CN103476748A - 用于提纯l-半胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于由含L-半胱氨酸的发酵肉汤制备提纯的含L-半胱氨酸的溶液的方法。在所述方法中，将含L-半胱氨酸的发酵肉汤在6-9的pH下与碱性阴离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与所述阴离子交换剂结合。然后用第一洗涤溶液洗涤阴离子交换剂，通过酸将结合的L-半胱氨酸从阴离子交换剂去除，并将其转移到洗出液中。将pH≤4的所述洗出液与酸性阳离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与所述阳离子交换剂结合。用第二洗涤溶液洗涤阳离子交换剂，并通过强酸将结合的L-半胱氨酸从阳离子交换剂去除。
Description
本发明涉及用于从含L-半胱氨酸的发酵肉汤中提纯L-半胱氨酸的方法。
L-半胱氨酸是一种氨基酸，其由于良好的水溶解性和SH基对许多试剂，例如对氧化剂的高敏感性，在较大的难度和高费用下才能提纯和分离。
US2590209描述了用于将氨基酸混合物分离成酸性、中性和碱性的氨基酸的一般方法，其中首先将酸性蛋白质水解物通过阳离子交换剂，然后通过氢氧化铵洗脱酸性和中性的氨基酸，同时保留碱性氨基酸。随后使用碳酸盐溶液将这些碱性氨基酸从阳离子交换剂洗出。进而通过下游的阴离子交换剂分离酸性和中性的氨基酸，在阴离子交换剂上只结合酸性氨基酸。所述方法不适于提纯半胱氨酸，因为将碱用作洗脱剂，而半胱氨酸在高pH值下是特别对氧化敏感的。
EP1958933A1（对应US2008-0190854）描述了提纯中的问题以及分离L-半胱氨酸的现有技术。该申请描述了一种方法，其中使包含能够在pH值<5下氧化半胱氨酸的氧化剂的含L-半胱氨酸的发酵肉汤在pH为5-9下与离子交换剂接触，其中发酵肉汤中出现pH<5，优选pH<2。在此，L-半胱氨酸与离子交换剂结合，并且结合的L-半胱氨酸通过洗脱剂从离子交换剂去除。随后可通过分级结晶从洗出液中得到L-半胱氨酸单盐酸盐一水合物。通过加入浓HCl或通过引入HCl气体首先结晶出无机碱金属离子和碱土金属离子的氯化物以及氯化铵。在过滤后，将含L-半胱氨酸的母液冷却至-10℃，L-半胱氨酸盐酸盐一水合物结晶。但是，收率和纯度取决于所使用的含L-半胱氨酸溶液的纯度；高达>98重量%的纯度要求进一步的分级结晶和/或重结晶。
例如从EP0885962B1（对应US5972663A）得知用于L-半胱氨酸的发酵制备的方法。这些方法使得可以经济地得到含大量L-半胱氨酸的发酵肉汤。
这种含L-半胱氨酸的发酵肉汤是复杂的混合物。它不仅包含L-半胱氨酸，而且通常还包含在发酵条件下，特别是通过存在的氧气的氧化而易于由L-半胱氨酸形成的L-胱氨酸。如EP0885962B1所述，在醛或酮的存在下，还可存在相应的L-半胱氨酸的半硫缩酮(hemithioketal)和/或噻唑烷的衍生物。发酵肉汤还可包含少量的其它氨基酸或它们的衍生物。它们通常还包含糖类、有机和无机阳离子和阴离子的盐例如碱金属盐和碱土金属盐以及痕量的重金属盐（例如Fe、Cu、Mn、Zn等）、着色剂和其它杂质和添加剂，例如发酵中使用的微生物的不希望的代谢物。此外，发酵肉汤还可包含发酵中使用的原料和成分，例如常规碳源，例如葡萄糖、乳糖、淀粉等；氮源，例如氨/铵或蛋白质或蛋白质水解物等；以及硫源，例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐等。由于L-半胱氨酸是含硫的氨基酸，所以硫源例如硫化物、亚硫酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐或连二亚硫酸盐等通常在发酵过程中供入以提供用于形成L-半胱氨酸所需的足够量的硫。此外，由于发酵过程中引入氧气，溶解氧也存在于发酵肉汤中。如EP0885962B1所示，这些发酵肉汤的pH通常为7。除了发酵肉汤的组成的复杂性之外，还会出现各成分比例上的自然波动，因为肉汤是生物过程的产物。
本发明的目的是提供一种用于由含L-半胱氨酸的发酵肉汤制备提纯的含L-半胱氨酸溶液的简单、不昂贵且工业可实施的方法。
