예에서, 0.01%(bsAb2) 및 0.1%(bsAb4)로 존재하는 동종이량체 불순물은 이러한 MM-SEC-MS 방법을 사용하여 성공적으로 검출되었다. 본 발명자들이 아는 한, 이러한 새로운 개발은 bsAb 샘플 중 동종이량체 불순물을 검출하는 데 가장 민감한 방법을 나타낸다. 마지막으로, 일련의 스파이크-인 표준을 사용하여, 본 발명자들은 MM-SEC-MS 방법이 다양한 수준으로 존재하는 동종이량체 불순물의 신뢰성있는 정량화를 제공할 수 있음을 입증하였다. 높은 감도로 인해, 심지어 0.1%의 낮은 수준에서도 높은 신뢰도 식별 및 정량화를 얻을 수 있다. 요약하면, 이러한 새로 개발된 MM-SEC-MS 방법은 bsAb 샘플 중 동종이량체 불순물의 검출 및 정량화에 대해 매우 민감한 접근법을 제공하므로, 치료용 bsAb 개발을 지원하는 데 사용될 수 있다. 마지막으로, 이러한 방법의 적용은 공동 제형화 치료제에 존재하는 항체 혼합물의 특성화와 같은 다른 영역으로 확장될 수 있다.

Claims

샘플 중 불순물을 정량화하는 방법으로서,
추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계;
이동상을 사용하여 상기 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및
질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 불순물의 양을 정량화하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불순물을 용리시키는 데 사용되는 이동상은 아세트산암모늄, 중탄산암모늄, 또는 폼산암모늄, 또는 이들의 조합을 갖는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불순물을 용리시키는 데 사용되는 이동상은 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄의 총 농도가 약 600mM 미만인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불순물을 용리시키는 데 사용되는 이동상은 유속이 약 0.2 ㎖/분 내지 약 0.4 ㎖/분인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지 상에 로딩되는 샘플의 양은 약 10㎍ 내지 약 100㎍인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불순물은 생성물-관련 불순물인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 불순물은 동종이량체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 용리될 때 분리되는 불순물 및 적어도 하나의 표적 단백질을 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 표적 단백질은 치료용 항체인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 질량분석기는 크로마토그래피 시스템에 결합된, 방법.
제1항에 있어서, 상기 추가적인 기능성은 소수성 상호작용 기능성인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 추가적인 기능성은 전하-전하 상호작용 기능성인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 질량분석기는 네이티브 질량분석기(native mass spectrometer)인, 방법.
샘플 중 불순물을 검출하는 방법으로서,
추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계;
이동상을 사용하여 상기 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 불순물을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및
질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 불순물을 검출하는 단계
를 포함하는, 방법.
샘플 중 표적 단백질을 정량화하는 방법으로서,
추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계;
이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 표적 단백질을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및
질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 표적 단백질을 정량화하는 단계
를 포함하는, 방법.
샘플 중 표적 단백질을 검출하는 방법으로서,
추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 샘플을 접촉시키는 단계;
이동상을 사용하여 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세척하여 표적 단백질을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및
질량분석기를 사용하여 상기 용리액 중 표적 단백질을 검출하는 단계
를 포함하는, 방법.
혼합형 크로마토그래피 시스템으로서,
추가적인 기능성을 구비한 혼합형 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 칼럼으로서, 이동상 및 표적 단백질을 갖는 샘플을 수용할 수 있는 것인, 상기 크로마토그래피 칼럼, 및
표적 단백질을 검출하기 위해 상기 크로마토그래피 칼럼에 결합된 질량분석기
를 포함하는, 혼합형 크로마토그래피 시스템.