CN107607642B - 一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法 - Google Patents
一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，具体包括以下步骤：1）将烟叶样品，采用三氯乙酸‑丙酮沉淀法、苯酚法分别提取蛋白，再将蛋白合并后复溶，获得蛋白样品溶液；2）将蛋白样品溶液进行酶解、脱盐、干燥，获得肽段干粉作为试样；3）将制备的试样依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测。本发明提供的该种方法，最大程度保留样本中的蛋白，大大提高了色谱的峰容量，具有检测通量高、灵敏度高，鉴定出的蛋白组量多的优点。
Description
技术领域
本发明属于烟草蛋白与蛋白组研究技术领域，涉及一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，具体涉及一种提取、酶解、测定新鲜烟叶中蛋白与蛋白组多维液相色谱质谱联用法。
背景技术
随着各种检测技术发展，蛋白质组的概念于1994年被提出，它是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域。蛋白质组学是从整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，研究蛋白质组是研究认识复杂生命活动的要求。
烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物，同时作为复杂的模式植物，烟草在植物遗传、发育、生理、生化和转基因等领域的研究中有代表性，因此开展烟草蛋白组学研究具有重要意义。
目前，检测烟草中蛋白与蛋白组的方法具有检测通量低、鉴定出的蛋白组量少等缺陷，因此有必要对现有技术进行进一步的研究与探讨，寻找一种更好的提取、鉴定烟草中蛋白与蛋白组的方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，用于解决现有技术中缺乏检测通量高、灵敏度高、鉴定出的蛋白组量多的鉴定烟草中蛋白与蛋白组的方法的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，具体包括以下步骤：
1)将烟叶样品，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法、苯酚法分别提取蛋白，再将蛋白合并后复溶，获得蛋白样品溶液；
2)将步骤1)所得蛋白样品溶液进行酶解、脱盐、干燥，获得肽段干粉作为试样；
3)将步骤2)中制备的试样进行二维液相色谱质谱联用法检测，依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测。
优选地，步骤1)中，所述三氯乙酸-丙酮沉淀法为常规用于提取蛋白的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法。具体来说，所述三氯乙酸-丙酮沉淀法为根据《Sample extractiontechniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；He Y；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)记载的三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法。
优选地，步骤1)中，所述苯酚法为常规用于提取蛋白的苯酚法。具体来说，所述苯酚法为根据《Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis ofplant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；He Y；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)记载的苯酚法进行提取蛋白。
优选地，步骤1)中，所述复溶采用的溶剂为4-8M(mol/L)尿素水溶液。更优选地，所述溶剂为6M(mol/L)尿素水溶液。
优选地，步骤1)中，所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积(μl)与蛋白的质量(mg)之比为体积之比为55-65：1。更优选地，所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积(μl)与蛋白的质量(mg)之比为体积之比为60：1。
优选地，步骤1)中，所述蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，包括以下步骤：
A)将蛋白样品溶液，加入沉淀剂进行旋转混悬后离心，取沉淀物加入溶解剂进行旋转混悬后溶解，再加入显色剂混合后，进行孵育反应，即得待测样品溶液；
B)取一系列不同浓度的蛋白标准溶液，采用与步骤A)相同的处理过程，即得一系列不同浓度的待测标准溶液；
C)将步骤A)中获得的待测样品溶液和步骤B)中获得的待测标准溶液，添加入试剂盒，采用紫外分光光度法(UV)进行吸光度测定，采用标准曲线法进行定量，获得蛋白样品溶液中蛋白的含量。
所述蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，能够测定获得烟叶样品中提取蛋白的含量，从而表明烟叶样品中具有较多的蛋白，为后续进一步鉴定并测定烟叶样品中多组蛋白组及蛋白组中多种蛋白的种类及其含量提供计算基础。
更优选地，步骤A)中，所述沉淀剂为预冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液的预冷温度不大于5℃。
进一步优选地，所述三氯乙酸-丙酮溶液为含有8-12％(体积百分比)三氯乙酸的丙酮溶液。最优选地，所述三氯乙酸-丙酮溶液为含有10％(体积百分比)三氯乙酸的丙酮溶液。
更优选地，步骤A)中，所述蛋白样品溶液与沉淀剂加入的体积之比为1:98-102。进一步优选地，所述蛋白样品溶液与沉淀剂加入的体积之比为1:100。
更优选地，步骤A)中，所述加入沉淀剂进行旋转混悬，是取蛋白样品溶液，先第一次加入沉淀剂在室温下进行旋转混悬后，再第二次加入沉淀剂进行旋转混悬。
上述旋转混悬是指常规的旋转混合，使试剂如沉淀剂、溶解剂等与蛋白样品充分接触、反应。
进一步优选地，所述蛋白样品溶液与第一次加入沉淀剂的体积之比为1:49-51。更进一步优选地，所述蛋白样品溶液与第一次加入沉淀剂的体积之比为1:50。
