CN107402269A - 基于scx/sax混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用 - Google Patents

基于scx/sax混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用，所述蛋白质组学样品前处理平台包括移液枪枪头(1)、强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)和固相萃取膜(3)；所述固相萃取膜(3)填充于移液枪枪头(1)的下端，强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)填充于移液枪枪头(1)下端并位于固相萃取膜(3)之上。本发明的蛋白质组学样品前处理平台在混合离子交换填料上完成样品预富集、还原、烷基化、酶解步骤，该反应器的特点在于所使用的混合离子交换填料可在任意pH值下实现蛋白质富集，且酶解pH置换过程中，蛋白质损失少，胰蛋白酶可以在两种填料之间来回移动，酶解效率更高。

Description

基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台 及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质组学技术领域，尤其涉及基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用。
背景技术
近年来，基于生物质谱的蛋白质组学技术已被广泛应用于蛋白质的大规模定性和定量表征，在基础生物学和生物医学等相关领域得到广泛地应用。样品预富集是整个蛋白质组学分析流程中至关重要的一步，决定着整个样品分析的灵敏度和精确度。目前，越来越多的科研工作者致力于寻找更高效的蛋白质预富集方法，以降低蛋白质在富集过程中的损失，以提高整个蛋白质组学分析流程的性能。
基于强阳离子交换填料(SCX)和强阴离子交换填料(SAX)的蛋白质预富集方法已经在蛋白质组学领域得到了成功地应用。其中，基于SCX填料的蛋白质预富集方法的原理是在酸性条件下大部分蛋白质的等电点因大于溶液pH值而带正电荷，从而被填料表面的SCX基团所富集；而基于SAX填料的蛋白质预富集方法的原理是在碱性条件下大部分蛋白质的等电点小于溶液pH值而带负电荷，从而被填料表面的SAX基团所富集。例如，田等人在RareCell Proteomic Reactor Applied to Stable Isotope Labeling by Amino Acids inCell Culture(SILAC)-based Quantitative Proteomics Study of Human EmbryonicStem Cell Differentiation中公开了基于SCX毛细管整体柱的在线细胞样品处理方法，通过整体柱上的SCX基团有效地富集蛋白，结合集成化的还原，烷化和酶解等蛋白质组学前处理步骤，大大减少了样品损失；该方法可从50,000个人类胚胎干细胞中成功的鉴定到2,281个蛋白，为微量细胞样本的蛋白质组学样品前处理提供了新方法。陈等人在Simple andIntegrated Spintip-Based Technology Applied for Deep Proteome Profiling中公开了一种基于离心力的集成化的蛋白质组学分析技术(simple and integrated spintip-based proteomics Technology,SISPROT)，通过将SCX填料和C18填充在一个200μL枪头中，完成蛋白质预富集等样品前处理过程，方便地实现了高灵敏的蛋白质组学分析。
三维SISPROT技术(3D-SISPROT)是在SISPROT技术基础上发展起来的一种方法，其将所有样品制备步骤整合到一个装有SAX离子交换填料和C18膜的枪头中，并在SAX填料上完成蛋白质预富集、酶解和多肽分级操作。赵等人在Biphasic Microreactor forEfficient Membrane Protein Pretreatment with a Combination of Formic AcidAssisted Solubilization,OnColumn pH Adjustment,Reduction,Alkylation,andTryptic Digestion中利用蛋白质在SCX和SAX材料上富集的互补性，开发了基于SCX和SAX串联填充柱的双相微反应器，并通过模型蛋白牛血清白蛋白，肌红蛋白和细胞色素c的混合物评估该双相微反应器的富集效果，结果证实该方法可有效地减少蛋白样品的损失。
