CN102827889A - 玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，属于发酵工程领域。用玉米浸泡水代替部分配料用水和酵母膏，采用从土壤中筛选所获得的弗吉尼亚链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸。该工艺操作方便，不但可以节约配料用水，还能够节省玉米浸泡水浓缩时的能耗，同时也解决了原来处理玉米浸泡水时的环境污染问题。此外，其产酸率和糖酸转化率也有所提高，可用于工业规模的发酵。

Description

玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种以玉米浸泡水代替部分配料用水和酵母膏用于发酵生产ε-聚赖氨酸产量的新方法。 

背景技术

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种氨基酸同聚物，由25-35个赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基连接而成。它易溶于水，但不溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯等有机溶剂。ε-PL不仅对G⁺和G^-有抑制作用，对绝大多数真菌也有较好的抑菌效果，并且对耐热芽孢杆菌和部分病毒也有抑制作用；在一定条件下，也可使某些噬菌体明显失活。它不受pH影响，对热稳定性（120 ℃，20 min）。美国食品药品管理局（FDA）于2004年1月批准ε-PL为一般认为安全的（GRAS）产品。它在人体内可被分解人体八种必需氨基酸之一的L-赖氨酸，后者也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此，ε-PL是一种理想的生物防腐剂。 

玉米浸泡水（参照《玉米淀粉工业手册》2009年9月第一版）是在生产玉米淀粉过程中产生的，其pH在4.0左右，干物质含量为7%-9%。玉米浸泡水中含有生物可利用的葡萄糖、氨基酸和微量元素，此外还含有生物素、V_B1、核黄素等。目前，大多数企业都是将玉米浸泡水进行浓缩制成玉米浆或玉米粉。在此过程中会消耗大量的能源，也对环境造成了一定程度的污染。 

王勇等人用玉米浸泡水代替豆粕水解液制备发酵培养基，发酵生产赖氨酸，明显降低了原料成本，专利申请号：200510043807.4；随后，他们利用玉米浸泡水在非无菌条件下培养饲料用酵母，专利申请号：200610068445.9。 

贾士儒等人以从土壤中筛选所获得的白色链霉菌为生产菌种，在发酵过程中流加提取过程的后期穿透液，发酵生产ε-聚-L-赖氨酸（专利申请号： 200610013800.2）；此外，他们还以淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌为生产菌种，在发酵过程中流加L-赖氨酸、葡萄糖和(NH₄)₂SO₄的混合液发酵生产ε-聚-L-赖氨酸，产物量比不流加L-赖氨酸的过程提高25%-50%，专利申请号： 200910069517.5。 

吴光耀等人将白色链霉菌经过2-4次扩大培养，接种于麦芽汁发酵培养液中，发酵生产ε-聚赖氨酸，专利申请号：200710067250.7。 

上述文献探讨了玉米浸泡水的综合利用以及ε-PL的生产工艺，但以玉米浸泡水 代替酵母膏发酵生产ε-PL的方法还未见报道。 

发明内容

本发明提供一种玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，以解决玉米浸泡水利用率不高的问题。 

本发明采取的技术方案是： 

（1）沉淀：将新鲜的玉米浸泡水静置沉淀24 h或进行过滤，以去除固形物； 

（2）配料：将培养基各组分加入经过（1）处理的玉米浸泡水中，葡萄糖 40-50 g/L、酵母膏 3-6 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 8-12 g/L，自来水和玉米浸泡水的体积比为1:1，作为流加液，调节pH至3.9-4.1；作为培养液，调节pH至6.8-7.2； 

（3）灭菌：将配制好的培养基于121 ~125℃维持15-20 min，然后降至26-32 ℃； 

（4）接种：按照10%（v/v）的接种量进行接种，所用弗吉尼亚链霉菌，Streptomyces virginiae已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 

（5）发酵：种子培养阶段，初始pH为6.8-7.0、温度26-32 ℃、搅拌培养或振荡培养20-30 h；发酵时间40-144 h，pH3.8~ 4.2，流加葡萄糖300-500 g/L和(NH₄)₂SO₄40-80 g/L，使发酵培养基中葡萄糖含量在10-15 g/L，收集发酵液。 

