CN101434981B - 一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，包括以下步骤：将具有产蛋白酶能力的单一菌种如自枯草芽孢杆菌、乳酸菌、雅致放射毛霉、米曲霉、宇佐美曲霉或产朊假丝酵母固态发酵粉碎的菜籽粕，然后提取固态发酵后的培养基，得到菜籽肽的粗提液，通过分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性专一的菜籽肽。该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物的蛋白酶水解作用和降解硫甙作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备生物活性专一的菜籽肽的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性专一的菜籽肽的制备方法，具体涉及一种采用微生物固态发酵菜籽粕的方法。
背景技术
菜籽饼粕是生产菜籽油的副产物，其中含有丰富的蛋白质，是重要的植物蛋白质资源，因菜籽粕中含有硫甙、植酸等抗营养成分，使菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业中的应用受到限制。菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S或1.7S清蛋白组成，赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高，氨基酸平衡优于大豆蛋白，是一种优质蛋白质，菜籽蛋白水解成多肽后，具有更好的生物活性和加工特性。
目前以菜籽粕或菜籽蛋白为原料制备生物活性专一(即具有某种特定生物活性如抗氧化、降血压、促进细胞生长和抗肿瘤等的菜籽肽的方法主要有化学法和酶法。化学法采用酸或碱水解植物蛋白时会产生氯丙醇类致癌物质，且反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型，同时水解废液的排放也会造成一定的环境污染。酶水解法是目前菜籽肽的制备主要方法，但是由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除，影响了蛋白酶的活性，水解程度不高，菜籽蛋白水解物的风味尤其是苦味问题还未根本解决，同时用于菜籽蛋白水解的酶类来源有限，且成本居高不下，酶法制备生物活性专一的菜籽肽受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，该方法对环境友好，反应条件温和，能充分发挥微生物水解蛋白质和降解硫甙好作用，是一种低成本、适合工业化大批量制备生物活性专一的菜籽肽的方法。
本发明提供一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，包括以下步骤：
(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕。
(2)以具有产蛋白酶能力的单一菌种，制备发酵剂。
(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵。
(4)提取步骤(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽肽的粗提液。
(5)将步骤(4)中所述粗提液分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性专一的菜籽肽。
步骤(1)所述菜籽粕的原料可以是普通油菜籽也可以是双低油菜籽，其粉碎粒径为100～600μm。粉碎后的菜籽粕可以直接用于发酵或灭菌后用于发酵。
步骤(2)所述发酵剂的制备过程为：
(2-1)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1％～5％(w/v)，KH2PO40.1％～2.0％，pH为4.0～10.0。
(2-2)将活化、扩大培养后的微生物菌种，用无菌营养液配制成菌含量或孢子含量为1×104～1×108个/mL的悬浊液，即为发酵剂。
步骤(3)所述单一菌种选自枯草芽孢杆菌、乳酸菌、雅致放射毛霉、米曲霉、宇佐美曲霉或产朊假丝酵母。
步骤(3)所述发酵条件为：发酵剂的加入量为粉碎的菜籽粕质量的0.7～4倍，发酵温度20℃～40℃，发酵时间2～5天，环境湿度40％～100％，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。
按照固液比为1∶5～1∶30加入去离子水、蒸馏水或自来水，对固态发酵后的培养基进行提取。提取温度为15～80℃，提取时间为10～180min，提取1～3次。该提取液采用真空过滤器或压力过滤器去除残渣，也可以采用离心法，离心力为1000～15000g，以获得菜籽活性肽的粗提液。该粗提液采用超滤膜分离纯化，超滤膜的截留分子量为30KDa、10kDa，3kDa和1kDa，收集不同分子量的滤液，得到五种生物活性专一的菜籽肽。该粗提液也可以采用凝胶层析、亲和层析或离子交换方法进行分类纯化，得到生物活性专一的菜籽肽。
本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料固态发酵生产菜籽肽，原料来源广泛，价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产工艺简单、成本低，而且变废为宝，有利于环境保护，以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽，可以节省大量昂贵的生物酶制剂。同时微生物发酵时产生多种酶类，能有效降解菜籽粕种的有毒物质，达到人和动物的食用标准，用食品级的微生物发酵生产的多肽除具有多肽本身的营养价值外，还含有多种对人体有益的功能因子，所得到的产品具有较好的溶解性，抗氧化性和降血压作用。
具体实施方式
实施例1固态发酵菜籽粕生产生物活性专一菜籽肽的菌种的筛选
筛选对象：黑曲霉、白地霉、米曲霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、乳酸菌、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