由于SAX或SCX填料的蛋白质富集效果有限，且富集的效果受pH影响较大，因此基于SAX或SCX填料的蛋白质组学方法受到一定限制
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于SCX/SAX混合填料的集成化蛋白质组学样品前处理平台及其应用，该平台的特点是应用了更优秀富集效果的SCX和SAX混合填料，使其更适于作为蛋白质反应器，蛋白质富集效率高，酶解效果好。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种蛋白质组学样品前处理平台，所述蛋白质组学样品前处理平台包括移液枪枪头1、强阳离子交换树脂(SCX)和强阴离子交换树脂(SAX)混合填料2和固相萃取膜3；所述固相萃取膜3填充于移液枪枪头1的下端，强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料2填充于移液枪枪头1下端并位于固相萃取膜3之上。
本发明中填料为SCX和SAX混合填料，使得蛋白质的富集量显著提高，且酶解pH的变化不会对蛋白质产生影响。
根据本发明，所述SCX和所述SAX的质量比能够影响蛋白质在填料上的富集情况，本发明所述SCX和所述SAX的质量比为(10-1):(1-10)，例如可以是10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、10:2、9:2、8:2、6:2、5:2、3:2、1:2、10:3、8:3、7:3、5:3、4:3、2:3、1:3、9:4、7:4、5:4、3:4、1:4、9:5、8:5、7:5、6:5、4:5、3:5、2:5、1:5、7:6、5:6、1:6、10:7、9:7、8:7、6:7、5:7、4:7、3:7、2:7、1:7、9:8、7:8、5:8、3:8、1:8、10:9、8:9、7:9、5:9、4:9、2:9、1:9、9:10、7:10、3:10或1:10，优选为(7-3):(3-7)，进一步优选为(5-1):(1-3)，最优选为1:1。
优选地，所述固相萃取膜为C18膜。
第二方面，本发明提供一种蛋白质的自动化反应系统，所述自动化反应系统包括如第一方面所述的蛋白质组学样品前处理平台。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的蛋白质组学样品前处理平台在细胞或者组织样品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学中的应用。
在具体应用时，主要是将所述蛋白质组学样品前处理平台用于生物样本中样品的前处理，将生物样本中的蛋白质样品在SCX和SAX混合填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，进行洗脱，以实现提高酶解效率的技术要求。
根据本发明，将所述蛋白质组学样品前处理平台用于生物样本中样品的前处理。
优选地，将生物样本中的蛋白质样品在SCX和SAX混合填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，进行洗脱。
第四方面，本发明提供一种蛋白质组学样品前处理方法，采用如第一方面所述的蛋白质组学样品前处理平台，包括如下步骤：
(1)活化SCX和SAX的混合填料，将蛋白样品上样到活化好的混合填料中，通过离心使蛋白质富集到混合填料上；
(2)预平衡固相萃取膜，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原和酶解；
(3)使用盐溶液将生成的多肽从SCX和SAX的混合填料转移到固相萃取膜上，使用有机溶剂将多肽洗脱下来。
本发明中所述的“蛋白质样品前处理”包括蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐和洗脱等操作，其在各操作过程中用到的蛋白酶、还原剂、烷基化试剂以及缓冲盐溶液等都为本领域公知的试剂，典型但非限制性的实例为：蛋白质可以为生物样品的组织、细胞或体液的蛋白质提取液或标准蛋白；蛋白酶可以选自碱性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶等。
