CN103911420A - 菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法 - Google Patents

菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法 Download PDF

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CN103911420A CN201410136658.5A CN201410136658A CN103911420A CN 103911420 A CN103911420 A CN 103911420A CN 201410136658 A CN201410136658 A CN 201410136658A CN 103911420 A CN103911420 A CN 103911420A
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王立峰
谢慧慧
王玉梅
张晶
熊维涛
鞠兴荣
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NANJING XINGDONGFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
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Abstract

本发明提供了一种菌酶协同固态发酵制备菜籽肽的方法，以解决现有技术中采用单纯的混菌固态发酵存在的导致菜籽肽得率比较低的问题。利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵菜籽粕制备菜籽肽，通过菜籽粕粉碎、制备发酵剂、固态发酵、灭酶、分离去除残渣、脱色、脱苦、脱盐、分离纯化和干燥等步骤获得菜籽肽粉。本发明利用细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵制备多肽，一方面微生物固态发酵产生多种代谢产物及酶类，能水解蛋白质并有效降解菜籽粕中的有毒物质，与酶解法相比，提高效率的同时也大大降低了苦味；另一方面中性蛋白酶的加入将辅助作用于肽段，与单纯微生物发酵相比将大大增强蛋白质的降解程度，提高菜籽肽得率。

Description

菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法
技术领域
本发明涉及微生物酶解发酵技术领域，具体涉及一种菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法。
背景技术
我国是世界上油菜籽产量最大的国家，油菜籽资源十分丰富。油菜籽经加工可得到约35% 的菜籽油和65% 的饼粕，菜籽饼粕中所含的菜籽蛋白高达35% ~ 42% ，其氨基酸含量非常丰富且平衡性强，几乎不存在限制性氨基酸，是一种非常优良的蛋白质，营养价值可与酪蛋白和动物蛋白相媲美。然而菜籽饼粕中含有较多硫甙、植酸、单宁等抗营养成分，这就导致菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业中的应用受到限制。
随着对蛋白质研究的深入，人们发现，人类摄食的蛋白质经消化道酶作用后，更多是以低聚肽(如二肽、三肽等)形式被吸收。菜籽肽是以菜籽蛋白或菜籽粕作为原材料，通过物理方法、化学方法或酶法处理后所得到的一种小分子蛋白质，其结构较菜籽蛋白更为简单且分子量更小，具有较好的蛋白质功能特性：溶解性、起泡性、乳化性，且与菜籽蛋白的氨基酸组成几乎完全一致，从而更容易被动物体摄入和吸收。
肽的制备主要是将大分子蛋白质用化学或酶的方法水解成小分子的肽链，其水解过程是蛋白质首先被水解成大分子肽，再得到小分子肽，若进一步水解，将最终得到游离氨基酸。目前利用菜籽粕或菜籽蛋白制备菜籽生物活性肽的方法主要有：化学水解法、酶水解法。化学水解法不能按规定水解程度进行水解、生产条件较苛刻、破坏了氨基酸原有的构型，从而降低了营养价值；酶水解法是目前我国制备多肽最常用的方法，但生产所用酶制剂用量大、价格昂贵，生产成本较高，且不能完全脱除菜籽粕或菜籽蛋白中的抗营养因子，难以形成大规模的工业化生产。
中国专利CN101440390提供一种混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，获得粉碎的菜籽粕；将枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；将所述发酵剂接入所述粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；加水提取所述固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽的粗提液；将所述粗提液经过脱色、脱盐和干燥获得菜籽活性肽。但是，采用单纯的混菌固态发酵，虽其脱毒效果较好，但发酵周期较长，且随着发酵时间的增加，发酵罐中菌数增长趋于稳定，其所产蛋白酶活力即趋于平缓，这就导致菜籽肽得率比较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种菌酶协同固态发酵制备菜籽肽的方法，以解决现有技术中采用单纯的混菌固态发酵存在的导致菜籽肽得率比较低的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵菜籽粕制备菜籽肽，具体步骤为：
a.将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，得到菜籽粕粉；
b.将具有产蛋白酶能力的细菌与霉菌复配，制备发酵剂；
c.将步骤b制得的发酵剂与中性蛋白酶接入步骤a所得的菜籽粕粉，进行固态发酵；
d.对步骤c所得的固态发酵后基质进行灭酶；
e.加水浸提步骤d中固态发酵后的培养基，分离去除残渣，获得菜籽肽的粗提液；
f将步骤e所得菜籽肽粗提液经过脱色、脱苦、脱盐、分离纯化和干燥获得菜籽肽粉。
优选的，步骤a中所述菜籽粕的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕粉的粒径为200~800μm，粉碎后的菜籽粕直接用于发酵或者经过105℃~121℃温度灭菌或湿热灭菌后用于发酵。
