CN105181863A - 一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，属于分析化学领域，该方法的色谱条件和系统适应性实验：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH值为2～4的水为流动相；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为190～210nm；柱温为20～50℃；理论板数按盐酸半胱氨酸计算应不低于3000，盐酸半胱氨酸与其它峰的分离度应达到1.5。本发明采用高效液相色谱法对溶液中的盐酸半胱氨酸进行了测定，该法对设备的要求不高，流动相为水，安全环保，本发明方法操作简单、提高了检测的灵敏度和准确度，具有简便、准确、重复性好、专属性强的特点。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法。
背景技术
盐酸半胱氨酸为氨基酸类药物，白色结晶或结晶性粉末；有臭，味酸。可用于治疗尿道疾病，在盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液中，盐酸半胱氨酸用于抗氧剂作用，保证盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液的质量要求。
现有盐酸半胱氨酸的测定方法有以下三种：
(1)碘量法：方法来源(《中国药典》2010年版第一增补本第435页)，现有检测盐酸半胱氨酸原料的方法。方法：取本品约0.25g，精密称定，置碘瓶中，加水20ml与碘化钾4g，振摇溶解后，加稀盐酸5ml，精密加入碘滴定液(0.05mol/L)25ml，于暗处放置15分钟，再置冰浴中冷却5分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液2ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的碘滴定液(0.05mol/L)相当于15.76mg的C3H7NO2S·HCl。
此法用于该品种时，由于在溶液中浓度较低，不能进行有效测定；由于葡萄糖的存在，干扰其测定；方法本身的精度决定其不太适应目前国家的相关要求。
(2)比色法：方法来源(杨雷著复方氨基酸注射液(18AA-V)中盐酸半胱氨酸的含量测定)。方法：a.标准曲线的制备：精密称取盐酸半胱氨酸对照品适量，加水溶解并稀释成每1ml中约含盐酸半胱氨酸0.7mg的溶液；分别精密量取3ml、4ml、5ml、6ml、7ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照液；精密量取各对照液1ml，置25ml具塞试管中，分别加冰乙酸和酸性茚三酮溶液2.0ml，轻轻摇匀，密塞，水浴加热5min，立即冰水冷却，加乙醇20ml，摇匀。以水1ml同法操作作为空白，立即于559nm波长处测定。以吸收度与其对应浓度进行线性回归，得回归方程。b.供试液的制备和测定：精密量取本品4ml，置25ml量瓶中，加水稀释到刻度，摇匀，作为供试液；精密量取1ml，照标准曲线制备项下的方法，自“置25ml具塞试管中”起，同法操作、测定。从回归方程计算盐酸半胱氨酸的浓度，即得。
此法用于该品种时发现：测样时间不好把控，检验较繁琐，检测结果不及高效液相色谱法准确，试剂有毒，易污染环境。
(3)柱前衍生方法：方法来源(曹玲著柱前衍生化HPLC法同时测定注射用复方甘草酸苷中盐酸半胱氨酸和甘氨酸的含量)。方法：色谱条件色谱柱:PhenomenexLunaC18(2)柱(4.6mm×25cm,5μm)；流动相A:乙腈-水(50∶50)；流动相B:0.014mol/L磷酸氢二钾溶液(磷酸调节pH值至8.2)；流速:1.0mL·min-1；检测波长:360nm；柱温:30℃；进样量10μl。梯度程序见表1：
表1：梯度程序
衍生化反应精密称取盐酸半胱氨酸和甘氨酸对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中分别含40μg与800μg的溶液，精密量取1ml置10ml量瓶中，加4％碳酸氢钠溶液1ml，1％DNFB乙腈溶液1ml，置60℃水浴中暗处反应20min后，放冷，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度，摇匀。取10μl注入液相色谱仪,记录色谱图。可见该色谱条件下，盐酸半胱氨酸和甘氨酸衍生化产物之间的分离度大于23，且与各自相邻色谱峰的分离度符合要求。
该方法有以下不足：检验方法繁琐且时间较长，试剂有毒，易污染环境。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，该方法具有简便、准确、重复性好、专属性强的特点。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，它包括以下步骤：
A.供试品溶液的制备：精密称取本品5ml，置于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；
B.对照品溶液的制备：取盐酸半胱氨酸对照品15mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；C.测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算溶液中盐酸半胱氨酸的含量；
其中，色谱条件与系统适应性实验：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH值为2～4的水为流动相；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为190～210nm；柱温为20～50℃；理论板数按盐酸半胱氨酸计算应不低于3000，盐酸半胱氨酸的分离度应达到1.5。
所述流动相用1mol/L的硫酸溶液调节pH值。
所述阳离子交换树脂为AgilentZORBAXSB-C18液相色谱柱。
所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量(％)＝(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积)×100％。
本发明具有以下优点：本发明采用高效液相色谱法对溶液中的盐酸半胱氨酸进行了测定，该法对设备的要求不高，流动相为水，安全环保，本发明方法操作简单、提高了检测的灵敏度和准确度，具有简便、准确、重复性好、专属性强的特点。
附图说明
图1为实施例1的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，它包括以下步骤：
A.供试品溶液的制备：精密称取本品(品名：盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液批号：H13080102S厂家：四川科伦药业股份有限公司试制样品)5ml，置于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；