根据本发明，步骤(1)所述样本蛋白来自于细胞和/或组织样品经裂解液裂解得到。
根据本发明，所述裂解液为十二烷基麦芽糖苷。
根据本发明，步骤(1)所述活化和上样的pH会影响到蛋白质的富集，本申请中所述活化和上样的pH均为3-12，例如可以是3、4、5、6、6.5、6.8、7、7.4、7.5、7.8、8、9、10、11或12，优选为6-8，进一步优选为7.4。
根据本发明，步骤(1)所述SCX和SAX的质量比为(10-1):(1-10)，例如可以是10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、10:2、9:2、8:2、6:2、5:2、3:2、1:2、10:3、8:3、7:3、5:3、4:3、2:3、1:3、9:4、7:4、5:4、3:4、1:4、9:5、8:5、7:5、6:5、4:5、3:5、2:5、1:5、7:6、5:6、1:6、10:7、9:7、8:7、6:7、5:7、4:7、3:7、2:7、1:7、9:8、7:8、5:8、3:8、1:8、10:9、8:9、7:9、5:9、4:9、2:9、1:9、9:10、7:10、3:10或1:10，优选为(7-3):(3-7)，进一步优选为(5-1):(1-3)，最优选为1:1。
本发明中，步骤(2)所述酶解的pH为可以为任意的pH，由于本发明中填料为SCX和SAX的混合填料，pH变化几乎不会引起的蛋白质样品在SCX/SAX填料上损失，所述酶解的pH只需要根据酶的最佳pH进行选择即可，任何pH都可以在本申请混合填料上实现，这也大大扩大了所述方法的适用范围，本申请酶解的pH为3-12，例如可以是3、4、5、6、6.5、7、8、9、10、11或12，优选为7-9，进一步优选为8。
本发明中，所述蛋白质在混合填料上酶解，胰蛋白酶穿梭于强阴离子和强阳离子交换混合填料之间，酶解效率更高，且在pH置换过程中填料上富集的蛋白质几乎无损失。
根据本发明，步骤(3)所述盐溶液为挥发性盐溶液，优选为甲酸铵和/或碳酸氢铵。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的前处理方法用于肿瘤组织蛋白质组的处理。
根据本发明，所述肿瘤组织为肠癌肿瘤组织。
相比于现有技术，本发明具有的有益效果：
(1)本发明的蛋白质组学样品前处理平台在一个移液枪枪头内集成了蛋白质的预富集、还原、酶解和洗脱等操作，实现少量细胞样品的蛋白质大规模鉴定，提高重现性以及定量分析准确性，并能实现高效完成蛋白质的酶解；
(2)本发明通过将填料替换为SCX和SAX混合填料，并通过设置SCX和SAX的比例，调节上样pH，通过两个条件的共同配合实现了在生理pH条件下进行样品前处理，且显著提高了上样容量；
(3)本发明方法应用SCX和SAX混合填料，在酶解过程中，胰蛋白酶在两种填料之间来回移动，大大提高了蛋白质样品的酶解效率。且在酶解前的pH置换过程中大大减少了富集在混合填料上的蛋白质样品的损失。
(4)本发明方法蛋白质鉴定量、特异性肽段数量和肽段谱图匹配数量均与基于SCX的SISPROT得到的结果相当，证实了本发明方法作为蛋白质反应器的可靠性和通用性。
附图说明
图1为本发明所述蛋白质组学样品前处理平台具体操作时的结构示意图，其中，1-移液枪枪头，2-强阳离子交换树脂(SCX)和强阴离子交换树脂(SAX)混合填料，3-C18膜，4-收集管；
图2本发明所述蛋白质组样品前处理方法中混合离子填料图；
图3(A)为BCA方法测定的SAX、SCX和SCX/SAX混合填料在不同pH条件下的蛋白质富集容量，图3(B)为SDS-PAGE方法测定的SAX填料在pH12条件下的蛋白质富集容量，图3(C)为SCX填料在pH 12条件下的蛋白质富集容量，图3(D)为SCX/SAX混合填料在pH 7.4条件下的蛋白质富集容量，其中，Ladder为标记组，Control为控制组；
图4为本发明不同比例的SCX/SAX混合填料中的蛋白质富集容量；
图5为本发明SCX/SAX混合填料的酶解pH置换对蛋白质富集的影响，其中，Ladder为标记组；Control为控制组，含BSA和LYZ各10μg；SCX1，SAX1和SCX/SAX1分别表示以控制组相同的样品量在SCX、SAX和SCX/SAX混合填料中上样后的流出液；SCX2、SAX2和SCX/SAX2分别表示的是用20μL 100mM Tris-HCl(pH 8)分别对上样后的SCX、SAX和SCX/SAX混合填料进行pH置换的样品流出液。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