优选的，步骤b中，所述的具有产蛋白酶能力的细菌为枯草芽孢杆菌，霉菌为雅致放射毛霉菌。
优选的，步骤b中，制备发酵剂的步骤为：
b-1.配制无菌营养液，其组成为：葡萄糖与无菌营养液体积的质量体积比为0.5%～1%g/mL，KH2PO4与无菌营养液体积的质量体积比为0.3%～0.5%g/mL，pH为6.0~8.0；
b-2.将活化、扩大培养后的微生物菌种，用步骤b-1中配置的无菌营养液配制成菌种量为1×106～1×108个/mL的菌悬液，即为发酵剂。
优选的，步骤c中，发酵剂的加入总量为菜籽粕质量的1～1.5倍，枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉菌发酵剂体积比为1:1～4:1，中性蛋白酶添加量为50～250U/g，发酵剂与中性蛋白酶同步或分步接入菜籽粕粉中，发酵温度为25℃～45℃，发酵时间为1～5天，环境湿度40%～100%，发酵容器为固态发酵罐或发酵池。
优选的，步骤c中，中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h后接入菜籽粕粉。
优选的，步骤d中，灭酶条件为：水浴，温度95℃～100℃，时间10~15min。
优选的，步骤e中所述的水为去离子水、蒸馏水或自来水，固态发酵后的培养基与水的固液比1:5～1:30g/mL，提取温度为15℃~80℃，提取时间为30~180min，提取1~3次。
优选的，步骤e中，分离去除残渣的方法为过滤或离心，其中，所述过滤采用真空过滤器或压力过滤器，所述离心的离心力为1000～14000g。
优选的，步骤f中，所述脱色、脱苦的步骤采用活性炭；所述脱盐的步骤采用离子交换色谱或反渗透；所述分离纯化的步骤为：通过截留分子量为30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和1kDa的超滤膜超滤，获得五种不同生物活性的菜籽肽，或采用离子交换、凝胶层析、亲和层析方法，获得生物活性专一的菜籽肽；所述干燥的步骤为热风干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明的有益效果是：本发明与现有的技术相比，直接以菜籽粕为原料固态发酵生产菜籽肽，原料来源广泛，价格低廉，不需要对其进行酸、碱的处理，更不需要分离出菜籽蛋白，生产规模大，变废为宝，有利于环境保护；本发明利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵取代单纯菌种发酵或纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽，一方面微生物固态发酵产生多种代谢产物及酶类，能水解蛋白质并有效降解菜籽粕中的有毒物质，与酶解法相比，提高效率的同时也大大降低了苦味，且降低了成本；另一方面中性蛋白酶的加入将辅助作用于肽段，与单纯微生物发酵相比将大大增强蛋白质的降解程度，提高菜籽肽得率。因此，此方法结合微生物发酵与酶解，反应条件温和，对环境友好，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽肽的方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
一种菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵菜籽粕制备菜籽肽，具体步骤为：
（1）将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，得到菜籽粕粉；菜籽粕的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕粉的粒径为200~800μm，粉碎后的菜籽粕直接用于发酵或者经过105℃~121℃温度灭菌或湿热灭菌后用于发酵；
（2）将具有产蛋白酶能力的细菌与霉菌复配，制备发酵剂；具有产蛋白酶能力的细菌优选为枯草芽孢杆菌，霉菌优选为雅致放射毛霉菌；
制备发酵剂的步骤为：
（2-1）配制无菌营养液，其组成为：葡萄糖与无菌营养液体积的质量体积比为0.5%～1%g/mL，KH2PO4与无菌营养液体积的质量体积比为0.3%～0.5%gmL，pH为6.0~8.0；
（2-2）将活化、扩大培养后的微生物菌种，用步骤（2-1）中配置的无菌营养液配制成菌种量为1×106～1×108个/mL的菌悬液，即为发酵剂；
（3）将步骤（2）制得的发酵剂与中性蛋白酶接入步骤（1）所得的菜籽粕粉，进行固态发酵；发酵剂的加入总量为菜籽粕质量的1～1.5倍，枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉菌发酵剂体积比为1:1～4:1，中性蛋白酶添加量为50～250U/g，发酵剂与中性蛋白酶同步或分步接入菜籽粕粉中，发酵温度为25℃～45℃，发酵时间为1～5天，环境湿度40%～100%，发酵容器为固态发酵罐或发酵池；中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h后接入菜籽粕粉。
（4）对步骤（3）所得的固态发酵后基质进行灭酶；灭酶条件为：水浴，温度95℃～100℃，时间10~15min；
（5）加水浸提步骤（4）中固态发酵后的培养基，分离去除残渣，获得菜籽肽的粗提液；加水浸提的水为去离子水、蒸馏水或自来水，固态发酵后的培养基与水的固液比1:5～1:30g/mL，提取温度为15℃~80℃，提取时间为30~180min，提取1~3次；分离去除残渣的方法为过滤或离心，其中，所述过滤采用真空过滤器或压力过滤器，所述离心的离心力为1000～14000g；
（6）将步骤（5）所得菜籽肽粗提液经过脱色、脱苦、脱盐、分离纯化和干燥获得菜籽肽粉；脱色、脱苦的步骤采用活性炭；所述脱盐的步骤采用离子交换色谱或反渗透；所述分离纯化的步骤为：通过截留分子量为30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和1kDa的超滤膜超滤，获得五种不同生物活性的菜籽肽，或采用离子交换、凝胶层析、亲和层析方法，获得生物活性专一的菜籽肽；所述干燥的步骤为热风干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 