发酵剂的制备：活化后的菌种扩大培养后(按常规方法培养)，用无菌水稀释发酵种子使菌体或者孢子浓度达到3×107个/mL，即为发酵剂。
将菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，121℃下湿热灭菌30min。于发酵罐内，按固液比1∶1～1∶2(质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为28℃～35℃，环境湿度为80％～90％，搅拌通风。发酵3天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再用12000g离心力高速离心去杂，得菜籽活性肽粗提液。
通过比较不同菌种发酵后菜籽粕的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率、微生物产生的蛋白酶的活力、粗提液中菜籽蛋白肽的分子量分布、粗提液的抗氧化性和降血压生物活性，得出：黑曲霉，白地霉、黑根霉和地衣芽孢杆菌发酵产物的氮溶解指数、氨基酸态氮、肽得率都比较低，而米曲霉固态发酵后产生了较多的可溶性氮，蛋白酶酶活力也很高，但多肽得率却较低，色谱分析结果表明产生了较多的游离氨基酸，可以推断其发酵后产生蛋白酶可能是外切酶，作用于菜籽粕后将蛋白质水解成了氨基酸，不能作为固态发酵生产生物活性专一菜籽肽的出发菌株。乳酸菌、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果较好。
实施例2雅致放射毛霉固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基：马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
平板扩大培养基：马铃薯200～300g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。
营养液成分：葡萄糖50g，KH2PO42g，自来水1000mL，pH为6.5。
发酵培养基：菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天，然后接种于平板于28℃进行扩大培养，4天后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为107个/mL。
将普通菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶1.5(质量比)加入发酵剂，调发酵温度为30℃，环境湿度为90％，搅拌通风。发酵5天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，经压力过滤装置过滤去除粕渣，即得菜籽活性肽粗提液。
将上述粗提液经过离子交换柱(HiTrapTM离子交换柱SP XL；流速：1mL/min，磷酸盐缓冲液pH 6.0，温度：25℃)，疏水层析(HiTrapTM疏水层析柱Phenyl FF；流速：1mL/min；温度：25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30；流速：0.2mL/min；温度：25℃)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到抗氧化性专一的菜籽肽。
该菜籽肽产品的抗氧化生物活性指标如下：
菜籽肽还原能力(还原Fe3+的能力)：产品浓度10mg/mL时，A700nm为0.158；
自由基清除率：产品浓度10mg/mL时，DPPH·自由基清除率为15％；
金属螯合力(Fe2+的螯合能力)：产品浓度10mg/mL时，金属螯合力为53％；
脂质氧化抑制率(硫氰酸盐-亚油酸法)：产品浓度50mg/mL时，脂质氧化抑制率为45％。
实施例3产朊假丝酵母固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基：麦芽浸膏3g；葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g；琼脂20g；自来水1000mL。
种子培养基：麦芽浸膏3g；葡萄糖10g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g；自来水1000mL。
营养液：葡萄糖3g，KH2PO43g，自来水1000mL，pH为7.0。
发酵培养基：菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液将其浓度调整为107个/mL
将菜籽粕粉碎至颗径为300μm左右，121℃，30min灭菌，于发酵罐内，按固液比1∶2.5(质量比)加入发酵剂，发酵温度为30℃，环境湿度为90％，搅拌通风，发酵4天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，即得菜籽活性肽粗提液。
将上述粗提液分别通过截留分子量为30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，经脱盐柱(HiPrepTM 26/10，流速30mL/min，温度25℃)脱盐、脱色，灭菌(121℃，30min)，喷雾干燥得到生物活性不同的五个组分菜籽肽粉。其中分子量1KDa～3KDa的菜籽肽具有较好抗氧化性。
实施例4枯草芽孢杆菌固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。
种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，自来水1000mL，pH 7.2-7.4。
营养液：葡萄糖2.6g，KH2PO42.6g，自来水1000，pH为7.0。
发酵培养基：菜籽粕、营养液。
发酵剂的制备：从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，发酵液中菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释发酵液，使菌体浓度为3×107个/mL，即为发酵剂。
