CN103224973A - 一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法，是利用地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌来发酵虾头来制备活性物质、甲壳素和有机酸钙。本发明利用地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的协同作用来发酵虾头，在发酵过程中无需任何酸碱的加入，同时采用自来水即可发酵，大大降低生产成本。得到的发酵液虾香浓郁、无腥臭味和苦涩味，同时富含氨基酸、多酚、复合酶系等多种有益成分，可用于生产调味品、水解蛋白制品、功能性食品、保健品等各个领域。采用本发明方法可以从一批虾头中同时分离制备多种活性物质，如富含氨基酸和多酚等多种活性物质的水解蛋白质、食品级甲壳素和更宜于人体吸收的葡萄糖酸钙，实现对原料中有效成分的全面利用。

Description

一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法

技术领域

本发明涉及一种利用混合微生物协同发酵技术从虾头提取活性物质、甲壳素和有机酸钙的技术领域。

背景技术

我国对虾产量高，产品主要以出口为主，而出口产品又以无头虾（虾仁）为主。在生产冷冻虾仁的过程中，会产生大量的虾头和虾壳等废弃物（占对虾质量的30-40%），目前主要被用来生产饲料、调味料和甲壳素，其余部分被直接丢弃。对虾加工副产物中含有丰富的蛋白质、甲壳素、氨基酸、多酚、矿物质、脂质等成分，直接丢弃既浪费了宝贵的资源，又污染了环境。虾头的开发途径已由于虾头营养价值丰富，不断被人们所认识，世界许多国家都着力开发这一资源。

目前利用虾头的主要途径是直接用于生产甲壳素，而传统的甲壳素制备方法一般采用高浓度的盐酸或氢氧化钠处理原料，脱除其中的矿物质、蛋白质、脂质等杂质，再经脱色而成。这种生产方式不仅产生大量强酸性或强碱性的废水，严重污染环境，而且其中蛋白质、钙等矿物质均作为杂质被除去，无法利用，同时强酸强碱会破坏产物甲壳素的结构。

现有技术中虽有一些方法可以通过虾头的自溶或者加入蛋白酶回收大部分蛋白质，剩余的残渣再用于生产甲壳素。如公开号CN101129161A的发明是通过自溶反应生产酶解蛋白，同时得到虾壳粉。但这样的残渣中依然保留着绝大部分矿物质、脂类和部分蛋白质，用其生产甲壳素仍然需要采用高浓度的盐酸或氢氧化钠处理原料，同样无法解决污染等问题。又如公开号为CN102643368A的申请，是采用酶解方式分解分离得到虾肉浆和蛋白质，可得到含多肽的虾头提取物；从滤出的壳中提取甲壳素。该方法是利用蛋白酶来水解虾蛋白，从而断裂甲壳素与蛋白的结合，以提高甲壳素的回收率。酶解法虽然避免了大量强碱试剂的使用，但是商品化的酶制剂成本很高，也限制了从虾头中制备甲壳素的大规模应用。

为解决上述问题，发酵法即以甲壳类加工副产物为唯一营养成分，利用微生物生长过程所产生的各种酶和有机酸脱去对虾头和虾壳中的蛋白质及钙生产甲壳素。该方法较酶法成本低、且操作简单，便于工业化大量生产，同时能够有效避免对环境的严重污染，逐渐成为国内外研究的热点。但目前对于虾头的处理还存在许多问题，需要提供一种更有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法，即一种发酵效果更好的、无需盐酸处理即可得到食品级甲壳素和有机酸钙的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明方法，是利用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）来发酵虾头来制备活性物质、甲壳素和有机酸钙。

本发明的方法，其具体步骤如下：

1）选取虾头进行粉碎制成浆液；

2）将扩大培养的微生物菌液接种到步骤1）制备的浆液中进行发酵；

3）将发酵液分离上清液和残渣，将上清液进行浓缩干燥获得包含蛋白质和葡萄糖酸钙的物质；

4）将残渣干燥后制得甲壳素。

上述的步骤2）中，地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)和氧化葡萄糖酸杆菌(G. oxydans)是同时加入到浆液中的；