混菌与酶分步固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌发酵剂的制备：
斜面培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；营养琼脂2.0g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
种子培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
无菌营养液：葡萄糖5.0g；KH2PO43.0g；无菌水1000mL；pH 7.0。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，使菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释种子液，配制成菌体浓度为3×107个/mL的枯草芽孢杆菌发酵剂。
雅致放射毛霉菌发酵剂的制备：
斜面培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
平板扩大培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
无菌营养液：葡萄糖5.0g；KH2PO43.0g；无菌水1000mL；pH 7.0。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4d，然后接种于平板28℃下扩大培养，4d后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3×107个/mL。
将上述枯草芽孢杆菌发酵剂及雅致放射毛霉菌发酵剂按体积比3:1混合即为混菌发酵剂。
中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h。
将菜籽粕粉碎后过40目筛，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1.5的比例加入发酵剂，发酵温度为35℃，环境湿度为90%，定时搅拌通风，发酵1天后，按150U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分搅拌均匀，相同条件下再发酵2天，然后在95℃下水浴10min灭酶，按固液质量比1:15的比例加入蒸馏水，30℃下浸提30min，低速离心（离心力为2500g）分离去除粕渣，再高速离心（离心力为14000g）除菌除杂，获得菜籽肽粗提液。
向菜籽肽粗提液中加入10g/L活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心（离心力为14000g）除杂，上清液经冷冻干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉，其中蛋白质含量83%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为62%。
实施例2 
混菌与酶同步固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌发酵剂的制备：
斜面培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；营养琼脂2.0g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
种子培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
无菌营养液：葡萄糖5.0g；KH2PO43.6g；无菌水1000mL；pH 6.5。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，使菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释种子液，配制成菌体浓度为3×107个/mL的枯草芽孢杆菌发酵剂。
雅致放射毛霉菌发酵剂的制备：
斜面培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
平板扩大培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
无菌营养液：葡萄糖5.0g；KH2PO43.6g；无菌水1000mL；pH 6.5。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4d，然后接种于平板28℃下扩大培养，4d后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为3×107个/mL。
将上述枯草芽孢杆菌发酵剂及雅致放射毛霉菌发酵剂按体积比4:1混合即为混菌发酵剂。
中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h。
将菜籽粕粉碎后过40目筛，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1.35的比例加入发酵剂，同时按150U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分搅拌均匀，发酵温度为40℃，环境湿度为90%，定时搅拌通风，发酵3天后，在95℃下水浴10min灭酶，按固液比1:15的比例加入蒸馏水，30℃下浸提30min，低速离心（离心力为2500g）分离去除粕渣，再高速离心（离心力为14000g）除菌除杂，获得菜籽肽粗提液。
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱（HiPrepTM 26/10,流速30mL/min，室温）脱色、脱苦、脱盐后，经浓缩、冷冻干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量88%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为65%。
实施例3 
混菌与酶同步固态发酵菜籽粕生产菜籽活性肽
与实施例2不同之处在于，按下列方法进行提纯：