进一步优选地，所述蛋白样品溶液与第二次加入沉淀剂的体积之比为1:49-51。更进一步优选地，所述蛋白样品溶液与第二次加入沉淀剂的体积之比为1:50。
进一步优选地，所述旋转混悬的时间为2-3分钟。
更优选地，步骤A)中，所述离心的转速为10000-15000g。进一步优选地，所述离心的转速为12000g。所述离心后要弃去上清液，保留沉淀物。
更优选地，步骤A)中，所述离心的次数为2次。
进一步优选地，每次所述离心的时间为4-6分钟。最优选地，每次所述离心的时间为5分钟。
更优选地，步骤A)中，所述溶解剂包括有溶解液和水，所述溶解液、水与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为9-11:39-41:1。
进一步优选地，所述溶解液、水与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为10:40:1。
进一步优选地，所述溶解液为含有0.05-0.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)的4-8M(mol/L)尿素水溶液。更进一步优选地，所述溶解液为含有0.1wt％十二烷基硫酸钠(SDS)的6M(mol/L)尿素水溶液。
进一步优选地，所述水为去离子水。
更优选地，步骤A)中，所述显色剂为BCA蛋白定量试剂盒中配备的显色剂。具体来说，所述显色剂为美国GE公司生产的Amersham 2-D Quant Kit试剂盒中配备用于蛋白标记的显色剂。
更优选地，步骤A)中，所述显色剂与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为1:9-11。进一步优选地，所述显色剂与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为1:10。
更优选地，步骤A)中，所述孵育反应为BCA蛋白定量试剂盒与蛋白进行的反应。
更优选地，步骤A)中，所述孵育反应的时间为10-30分钟。进一步优选地，所述孵育反应的时间为15-20分钟。
更优选地，步骤A)中，所述孵育反应在室温下进行。
上述室温为20-30℃。
更优选地，步骤B)中，所述蛋白标准溶液为牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)标准溶液。所述蛋白标准溶液由BCA蛋白定量试剂盒提供。所述蛋白标准溶液的浓度为2mg/ml。
更优选地，步骤B)中，所述待测标准溶液中蛋白的浓度范围为0-2μg/μl。所述待测标准溶液中包括有空白溶液。
更优选地，步骤C)中，所述试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒。上述BCA蛋白定量试剂盒为美国GE公司生产的Amersham 2-D Quant Kit试剂盒。
更优选地，步骤C)中，所述紫外分光光度法(UV)的检测波长为470-490nm。进一步地，所述紫外分光光度法(UV)的检测波长为480nm。
更优选地，步骤C)中，所述吸光度测定采用水作为参比液。所述水为去离子水。
更优选地，步骤C)中，所述吸光度测定需要在添加显色剂后的40分钟内完成测定。
更优选地，步骤C)中，所述标准曲线法是指将步骤B)获得一系列不同蛋白浓度的待测标准溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值与蛋白浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程，再将步骤A)中获得的待测样品溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值代入标准工作曲线的回归方程，计算得到待测样品溶液中的蛋白浓度。
优选地，步骤2)中，所述酶解的过程为：取蛋白样品溶液，依次加入二硫苏糖醇(DTT)溶液、碘乙酰胺(IAA)溶液进行反应后，转移至超滤管中加入碳酸氢铵溶液进行超滤离心，再加入胰蛋白(Trypsin)酶进行反应后补加胰蛋白(Trypsin)酶继续反应，将反应产物离心后，收集获得肽段溶液。
更优选地，所述二硫苏糖醇溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为1:99-101。进一步优选地，所述二硫苏糖醇溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为1:100。
更优选地，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5-1.5M(mol/L)。进一步优选地，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为1M(mol/L)。所述二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇水溶液。
更优选地，所述二硫苏糖醇溶液加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：2-3h。进一步优选地，所述二硫苏糖醇溶液加入后的反应条件为：反应温度：37℃；反应时间：2.5h。
更优选地，所述碘乙酰胺溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为5:99-101。进一步优选地，所述碘乙酰胺溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为5:100。
更优选地，所述碘乙酰胺溶液的浓度为0.5-1.5M(mol/L)。进一步优选地，所述碘乙酰胺溶液的浓度为1.0M(mol/L)。所述碘乙酰胺溶液为碘乙酰胺(IAA)水溶液。
更优选地，所述碘乙酰胺溶液加入后的反应条件为室温避光反应35-45min。进一步优选地，所述碘乙酰胺溶液加入后的反应条件为20-25℃避光反应40min。
更优选地，所述碳酸氢铵溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为1.5-2.5:1。进一步优选地，所述碳酸氢铵溶液与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为2:1。
更优选地，所述碳酸氢铵溶液的浓度为20-30mM(mmol/L)。进一步优选地，所述碳酸氢铵溶液的浓度为25mM(mmol/L)。所述碳酸氢铵溶液为碳酸氢铵水溶液。