将双低菜籽粕粉碎至粒径为500μm左右，灭菌。于发酵罐内，按固液比1∶2.5(质量比)的比例加入发酵剂，发酵温度为32℃，环境湿度为90％，搅拌通风。发酵4天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)分离去除粕渣，再高速离心(12000g)去杂，得菜籽活性肽粗提液。
将上述粗提液分别通过截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，将分子量小于10kDa的组分经过离子交换柱(HiTrapTM离子交换柱Q XL；流速：lmL/min；Tris HCl缓冲液pH 7.5温度：25℃)，疏水层析(HiTrapTM疏水层析柱Phenyl FF；流速：1mL/min；温度：25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30；流速：0.2mL/min；温度：25℃)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到抗氧化性专一的菜籽肽。
菜籽肽的抗氧化生物活性指标如下：
菜籽肽还原能力(还原Fe3+的能力)：产品浓度10mg/mL时，A700nm为0.151
自由基清除率：产品浓度10mg/mL时，DPPH·自由基清除率为12％
金属螯合力(Fe2+的螯合能力)：产品浓度10mg/mL时，金属螯合力为50％
脂质氧化抑制率(硫氰酸盐-亚油酸法)：产品浓度50mg/mL时，脂质氧化抑制率为42％
实施例5乳酸菌固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
斜面培养基：酵母膏5g，碳酸钙6g，琼脂15～20g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。
种子培养基：酵母膏5g，碳酸钙6g，5°Bé麦芽汁1000mL，pH 6.0。
营养液成分：葡萄糖4g，KH2PO4 1g、自来水1000mL，pH为6.0。
发酵培养基：菜籽粕，营养液。
发酵剂的制备：从活化后的菌种培养斜面中，挑取两环乳酸接种于种子培养基中，8层纱布封口，37℃，120r/min，摇床培养24h，发酵液中的菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液调节发酵液菌体浓度至3×107个/mL。
将菜籽粕粉碎至粒径为400μm左右，于发酵罐内，按固液比1∶1.5(质量比)加入发酵剂，发酵温度为37℃，环境湿度为90％，搅拌通风。发酵4.5天后，按固液比1∶15(质量比)加蒸馏水溶解发酵培养基，低速离心(2500g)去除粕渣，再高速离心(12000g)去杂，得菜籽活性肽粗提液。
将上述粗提液分别通过截留分子量为3kDa的超滤膜进行超滤，分子量≤3kDa的组分经过凝胶过滤(柱：SOURCETM 5RPC，流速1mL/min，温度25℃；磷酸盐缓冲液pH7.0)，收集具有抗氧化生物活性的组分，经冷冻干燥后得到生物活性专一的菜籽肽。
该生物活性专一的菜籽肽降血压生物活性指标：抑制50％的ACE(血管收缩素转移酶)活性所需抑制剂的浓度(IC50)为0.3mg/mL。
Claims (8)
1.一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：
(1)将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；
(2)以乳酸菌制备发酵剂；所述制备发酵剂的过程为，
(2-1)配制无菌营养液，其成分为葡萄糖0.1％～5％，KH2PO40.1％～2.0％，pH为4.0～10.0，(2-2)将活化、扩大培养后的微生物菌种，用(2-1)所述无菌营养液配制成菌含量或孢子含量为1×104～1×108个/ml的悬浊液，即为发酵剂；
(3)将步骤(2)所述发酵剂接入步骤(1)所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；
(4)提取步骤(3)所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽肽的粗提液；
(5)将步骤(4)中所述粗提液分离纯化、灭菌、干燥即得生物活性专一的菜籽肽。
2.根据权利要求1所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述粉碎后的菜籽粕的粒径为200～800μm。
3.根据权利要求1所述微生物固态发酵制各生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：制备菜籽粕的菜籽原料是普通油菜籽或双低油菜籽。
4.根据权利要求1所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(3)中的发酵条件为：发酵剂的加入量为粉碎的菜籽粕质量的0.7～4倍，发酵温度20℃-40℃，发酵时间2～5天，环境湿度40％-100％，发酵容器为发酵罐、发酵缸或发酵池。
5.根据权利要求1所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：
步骤(4)所述提取条件为：按照固液比为1∶5～1∶30加入离子水、蒸馏水或自来水进行提取，提取温度为15～80℃，提取时间10～180min，提取1～3次。
6.根据权利要求1所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：
步骤(4)所述分离去除残渣的方法为过滤法或离心法，过滤法采用真空过滤器或压力过滤器，离心法采用的离心力为1000～15000g。
7.根据杈利要求1所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(5)中所述分离纯化过程为：(1)超滤膜分离：所述超滤膜的截留分子量为30KDa、1OkDa，3kDa和1kDa，收集不同分子量的滤液，得到五种生物活性专一的菜籽肽滤液；(2)菜籽肽滤液采用离子交换树脂或反渗透脱盐。
8.按权利要求1或2所述微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，其特征在于：步骤(5)中所述分离纯化过程为采用凝胶层析、疏水层析或离子交换方法，得到生物活性专一的菜籽肽。
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