另一种方式，是先接种地衣芽孢杆菌，再发酵一段时间后，再接种氧化葡萄糖酸杆菌；或是先接种氧化葡萄糖酸杆菌，再接种地衣芽孢杆菌。

上述的步骤2）中发酵的条件如下：25-40℃、150-200rpm下震荡发酵12-72h；

上述的步骤1）或步骤2）的浆液中添加有葡萄糖；

上述步骤3）中的发酵液经2000-10000rpm离心和/或过滤分离成发酵上清液和残渣。

本发明利用地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的协同作用来发酵虾头，在发酵过程中无需任何酸碱的加入，同时采用自来水即可发酵，大大降低生产成本。得到的发酵液虾香浓郁、无腥臭味和苦涩味，同时富含氨基酸、多酚、复合酶系等多种有益成分，可用于生产调味品、水解蛋白制品、功能性食品、保健品等各个领域。采用本发明的方法可以从一批虾头中同时分离制备多种活性物质，如富含氨基酸和多酚等多种活性物质的水解蛋白质、食品级甲壳素和更宜于人体吸收的葡萄糖酸钙，实现对原料中有效成分的全面利用。而且， 本发明避免了传统甲壳素生产方法中使用大量盐酸、氢氧化钠，并产生大量废水的缺点，减少环境污染。

具体实施方式

本发明利用两种菌协同发酵从虾头中提取活性物质、甲壳素和有机酸钙，具体方法描述如下。上述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）两种微生物均可购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号分别是CGMCC 1.265和CGMCC 1.110。也可以是从其它途径获得，具有相同或类似代谢功能的菌株。

实施例1：

取冻存对虾虾头，室温解冻后称重约15g，加少许水，经高剪切均质机匀浆，收集匀浆物。加虾头重量8倍的水，制备培养基，121℃灭菌。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)接种于种子培养基（蛋白胨1%、酵母浸出物0.5%、氯化钠1%、pH7.2，上述浓度为质量体积百分比）中，置37℃恒温箱中震荡培养24h，再将其按10%的接种量接种于虾头培养基中37℃下培养48h，4000r/min离心5min，分别收集发酵液和发酵残渣，液体部分采用喷雾干燥得复合蛋白质粉1.09g，沉淀部分经烘干后得到甲壳素1.90g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为90.38%、45.53%。结果表明，地衣芽孢杆菌可以虾头为唯一的碳源和氮源进行生长，且脱蛋白率很高，但脱盐率较低，如表1所示。

实施例2：

取冻存的对虾虾头，室温解冻后称重约15g，加少许水，经高剪切均质机匀浆，收集匀浆物。加虾头重量8倍的10%葡萄糖溶液，制备培养基，115℃灭菌。对于葡萄糖的添加浓度，技术人员可以根据情况进行调节，而不仅限于本实施例的记载。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌进行活化。其他操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.20g，甲壳素1.69g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为93.69%、45.46%。由此可知，额外碳源（葡萄糖）的补充可提高地衣芽孢杆菌发酵虾头的脱蛋白率，脱盐率变化不大，如表1所示。

实施例3：

虾头前处理同实施例1（浆液中不加入葡萄糖水溶液）。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的氧化葡萄糖酸杆菌 (G. oxydans)，进行活化。其他操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.53g，甲壳素1.12g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为40.71%、93.46%。结果表明，氧化葡萄糖酸杆菌可以虾头为唯一的碳源和氮源进行生长，不需经过灭菌即可直接发酵，且脱盐率很高，但脱蛋白率较低，不及地衣芽孢杆菌的1/2，如表1所示。

实施例4：

虾头前处理同实施例2。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的氧化葡萄糖酸杆菌进行活化。其他操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.41g，甲壳素1.28g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为42.15%、95.31%。结果表明，额外碳源（葡萄糖）的补充可提高氧化葡萄糖酸杆菌发酵虾头的脱盐率，而脱蛋白率变化不大，如表1所示。

