CN108593818A - 一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，所述方法以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂，以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液作为流动相B，流动相A、流动相B按30：70的比例等度洗脱，检测波长为288nm，柱温为30℃，能够准确测定杂质D的含量，且能够同时测定尼麦角林已知杂质C、B、A、G、F、H和其他未知杂质。

Description

一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法。

背景技术

尼麦角林(Nicergoline)为半合成麦角碱衍生物，有α受体阻断作用和扩血管作用，可加强脑细胞能量的新陈代谢，适用于急慢性脑血管、周围循环障碍，脑代谢功能不良和头痛，口服给药后迅速吸收。杂质D(5-溴吡啶-3-羧酸)、杂质C(甲基光麦角醇)是尼麦角林的合成原料，同时也是其主要降解物，存在于尼麦角林原料药，特别是制剂中。如尼麦角林在制剂生产过程中经过制粒干燥等工艺步骤，尼麦角林原料在有水或乙醇溶液存在的情况下受热降解，杂质D、C含量明显增大。此外，尼麦角林胶囊的长期稳定性试验结果也表明杂质D、C的含量呈增大趋势，且杂质D为有毒物质，因此确有必要对该两杂质进行控制，保证药物的安全性和有效性。

杂质D极性大，在现行质量标准和欧洲药典尼麦角林原料有关物质项下的高效液相色谱条件中，几乎无保留，出峰时间均较快，与溶剂峰出现重叠现象，致使测定结果准确性较差。欧洲药典尼麦角林原料有关物质项下的高效液相色谱条件采用梯度洗脱方法，杂质D的相对保留时间为0.06。梯度洗脱法受试剂、色谱柱、高效液相色谱仪品牌型号等因素的影响较大，造成杂质相对保留时间不稳定，因而每次试验需用杂质对照品定位，而杂质对照品价格昂贵且不易获得。目前还没有一种既能准确测定杂质D含量，又能够用相对保留时间法同时测定尼麦角林已知杂质C、B、A、G、F、H和其他未知杂质的等度洗脱高效液相色谱法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，所述方法能够准确测定杂质D(见结构式1)的含量，又能够同时测定尼麦角林已知杂质C(见结构式2)、B(见结构式3)、A(见结构式4)、G(见结构式5)、F(见结构式6)、H(见结构式7)和其他未知杂质的存在和/或含量。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，包括：

(1)制备尼麦角林系统适用性溶液、供试品溶液；

(2)用色谱法检测尼麦角林系统适用性溶液和供试品溶液，确定供试品中杂质的存在和/或量，色谱条件为：以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂，以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液作为流动相B，流动相A、流动相B按30：70的比例等度洗脱，检测波长为288nm。

在优选的实施方案中，一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，包括：

(1)制备尼麦角林系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液；

(2)用色谱法检测尼麦角林系统适用性溶液，确定杂质C、D、主峰的位置和相对保留时间及其他杂质峰和主峰的分离情况，色谱条件为：以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂，以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液作为流动相B，流动相A、流动相B按30：70的比例等度洗脱，检测波长为288nm；

(3)用与步骤(2)相同的色谱条件检测尼麦角林的供试品溶液和对照溶液，根据相对保留时间确定供试品溶液中是否含有已知杂质D、C、B、A、G、F、H及其他未知杂质，从而确定尼麦角林供试品中各杂质的存在和/或量。

在一些更为优选地实施方案中，一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，包括：

(1)制备尼麦角林系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液；

(2)用色谱法检测尼麦角林系统适用性溶液，确定杂质C、D、主峰的位置和相对保留时间及其他杂质峰和主峰的分离情况，色谱条件为：以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂，以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液作为流动相B，流动相A、流动相B按30：70的比例等度洗脱，检测波长为288nm；

(3)用与步骤(2)相同的色谱条件检测尼麦角林的供试品溶液和对照溶液，根据相对保留时间确定供试品溶液中是否含有已知杂质D、C、B、A、G、F、H及其他未知杂质。如果存在与杂质D对照品保留时间基本一致的峰，根据杂质D对照品溶液主峰面积，以外标法计算供试品溶液中杂质D的含量，供试品溶液中除杂质D外，根据相对保留时间确定已知杂质C、B、A、G、F、H，并按外标法以自身对照溶液主峰面积计算其它已知杂质和单一杂质含量及杂质总量。