仪器、试剂与材料
EPOCH酶标仪购于美国BioTec公司；EASY-nLC 1000液相色谱分离系统配1.9μmReproSil-Pur C18树脂(德国Dr.Maisch公司)填充的带有喷雾头的毛细管分析柱(20cm×100μm)，Q-Exactive质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
强阳离子交换填料(SCX)和强阴离子交换填料(SAX)均购于Agilent公司；C18膜购于MEmpore,USA；BCA Protein Assay Kit购于Thermo Scientific公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，分析纯)、柠檬酸钾(CAK，分析纯)、氨水(28％)、甲酸(FA，HPLC级)，甲醇(MeOH，HPLC级)，乙腈(ACN，HPLC级)均购买于美国Sigma公司；牛血清蛋白质(BSA，纯度>98％)购买于BBI lifesiences；溶菌酶(LYZ，纯度>98％)购买于美国Sigma公司；碳酸氢铵(ABC，纯度>98％)购买于美国Fluka公司；超纯水(18MΩcm)由MilliQ设备(Millipore公司)制得。
将BSA(牛血清蛋白)和LYZ(溶菌酶)分别溶于超纯水中配制成2μg/μL的储备液备用；将SCX和SAX填料分别用甲醇配制成为20mg/mL的储备液备用。称取1.298g CAK溶于35mL超纯水，用浓盐酸调pH到pH 3，最后用超纯水定容到40mL，配制成100mM CAK储备液备用；称取0.381g HEPES溶于30mL超纯水中，用氨水将pH调到7.4，定容至40mL，配制成40mM HEPES储备液备用。
实施例1集成蛋白质前处理的蛋白质组学样品前处理平台
如图1所示，一种集成蛋白质前处理的蛋白质组学样品前处理平台，包括移液枪枪头1、SAX和SCX混合填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标准的200μL枪头，C18膜3填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，2mg SAX和SCX混合填料2填充于移液枪枪头1下端及C18膜3之上。
将支撑块置于1.5mL收集管4上端，将蛋白质组学样品前处理平台通过支撑块置于收集管4之上，将收集管4放入离心机中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组学样品前处理平台，完成蛋白质的预富集、酶解等操作，具体步骤如下：
(1)活化SCX和SAX的混合填料，所述混合填料如图2所示，将蛋白样品上样到活化好的混合填料中，通过离心使蛋白质富集到混合填料上；
(2)预平衡固相萃取膜，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原和酶解；
(3)使用盐溶液将生成的多肽从SCX和SAX的混合填料转移到固相萃取膜上，使用有机溶剂将多肽洗脱下来。
实施例2pH值对SCX/SAX混合填料的蛋白质富集的影响
本实施例通过对SCX/SAX混合填料的蛋白质富集pH值优化，采用BCA测试方法。
基于SCX，SAX和SCX/SAX混合填料的蛋白质反应器装置，将枪头通过一个适配子置于1.5mL离心管上。将一块SCX膜(3M Empore，USA)置于枪头底部起固定填料的作用，在SCX膜上分别填充50μL SCX(20mg/mL)，50μL SAX(20mg/mL)和50μL SCX/SAX(20mg/mL)混合填料。在对SCX填料的上样容量的测定实验中，首先依次加入20μL 100mM柠檬酸钾(pH 3)和20μL10mM柠檬酸钾(pH 3)对SCX填料进行预平衡；然后置换新的1.5mL离心管，将BSA(2μg/μL)和LYZ(2μg/μL)储备液1:1混合，并用1％FA(pH3)将BSA和LYZ混合液1：1稀释成含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液。取120μL稀释后的BSA和LYZ的混合溶液进行上样，离心5min(300rcf)，收集1.5mL离心管中流出液，并应用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