该目的通过一种方法实现，在所述方法中将含L-半胱氨酸的发酵肉汤在6-9的pH下与碱性阴离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与阴离子交换剂结合，用第一洗涤溶液冲洗所述阴离子交换剂，用酸将结合的L-半胱氨酸从阴离子交换剂中去除，并将其转移到洗出液中，将所述洗出液在≤4的pH下与酸性阳离子剂接触，其中L-半胱氨酸与阳离子交换剂结合，用第二洗涤溶液冲洗阳离子交换剂，并用强酸将结合的L-半胱氨酸从阳离子交换剂去除。
本发明的方法总是得到均匀的溶液，而无论发酵肉汤组成的波动，这是因为L-半胱氨酸可靠并且几乎完全地从所有伴随的物质中分离出。如需要，然后可从溶液中得到固体形式的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。为此，优选浓缩所得溶液，直至结晶出理想的产物，优选是L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。以此方式得到的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物具有>98重量%的纯度。不需要EP1958933A1中所述的分级结晶。
优选在已分离出细胞和固体物之后，使用本发明的方法首先通过碱性离子交换剂，然后通过酸性离子交换剂提纯含L-半胱氨酸的发酵肉汤。
酸性离子交换剂和碱性离子交换剂是已知且市售的。各种合适材料的选择见于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.A14，p.451。作为活性离子交换基团，它们包含例如羧酸基（弱酸性离子交换剂）、磺酸基和磷酸基（强酸性离子交换剂）、季铵基（强碱性离子交换剂）或胺基（弱碱性离子交换剂）。作为活性离子交换基的反荷离子，阳离子或阴离子可与离子交换剂结合。酸性离子交换剂通常以质子化H+形式使用，但其它的常规反荷离子是例如铵离子、碱金属离子和/或碱土金属离子。碱性离子交换剂，特别是强碱性离子交换剂常以OH-形式使用，但其它常规的反荷离子是例如氯离子和现有技术中描述的其它离子。
优选使用强酸性离子交换剂和强碱性离子交换剂。阴离子交换剂优选以OH-形式使用，而阳离子交换剂优选以H+形式使用。但是，原则上也可使用具有其它反荷离子的离子交换剂。
含L-半胱氨酸的发酵肉汤优选首先与强碱性阴离子交换剂接触，然后将来自阴离子交换剂的含L-半胱氨酸的洗出液与强酸性阳离子交换剂接触。这可例如通过使发酵肉汤或洗出液泵入用相应的离子交换剂填充的柱而实施。所使用的发酵肉汤的pH相当于发酵过程中的pH，为6-9，优选为6-8。
来自阴离子交换剂的含L-半胱氨酸的洗出液优选在pH为1-4下施用于阳离子交换剂。
所述第一洗涤溶液优选是pH为6-8的水，特别优选是pH为7的水（中性水）。使用该洗涤溶液洗涤从阴离子交换剂中去除发酵肉汤中的中性和阳离子成分。
所述第二洗涤溶液优选是pH为4-8的水，特别优选是pH为5-7的水。使用该中性至略酸性的水洗涤从阳离子交换剂中去除阴离子杂质。
在本专利申请中给出的所有pH值都是在25o℃下测定的pH。
在产生本发明的试验中，出人意料地发现在>7的pH值下通过环境氧或其它氧化剂很容易转化为L-胱氨酸的L-半胱氨酸可吸收在碱性离子交换剂上，并在无显著的氧化下又洗脱掉。这是特别出人意料的，因为当在洗脱与酸性阳离子交换剂结合的L-半胱氨酸中使用碱例如氨水时，观察到L-半胱氨酸显著氧化为L-胱氨酸。该氧化造成收率直接显著的下降（参见实施例3-6），因此方法的经济性不再是理想的。
如果中性的含L-半胱氨酸的溶液或发酵肉汤与阴离子交换剂，优选OH-形式的强碱性阴离子交换剂接触，L-半胱氨酸在该操作中基本定量地与阴离子交换剂结合。其它氨基酸例如L-胱氨酸和/或可存在于发酵肉汤中的其它阴离子在此也可与离子交换树脂结合。许多其它杂质，例如中性化合物或阳离子或它们相应的碱不与阴离子交换树脂结合，而存在于流出物中。
在使用酸洗脱之后，将含L-半胱氨酸的溶液与阳离子交换剂，优选H+形式的强酸性阳离子交换剂接触，导致L-半胱氨酸与阳离子交换剂定量结合。仍存在的阴离子杂质不与阳离子交换树脂结合，而存在于流出物中。
作为洗脱剂，优选使用强酸，为此目的优选是pKa小于4.5的酸，特别优选是盐酸。盐酸水溶液是特别适用的。