B.对照品溶液的制备：取盐酸半胱氨酸对照品15mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；C.测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示，按外标法以峰面积计算溶液中盐酸半胱氨酸的含量；
其中，色谱条件与系统适应性实验：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；AgilentZORBAXSB-C18液相色谱柱；以pH值为2～4的水为流动相，用1mol/L的硫酸溶液调节pH值；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为190～210nm；柱温为20～50℃；理论板数按盐酸半胱氨酸计算应不低于3000盐酸半胱氨酸与其它峰的分离度应达到1.5。
供试品标示含量(％)＝(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积)×100％。
实施例2：专属性实验
空白辅料：配制不含有盐酸半胱氨酸的辅料空白溶液，按照色谱条件进行分析，辅料空白溶液不干扰盐酸半胱氨酸含量检测。
对照溶液：取盐酸半胱氨酸对照品溶液，按照色谱条件进行分析。
供试品溶液：取盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液，按照拟定的色谱条件进行分析。
实验结果表明：空白辅料不干扰盐酸半胱氨酸含量的检测；流动相不干扰盐酸半胱氨酸含量的检测；溶剂不干扰盐酸半胱氨酸含量的检测。
实施例3：线性实验
精密量取盐酸半胱氨酸对照储备液(精密称取盐酸半胱氨酸对照品16.15mg至50ml容量瓶中，加流动相稀释定容即得，0.323mg/ml)，分别取1、2.5、5、6.5、8ml至50ml容量瓶中，稀释浓度分别为6.46μg/ml、16.15μg/ml、32.3μg/ml、41.99μg/ml、51.68μg/ml。分别精密量取上述对照品溶液各10～30μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。测定结果如表2所示。
表2：盐酸半胱氨酸----线性测定结果
实验结果表明：线性范围进样量在6.46μg/ml～51.68μg/ml，线性方程y＝3.8563x+1.5989相关系数：r2＝0.998
实施例4：精密度实验
进样精密度：取H13080103S(品名：盐酸多巴酚丁胺葡萄糖注射液厂家：四川科伦药业股份有限公司试制样品)样品溶液，按照标准项下盐酸半胱氨酸含量检测制备方法，制备供试品溶液，按照盐酸半胱氨酸含量色谱条件进样分析，以盐酸半胱氨酸含量计算RSD，应不大于2.0％。结果如表3所示。
表3：盐酸半胱氨酸—进样精密度
实验结果表明：对H130803S批次样品，连续进样6次，含量RSD为0.77％，精密度良好。
实施例5：准确度实验
按照处方(称取盐酸多巴酚丁胺1.12g、葡萄糖50g、依地酸钙钠0.1g至1000ml,摇匀即得)配制空白辅料溶液，精密量取空白辅料溶液5ml至50ml容量瓶中,平行制备9份样品；精密量取盐酸半胱氨酸对照品储备液(浓度：0.323mg/ml)4ml、5ml、6ml，分别加入含有空白辅料的容量瓶中，用流动相定容至50ml，每份平行制备3份样品，稀释至刻度。按上述盐酸半胱氨酸含量测定方法进行测定。按以下公式计算回收率，回收率应在98％～102％之间。测定结果如表4所示。
计算公式：回收率％＝测得盐酸半胱氨酸含量/加入盐酸半胱氨酸含量×100％
表4：盐酸半胱氨酸含量—准确度测定结果
实验结果表明：回收率均在97％以上，RSD为2.03％。回收率分别为：102.96％、102.37％、102.35％、99.23％、100.54％、101.05％、101.33％、96.49％、102.56％，平均回收率为100.99％。
实施例6：重复性实验
取样品溶液，按照标准项下盐酸半胱氨酸含量检测制备方法，平行制备6份供试品溶液，按照盐酸半胱氨酸含量色谱条件进样分析，以盐酸半胱氨酸含量计算RSD％，应不大于2.0％。结果如表5所示。
表5：盐酸半胱氨酸—重复性
实验结果表明：对H130803S批次样品，重复制6份样品，含量RSD为0.29％，重复性良好。
实施例7：稳定性实验
取H13080103S样品，照盐酸半胱氨酸含量测定方法制备供试溶液，分别于0h，1h，2h，4h，5h、8h小时取样测定。实验结果如表6所示。
表6：盐酸半胱氨酸含量—稳定性
实验结果表明：分别于0h，1h，2h，4h，5h，8h小时进样，RSD值为0.96％，稳定性良好。
实施例8：耐用性实验
取H13080103S样品，照盐酸半胱氨酸含量测定方法制备供试溶液，分别于不同的柱温(30度、35度、40度、45度)；流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min)；波长(195nm、200nm、205nm)考察调整试验条件后对盐酸半胱氨酸含量的影响。结果如表7所示。
表7：耐用性考察结果
实验结果表明：改变盐酸半胱氨酸含量测定的色谱条件，即色谱柱柱温(30度、35度、40度、45度)，流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min)，波长(195nm、200nm、205nm)，结果各种条件下盐酸半胱氨酸理论塔板数均大于3000，含量RSD为1.58％，耐用性良好。
Claims (4)
1.一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
A.供试品溶液的制备：精密称取本品5ml，置于50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；
B.对照品溶液的制备：取盐酸半胱氨酸对照品15mg，精密称定，置50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；
C.测定：精密量取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算溶液中盐酸半胱氨酸的含量；
其中，色谱条件与系统适应性实验：色谱柱以阳离子交换树脂为填充剂；以pH值为2～4的水为流动相；流动相的流速为0.8～1.2ml/min；检测波长为190～210nm；柱温为20～50℃；理论板数按盐酸半胱氨酸计算应不低于3000，盐酸半胱氨酸的分离度应达到1.5。
2.如权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，其特征在于，所述流动相用1mol/L的硫酸溶液调节pH值。
3.如权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18液相色谱柱。
4.如权利要求1所述的一种高效液相色谱法测定溶液中盐酸半胱氨酸的方法，其特征在于，所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积）×100%。
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