更优选地，所述超滤离心的反应条件为：离心转速：9000-11000g；离心时间：9-11min；离心次数：3-5次。进一步优选地，所述超滤离心的反应条件为：离心转速：10000g；离心时间：10min；离心次数：4次。
更优选地，所述胰蛋白酶与所述蛋白样品溶液加入的质量之比为1:99-101。进一步优选地，所述胰蛋白酶与所述蛋白样品溶液加入的质量之比为1:100。
更优选地，所述胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：3-5h。进一步优选地，所述胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：37℃；反应时间：4h。
更优选地，所述补加胰蛋白酶与所述蛋白样品溶液加入的质量之比为1:49-51。进一步优选地，所述补加胰蛋白酶与所述蛋白样品溶液加入的质量之比为1:50。
更优选地，所述补加胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：15-17h。进一步优选地，所述补加胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：37℃；反应时间：16h。
更优选地，所述离心条件为：离心转速：9000-11000g；离心时间：10-20min。进一步优选地，所述离心条件为：离心转速：10000g；离心时间：15min。
优选地，步骤2)中，所述脱盐是将酶解后获得的肽段溶液过C18固相萃取柱进行脱盐。
优选地，步骤2)中，所述干燥为冻干。
更优选地，所述冻干的温度为≤-80℃。所述冻干进行还原烷基化酶解，提高蛋白覆盖率，能够获得肽段干粉。
优选地，步骤3)中，所述二维液相色谱质谱联用法是指由第一维液相色谱、第二维液相色谱、质谱组成的检测系统对试样进行检测的方法。
优选地，步骤3)中，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：AquityUPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱(内径2.1mm、长度150mm、填料粒径3.5μm、孔径
)；柱温：室温；流速：150-250μl/min；进样量：5-20μl；第一维流动相A相：15-25mM甲酸铵水溶液，pH＝9-11(氨水调节)；第一维流动相B相：15-25mM甲酸铵+85-95v/v％乙腈水溶液，pH＝9-11(氨水调节)；检测波长：210-220nm；梯度洗脱。所述85-95v/v％乙腈水溶液为体积百分比为85-95％的乙腈水溶液。
更优选地，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：Aquity UPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱(内径2.1mm、长度150mm、填料粒径3.5μm、孔径
)；柱温：20-25℃；流速：200μl/min；进样量：10μl；第一维流动相A相：20mM甲酸铵水溶液，pH＝10.0(氨水调节)；第一维流动相B相：20mM甲酸铵+90v/v％乙腈水溶液，pH＝10.0(氨水调节)；检测波长：214nm；梯度洗脱。所述90v/v％乙腈为体积百分比为90％的乙腈水溶液。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-65：35；
40-41min，A相：B相体积比为65：35-95：5；
41-56min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
优选地，步骤3)中，所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：NanoAquity UPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第二维液相色谱柱：Acclaim PepMap C18纳升级反相色谱柱(15cm×75μm、填料粒径3μm、孔径
)；上样流速：5-15μl/min；上样时间：2-4min；进样量：6-10μl；柱温：35-45℃；流速：250-350nL/min；第二维流动相A相：4-6v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.05-0.15v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2-3(甲酸调节)；第二维流动相B相：85-95v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.05-0.15v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2-3(甲酸调节)；梯度洗脱。
更优选地，所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：Nano AquityUPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第二维液相色谱柱：Acclaim PepMap C18纳升级反相色谱柱(15cm×75μm、填料粒径3μm、孔径
)；上样流速：10μl/min；上样时间：3min；进样量：8μl；柱温：40℃；流速：300nL/min；第二维流动相A相：5v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.1v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2.5(甲酸调节)；第二维流动相B相：90v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.1v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2.5(甲酸调节)；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-45min，A相：B相体积比为98：2-60：40；
45-45min，A相：B相体积比为60：40-98：2；
45-60min，A相：B相体积比为98：2-98：2。