根据本发明，所述尼麦角林系统适用性溶液的制备方法为：以体积比为2:8的乙腈-水溶液为溶剂制备尼麦角林溶液，并于60℃～80℃加热至少1小时即得；优选地，所述尼麦角林系统适用性溶液的制备方法为：以体积比为2:8的乙腈-水溶液为溶剂，制备浓度为1mg/ml的尼麦角林溶液，60℃～80℃加热1～5小时即得；进一步优选地，所述尼麦角林系统适用性溶液的制备方法为：以体积比为2:8的乙腈-水溶液为溶剂，制备浓度为1mg/ml的尼麦角林溶液，60℃～80℃加热1小时即得。

根据本发明，所述尼麦角林系统适用性溶液的浓度为：以加热前的尼麦角林溶液计，浓度为0.5～2mg/ml，进样体积为10～20μl；优选地，所述尼麦角林系统适用性溶液的浓度为：以加热前的尼麦角林溶液计，浓度为0.5～1mg/ml，进样体积为10～20μl；进一步优选地，所述尼麦角林系统适用性溶液的浓度为：以加热前的尼麦角林溶液计，浓度为1mg/ml，进样体积为10μl。

根据本发明，所述尼麦角林供试品溶液为以尼麦角林计，浓度为1～2mg/ml的乙腈溶液；优选地，所述尼麦角林供试品溶液为以尼麦角林计，浓度为1mg/ml的乙腈溶液；具体地，尼麦角林制剂供试品溶液的制备为以尼麦角林计，配制尼麦角林浓度为1mg/ml的乙腈溶液，离心或过滤即得。

根据本发明，所述尼麦角林对照溶液的制备方法为：精密称取杂质D对照品约10mg，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置100ml量瓶中，精密加入供试品溶液0.5ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

根据本发明，色谱柱温为25℃～35℃；优选地，色谱柱温为30℃。

本发明包括但不限于尼麦角林原料、尼麦角林片剂及尼麦角林胶囊；优选地，所述尼麦角林为尼麦角林胶囊。本发明人分别考察了Agilent、Sunfire等品牌C₁₈柱、氰基柱、离子交换柱和ADME等常规色谱柱，本发明人发现无论怎样改变流动相组成、pH值等条件，都无法实现杂质D与溶剂辅料峰完全分离，并同时使其他杂质峰完全分离；本发明人意外发现，以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂的色谱柱进行分离，同时以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液(含0.5％三乙胺的60mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH值至2.1)作为流动相B；流动相A、流动相B按30：70的比例进行等度洗脱，能够实现杂质D与溶剂辅料峰完全分离的同时，其他杂质峰完全分开达到浓度测定程度。

本发明提供的测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，杂质D的相对保留时间延长至0.16，与溶剂峰完全分离，同时也能测定尼麦角林中杂质C、B、A、G、F、H和其他未知杂质，结果具准确性和可靠性，为尼麦角林建立稳定、可靠、全面的质量控制方法提供了科学依据。

结构式1：杂质D

中文名称：5-溴吡啶-3-羧酸

分子式：C₆H₄BrNO₂

分子量：202.00

结构式：

结构式2：杂质C

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-10a-甲氧基-4,7-二甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚[4,3-fg]喹啉-9-基]甲醇；(甲基光麦角醇)

分子式：C₁₈H₂₄N₂O₂

分子量：300.40

结构式：

结构式3：杂质B

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-10a-甲氧基-7-甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚[4,3-fg]喹啉-9-基]甲基5-溴吡啶-3-羧酸酯；(1-去甲尼麦角林)

分子式：C₂₃H₂₄BrN₃O₃

分子量：470.37

结构式：

结构式4：杂质A

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-10a-甲氧基-4,7-二甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚[4,3-fg]喹啉-9-基]甲基5-氯吡啶-3-羧酸酯(氯尼麦角林)；

分子式：C₂₄H₂₆ClN₃O₃

分子量：439.94

结构式：

结构式5：杂质G

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-4,7-二甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚[4,3-fg]喹啉-9-基]甲基-5溴吡啶-3-羧酸酯；(1-去甲氧基尼麦角林)

