CN102168122A - 一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，包括以下步骤，首先，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入水和葡萄糖或蔗糖，混合搅拌；其次，将粪肠球菌接入活化培养基活化，恒温培养，接入第一步的混合液中；然后，将接入粪肠球菌的混合液恒温发酵；最后，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓稀盐酸浸泡，再脱色，得到甲壳素，使用该方法制备甲壳素，各种最终产物都能得到有效利用，减少了污染。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及甲壳素的制备方法，尤其设计一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法。
背景技术
甲壳素又称几丁质、甲壳质，是以β-1，4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖为基本单位的直链多聚物。几丁质广泛存在于甲壳纲动物虾蟹、昆虫的甲壳以及真菌(酵母，霉菌)、藻类、植物的细胞壁中，是地球上蕴藏最丰富的有机物之一，在虾蟹壳中的含量高达15％-30％。
几丁质及其降解产物几丁寡糖、壳聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖具有抗癌、抗菌、调节免疫和植物生长等作用，在医药、农业和食品工业等方面具有广阔的应用前景和经济价值。目前几丁质主要是从虾蟹壳中提取。由于虾蟹壳中的甲壳质与蛋白质共价结合，以蛋白聚糖形式存在，同时伴生碳酸钙，所以，虽然制备甲壳质的方法很多，但都大同小异，主要操作方法是脱钙和脱蛋白，如Hackman法、Whistler和Bemiller法、Broussignac法、Peniston法等。由于目前人们所利用的甲壳质主要通过化学的方法来制取，在制备过程中需用大量的酸碱，产生大量的废水废料，严重污染了环境[3]。为减少对环境的污染，人们寻找各种替代的方法。一种途径是采用添加蛋白酶和有机酸的方法，通过蛋白酶降解虾蟹壳中的蛋白质，利用有机酸脱钙的工艺方法使蛋白质及钙与甲壳素分离，比如中国专利200810159615.3、201010217608.1(申请号)、02122565.6等。另一种途径是利用乳酸菌发酵将虾壳等原料中的蛋白质水解液化分离出来，发酵产生的乳酸将壳中的无机钙盐溶解，转移到发酵液中，剩余的残渣经脱色处理即可得到甲壳素。比如中国专利201010181224.9(申请号)、201010181245.0、200910040121.8等。涉及的乳酸菌包括嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌等。利用粪肠球菌发酵法生产甲壳素的报道则还未见到。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，该方法的各种最终产物都能得到有效利用，减少了污染。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，包括以下步骤：
第一步，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入粉碎物质量1～3倍的水和粉碎物质量10～20％的葡萄糖或蔗糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养24～36小时，接着按10～20％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在27～45℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为0.5～5mol/L的稀盐酸浸泡2小时以上，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
所述活化培养基为液体乳酸细菌培养基。
所述脱色也可以采用日光暴晒的方式。
与现有技术相比，本发明的优点在于
一、同化学方法相比，大大减少了对强酸碱的使用，降低了污染。
二、各种最终产物都得到有效利用，降低了污染，发酵液残渣用于制备甲壳素，发酵液离心后所得沉淀主要是粪肠球菌菌体，可用于生产益生菌制剂或喷雾干燥后得到单细胞蛋白，上清液富含乳酸钙，可用于制备钙片等补钙制品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，包括以下步骤：
第一步，将100g虾壳粉碎，加入100g水和10g葡萄糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养24小时，接着按10％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在27℃下恒温发酵48小时；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为0.5mol/L的稀盐酸浸泡6小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
实施例二
一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，包括以下步骤：
第一步，将100g蟹壳粉碎，加入300g水和20g蔗糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养36小时，接着按20％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在45℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为5mol/L的稀盐酸浸泡4小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
实施例三
一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，包括以下步骤：
第一步，将总重为100g的虾壳和蟹壳混合物粉碎，加入200g水和15g葡萄糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养30小时，接着按15％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在35℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为2mol/L以上的稀盐酸浸泡2小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
以上各实施例中，都可以采用日光暴晒脱色来代替双氧水脱色，更加经济实惠，所述的活化培养基可以采用液体乳酸细菌(MRS)培养基。
各实施例的发酵液经离心所得的菌体沉淀可加工后作为SCP，用作饲料添加剂或益生菌制剂原料，上清液中含有乳酸钙，可提取获得。
本发明的原理为：
虾蟹壳等甲壳类动物的外骨骼的成分主要是碳酸钙、甲壳素和蛋白质，同时还含有少量色素和其他物质，乳酸菌在生长过程中能够产生乳酸，乳酸可以将不溶于水的碳酸钙转化为可溶性的乳酸钙；乳酸菌生长过程中分泌的蛋白酶可以将虾蟹壳中的蛋白质水解。因此经过乳酸菌处理的虾蟹壳残渣主要成分就只有甲壳素，经过稀酸脱除残余矿物质和脱色处理就可以得到所需的甲壳素。
截止目前，利用虾蟹壳制备甲壳素都是用的化学方法，主要原因是成本较低。利用微生物降解法制备甲壳素的研究并不多，选用粪肠球菌主要是因为它可以作为生产甲壳素的副产品生产益生菌制剂，它作为益生菌制剂，具有一定的优越性，具体表现在
1、同其他益生性乳酸菌相比，粪肠球菌是人体肠道的正常菌群，因此可在体内长期生存，而其他多数乳酸菌属于过路菌，不能在体内长期生存，一旦停止服用益生菌制剂，就会在体内逐步减少。
2、同其他常用的益生菌相比，对酸和胆盐的耐受性高，因此在人体或动物食道的存活能力更强。
3、耐高温能力强，可常温保存。
Claims (7)
1.一种利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入粉碎物质量1～3倍的水和粉碎物质量10～20％的葡萄糖或蔗糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养24～36小时，接着按10～20％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在27～45℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为0.5～5mol/L的稀盐酸浸泡2小时以上，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
2.根据权利要求1所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入粉碎物等质量的水和粉碎物质量10％的葡萄糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养24小时，接着按10％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在27℃下恒温发酵48小时；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为0.5mol/L的稀盐酸浸泡6小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
3.根据权利要求1所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入粉碎物质量3倍的水和粉碎物质量20％的蔗糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养36小时，接着按20％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在45℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为5mol/L的稀盐酸浸泡4小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
4.根据权利要求1所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将甲壳类动物外骨骼粉碎，加入粉碎物质量2倍的水和粉碎物质量15％的葡萄糖，混合搅拌；
第二步，将粪肠球菌接入活化培养基活化，然后在37℃下恒温培养30小时，接着按15％的接种量，接入第一步的混合液中；
第三步，将接入粪肠球菌的混合液在35℃下恒温发酵48小时以上；
第四步，将发酵液与发酵残渣过滤分离后，发酵残渣经浓度为2mol/L以上的稀盐酸浸泡2小时，再用双氧水脱色，得到甲壳素。
5.根据权利要求1至4任一权利要求所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，所述活化培养基为液体乳酸细菌培养基。
6.根据权利要求1至4任一权利要求所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，所述脱色也可以采用日光暴晒的方式。
7.根据权利要求1至4任一权利要求所述的利用粪肠球菌发酵从甲壳类动物外骨骼中制备甲壳素的方法，其特征在于，所述的甲壳类动物外骨骼为虾壳、蟹壳或者两者的混合物。
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