CN108060194A - 一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽和甲壳素的方法 - Google Patents

一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽和甲壳素的方法 Download PDF

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Abstract

本发明公开了一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽和甲壳素的方法，具体的包含下列步骤：1)向研磨粉碎的虾蟹下脚料中加入适当的碳源，搅拌均匀后121℃灭菌；2)接种5‑10%的混合菌群；3)30‑40℃有氧发酵培养30‑40h，无氧发酵培养15‑20h；4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min；6)将步骤（5）所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1‑10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分；7)将步骤（4）所得固体残渣清洗晾干。8)将步骤（7）所得的固体残渣晾干采用稀醋酸处理后即得粗甲壳素；9）将步骤（8）所得粗甲壳素脱色即得甲壳素。本发明的方法可以得到高抗氧化能力的多肽以及甲壳素，本方法操作简单，极大的降低了生产成本，减少了环境污染，实现了虾蟹加工下脚料的高值化利用。

Description

一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽和甲壳素的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体的涉及一种通过发酵虾蟹壳来制备抗氧化多肽和甲壳素的方法。
背景技术
对虾蟹而言，其不可食用部分如虾头、蟹壳、虾壳等往往含有丰富的营养物质，比如普通青虾的虾头、虾壳约占整虾重量的1/3左右，虾蟹壳中含有丰富的甲壳素，虾头中还含有10％左右的蛋白质、丰富的维生素E、叶黄素、卵磷脂等成分，营养价值较高，但由于传统的烹饪方法无法对其进行直接加工成人类可以直接利用的美食，以及虾头中含有的大量有害病菌无法在烹饪时完全杀死等原因，无法被人类直接利用，造成了极大的资源浪费。
目前在工业上用虾蟹壳生产甲壳素的方法需要高浓度的酸碱等原料，成本高而且对环境也造成了污染，更为重要的是虾头蟹壳中其他的营养物质如蛋白质等也被破坏掉无法利用。而传统上采用蛋白酶水解虾蟹下脚料的方法，获取的蛋白质多肽等产品也都存在明显的苦涩味和腥臭味等缺点，而且由于蛋白酶的价格比较高使得其生产成本也比较高。
本发明的方法采用从虾蟹肠道中筛选的微生物对虾蟹下脚料进行发酵，前期进行有氧发酵积累菌种的数量，同时芽孢杆菌也会发酵产生多种蛋白酶，可以对虾蟹中无法直接利用的蛋白质进行水解，制备得到抗氧化肽，后期进行无氧发酵，乳酸菌产生的乳酸可以对虾蟹壳中的碳酸钙等矿物质进行软化分解，减少后期外源稀醋酸的添加量，同时整个反应pH呈现酸性也减少了有异味分子的产生。同时发酵制备的发酵液可以进行萃取得到虾青素等高附加值的产品。
发明内容
1.本发明涉及一种从虾蟹加工下脚料中提取抗氧化多肽与甲壳素的方法：
1)向虾蟹下脚料中加入适当的碳源，搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种5-10％的混合菌群；
3)30-40℃有氧发酵培养30-40h，无氧发酵培养15-20h；
4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min。
6)将步骤(5)所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分。
7)将步骤(4)所得固体残渣清洗晾干。
8)将步骤(7)所得的固体残渣晾干后采用稀醋酸处理既得粗甲壳素。
9)将步骤(8)所得粗甲壳素采用高锰酸钾脱色法脱色即得甲壳素。
进一步，作为一种优选的方案，制备抗氧化肽与甲壳素发酵时采用的虾蟹下脚料最好的是虾头。
进一步，步骤1中虾蟹可以采用研磨机研磨碎，以增加与混合菌株的接触，利于发酵时间的缩短。
进一步，所用碳源为玉米淀粉、蔗糖等。
进一步，所用的发酵菌为巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌与瑞士乳杆酸菌、保加利亚乳杆菌、粪屎肠球菌的混合菌。
进一步，所用混合菌全部筛选自虾蟹肠道中。
进一步，所用混合菌的添加比例为巨大芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：瑞士乳杆酸菌：保加利亚乳杆菌：粪屎肠球菌＝1:3:1:1:2。
进一步，截留发酵液采用10kDa，1kDa的卷式滤膜。
进一步，作为一种优选的方案，处理后的固体残渣可以采用双氧水脱除色素、高锰酸钾脱除色素的方法。
本技术发明与现有技术相比：
1.本技术发明采用来源于虾蟹本身肠道寄生的菌株，如粪屎肠球菌等有益菌，发酵制备得到的抗氧化肽与甲壳素安全无毒。
2.本发明方法中采用乳酸菌发酵下脚料可以产生乳酸，乳酸可以与虾蟹壳中的碳酸钙发生反应，从而减少了外源添加稀酸的量，可以大大降低成本。
3.本发明方法可以实现虾蟹加工下脚料的高值化利用，降低生产成本，减少环境污染同时可以制得抗氧化能力较高的肽。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1
1)将50-100g虾头下脚料用研磨机研碎，向研磨物中添加50-100g玉米淀粉，加自来水500-1000mL搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种5-10％的混合菌群；
3)30-40℃有氧培养30-40h，无氧培养15-20h；
4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min。
6)将步骤(5)所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分。
7)将步骤(4)所得固体残渣清洗晾干。
8)将步骤(7)所得的固体残渣晾干后采用10-20％稀醋酸处理2-4h既得粗甲壳素。