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱（HiPrepTM 26/10,流速30mL/min，室温）脱色、脱苦、脱盐后，再分别通过截留分子量为30kDa、10kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，经冷冻干燥得到生物活性不同的五个组分菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量90%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为70%。
分子量范围在1kDa~3kDa的组分再经过离子交换（HiTrapTM 离子交换柱SP XL；流速1mL/min，磷酸盐缓冲液pH7.0，室温）和凝胶过滤（Superdex Peptide HR 10/30；流速0.5mL/min，室温）纯化后，经冷冻干燥得到生物活性专一的菜籽肽。
实施例4
混菌与酶分步固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌发酵剂的制备：
斜面培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；营养琼脂2.0g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
种子培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
无菌营养液：葡萄糖10.0g；KH2PO45.0g；无菌水1000mL；pH 8.0。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，使菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释种子液，配制成菌体浓度为1×106个/mL的枯草芽孢杆菌发酵剂。
雅致放射毛霉菌发酵剂的制备：
斜面培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
平板扩大培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
无菌营养液：葡萄糖10.0g；KH2PO45.0g；无菌水1000mL；pH 8.0。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4d，然后接种于平板28℃下扩大培养，4d后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为1×106个/mL。
将上述枯草芽孢杆菌发酵剂及雅致放射毛霉菌发酵剂按体积比1:1混合即为混菌发酵剂。
中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h。
将菜籽粕粉碎后过40目筛，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1的比例加入发酵剂，发酵温度为25℃，环境湿度为40%，定时搅拌通风，发酵2天后，按50U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分搅拌均匀，相同条件下再发酵3天，然后在100℃下水浴12min灭酶，按固液质量比1:5的比例加入蒸馏水，15℃下浸提180min，提取3次，低速离心（离心力为1000g）分离去除粕渣，再高速离心（离心力为14000g）除菌除杂，获得菜籽肽粗提液。
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱（HiPrepTM 26/10,流速30mL/min，室温）脱色、脱苦、脱盐后，再分别通过截留分子量为30kDa、10kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行超滤，收集不同截留分子量的滤液，经冷冻干燥得到生物活性不同的五个组分菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量78%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为56%。
分子量范围在1kDa~3kDa的组分再经过离子交换（HiTrapTM 离子交换柱SP XL；流速1mL/min，磷酸盐缓冲液pH7.0，室温）和凝胶过滤（Superdex Peptide HR 10/30；流速0.5mL/min，室温）纯化后，经冷冻干燥得到生物活性专一的菜籽肽。
实施例5 
混菌与酶同步固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌发酵剂的制备：
斜面培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；营养琼脂2.0g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
种子培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
无菌营养液：葡萄糖7.0g；KH2PO44.0g；无菌水1000mL；pH 6。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，使菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释种子液，配制成菌体浓度为1×108个/mL的枯草芽孢杆菌发酵剂。
雅致放射毛霉菌发酵剂的制备：
斜面培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
平板扩大培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
无菌营养液：葡萄糖7.0g；KH2PO44.0g；无菌水1000mL；pH 6。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4d，然后接种于平板28℃下扩大培养，4d后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为1×108个/mL。
