CN101671703A

CN101671703A - 一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法

Info

Publication number: CN101671703A
Application number: CN 200910069517
Authority: CN
Inventors: 贾士儒; 莫治文; 谭之磊; 王国良; 范宝庆; 王甜; 李琳; 周斌
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2009-07-01
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2029-07-01
Also published as: CN101671703B

Abstract

本发明涉及一种提高ε－聚－L－赖氨酸产量的新方法，是采用从土壤中筛选所获得的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)[对S－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(以下简称AEC)、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]，在原生产工艺基础上，通过流加L－赖氨酸、葡萄糖和(NH₄)₂SO₄的混合液进行ε－聚－L－赖氨酸的发酵生产，产物量比不流加L－赖氨酸的过程提高25～50％。本发明改变了原有生产工艺方法，显著提高了ε－聚－L－赖氨酸的产率，降低了成本，可用于工业规模的发酵。

Description

一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种提高一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)生产ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法，该新方法涉及到在发酵过程中流加L-赖氨酸。

背景技术

ε-聚-L-赖氨酸是一种含有25～30个残基的赖氨酸同聚物，它易溶于水，但不溶于乙酸乙酯、乙醇、乙醚等有机溶剂；其热稳定性高，120℃加热10min仍具有抑菌活性。ε-聚-L-赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，其抑菌谱广，在中性和微酸性条件下，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌都有抑制作用，其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。在一定条件下，也可使某些噬菌体明显失活。ε-聚-L-赖氨酸安全性高，在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。FDA于2004年1月批准日本Chisso公司的ε-聚-L-赖氨酸为GRAS产品。因此，ε-聚-L-赖氨酸是一种理想的生物防腐剂。

到目前为止，已知岩田敏治等人在中国申请的专利(专利名称为：大量生产ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，专利号：97182253.0)是在培养基中培养菌株B21021(FERM BP-5926)，然后从培养基中分离和纯化ε-聚-L-赖氨酸。该菌株是通过对小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理而获得的，其对浓度为10mg/mL或更高的AEC具有抗性。

徐虹等人申请的专利(专利名称为：利用北里孢菌PL6-3制备的方法，专利号为：200510037774.2)是以北里孢菌(Kitasatospora sp.)即CCTCC No.M205012培养在含有碳源、氮源等的培养基上，然后通过离子交换树脂法从发酵液中分离得到ε-聚赖氨酸及其盐。

贾士儒等申请的专利(专利名称为：回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，专利号为：200610013800.2)是以从土壤中筛选所获得的白色链霉菌(Streptomyces albulus)[AEC、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]为生产菌种，在发酵过程中流加提取过程的后期穿透液，然后通过离子交换树脂法提取得到ε-聚-L-赖氨酸。

贾士儒等申请的专利(专利名称为：一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，专利号为：200710057098.4)是以在中国海南省土壤中分离得到的TUST1为基础上利用紫外诱变、紫外和化学诱变相结合，以及N离子注入等诱变方法选育出的ε-聚赖氨酸的高产菌株，该菌株对10mg/mL或更高浓度AEC有抗性，优化后产酸达10～30g/L。发酵液经离心、过滤和离子交换树脂等处理后得到分子量分布为4000～6500Da的ε-聚赖氨酸。

吴光耀申请的专利(专利名称为：一种天然抗菌防腐剂聚赖氨酸及其制备方法，专利号为：200710067250.7)是以白色链霉菌经过2～4次扩大培养，接种于麦芽汁发酵培养液中，然后从发酵混合物中分离得到聚赖氨酸。

L-赖氨酸是ε-聚-L-赖氨酸的直接前体，但是现有的ε-聚-L-赖氨酸的发酵工艺中，没有关于流加L-赖氨酸的报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种与常规ε-聚-L-赖氨酸生产方法相比，目的产物获得量更高的发酵生产方法。本发明所述的新方法是在发酵过程中流加L-赖氨酸，该方法较原有工艺显著提高了ε-聚-L-赖氨酸的生成量，降低了成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用流加工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的新方法，该方法是在发酵过程中间歇流加L-赖氨酸，然后从发酵液中分离得到ε-聚-L-赖氨酸。

实现本发明的技术方案是：

利用经活化的淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌菌株进行发酵培养，获得本发明的ε-聚-L-赖氨酸。在发酵培养过程中，可将斜面菌种首先进行液体种子培养，再以10％接种于发酵培养基中进行发酵培养。