优选地，步骤3)中，所述质谱的条件为：质谱系统：LTQ Orbitrap XL系统；离子源：在线纳升级电喷雾离子源(online nano-electrospray ions source)；离子源喷雾电压：1.9kV；加热毛细管温度：200℃；扫描方式：全扫描MS使用Orbitrap进行Profile模式扫描；扫描范围：m/z 300-1800；分辨率：100000(m/z 400处)；Orbitrap离子最大引入时间：500ms，AGC(automatic gain control)控制为1×106；LTQ离子最大引入时间：120ms，AGC控制为2×104；数据采集模式：自动在MS和MS/MS间切换采集；对符合MS/MS条件、强度排名前10的离子使用LTQ进行Centroid模式扫描；对单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行2次MS/MS，之后排除60秒；MS/MS使用35％的碰撞能量碰撞反应30ms，q值设定为0.25。
优选地，步骤3)中，所述质谱的检测结果由搜索引擎通过检索数据库进行比较，鉴定出试样中的多组蛋白组及蛋白组中的多种蛋白。
更优选地，所述搜索引擎通过检索数据库进行搜索的参数条件为：搜索引擎：MASCOTTM(v2.3.2)；实验数据处理软件：Proteome Discoverer软件；检索数据库：NCBI数据库(种属为Nicotiana)；酶切方式：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2；修饰方式：固定修饰为半胱氨酸(Cysteine)的碘乙酰胺烷基化，可变修饰为甲硫氨酸(Methionine)的氧化；误差范围：一级肽段母离子允许误差≤10ppm，二级碎片离子允许误差≤0.6Da，肽段最少含有7个氨基酸；蛋白鉴定标准：离子得分满足肽段假阳性率≤1％，用于降低假阳性结果。
进一步优选地，所述NCBI数据库的版本号为2014_11_10，所述NCBI数据库的扫描序列为104349条序列。
所述ppm为质谱检测中的百万分之一。所述一级肽段母离子允许误差≤10ppm是指一级肽段母离子质荷比允许误差不大于十万分之一。
如上所述，本发明提供的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，通过三氯乙酸(TCA)/丙酮法结合苯酚法对新鲜的烟草叶片进行提取，并进行酶解后获得肽段，采用多维液相色谱质谱联用法(Nano-RPLC)/ESI-MS/MS进行分析，通过第一维高pH反相色谱分离，第二维低pH反相色谱分离后进入电喷雾质谱进行检测后，搜库鉴定。与现有技术相比，第一、采用合并TCA/丙酮法和苯酚法提取出的蛋白质，最大程度保留样本中的蛋白；第二、通过多维液相色谱分离，大大提高了色谱的峰容量；第三、采用LTQ Orbitrap XL电喷雾质谱方法，具有检测通量高、灵敏度高，鉴定出的蛋白组量多的优点。
附图说明
图1显示为本发明中的高pH反相色谱分离色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指相对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
以下实施例中使用的试剂及实验仪器均为常规使用的试剂及实验仪器，均可从市场上购买获得。具体使用试剂和仪器如下：
1、试剂
三氯乙酸、丙酮、苯酚、尿素、十二烷基硫酸钠、碳酸氢铵、甲酸铵、乙腈、甲酸(色谱纯，Sigma公司)；牛血清白蛋白标准溶液(2mg/ml，美国GE公司)；二硫苏糖醇、碘乙酰胺(化学纯，sigma公司)；胰蛋白酶(序列级，sigma公司)；氨水(色谱纯，圣克鲁斯公司)；去离子水(纯水机自制)；Amersham 2-D Quant Kit试剂盒(美国GE公司)。
2、仪器
mini 1240型紫外分光光度计(UV，岛津公司)；
Cartridge C18固相萃取柱(Waters Corporation,Milford,USA)；Aquity UPLC高效液相色谱系统(美国沃特世公司)；Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)；XBridge反相液相色谱柱(内径2.1mm、长度150mm、填料粒径3.5μm、孔径
)(美国沃特世公司)；Nano Aquity UPLC高效液相色谱系统(Waters Corporation,Milford,USA)；Acclaim PepMap C18纳升级反相色谱柱(15cm×75μm、PepMap填料粒径3μm、孔径
)(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)；LTQ Orbitrap XL质谱系统(Thermo Electron Corp.,Bremen,Germany)；在线纳升级电喷雾离子源(MichromBioresources,Auburn,USA)；Proteome Discoverer实验数据处理软件(version 1.4,Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)；MASCOTTM(v2.3.2)搜索引擎(开放数据库)；NCBI数据库(种属为Nicotiana，2014_11_10，104349条序列)(开放数据库)；超滤管(Amicon Ultra Centrifugal Filters，10K，Millipore公司)；5417R型离心机(eppendorf公司)。
实施例1
1、蛋白提取
取新鲜的烟叶样品，采用《Sample extraction techniques for enhancedproteomic analysis of plant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；HeY；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)记载的TCA/丙酮沉淀法、苯酚法分别提取蛋白，再将提取的蛋白合并后加入4-8M尿素水溶液复溶，获得蛋白样品溶液。所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积(μl)与蛋白的质量(mg)之比为体积之比为55-65：1。
蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，先取蛋白样品溶液，加入沉淀剂进行旋转混悬后离心，取沉淀物加入溶解剂进行混悬后溶解，再加入显色剂混合后，进行孵育反应，即得待测样品溶液。其中，蛋白样品溶液与沉淀剂加入的体积之比为1:98-102。加入沉淀剂进行旋转混悬，是取蛋白样品溶液，先第一次加入沉淀剂在室温下进行旋转混悬后，再第二次加入沉淀剂混悬均匀。蛋白样品溶液与第一次加入沉淀剂的体积之比为1:49-51。蛋白样品溶液与第二次加入沉淀剂的体积之比为1:49-51。旋转混悬的时间为2-3分钟。离心的转速为10000-15000g，离心的次数为2次每次所述离心的时间为4-6分钟。溶解剂包括有溶解液和水，溶解液、水与蛋白样品溶液加入的体积之比为9-11:39-41:1。显色剂与蛋白样品溶液加入的体积之比为1:9-11。孵育反应在室温下进行10-30分钟。其中，沉淀剂为预冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液为含有8-12％(体积百分比)三氯乙酸的丙酮溶液，三氯乙酸-丙酮溶液的预冷温度不大于5℃。溶解液为含有0.05-0.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)的4-8M尿素水溶液。显色剂为BCA蛋白定量试剂盒中配备的显色剂。
再取一系列不同浓度的蛋白标准溶液，采用与蛋白样品溶液相同的处理过程，即得一系列不同浓度的待测标准溶液。其中，蛋白标准溶液为牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)标准溶液。蛋白标准溶液的浓度为2mg/ml。待测标准溶液中蛋白的浓度范围为0-2μg/μl。待测标准溶液中包括有空白溶液。
然后将获得的待测样品溶液和获得的待测标准溶液，添加入试剂盒，采用紫外分光光度法进行吸光度测定，采用标准曲线法进行定量，获得蛋白样品溶液中蛋白的含量。其中，试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒。紫外分光光度法的检测波长为470-490nm。吸光度测定采用水作为参比液。吸光度测定需要在添加显色剂后的40分钟内完成测定。
标准曲线法是指将获得一系列不同蛋白浓度的待测标准溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值与蛋白浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程，再将获得的待测样品溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值代入标准工作曲线的回归方程，计算得到待测样品溶液中的蛋白浓度。
2、试样的制备
将蛋白样品溶液进行酶解后获得肽段溶液，再进行脱盐、干燥，即获得肽段干粉作为试样，待测。
酶解过程为：取蛋白样品溶液，依次加入二硫苏糖醇(DTT)溶液、碘乙酰胺(IAA)溶液进行反应后，转移至超滤管中加入碳酸氢铵溶液进行超滤离心，再加入胰蛋白(Trypsin)酶进行反应后补加胰蛋白(Trypsin)酶继续反应，将反应产物离心后，收集获得肽段溶液。
其中，二硫苏糖醇溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为1:99-101。二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5-1.5M(mol/L)。二硫苏糖醇溶液加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：2-3h。碘乙酰胺溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为5:99-101。碘乙酰胺溶液的浓度为0.5-1.5M(mol/L)。碘乙酰胺溶液加入后的反应条件为室温避光反应35-45min。碳酸氢铵溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为1.5-2.5:1。碳酸氢铵溶液的浓度为20-30mM(mmol/L)。超滤离心的反应条件为：离心转速：9000-11000g；离心时间：9-11min；离心次数：3-5次。
胰蛋白酶与蛋白样品溶液加入的质量之比为1:99-101。胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：3-5h。补加胰蛋白酶与蛋白样品溶液加入的质量之比为1:49-51。补加胰蛋白酶加入后的反应条件为：反应温度：35-40℃；反应时间：15-17h。离心条件为：离心转速：9000-11000g；离心时间：10-20min。
脱盐是将酶解后获得的肽段溶液过C18固相萃取柱进行脱盐。干燥为冻干，所述冻干的温度为≤-80℃。
3、鉴定
将制备的试样进行二维液相色谱质谱联用法检测，依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测后，将质谱检测结果由搜索引擎通过检索数据库进行比较，鉴定出试样中的多组蛋白组及蛋白组中的多种蛋白。
第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：Aquity UPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱(内径2.1mm、长度150mm、填料粒径3.5μm、孔径
)；柱温：室温；流速：150-250μl/min；进样量：5-20μl；第一维流动相A相：15-25mM甲酸铵水溶液，pH＝9-11(氨水调节)；第一维流动相B相：15-25mM甲酸铵+85-95v/v％乙腈水溶液，pH＝9-11(氨水调节)；检测波长：210-220nm；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-65：35；
40-41min，A相：B相体积比为65：35-95：5；
41-56min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：Nano Aquity UPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第二维液相色谱柱：AcclaimPepMap C18纳升级反相色谱柱(15cm×75μm、填料粒径3μm、孔径