在对SAX填料的上样容量的测定实验中，首先加入20μL 3M氨水(pH 12)对SAX填料进行预平衡，然后置换新的1.5mL离心管，将BSA(2μg/μL)和LYZ(2μg/μL)储备液1:1混合，并用3M氨水(pH 12)将BSA和LYZ混合液1：1稀释成含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液。取120μL稀释后的BSA和LYZ的混合溶液进行上样，离心5min(300rcf)，收集1.5mL离心管中流出液，并应用BCA试剂盒测定蛋白浓度。在SCX/SAX混合填料的上样容量的研究实验中，首先在填充有一块SCX膜的枪头中加入1mg的1:1SCX/SAX混合填料。对SCX/SAX混合填料分别在酸性(pH 3)，中性(pH 7.4)和碱性(pH 12)条件的上样容量的测定实验中，分别加入20μL 10mM柠檬酸钾(pH 3)，20mM HEPES(pH 7.4)和3M氨水(pH 12)对SCX/SAX混合填料进行预平衡，然后置换新的1.5mL离心管，将BSA(2μg/μL)和LYZ(2μg/μL)储备液1:1混合，并分别用1％FA(pH 3)，20mM HEPES(pH 7.4)和3M氨水(pH12)将BSA和LYZ混合液1：1稀释成含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液。取200μL稀释后的BSA和LYZ的混合溶液分别上样，离心5min(300rcf)，收集1.5mL离心管中流出液，并应用BCA试剂盒测定蛋白浓度。以上的pH值优化实验，每个样品重复3次，取平均值。
SCX和SAX填料的最佳蛋白质富集pH值分别为3和12，而SCX/SAX混合填料的最佳蛋白质富集pH还未有报道，所以本发明在三种不同pH条件下(3、7.4和12)对SCX/SAX混合填料进行蛋白质富集容量的考察，由于BSA的分子量约为6,6000、等电点为约4.7，而LYZ的分子量约为1,4000、等电点为约11.4，因而可以很好地模拟实际样品中不同分子量和不同等电点的蛋白质。其中，SAX、SCX填料以及SCX/SAX混合填料的量均为1mg。结果如图3(A)所示，在酸性(pH 3)条件下，SCX/SAX混合填料与SCX填料的富集容量分别为63±4μg和94±4μg；SCX的富集容量稍高，说明酸性条件有利于SCX填料吸附蛋白，而SCX/SAX混合填料中的SCX填料的量只是SCX填料的一半，富集容量相应降低；在碱性(pH 12)条件下，SCX/SAX混合填料与SAX填料的富集容量分别是83±3μg和74±5μg，两者相差不多；在中性(pH 7.4)条件下，SCX/SAX混合填料的富集容量大大提高到182±10μg；说明SCX/SAX混合填料的最佳上样pH值为7.4，所以在后续的实验中，SCX/SAX混合填料的上样pH均为7.4。
实施例3pH值对SCX/SAX混合填料的蛋白质富集的影响
本实施例通过对SCX/SAX混合填料的蛋白质富集pH值优化，采用SDS-PAGE方法。
在对SCX填料的上样容量的测定实验中，首先依次加入20μL 100mM柠檬酸钾(pH3)和20μL 10mM柠檬酸钾(pH 3)对SCX填料进行预平衡。然后置换新的1.5mL离心管，将BSA(2μg/μL)和LYZ(2μg/μL)储备液1:1混合，并用1％FA(pH 3)将BSA和LYZ混合液1：1稀释成含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液。取30μL稀释后的BSA和LYZ的混合溶液进行上样，离心5min(300rcf)，收集1.5mL离心管中流出液；再取30μL稀释后的BSA和LYZ的混合溶液进行上样，离心5min(300rcf)，收集1.5mL离心管中流出液；上样7次，依次得到7份流出液。应用SDS-PAGE方法测定7个流出液中BSA和LYZ含量，并以30μL BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液作为对照，其中所用SDS-PAGE分离胶的浓度为15％，浓缩胶的浓度为4％。用考马斯亮蓝染色，用蒸馏水脱色。类似的，应用SDS-PAGE方法测定了SAX和SCX/SAX混合填料的上样容量。