该方法能够实现节水与节能，并有利于保护环境。本发明所述工艺，是利用玉米浸泡水替代部分配料用水和酵母膏，调整发酵培养基的原料配比。此外，由于ε-PL积累阶段的最适pH为4.0，这恰恰与玉米浸泡水的pH相一致，因此，采用本发明所述工艺，可以有效提高ε-PL的产量和糖酸转化率。 

具体实施方式

本发明所用弗吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日。 

实施例1 

（1）沉淀：将新鲜的玉米浸泡水静置沉淀24 h或进行过滤，以去除固形物； 

（2）配料：将培养基各组分加入经过（1）处理的玉米浸泡水中，葡萄糖 40 g/L、酵母膏 3 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 8 g/L，自来水和玉米浸泡 水的体积比为1:1，作为流加液，调节pH至3.9-4.1；作为培养液，调节pH至6.8-7.2； 

（3）灭菌：将配制好的培养基于121℃维持15 min，然后降至26 ℃； 

（4）接种：按照10%（v/v）的接种量进行接种，所用弗吉尼亚链霉菌，Streptomyces virginiae已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 

（5）发酵：种子培养阶段，初始pH为6.8、温度26 ℃、搅拌培养或振荡培养20 h；发酵时间40 h，pH3.8，流加葡萄糖300 g/L和(NH ₄)₂SO₄ 40 g/L，使发酵培养基中葡萄糖含量在10 g/L，收集发酵液。 

实施例2 

（1）沉淀：将新鲜的玉米浸泡水静置沉淀24 h或进行过滤，以去除固形物； 

（2）配料：将培养基各组分加入经过（1）处理的玉米浸泡水中，葡萄糖 45 g/L、酵母膏 4.5 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 10 g/L，自来水和玉米浸泡水的体积比为1:1，作为流加液，调节pH至3.9-4.1；作为培养液，调节pH至6.8-7.2； 

（3）灭菌：将配制好的培养基于123℃维持18min，然后降至29 ℃； 

（4）接种：按照10%（v/v）的接种量进行接种，所用弗吉尼亚链霉菌，Streptomyces virginiae已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 

（5）发酵：种子培养阶段，初始pH为6.9、温度29 ℃、搅拌培养或振荡培养25 h；发酵时间92 h，pH 4.0，流加葡萄糖450 g/L和(NH₄)₂SO₄ 60g/L，使发酵培养基中葡萄糖含量在12.5 g/L，收集发酵液。 

实施例3 

（1）沉淀：将新鲜的玉米浸泡水静置沉淀24 h或进行过滤，以去除固形物； 

（2）配料：将培养基各组分加入经过（1）处理的玉米浸泡水中，葡萄糖50 g/L、酵母膏6 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L，(NH₄)₂SO₄12 g/L，自来水和玉米浸泡水的体积比为1:1，作为流加液，调节pH至3.9-4.1；作为培养液，调节pH至6.8-7.2； 

（3）灭菌：将配制好的培养基于125℃维持20 min，然后降至32 ℃； 

（4）接种：按照10%（v/v）的接种量进行接种，所用弗吉尼亚链霉菌，Streptomyces virginiae已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号； 

（5）发酵：种子培养阶段，初始pH为7.0、温度32 ℃、搅拌培养或振荡培养30 h；发酵时间144 h，pH 4.2，流加葡萄糖500 g/L和(NH₄)₂SO₄ 80 g/L，使发酵培养基中葡萄糖含量在15 g/L，收集发酵液。 

试验例：本发明所述菌株筛选方法： 

土样采回后，每克土样中添加0.l g CaCO₃，在室温下自然风干3-10 d，碾碎过筛，于50 ℃烘1-2 h。称取l g土样加入到10 mL无菌的pH 7.0磷酸缓冲液中，50 ℃振荡10 min。取0.2 mL样液涂布于SGB培养基，28 ℃培养3-7 d。挑取在SGB培养基中形成透明圈的单菌落接于SG培养基中，28 ℃培养7 d，然后挖取菌落周围琼脂块，用Dragendorff试剂检测，挑取Dragendorff阳性反应的菌株进行复筛。将菌株接于复筛培养基中进行培养，对发酵产物进行分析鉴定，并选取一株ε-PL产量最高的菌株。 