)；上样流速：5-15μl/min；上样时间：2-4min；进样量：6-10μl；柱温：35-45℃；流速：250-350nL/min；第二维流动相A相：4-6v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.05-0.15v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2-3(甲酸调节)；第二维流动相B相：85-95v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.05-0.15v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2-3(甲酸调节)；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-45min，A相：B相体积比为98：2-60：40；
45-45min，A相：B相体积比为60：40-98：2；
45-60min，A相：B相体积比为98：2-98：2。
质谱的条件为：质谱系统：LTQ Orbitrap XL系统；离子源：在线纳升级电喷雾离子源(online nano-electrospray ions source)；离子源喷雾电压：1.9kV；加热毛细管温度：200℃；扫描方式：全扫描MS使用Orbitrap进行Profile模式扫描；扫描范围：m/z 300-1800；分辨率：100000(m/z 400处)；Orbitrap离子最大引入时间：500ms，AGC(automatic gaincontrol)控制为1×106；LTQ离子最大引入时间：120ms，AGC控制为2×104；数据采集模式：自动在MS和MS/MS间切换采集；对符合MS/MS条件、强度排名前10的离子使用LTQ进行Centroid模式扫描；对单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行2次MS/MS，之后排除60秒；MS/MS使用35％的碰撞能量碰撞反应30ms，q值设定为0.25。
搜索引擎通过检索数据库进行搜索的参数条件为：搜索引擎：MASCOTTM(v2.3.2)；实验数据处理软件：Proteome Discoverer软件；检索数据库：NCBI数据库(种属为Nicotiana，2014_11_10，104349条序列)；酶切方式：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2；修饰方式：固定修饰为半胱氨酸(Cysteine)的碘乙酰胺烷基化，可变修饰为甲硫氨酸(Methionine)的氧化；误差范围：一级肽段母离子允许误差≤10ppm，二级碎片离子允许误差≤0.6Da，肽段最少含有7个氨基酸；蛋白鉴定标准：离子得分满足肽段假阳性率≤1％，用于降低假阳性结果。从而能够鉴定出多组蛋白组(Protein Group)及蛋白组中包含的多种蛋白。
实施例2
1、蛋白提取
取新鲜的烟叶样品，采用《Sample extraction techniques for enhancedproteomic analysis of plant tissues》(Isaacson T；Damasceno CM；Saravanan RS；HeY；CataláC；SaladiéM；Rose JK，Nature Protocols，2006，1，769-774)记载的TCA/丙酮沉淀法、苯酚法提取蛋白，再将提取的蛋白合并后加入6M尿素水溶液复溶，获得蛋白样品溶液。所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积(μl)与蛋白的质量(mg)之比为体积之比为60：1。
蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，先取蛋白样品溶液10μL，加入500μL沉淀剂，室温下旋转混悬2-3分钟，再添加500μL共沉淀剂，混悬均匀后离心，沉淀为蛋白，弃去上清液，再次离心5分钟，弃去上清。其中，蛋白样品溶液与沉淀剂加入的体积之比为1:100。蛋白样品溶液与第一次加入沉淀剂的体积之比为1:50。蛋白样品溶液与第二次加入沉淀剂的体积之比为1:50。离心的转速为12000g，离心的次数为2次每次所述离心的时间为5分钟。沉淀剂为预冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液为含有10％(体积百分比)三氯乙酸的丙酮溶液，三氯乙酸-丙酮溶液的预冷温度不大于5℃。
再添加100μL溶解液和400μL去离子水，混悬使得沉淀溶解。再添加1mL显色剂，颠倒混匀。室温下孵育反应15-20分钟。其中，溶解液、水与蛋白样品溶液加入的体积之比为10:40:1。显色剂与蛋白样品溶液加入的体积之比为1:10。溶解液为含有0.1wt％十二烷基硫酸钠(SDS)的6M尿素水溶液。显色剂为美国GE公司生产的Amersham 2-D Quant Kit试剂盒中配备的显色剂。
再取一系列不同浓度的蛋白标准溶液，采用与蛋白样品溶液相同的处理过程，即得一系列不同浓度的待测标准溶液。其中，蛋白标准溶液为牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)标准溶液。蛋白标准溶液的浓度为2mg/ml。待测标准溶液具体结果见表1，其中，第一管为空白，不包含蛋白。
表1标准曲线溶液
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| BSA体积 | 0μl | 1μl | 2μl | 4μl | 6μl | 10μl |
| 蛋白质量 | 0μg | 2μg | 4μg | 8μg | 12μg | 20μg |
然后将获得的待测样品溶液和获得的待测标准溶液，添加入试剂盒，采用紫外分光光度法进行吸光度测定，采用标准曲线法进行定量，获得蛋白样品溶液中蛋白的含量。其中，试剂盒为Amersham 2-D Quant Kit试剂盒。吸光度测定的波长为480nm。吸光度测定采用水作为参比液。吸光度测定需要在添加显色剂后的40分钟内完成测定。
标准曲线法是指将获得一系列不同蛋白浓度的待测标准溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值与蛋白浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到标准工作曲线的回归方程，再将获得的待测样品溶液进行吸光度测定后，获得吸光度值代入标准工作曲线的回归方程，计算得到待测样品溶液中的蛋白浓度。
经测定，待测样品溶液中的蛋白浓度为4-8μg/μL。
2、试样的制备
将蛋白样品溶液进行酶解后获得肽段溶液，再进行脱盐、干燥，即获得肽段干粉作为试样，待测。