由于BCA方法无法对BSA和LYZ的保留行为进行单独评价，本发明应用SDS-PAGE方法对BSA和LYZ在SCX/SAX混合填料上的保留情况进行了进一步的考察。结果如图3(B)-图3(D)所示，图3(B)表明在pH 12条件下LYZ比BSA在SAX上的结合量更多；图3(C)表明在pH 3条件下SCX填料的蛋白质富集研究结果则正好相反，BSA比LYZ在SCX填料上的结合量多；图3(D)表明对于SCX/SAX混合填料，在pH7.4条件下BSA显著地比LYZ结合更多。
结合容量相较于SCX和SAX显著提高，说明混合填料相较于SAX和SCX填料有更好的蛋白质富集效果。考虑到pH7.4是生理pH条件，采用该pH条件进行蛋白质预富集更加有利于保持蛋白质的天然活性，有望成为更为通用的蛋白质富集pH条件。
实施例4SCX/SAX混合填料比例对蛋白质富集的影响
首先将SCX(2mg/mL)和SAX(2mg/mL)的储备液配制成为SCX/SAX分别为5：1、3：1、1：1、1：3和1：5(质量比)的SCX/SAX混合液。向填充有一块SCX膜的200μL枪头中分别加入1mg不同比例的SCX/SAX混合填料，离心1min(2000rcf)；然后分别加入20μL 20mM HEPES(pH 7.4)活化SCX/SAX混合填料，离心1min(1500rcf)；换新的1.5mL离心管，向枪头中加入200μL20mM HEPES(pH 7.4)稀释后的含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)的混合溶液。离心5min(300rcf)，收集流出液，用BCA法对该溶液进行蛋白质的浓度测定。以上实验每种比例重复3次，取平均值。
在pH 7.4条件下，对不同比例混合的SCX/SAX填料的蛋白质富集容量进行了考察，结果如图4所示。当SCX：SAX为1：1时，SCX/SAX混合填料的吸附容量最大，为182±10μg，而随着SCX比例变高，吸附容量逐渐降低，同样的随混合填料中SAX比例变高，混合填料的吸附容量逐渐降低。说明当SCX与SAX比例为1:1时，能够达到最佳的蛋白质吸附效果。
实施例5
与实施例4相比，除了SCX/SAX的质量比为7:3，其他条件和方法与实施例4相同。
实施例6
与实施例4相比，除了SCX/SAX的质量比为10:1，其他条件和方法与实施例4相同。
实施例7
与实施例4相比，除了SCX/SAX的质量比为1:10，其他条件和方法与实施例4相同。
对比例1
与实施例4相比，除了SCX/SAX的质量比为12:1，其他条件和方法与实施例4相同。
对比例2
与实施例4相比，除了SCX/SAX的质量比为1:12，其他条件和方法与实施例4相同。
将实施例4的结果与对比例1、对比例2的结果的蛋白质富集容量进行了考察，结果如表1所示：
表1
比例 吸附容量(μg)
5:1 148±10
3:1 156±10
1:1 182±10
1:3 146±10
1:5 131±10
7:3 126±10
10:1 116±10
1:10 113±10
12:1 85±10
1:12 83±10
从表1可以看出，实施例与对比例进行对比，当SCX/SAX的质量比在(10-1):(1-10)范围内的时候，实施例中的蛋白的吸附容量明显高于对比例，随着SCX/SAX的质量比进一步缩小至(3-7):(7-3)，蛋白的吸附容量进一步提高，随着SCX/SAX的质量比提高到(5-1):(1-3)，蛋白有较高的吸附容量，可达146μg以上，当SCX/SAX的质量比达到1:1的时候，其吸附容量达到最高，可见，本申请的SCX/SAX质量比能够显著影响蛋白的吸附容量。
实施例8酶解pH变化对蛋白质富集的影响
向填充有一块SCX膜的200μL枪头中分别加入1mg SCX，1mg SAX和1:1的SCX/SAX混合填料，并对SCX，SAX和SCX/SAX填料进行预平衡，将1:1的含BSA(0.5μg/μL)和LYZ(0.5μg/μL)储备液分别用1％FA(pH 3)，3M氨水(pH 12)，20mM HEPES(pH 7.4)1:1稀释，其后分别取20μL上样，离心5min(300rcf)，收集流出液，依次记为SCX1，SAX1和SCX/SAX1；置换新的离心管，分别加入20μL 100mM Tris-HCl(pH 8)，离心5min(300rcf)，收集流出液，依次记为SCX2，SAX2和SCX/SAX2。将三种填料的六份流出液用上述的SDS-PAGE的方法测定。