9)将步骤(8)所得粗甲壳素采用高锰酸钾脱色法脱色即得甲壳素。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(3)中有氧发酵与无氧发酵的时间比为有氧：无氧＝2-1:1。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用碳酸氢钠进行中和。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用正丁醇等进行萃取得到虾青素后再进行截留制备抗氧化肽。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上作为一种优选的实施方式
1)将50g虾头下脚料用研磨机研碎，向研磨物中添加50g玉米淀粉，加自来水500mL搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种5％的混合菌群；
3)30℃有氧培养30h，无氧培养15h；
4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min。
6)将步骤(5)所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分。
7)将步骤(4)所得固体残渣清洗晾干。
8)将步骤(7)所得的固体残渣晾干后采用10％稀醋酸处理2h既得粗甲壳素。
9)将步骤(8)所得粗甲壳素采用双氧水脱色法脱色即得甲壳素。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用碳酸氢钠进行中和。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用正丁醇等进行萃取得到虾青素后再进行截留制备抗氧化肽。
实施例3
本实施例在实施例1-2的基础上作为一种优选的方式
1)将100g虾头下脚料用研磨机研碎，向研磨物中添加100g玉米淀粉，加自来水1000mL搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种10％的混合菌群；
3)40℃有氧培养40h，无氧培养20h；
4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min。
6)将步骤(5)所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分。
7)将步骤(4)所得固体残渣清洗晾干。
8)将步骤(7)所得的固体残渣晾干后采用20％稀醋酸处理4h既得粗甲壳素。
9)将步骤(8)所得粗甲壳素采用高锰酸钾脱色法脱色即得甲壳素。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用碳酸氢钠进行中和。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用正丁醇等进行萃取得到虾青素后再进行截留制备抗氧化肽。
实施例4
本实施例在实施例1-3的基础上作为一种优选的实施方式
1)将80g虾头下脚料用研磨机研碎，向研磨物中添加60g玉米淀粉，加自来水600mL搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种6％的混合菌群；
3)35℃有氧培养30h，无氧培养20h；
4)发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5)将可溶性发酵液8000rpm离心10min。
6)将步骤(5)所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分。
7)将步骤(4)所得固体残渣清洗晾干。
8)将步骤(7)所得的固体残渣晾干后采用15％稀醋酸处理3h，既得粗甲壳素。9)将步骤(8)所得粗甲壳素采用高锰酸钾脱色法脱色即得甲壳素。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用碳酸氢钠进行中和。
进一步，作为一种优选的实验方案上述步骤(5)所得发酵液可以使用正丁醇等进行萃取得到虾青素后在进行截留制备抗氧化肽。
实验例1
获得的1-10kDa、小于1kDa、大于10kDa的三个组分的抗氧化能力可通过测定DPPH自由基清除率来评定。
取100mL无水乙醇溶解10mg DPPH得到10％的工作储备液，避光保存。使用前将工作储备液稀释得到5×10-5mol/L的DPPH工作液，另将待测抗氧化肽配制成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的系列溶液。每个样品分成三组，对照组：2.5mL的DPPH溶液加0.5mL无菌水；待测样品组：2.5mL的DPPH溶液加0.5mL待测样液；空白组：2.5mL无水乙醇溶液加0.5mL待测样液。各组在室温避光反应15min后使用1cm的比色皿在517nm下测定其吸光值。实验重复测定3次，结果取平均值。
上式中：
A0—对照组吸光值；
Ai—样液吸光值；
Aj—未加DPPH的空白组吸光值。
VC的DPPH清除能力变化不明显，最低也在80％以上，具有较好的清除能力。三种待测多肽的DDPH清除能力都基本呈现一种剂量效应。总体上<1kDa的组分的抗氧化能力最强，在10mg/mL时接近VC的清除能力可以达到90％以上。而1-10kDa和>10kDa的组分则抗氧化能力较低，DDPH清除能力最高仅有50％左右。
实验例2
采用水杨酸比色法测定三种不同多肽对羟自由基的清除能力来评定他们的抗氧化能力。将待测抗氧化肽配制成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的系列溶液。在试管中分别加入2.0mmol/LFeSO4溶液1.5mL、30mmol/LH2O2溶液1.5mL、6.0mmol/L水杨酸溶液1.5mL，混匀，在37℃水浴15min后取出，在510nm处测其吸光度A0；然后加入待测样品2.0mL，于37℃水浴15min后取出，测其吸光度A。重复测定三次，取平均值。
清除率计算公式为:
式中:
A0－为试剂空白液的吸光度；
A－为样液的吸光度。
实验证明，1-10kDa，＜1kDa，>10kDa的三组分都具有一定的抗氧化能力，且都呈现出剂量效应。其中＜1kDa的组分抗氧化能力最强，1-10kDa次之，>10kDa的组分抗氧化能力最弱。其中＜1kDa的组分在浓度大于5mg/mL时其抗氧化能力开始大于Vc的抗氧化能力，在8mg/mL时羟自由基的清除能力就达到90％以上，而此时Vc则仅有70％左右。1-10kDa的组分在6-10mg/mL范围内与Vc的羟自由基清除能力相当，而>10kDa的组分的羟自由基清除能力则相对较弱，最大也就在50％左右。
综上所述，获得的三种组分都具有一定的抗氧化能力，其中＜1kDa的组分的抗氧化能力最强，在高浓度下可以达到甚至超过Vc的抗氧化能力。