酶解过程为：取200μg的蛋白样品溶液，先加入1％(v/v)1M的二硫苏糖醇(DTT)溶液，在37℃下反应2.5小时。再加入5％(v/v)1M的碘乙酰胺(IAA)溶液，室温避光反应40分钟。其中，二硫苏糖醇溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为1:100。碘乙酰胺溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为5:100。将样品转移到超滤管中加入400μL 25mM碳酸氢铵碳酸氢铵溶液进行超滤离心，碳酸氢铵溶液与蛋白样品溶液加入的体积之比为2:1，使最终体积在100μL。再加入胰蛋白(Trypsin)酶在37℃下反应4小时，胰蛋白酶与蛋白样品溶液加入的质量之比为1:100。补加胰蛋白(Trypsin)酶，继续37℃下反应16小时，补加胰蛋白酶与蛋白样品溶液加入的质量之比为1:50。将反应产物离心后，收集获得肽段溶液，离心条件为：离心转速：10000g；离心时间：15min。使用1.3ml C18固相萃取柱进行脱盐后在≤-80℃冻干，最终获得肽段干粉。
3、鉴定
将制备的试样进行二维液相色谱质谱联用法检测，依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测后，将质谱检测结果由搜索引擎通过检索数据库进行比较，鉴定出试样中的多组蛋白组及蛋白组中的多种蛋白。
第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：Aquity UPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱(内径2.1mm、长度150mm、填料粒径3.5μm、孔径
)；柱温：20-25℃；流速：200μl/min；进样量：10μl；第一维流动相A相：20mM甲酸铵水溶液，pH＝10.0(氨水调节)；第一维流动相B相：20mM甲酸铵+90v/v％乙腈水溶液，pH＝10.0(氨水调节)；检测波长：214nm；梯度洗脱。具体结果见图1。肽段粉末使用高pH流动相A100μl溶解上样，使用梯度洗脱，0-40分钟，流动相由5％B升至35％B，40-41分钟由35％B降至5％B，并保持15分钟平衡色谱柱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-65：35；
40-41min，A相：B相体积比为65：35-95：5；
41-56min，A相：B相体积比为95：5-95：5。
第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：Nano Aquity UPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱(2.0mm×100μm)；第二维液相色谱柱：AcclaimPepMap C18纳升级反相色谱柱(15cm×75μm、填料粒径3μm、孔径
)；上样流速：10μl/min；上样时间：3min；进样量：8μl；柱温：40℃；流速：300nL/min；第二维流动相A相：5v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.1v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2.5(甲酸调节)；第二维流动相B相：90v/v％(体积百分比)乙腈(ACN)+0.1v/v％(体积百分比)甲酸水溶液，pH＝2.5(甲酸调节)；梯度洗脱。肽段干粉使用10μl流动相A溶解，溶解后上样8μl，上样流速为10μl/min，上样3分钟，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的盐溶液直接排入废液，经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段，45分钟内从2％B升至40％B，以2％的B平衡色谱柱15分钟，反相过程共60分钟。
梯度洗脱的具体程序为：
0-45min，A相：B相体积比为98：2-60：40；
45-45min，A相：B相体积比为60：40-98：2；
45-60min，A相：B相体积比为98：2-98：2。
质谱的条件为：质谱系统：LTQ Orbitrap XL系统；离子源：在线纳升级电喷雾离子源(online nano-electrospray ions source)；离子源喷雾电压：1.9kV；加热毛细管温度：200℃；扫描方式：全扫描MS使用Orbitrap进行Profile模式扫描；扫描范围：m/z 300-1800；分辨率：100000(m/z 400处)；Orbitrap离子最大引入时间：500ms，AGC(automatic gaincontrol)控制为1×106；LTQ离子最大引入时间：120ms，AGC控制为2×104；数据采集模式：自动在MS和MS/MS间切换采集；对符合MS/MS条件、强度排名前10的离子使用LTQ进行Centroid模式扫描；对单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行2次MS/MS，之后排除60秒；MS/MS使用35％的碰撞能量碰撞反应30ms，q值设定为0.25。
所述搜索引擎通过检索数据库进行搜索的参数条件为：搜索引擎：MASCOTTM(v2.3.2)；实验数据处理软件：Proteome Discoverer软件；检索数据库：NCBI数据库(种属为Nicotiana，2014_11_10，104349条序列)；酶切方式：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2；修饰方式：固定修饰为半胱氨酸(Cysteine)的碘乙酰胺烷基化，可变修饰为甲硫氨酸(Methionine)的氧化；误差范围：一级肽段母离子允许误差≤10ppm，二级碎片离子允许误差≤0.6Da，肽段最少含有7个氨基酸；蛋白鉴定标准：离子得分满足肽段假阳性率≤1％，用于降低假阳性结果。最终共鉴定出2395蛋白组(Protein Group)，包含7677蛋白。
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，具体包括以下步骤：
1)将烟叶样品，采用三氯乙酸-丙酮沉淀法、苯酚法分别提取蛋白，再将蛋白合并后复溶，获得蛋白样品溶液；
2)将步骤1)所得蛋白样品溶液进行酶解、脱盐、干燥，获得肽段干粉作为试样；
3)将步骤2)中制备的试样进行二维液相色谱质谱联用法检测，依次通过第一维液相色谱、第二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；