由于酶解最佳pH为8，与上样pH值不同，pH置换过程往往会引起蛋白质的损失，因此对混合SCX/SAX填料在酶解pH值变化过程中蛋白质的损失情况进行了考察，并与SCX和SAX进行了比较。结果如图5所示，在三种填料的结合容量范围内选取20μg的上样量，蛋白质样品会得到完全保留。在标准的SISPROT技术操作中，一般使用1-2μL 100mM Tris-HCl(pH8)酶解缓冲液对pH进行调节。为了充分考察酶解缓冲液pH条件对蛋白富集的影响，本实施例中采用20μL 100mM Tris-HCl(pH 8)缓冲液进行pH条件置换。在洗脱后的流出液中，SCX填料中有一部分BSA损失，SAX填料有一部分的LYZ损失，而SCX/SAX混合填料在pH变化过程中没有蛋白质损失。说明以SCX/SAX填料为载体的酶解过程中，pH变化几乎不会引起的蛋白质样品在SCX/SAX填料上损失，这说明SCX/SAX混合填料作为蛋白质反应器方面有非常好的应用前景。
实施例9SCX/SAX混合填料的改进的SISPROT方法处理肠癌组织样品
向填充有三块C18膜(3M Empore,USA)的200μL枪头中加入50μL含SCX(10mg/mL)与SAX(10mg/mL)的混合填料，离心1min(2000rcf)；用80μL甲醇预平衡C18膜，分别用20μL20mM HEPES(pH 7.4)和20μL 10mM HEPES(pH 7.4)对SCX/SAX填料进行预平衡。应用已发展的DDM裂解液和组织样品裂解方法(Chen W,Wang S,Adhikari S,et al.Simple andIntegrated Spintip-Based Technology Applied for Deep Proteome Profiling.AnalChem,2016,88:4864-4871)裂解肠癌组织。将蛋白质含量为10μg的肠癌组织裂解液样品与20mM HEPES(pH 7.4)1：1混合上样，离心并收集样品流出液，重复上样一次；然后用20μL20％ACN，10mM HEPES进行清洗，离心1min(1500rcf)；加入10μL含50mM DTT的20mM NH4HCO3溶液，放在室温反应30min还原二硫键；用20μL超纯水洗；配制含2μg/μL胰蛋白酶和10mMIAA的50mM Tris-HCl溶液，取6μL加入到枪头中，放在黑暗中酶解反应1小时；然后分别加入40μL 20mM HEPES(pH 7.4)和20μL 5mM甲酸铵(pH 10)，以将酶解多肽洗脱至C18膜上；换用新的离心管，加入20μL含80％乙腈的5mM甲酸铵洗脱所富集的酶解多肽，收集流出液。用冻干机将流出液冻干，用10μL 0.1％FA复溶样品并进行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析
所有样品均在由EASY-nLC 1000系统和Q-Exactive质谱组成的LC-MS/MS系统上分析。液相色谱分离系统由1.9μm ReproSil-Pur C18树脂填充的带有喷雾头的毛细管分析柱组成。分离采用了双流动相系统：A相为含有0.1％FA的水溶液，B相为含有0.1％FA的ACN溶液。将样品的一半体积上样到分析柱中，然后以250nL/min的流速在分析柱中进行分离和分析。分析癌症样品的梯度设置如下：0-2min，3％B-7％B；2-52min，7％B-22％B；52-62min，22％B-35％B；62-64min，35％B-90％B；64-70min，90％B；70-72min，90％B-3％B；72-80min，3％B。分析BSA时的有效梯度缩短至30min，即梯度设置为：0-2min，3％B-7％B；2-27min，7％B-22％B；27-32min，22％B-35％B；32-34min，35％B-90％B；34-40min，90％B。全质谱扫描是在Q-Exactive质量分析器上完成的，扫描范围是m/z 350～1550，质谱分辨率为1.2×105。MS/MS数据通过高能碰撞裂解的数据依赖性采集模式获取。参数设置如下：最大离子注入时间：50ms；分离窗口：2.0m/z；归一化的碰撞能：27％；选取丰度最高且离子峰强度高于2.0×104的前10个离子进行MS/MS分析；动态排除时间：60s。
数据分析
质谱原始数据由Sequest HT(Proteome Discoverer，Version 1.4)对humanUniprot fasta数据库(包含68485个蛋白，下载于2015年4月14日)进行搜索。数据库搜索参数：母离子质量容忍度为10ppm，碎片离子设置为0.02Da，胰蛋白酶酶切，最大漏切位点设为2个，甲硫氨酸氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨基设置为可变修饰，半胱氨酸脲基甲基化设置为固定修饰，肽段鉴定的错误发现率(FDR)控制在1％以内。