分子式：C₂₃H₂₄BrN₃O₂

分子量：454.39

结构式：

结构6：杂质F

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-10a-甲氧基-4,7-二甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚并[4,3-fg]喹啉-9-基]甲基5-溴-3-吡啶羧酸酯(异尼麦角林)；

分子式：C₂₄H₂₆BrN₃O₃

分子量：484.39

结构式：

结构7：杂质H

中文名称：[(6aR,9R,10aS)-10a-甲氧基-4-甲基-4,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢吲哚并[4,3-fg]喹啉-9-基]甲基-5溴-3-吡啶羧酸酯；(6-去甲尼麦角林)

分子式：C₂₃H₂₄BrN₃O₃

分子量：470.37

结构式：

附图说明

图1是实施例1的杂质测试溶液色谱图；

图2是实施例1的混合杂质对照品溶液色谱图；

图3是实施例1的样品溶液色谱图；

图4是实施例2的60℃水浴加热0分钟色谱图；

图5是实施例2的60℃水浴加热10分钟色谱图；

图6是实施例2的60℃水浴加热30分钟色谱图；

图7是实施例2的60℃水浴加热50分钟色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的发明内容进一步的详细描述。

实施例1色谱条件的验证

色谱柱：以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂；

流动相：以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液(含0.5％三乙胺的60mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH值至2.1)作为流动相B。流动相A、流动相B按30：70的比例进行等度洗脱；

检测波长：288nm；

柱温：30℃；

杂质测试溶液的配制：取EP系统适用性对照品一支，精密加入乙腈1ml使溶解，即得；

混合杂质对照品溶液的配制：取杂质D 9.42mg、杂质A(氯尼麦角林)10.68mg、杂质G(1-去甲氧基尼麦角林)10.25mg、杂质B(1-去甲尼麦角林)10.30mg、杂质C 10.30mg，分别置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为对各照品储备溶液。分别精密量取各对照品储备溶液1ml、2.5ml、2.5ml、4ml、1ml，置同一50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；

样品溶液的配制：取本品内容物研细，精密称取适量(相当于尼麦角林25mg)，置25ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，离心，取上清液作为供试品溶液；

各精密量取杂质测试溶液、混合杂质对照品溶液和样品溶液各10μl进样，记录色谱图，见图1～3。

杂质D在5.654分钟出峰、杂质C在8.618分钟出峰、杂质B在21.681分钟出峰、杂质A在28.288分钟出峰、主峰在31.164分钟出峰，杂质G在36.962分钟出峰、杂质H在39.823分钟出峰、杂质F在45.457分钟出峰。

结论：在该方法条件下杂质A、B、C、D、G、H、F和主峰均能完全分离。

实施例2尼麦角林热稳定性考察

精密称取尼麦角林对照品0.1028g，置100ml量瓶中，加乙腈-水(8：2)使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为测试溶液。取测试溶液置60℃水浴中加热破坏，并分别精密量取加热0min、10min、30min、50min的测试溶液20μl注入液相色谱仪，照实施例1的色谱条件，记录色谱图，见图4～7，结果表明尼麦角林受热降解，杂质D和杂质C随加热时间增加而逐渐增大，具体见表1。

表1

实施例3线性范围、检测限及定量限

取杂质D 9.42mg、杂质A(氯尼麦角林)10.68mg、杂质G(1-去甲氧基尼麦角林)10.25mg、杂质B(1-去甲尼麦角林)10.30mg、杂质C 10.30、尼麦角林对照品10.12mg，分别置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为各对照品储备溶液。分别精密量取各对照品储备溶液适量，用乙腈稀释制成一系列浓度的溶液，照实施例1的色谱条件分别精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(μg·ml^-1)为x，以峰面积为y，分别计算各成分的线性回归方程和校正因子(尼麦角林斜率与各组分斜率的比值)，结果见表2，杂质A、杂质D、杂质C、杂质B、杂质G和尼麦角林的检测限分别为4.9、2.7、1.7、5.6、5.8、5.6ng(S/N＝3)，定量限分别为16.3、9.0、5.7、18.7、19.3、18.7ng(S/N＝10)，除杂质D外，其他已知杂质可以采用自身对照进行定量。

表2各组分的回归方程和校正因子(n＝7)

实施例4重复性及稳定性试验

供试品溶液的制备：取6份同一批样品的内容物研细，精密称取适量(相当于尼麦角林25mg)，置25ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，离心，取上清液作为供试品溶液。