所述复溶采用的溶剂为4-8M尿素水溶液；所述蛋白样品溶液中，所述复溶采用的溶剂加入的体积与蛋白的质量之比为55-65：1，μl/mg；
步骤2)中，所述酶解过程为：取蛋白样品溶液，依次加入二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液进行反应后，转移至超滤管中加入碳酸氢铵溶液进行超滤离心，再加入胰蛋白酶进行反应后补加胰蛋白酶继续反应，将反应产物离心后，收集获得肽段溶液；
步骤2)中，所述脱盐是将酶解后获得的肽段溶液过C18固相萃取柱进行脱盐；所述干燥为冻干，所述冻干的温度为≤-80℃；
步骤3)中，所述第一维液相色谱的条件为：第一维液相色谱系统：Aquity UPLC系统；第一维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第一维液相色谱柱：XBridge反相液相色谱柱；柱温：室温；流速：150-250μl/min；进样量：5-20μl；第一维流动相A相：15-25mM甲酸铵水溶液，pH＝9-11；第一维流动相B相：15-25mM甲酸铵+85-95v/v％乙腈水溶液，pH＝9-11；检测波长：210-220nm；梯度洗脱；
所述第一维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：
0-40min，A相：B相体积比为95：5-65：35；
40-41min，A相：B相体积比为65：35-95：5；
41-56min，A相：B相体积比为95：5-95：5；
步骤3)中，所述第二维液相色谱的条件为：第二维液相色谱系统：Nano Aquity UPLC系统；第二维肽段捕集柱：Acclaim PepMap C18捕集柱；第二维液相色谱柱：Acclaim PepMapC18纳升级反相色谱柱；上样流速：5-15μl/min；上样时间：2-4min；进样量：6-10μl；柱温：35-45℃；流速：250-350nL/min；第二维流动相A相：4-6v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；第二维流动相B相：85-95v/v％乙腈+0.05-0.15v/v％甲酸水溶液，pH＝2-3；梯度洗脱；
所述第二维液相色谱的梯度洗脱的具体程序为：
0-45min，A相：B相体积比为98：2-60：40；
45-45min，A相：B相体积比为60：40-98：2；
45-60min，A相：B相体积比为98：2-98：2。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤1)中，所述蛋白样品溶液采用紫外分光光度法进行定量，包括以下步骤：
A)将蛋白样品溶液，加入沉淀剂进行旋转混悬后离心，取沉淀物加入溶解剂进行旋转混悬后溶解，再加入显色剂混合后，进行孵育反应，即得待测样品溶液；
B)取一系列不同浓度的蛋白标准溶液，采用与步骤A)相同的处理过程，即得一系列不同浓度的待测标准溶液；
C)将步骤A)中获得的待测样品溶液和步骤B)中获得的待测标准溶液，添加入试剂盒，采用紫外分光光度法进行吸光度测定，采用标准曲线法进行定量，获得蛋白样品溶液中蛋白的含量。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤A)中，包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述沉淀剂为预冷后的三氯乙酸-丙酮溶液，所述三氯乙酸-丙酮溶液的预冷温度不大于5℃；
A2)所述溶解剂包括有溶解液和水，所述溶解液、水与所述蛋白样品溶液加入的体积之比为9-11:39-41:1；所述溶解液为含有0.05-0.2wt％十二烷基硫酸钠的4-8M尿素水溶液；
A3)所述显色剂为BCA蛋白定量试剂盒中配备的显色剂。
4.根据权利要求2所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤B)中，所述蛋白标准溶液为牛血清白蛋白标准溶液；所述待测标准溶液中蛋白的浓度范围为0-2μg/μl。
5.根据权利要求2所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤C)中，包括以下条件中任一项或多项：
B1)所述试剂盒为BCA蛋白定量试剂盒；
B2)所述紫外分光光度法的检测波长为470-490nm。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤3)中，所述质谱的条件为：质谱系统：LTQ Orbitrap XL系统；离子源：在线纳升级电喷雾离子源；离子源喷雾电压：1.9kV；加热毛细管温度：200℃；扫描方式：全扫描MS使用Orbitrap进行Profile模式扫描；扫描范围：m/z 300-1800；分辨率：100000，m/z 400处；Orbitrap离子最大引入时间：500ms，AGC控制为1×106；LTQ离子最大引入时间：120ms，AGC控制为2×104；数据采集模式：自动在MS和MS/MS间切换采集；对符合MS/MS条件、强度排名前10的离子使用LTQ进行Centroid模式扫描；对单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10秒内进行2次MS/MS，之后排除60秒；MS/MS使用35％的碰撞能量碰撞反应30ms，q值设定为0.25。
7.根据权利要求1所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，步骤3)中，所述质谱的检测结果由搜索引擎通过检索数据库进行比较，鉴定出试样中的多组蛋白组及蛋白组中的多种蛋白。
8.根据权利要求7所述的一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法，其特征在于，所述搜索引擎通过检索数据库进行搜索的参数条件为：搜索引擎：MASCOTTM；
实验数据处理软件：Proteome Discoverer软件；检索数据库：NCBI数据库，种属为Nicotiana；酶切方式：胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切为2；修饰方式：固定修饰为半胱氨酸的碘乙酰胺烷基化，可变修饰为甲硫氨酸的氧化；误差范围：一级肽段母离子允许误差≤10ppm，二级碎片离子允许误差≤0.6Da，肽段最少含有7个氨基酸；蛋白鉴定标准：离子得分满足肽段假阳性率≤1％。
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