本发明所指出的ε-聚-L-赖氨酸可在以下条件下进行培养。初始pH 6.8～7.0、温度25～35℃、好气条件下振荡培养或搅拌培养，种子培养15～30h；发酵时间在40～120h之间时，每2h测定一次残糖含量，当残糖含量小于10g/L时，流加葡萄糖和(NH₄)₂SO₄，同时流加L-赖氨酸，使发酵培养基中葡萄糖含量维持在13g/L左右。培养时间约为120h，只要在本发明的ε-聚-L-赖氨酸产量达到最高时结束即可。经如上所述的培养，主要在培养液中产生本发明的ε-聚-L-赖氨酸。

如上所得的培养液中收集ε-聚-L-赖氨酸，可按照常规方法进行。本发明获得所述ε-聚-L-赖氨酸是将发酵液离心以除去菌体及部分固形物，具体操作是利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例的进一步验证，得知本发明所改进的流加方案的有效性。

通过实施本发明具体的技术指标，可以实现本发明内容。

具体实施方式

首先需要说明的是：

1.所用白色链霉菌(Streptomyces albulus)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1986，保藏日期分别为2007年3月23日。

2.所用淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3145，保藏日期为2009年6月29日。

以下是实施例，将对本发明作进一步说明，但是本发明并不仅限于以下实施例。

实施例1叙述的是现有的生产工艺；

实施例2，实施例3及实施例4为与实施例1相对比的创新工艺。

实施例1：

在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好气培养120h，空气流速为4.0～6.0L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25～30％)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH₄)₂SO₄(80g/L)使残糖浓度达到13g/L。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右。

培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε-聚-L-赖氨酸为10.7g/L。离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

实施例2：

在装有2.7L培养基的5L发酵罐中，接种300mL淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好氧培养120h，空气流速为4.0～6.0L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25～30％)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH₄)₂SO₄(80g/L)使残糖浓度达到13g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右。

培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε-聚-L-赖氨酸19.0g/L。离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

实施例3：

在装有16.2L培养基的30L发酵罐中，接种1.8L淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的二级摇瓶种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好气培养120h，空气流速为4.0～6.0L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25～30％)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH₄)₂SO₄(80g/L)使残糖浓度达到13g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(10g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右。

培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε-聚-L-赖氨酸为14.6g/L。离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

实施例4：

在装有16.2L培养基的30L发酵罐中，接种1.8L淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌的二级摇瓶种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好气培养120h，空气流速为4.0～6.0L/min。当pH降至6.0左右时，流加氨水(25～30％)维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至10g/L时，通过流加葡萄糖(400g/L)和(NH₄)₂SO₄(80g/L)使残糖浓度达到13g/L，并向发酵液中流加L-赖氨酸(15g/L)。同时，不再控制pH，让其自然降至4.0并维持在4.0左右。

培养120h，结束发酵，发酵液中最高积累ε-聚-L-赖氨酸为17.6g/L。离心去除菌体及部分固形物，利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经D392大孔弱碱性阴离子交换树脂脱色后，再经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

Claims

1.一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法，其特征在于：以淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)为生产菌株，在发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的过程中，产物开始积累以后，向培养基中流加L-赖氨酸，达到提高产量的目的。这种生产ε-聚-L-赖氨酸的具体方法是：

步骤1：采用从土壤中筛选所获得的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)或白色链霉菌(Streptomyces albulus)进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为初始pH 6.8～7.0、温度25～35℃、有氧条件下振荡培养或搅拌培养，种子培养15～30h，发酵时间为96～120h；培养过程中，流加碳源和氮源的同时流加L-赖氨酸。

步骤2：发酵结束后，将发酵液离心以除去菌体及部分固形物，利用阳离子交换树脂对上清液进行交换吸附后洗脱，洗脱液经阴离子交换树脂脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸盐酸盐。

2.如权利要求1所述的生产菌株，其特征在于：白色链霉菌(Streptomyces albulus)和淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)已由中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号分别为CGMCC No.1986和CGMCC No.3145，保藏日期分别为2007年3月23日和2009年6月29日。

3.如权利要求1所述的工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于：当发酵时间在40～120h之间时，每2h测定一次残糖含量，当残糖含量小于10g/L时，流加葡萄糖和(NH₄)₂SO₄，同时流加L-赖氨酸，直至葡萄糖含量达到13g/L左右。

4.如权利要求1所述的工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于：分离提取所用的阳离子交换树脂为D152大孔弱酸性阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为D392大孔弱碱性阴离子交换树脂。

5.如权利要求1所述的工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于：流加L-赖氨酸较不流加时，ε-聚-L-赖氨酸的产率较原有工艺提高了25～50％，显著降低了成本。