结果如表2所示：
表2基于SCX/SAX混合填料的改进的SISPROT方法与传统的SISPROT方法处理肠癌样品的对比研究。
从表2可以看出，混合SCX/SAX填料具有优秀的蛋白质富集效果，并且受pH变化影响较小，较基于SCX填料的SISPROT方法更适合用于蛋白质组学样品前处理。所以本发明应用基于SCX/SAX混合填料的改进的SISPROT方法处理了肠癌肿瘤组织样品，并与基于SCX填料的SISPROT方法进行了对比，发现得到的蛋白质，特异性肽段和肽段谱图匹配数的数量相当，说明基于SCX/SAX混合填料的蛋白质处理方法是可靠的。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (10)

1.一种蛋白质组学样品前处理平台，其特征在于，所述蛋白质组学样品前处理平台包括移液枪枪头(1)、强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)和固相萃取膜(3)；所述固相萃取膜(3)填充于移液枪枪头(1)的下端，强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂混合填料(2)填充于移液枪枪头(1)下端并位于固相萃取膜(3)之上。
2.根据权利要求1所述的蛋白质组学样品前处理平台，其特征在于，所述强阳离子交换树脂和所述强阴离子交换树脂的质量比为(10-1):(1-10)，优选为(7-3):(3-7)，进一步优选为(5-1):(1-3)，最优选为1:1；
优选地，所述固相萃取膜为C18膜。
3.一种蛋白质的自动化反应系统，其特征在于，所述自动化反应系统包括如权利要求1或2所述的蛋白质组学样品前处理平台。
4.根据权利要求1或2所述的蛋白质组学样品前处理平台在细胞或者组织样品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述蛋白质组学样品前处理平台用于生物样本中样品的前处理；
优选地，将生物样本中的蛋白质样品在强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的混合填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，进行洗脱。
6.一种蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的蛋白质组学样品前处理平台，包括如下步骤：
(1)活化强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的混合填料，将蛋白样品上样到活化好的混合填料中，通过离心使蛋白质富集到混合填料上；
(2)预平衡固相萃取膜，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原和酶解；
(3)使用盐溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂和强阴离子交换树脂的混合填料转移到固相萃取膜上，使用有机溶剂将多肽洗脱下来。
7.根据权利要求6所述的前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述样本蛋白来自于细胞和/或组织样品经裂解液裂解得到；
优选地，所述裂解液为十二烷基麦芽糖苷；
优选地，步骤(1)所述活化和上样的pH均为3-12，优选为6-8，进一步优选为7.4；
优选地，步骤(1)所述强阳离子交换树脂和所述强阴离子交换树脂的质量比为(10-1):(1-10)，优选为(3-7):(3-7)，进一步优选为(5-1):(1-3)，最优选为1:1。
8.根据权利要求6或7所述的前处理方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解的pH为3-12，优选为7-9，进一步优选为8；
优选地，步骤(3)所述盐溶液为挥发性盐溶液，优选为甲酸铵和/或碳酸氢铵。
9.一种如权利要求6-8中任一项所述的前处理方法用于肿瘤组织蛋白质组的分析。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤组织为肠癌肿瘤组织。
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