在使用盐酸洗脱中，将优选具有不同当量浓度的盐酸水溶液，更优选0.01-12N HCl，特别优选0.01-1N HCl，泵压通过吸附有L-半胱氨酸的阴离子交换剂。非常特别优选在洗脱过程中HCl浓度从初始0.01N增加至1N的洗脱剂。
在使用盐酸洗脱中，优选泵压具有不同当量浓度的盐酸水溶液，优选0.1-12N HCl，特别优选1-2N HCl通过装载有L-半胱氨酸的阳离子交换剂。
优选在25℃和周围大气压力即900-1100hPa下实施吸附、洗涤步骤和洗脱。但是，也可在更低或更高的温度和压力下实施。
使用盐酸洗脱L-半胱氨酸得到L-半胱氨酸的提纯HCl溶液。该溶液可任选浓缩，并且例如通过活性炭脱色。任选地，在加入HCl之后，使工业上特别重要的产物L-半胱氨酸盐酸盐一水合物结晶。通过双离子交换剂的提纯能够得到高纯度的L-半胱氨酸，无论初始采用的发酵肉汤的组成如何。不需要例如通过分级结晶的其它提纯。
本发明的方法能够从含L-半胱氨酸的发酵肉汤有效提纯L-半胱氨酸，并具有良好的收率和经济性。当需要或希望时，可能存在的任何L-半胱氨酸的衍生物，例如L-胱氨酸或噻唑烷衍生物可例如在特定的方法条件下转化为L-半胱氨酸，以提高所达到的收率。因此，例如经过强酸性阳离子交换剂而使半胱氨酸的噻唑烷衍生物断裂是已知的，并且描述于EP1059288B1中。通过加入合适的还原剂而使L-胱氨酸断裂形成L-半胱氨酸也是可想到的。
无论初始采用的发酵肉汤的组成如何，所述方法能够将外来的氨基酸含量降低至基于L-半胱氨酸<5重量%，优选<1重量%。此外，还可将含盐量降低至基于L-半胱氨酸<10重量%，优选<1重量%。此外，所述方法可由含L-半胱氨酸的发酵肉汤制备纯度>98重量%且光学纯度>99%的L-半胱氨酸或L-半胱氨酸盐酸盐或L-半胱氨酸盐酸盐一水合物，而不需要例如通过分级结晶再额外提纯。
在实施本发明方法之前，优选在第一方法步骤中从含L-半胱氨酸的发酵肉汤分离出微生物细胞和/或不溶性成分。这例如通过离心、过滤、滗析、膜过滤或本领域技术人员熟悉的用于从发酵肉汤分离细胞/固体物的方法来实施。所述分离任选通过加入过滤助剂例如
活性炭或硅藻土实施。在该方法步骤中，在发酵中可由微生物形成的除了细胞之外的其它不溶性成分，例如从溶液沉淀的胱氨酸或其它微溶的成分的沉淀物也有利地从发酵肉汤中分离出。此外，大分子，例如蛋白质可在该方法步骤中例如分离出或吸附在任选使用的过滤助剂或活性炭等上并因此分离出。通过该预处理得到的含L-半胱氨酸的溶液出于本发明目的也包括在术语“发酵肉汤”之下。
以下实施例用于说明本发明。
实施例1：通过本发明的方法提纯含L-半胱氨酸的发酵肉汤
在中性pH（pH：7）下将500ml无细胞的发酵肉汤（24g/l L-半胱氨酸、1.2g/l L-胱氨酸、18g/l N-乙酰丝氨酸）施用于150ml的阴离子交换树脂（OH-形式），所述阴离子交换树脂从Rohm&Haas以名称FPA42Cl可购得。然后用250ml水（pH7）洗涤树脂，并用1750ml HCl洗脱。在此，逐步每250ml将酸浓度从0.01M HCl提高至0.1M HCl至0.25M HCl至0.5MHCl。通过HPLC测定各情况中洗出液馏分的半胱氨酸含量，并合并含半胱氨酸的馏分。在该合并溶液中，将500ml施用于120ml的阳离子交换树脂（H+形式），所述阳离子交换树脂从Rohm&Haas以名称
FPC14-Na可购得。然后用120ml水洗涤树脂，并用720ml1M HCl洗脱树脂。
来自阴离子交换剂的洗出液中的含半胱氨酸馏分包含大于85%的所施用的发酵肉汤中存在的L-半胱氨酸，并且在来自阳离子交换树脂的洗出液的产物馏分中的L-半胱氨酸的收率是定量的。
实施例2：对比例：仅通过阳离子交换剂提纯含L-半胱氨酸的发酵肉汤（对应EP1958933A1中的方法），洗脱剂：HCl
通过6M HCl将6500ml pH为7的无细胞的发酵肉汤酸化至pH=1，并在1小时后离心分离掉变性蛋白质和其它固体物。通过阳离子交换剂
FPC14-Na，H+形式）提纯5350ml澄清的含HCl的溶液（19g/l L-半胱氨酸、1.4g/l L-胱氨酸、8g/l N-乙酰丝氨酸）。将溶液施加至离子交换剂，用3300ml水洗涤柱，并用5500ml1M HCl洗脱。洗出液中的含半胱氨酸馏分包含85%所用的半胱氨酸量以及溶液中存在的阳离子。