SG培养基（g/L）：甘油10，琼脂15，酵母膏0.1，NaH₂PO₄ 0.68，MgSO₄·7H₂O 0.25，(NH₄)₂SO₄ 0.66，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。 

SGB培养基：SG培养基中加入美蓝0.002%，121 ℃灭菌20 min。 

复筛培养基（g/L）：葡萄糖50、酵母膏 5、KH₂PO₄ 1.36、K₂HPO₄ 0.8，(NH₄)₂SO₄ 10，pH 6.8，121 ℃灭菌20 min。 

上述弗吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

下边通过具体对比试验例来进一步说明采用本发明菌株的有益效果。 

实施例1： 

选用菌种小白链霉菌，弗吉尼亚链霉菌CGMCC No.6420。 

在500 mL三角瓶中装入100 mL培养基（pH 7.0），挑取一环孢子，180-200 rpm，培养28 h。吸取10 mL种子培养液于装有90 mL培养基（pH 7.0）的500 mL三角瓶中，180-200 rpm，培养72 h。采用不同的培养基用水和生产菌种，结果见表1。 

表1 500 mL三角瓶中的发酵结果 

结论：从表1中的数据可以看出，培养基用水中以玉米浸泡水代替50%的自来水，其ε-PL产量要比单独使用自来水配制培养基时提高16.4%；而筛选出的弗吉尼亚链霉菌CGMCC No.6420，其发酵能力要比小白链霉菌高17.2%。 

实施例2： 

选用菌种小白链霉菌，弗吉尼亚链霉菌CGMCC No.6420。 

在5 L发酵罐中装入2.7 L培养基（pH 7.0），接种300 mL种子培养液，待DO降至25 %时自动控制为25 %，300-700 rpm，培养144 h，空气流速为4.5-6.0 L/min。当pH降至6.0时，流加氨水（30%）维持pH为6.0，当发酵液中的残糖浓度降至8 g/L时，通过流加葡萄糖（350 g/L）和(NH₄)₂SO₄（60 g/L）使残糖浓度达到12 g/L。同时，pH自然降至4.0并维持在4.0左右。采用不同的培养基用水和生产菌种，结果见表2。 

表2 5 L发酵罐中的发酵结果 

结论：从表2中的数据可以看出，培养基用水中以玉米浸泡水代替50%的自来水，其ε-PL产量要比单独使用自来水配制培养基时提高14.7%；而筛选出的弗吉尼亚链霉菌CGMCC No.6420，其发酵能力要比小白链霉菌高12.7%。 

Claims (1)

1.一种玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）沉淀：将新鲜的玉米浸泡水静置沉淀24 h或进行过滤，以去除固形物；

（2）配料：将培养基各组分加入经过（1）处理的玉米浸泡水中，葡萄糖 40-50 g/L、酵母膏 3-6 g/L、KH₂PO₄ 1.5 g/L、K₂HPO₄1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 8-12 g/L，自来水和玉米浸泡水的体积比为1:1，作为流加液，调节pH至3.9-4.1；作为培养液，调节pH至6.8-7.2；

（3）灭菌：将配制好的培养基于121 ~125℃维持15-20 min，然后降至26-32 ℃，

（4）接种：按照10%（v/v）的接种量进行接种，所用弗吉尼亚链霉菌，Streptomyces virginiae已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6420，保藏日期为2012年8月13日；

（5）发酵：种子培养阶段，初始pH为6.8-7.0、温度26-32 ℃、搅拌培养或振荡培养20-30 h；发酵时间40-144 h，pH3.8~ 4.2，流加葡萄糖300-500 g/L和(NH₄)₂SO₄40-80 g/L，使发酵培养基中葡萄糖含量在10-15 g/L，收集发酵液。