以实施例1的混合杂质对照品溶液的配制为对照品溶液。

照实施例1的色谱条件，取供试品溶液、对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，结果见表3，取同一份供试品溶液分别在0、1、2、3、8、12、24小时进样，结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定。

表3重复性试验结果(％)

注：Ⅰ对照品法结果Ⅱ自身对照结果

结论：由表可见，已知杂质按自身对照以尼麦角林峰面积计算和按对照品溶液各杂质峰面积以外标法计算，结果基本一致。6份样品各杂质含量重复性较好。

实施例5回收率试验

加样对照品溶液的配制：取杂质D 9.42mg、杂质A(氯尼麦角林)10.68mg、杂质G(1-去甲氧基尼麦角林)10.25mg、杂质B(1-去甲尼麦角林)10.30mg、杂质C 10.30mg，分别置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为对照品储备溶液。分别精密量取对照品储备溶液1ml、2.5ml、2.5ml、4ml、1ml，置同一50ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；

供试品溶液的配制：精密称取9份空白辅料约0.14g，置10ml量瓶中，分别精密加入加样对照品溶液0.5ml、0.8ml和1ml，各三份，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

以实施例1的混合杂质对照品溶液的配制为对照品溶液。

照实施例1的色谱条件，精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl进样，记录色谱图，结果见表4。

表4各杂质回收率结果

结论：由表可见回收率均在87％～104％之间，该方法能准确定量检查各杂质。

实施例6耐用性实验

按实施例1的色谱条件，分别考察了柱温、流速和流动相比例的影响，见表5，结果表明柱温和流速影响较小，乙腈的比例影响较大。同时还考察了同规格不同批号的色谱柱，结果相对保留时间无明显差异。

表5耐用性试验结果

Claims (8)

1.一种测定尼麦角林有关物质的高效液相色谱方法，包括：

(1)制备尼麦角林系统适用性溶液、供试品溶液；

(2)用色谱法检测尼麦角林系统适用性溶液和供试品溶液，确定供试品中杂质的存在和/或量，色谱条件为：以强阳离子交换树脂和反相C18按体积比1:4混合的填料为填充剂，以乙腈作为流动相A，磷酸盐缓冲液作为流动相B，流动相A、流动相B按30：70的比例等度洗脱，检测波长为288nm。

2.如权利要求1所述的高效液相色谱方法，所述用色谱法检测尼麦角林系统适用性溶液，其特征在于确定杂质C、D、主峰的位置和相对保留时间及其他杂质峰和主峰的分离情况。

3.如权利要求1所述的高效液相色谱方法，所述用色谱法检测尼麦角林的供试品溶液和对照溶液，其特征在于：根据权利要求2获得的相对保留时间确定供试品溶液中是否含有已知杂质D、C、B、A、G、F、H及其他未知杂质，从而确定尼麦角林供试品中各杂质的存在和/或量。

4.如权利要求3所述的高效液相色谱方法，进一步包括：如果存在与杂质D对照品保留时间基本一致的峰，根据杂质D对照品溶液主峰面积，以外标法计算供试品溶液中杂质D的含量，供试品溶液中除杂质D外，根据相对保留时间确定已知杂质C、B、A、G、F、H，并按外标法以自身对照溶液主峰面积计算其它已知杂质和单一杂质含量及杂质总量。

5.如权利要求1至2任一项所述的高效液相色谱方法，所述尼麦角林系统适用性溶液由以下方法制得：包括以体积比为2:8的乙腈-水溶液为溶剂制备尼麦角林溶液，并于60℃～80℃加热至少1小时即得，其中，尼麦角林溶液的浓度为1mg/ml，优选地，加热时间为1～5小时，更优选为1小时。

6.如权利要求1或3或4所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述尼麦角林供试品溶液为尼麦角林的乙腈溶液，其浓度为1～2mg/ml，优选地，浓度为1mg/ml，所述浓度以尼麦角林计。

7.如权利要求1或3或4所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述尼麦角林对照溶液由以下方法制得：包括精密称取杂质D对照品约10mg，置100ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置100ml量瓶中，精密加入供试品溶液0.5ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

8.如权利要求1至4任一项所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述色谱法的色谱柱温为25℃～35℃；优选地，所述色谱法的色谱柱温为30℃。