实施例3：对比例：通过阳离子交换剂在碱性条件下提纯含L-半胱氨酸的发酵肉汤，洗脱剂：NH4OH
通过6M HCl将100ml pH为7的无细胞的发酵肉汤酸化至pH=1，并在1小时后离心分离掉变性蛋白质和其它固体物。通过阳离子交换剂（20ml
FPC14-Na，H+形式）提纯澄清的含HCl的溶液（20g/l L-半胱氨酸、1.2g/l L-胱氨酸、8g/l N-乙酰丝氨酸）。将溶液施加至离子交换剂，用60ml水洗涤柱，并用100ml2M NH3洗脱。产物馏分包含约50%的所施用的发酵肉汤中存在的L-半胱氨酸、以及相对于初始量显著提高的胱氨酸量。
实施例4：来自实施例1的HCl洗出液的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的结晶
将500ml来自实施例1的提纯的含L-半胱氨酸的溶液（使用1M HCl得到的洗出液）在45℃和50mbar下在旋转蒸发器上蒸发，直至开始结晶，然后使溶液缓慢变为室温，随后继续将温度降低至-18℃。在搅拌3小时之后，在预冷的吸滤器上通过抽吸过滤掉沉淀物，并在空气中干燥。
收率：6.5g细结晶固体，>98重量%的半胱氨酸盐酸盐一水合物（基于原溶液=无细胞的发酵肉汤，相当于70%的总半胱氨酸收率）
实施例5：对比例：来自实施例2的HCl洗出液的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的结晶
将5500ml来自实施例2的提纯的含L-半胱氨酸的溶液（使用1M HCl得到的洗出液）在45℃和50mbar下在旋转蒸发器上蒸发，直至开始结晶，然后使溶液缓慢变为室温，随后继续将温度降低至-18℃。在搅拌3小时之后，在预冷的吸滤器上通过抽吸过滤掉沉淀物，并在空气中干燥。
收率：120g细结晶固体，79重量%的半胱氨酸盐酸盐一水合物（基于原溶液=无细胞的发酵肉汤，相当于64%的总半胱氨酸收率）
实施例6：对比例：来自实施例3的HCl洗出液的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物的结晶
将100ml来自实施例3的提纯的含L-半胱氨酸的溶液（使用2M NH3得到的洗出液）在45℃和50mbar下在旋转蒸发器上蒸发，直至开始结晶，然后使溶液缓慢变为室温，随后继续将温度降低至-18℃。在搅拌3小时之后，在预冷的吸滤器上通过抽吸过滤掉沉淀物，并在空气中干燥。
收率：所得产物的分析显示在这些条件下，约90%所用的L-半胱氨酸转化为L-胱氨酸。
Claims (8)
1.用于由含L-半胱氨酸的发酵肉汤制备提纯的含L-半胱氨酸的溶液的方法，其特征在于，将所述含L-半胱氨酸的发酵肉汤在6-9的pH下与碱性阴离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与所述阴离子交换剂结合，用第一洗涤溶液冲洗该阴离子交换剂，通过酸将结合的L-半胱氨酸从阴离子交换剂去除，并将其转移到洗出液中，将所述洗出液在≤4的pH下与酸性阳离子交换剂接触，其中L-半胱氨酸与所述阳离子交换剂结合，用第二洗涤溶液冲洗该阳离子交换剂，并通过强酸将结合的L-半胱氨酸从阳离子交换剂去除。
2.权利要求1的方法，其特征在于，使用强酸性离子交换剂和强碱性离子交换剂。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述阴离子交换剂以OH-形式使用，以及所述阳离子交换剂以H+形式使用。
4.权利要求1的方法，其特征在于，所述第一洗涤溶液是pH为6-8的水，特别优选是pH为7的水。
5.权利要求1的方法，其特征在于，所述第二洗涤溶液是pH为4-8的水，特别优选是pH为5-7的水。
6.权利要求1的方法，其特征在于，首先从所述发酵肉汤中分离掉细胞和固体物。
7.权利要求1的方法，其特征在于，所得溶液首先被浓缩，随后从浓缩溶液中结晶出L-半胱氨酸盐酸盐一水合物。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所得L-半胱氨酸盐酸盐一水合物具有>98重量%的纯度。
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