实施例5：

虾头前处理同实施例1。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌分别进行活化。再将两株菌的扩大培养液按体积比为10%的接种量接种于虾头培养基中，37℃下培养84h，4000r/min离心5min，分别收集发酵液和发酵残渣，操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.66g，甲壳素1.01g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为89.64%、91.52%。由此可见，将两株菌协同发酵虾头，脱蛋白率和脱盐率均可达到比较高的水平（见表1），说明两菌共同发酵虾头的可行性。

实施例6：

虾头前处理同实施例2（即浆液中加入虾头重量8倍的10%葡萄糖溶液）。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌分别进行活化。其他操作同实施例3。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.83g，甲壳素0.89g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为91.69%、93.46%。由此可知，当有额外碳源（葡萄糖）补充时，地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌协同发酵虾头的脱蛋白率和脱盐率均有不同程度的提高，如表1所示。

实施例7：

虾头前处理同实施例2。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌分别进行活化。先将地衣芽孢杆菌以5%的接种量接种于虾头培养基中，37℃下培养48h后，再以5%的接种量将氧化葡萄糖酸杆菌接种于上述虾头培养基中，继续于37℃下培养36h。其他操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.63g，甲壳素1.31g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为95.06%、94.51%。如表1所示，该工艺的脱蛋白率和脱盐率明显高于两菌单独发酵（实施例2和实施例4）以及两菌共同发酵的结果（实施例6）。

实施例8：

虾头前处理同实施例2。将已纯化冷藏或真空冷冻干燥保存的地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌分别进行活化。先将氧化葡萄糖酸杆菌以5%的接种量接种于虾头培养基中，37℃下培养36h后，再以5%的接种量将地衣芽孢杆菌接种于上述虾头培养基中，继续于37℃下培养48h。其他操作同实施例1。最终获得蛋白质和葡萄糖酸钙复合粉1.70g，甲壳素1.09g，测定工艺中脱蛋白率和脱盐率分别为92.11%、96.37%。如表1所示，该工艺的脱蛋白率和脱盐率均高于两菌单独发酵（实施例2和实施例4）以及两菌共同发酵的结果（实施例6），但脱盐率低于实施例7。

表1 ：不同发酵方式所得脱蛋白率和脱盐率的比较

上述结果表明，地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌均可以虾头为唯一的碳源和氮源进行生长；当虾头培养基中添加葡萄糖时，两种微生物对虾头的利用程度均不同程度地增大；两菌协同发酵过程以先接种地衣芽孢杆菌后接种氧化葡萄糖酸杆菌的脱盐率和脱蛋白率为最高。这一结果也在实际操作中获得了验证，因此，本发明的方法具有很好的推广应用价值。

Claims (8)

1.一种发酵虾头制备活性物质、甲壳素和有机酸钙的方法，其特征在于，是利用地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌来发酵虾头来制备活性物质、甲壳素和有机酸钙。

2.如权利要求1所述的方法，其步骤如下：

1）选取虾头进行粉碎制成浆液； 

2）将扩大培养的微生物菌液接种到步骤1）制备的浆液中进行发酵；

3）将发酵液分离上清液和残渣，将上清液进行浓缩干燥获得包含蛋白质和葡萄糖酸钙的物质；

4）将残渣干燥后制得甲壳素。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中，地衣芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌同时加入到浆液中的。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中先接种地衣芽孢杆菌后，再接种氧化葡萄糖酸杆菌。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中先接种氧化葡萄糖酸杆菌，再接种地衣芽孢杆菌。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤2）中发酵的条件如下：25-40℃、150-200rpm下震荡发酵12-72h。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤1）或步骤2）的浆液中添加有葡萄糖。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤3）中的发酵液经2000-10000rpm离心和/或过滤分离成发酵上清液和残渣。