Claims (4)

1.一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽与甲壳素的方法，其特征在于：
1)向研磨粉碎的虾蟹下脚料中加入适当的碳源，搅拌均匀后121℃灭菌；
2)接种5-10%的混合菌群；
3)30-40℃有氧发酵培养30-40h，无氧发酵培养15-20h；
4) 发酵结束后，采用滤纸将发酵液过滤，分离固体残渣与可溶性溶液；
5) 将可溶性发酵液8000rpm离心10min；
6) 将步骤（5）所得离心后的发酵液，用10kDa、1kDa的滤膜截留，将发酵液分成1-10kDa，大于10kDa，小于1kDa三个组分；
7) 将步骤（4）所得固体残渣清洗晾干；
8) 将步骤（7）所得的固体残渣晾干使用稀醋酸处理即得粗甲壳素；
9）将步骤（8）所得粗甲壳素脱色即得甲壳素。
2.根据权利要求1所述的一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽与甲壳素的方法，其特征在于：所用的发酵菌为巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌与瑞士乳杆酸菌、保加利亚乳杆菌、粪屎肠球菌组成的混合菌。
3.根据权利要求2所述的一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽与甲壳素的方法，其特征在于：所用混合菌全部筛选自虾蟹肠道中。
4.根据权利要求2所述的一种通过发酵虾蟹壳制备抗氧化多肽与甲壳素的方法，其特征在于：所用混合菌的添加比例为巨大芽孢杆菌：短小芽孢杆菌：瑞士乳杆酸菌：保加利亚乳杆菌：粪屎肠球菌=1:3:1:1:2。
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