将上述枯草芽孢杆菌发酵剂及雅致放射毛霉菌发酵剂按体积比2:1混合即为混菌发酵剂。
中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h。
将菜籽粕粉碎后过40目筛，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1.25的比例加入发酵剂，同时按250U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分搅拌均匀，发酵温度为45℃，环境湿度为100%，定时搅拌通风，发酵1天后，在98℃下水浴15min灭酶，按固液比1:30的比例加入蒸馏水，80℃下浸提100min，提取2次，低速离心（离心力为1000g）分离去除粕渣，再高速离心（离心力为12000g）除菌除杂，获得菜籽肽粗提液。
向菜籽肽粗提液中加入10g/L活性炭，于50℃脱色、脱苦1h，然后高速离心（离心力为14000g）除杂，上清液经冷冻干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉，其中蛋白质含量81%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为72%。
实施例6 
混菌与酶同步固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
枯草芽孢杆菌发酵剂的制备：
斜面培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；营养琼脂2.0g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
种子培养基：牛肉膏0.3g；蛋白胨1.0g；NaCl 0.5g；自来水100mL；pH 7.2~7.4。
无菌营养液：葡萄糖8.0g；KH2PO45.0g；无菌水1000mL；pH 7。
发酵剂的制备：从活化后的菌种保藏斜面中，挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，8层纱布封口，35℃，120r/min，摇床培养24h，使菌体浓度达到108个/mL。用无菌营养液稀释种子液，配制成菌体浓度为1×107个/mL的枯草芽孢杆菌发酵剂。
雅致放射毛霉菌发酵剂的制备：
斜面培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
平板扩大培养基：马铃薯30g，葡萄糖2g，琼脂2g，自来水100mL。
无菌营养液：葡萄糖8.0g；KH2PO45.0g；无菌水1000mL；pH 7。
发酵剂的制备：雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4d，然后接种于平板28℃下扩大培养，4d后用无菌营养液洗下孢子，并将其浓度调整为1×107个/mL。
将上述枯草芽孢杆菌发酵剂及雅致放射毛霉菌发酵剂按体积比3:1混合即为混菌发酵剂。
中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h。
将菜籽粕粉碎后过40目筛，灭菌，于发酵罐内，按固液比1:1.2的比例加入发酵剂，同时按250U/g加酶量加入中性蛋白酶，充分搅拌均匀，发酵温度为25℃，环境湿度为80%，定时搅拌通风，发酵4天后，在100℃下水浴14min灭酶，按固液比1:20的比例加入蒸馏水，50℃下浸提120min，提取1次，低速离心（离心力为2000g）分离去除粕渣，再高速离心（离心力为13000g）除菌除杂，获得菜籽肽粗提液。
菜籽肽粗提液经过活性炭柱、脱盐柱（HiPrepTM 26/10，流速30mL/min，室温）脱色、脱苦、脱盐后，经浓缩、冷冻干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量80%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为68%。
对照例
混菌固态发酵菜籽粕生产菜籽肽
与实施例2不同之处在于，只加入混菌发酵剂、不加中性蛋白酶进行固态发酵。经与实施例2相同的后处理方法获得菜籽肽粉。所得到的菜籽肽蛋白质含量76%（干基，N×6.25），分子量在1kDa~5kDa的肽含量为52%。
下表是本发明的实施例与对照例的试验效果对比
  实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 对照例
  菌酶分步 菌酶同步 菌酶同步 菌酶分步 菌酶同步 菌酶同步 混菌
蛋白质含量 83% 88% 90% 78% 81% 80% 76%
1kDa~5kDa肽含量 62% 65% 70% 56% 72% 68% 52%
      将本发明的各个实施例的蛋白质含量及1kDa~5kDa肽含量与只加入混菌发酵剂、不加中性蛋白酶的对照例对比，从上表中可以看出，本发明的实施例1-6中，蛋白质含量、1kDa~5kDa肽含量均远远高于对照例，具体为：实施例1-6的蛋白质含量比对照例的平均高出10%左右，其中实施例3高出近18%，1kDa~5kDa肽含量平均高出12%左右。
本发明利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵取代单纯菌种发酵或纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽，与酶解法相比，提高效率的同时也大大降低了苦味，且降低了成本；另一方面中性蛋白酶的加入将辅助作用于肽段，与单纯微生物发酵相比将大大增强蛋白质的降解程度，提高菜籽肽得率。

Claims (10)

1.一种菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：利用具有产蛋白酶能力的细菌及霉菌与蛋白酶协同固态发酵菜籽粕制备菜籽肽，具体步骤为：
a.将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，得到菜籽粕粉；
b.将具有产蛋白酶能力的细菌与霉菌复配，制备发酵剂；
c.将步骤b制得的发酵剂与中性蛋白酶接入步骤a所得的菜籽粕粉，进行固态发酵；
d.对步骤c所得的固态发酵后基质进行灭酶；
e.加水浸提步骤d中固态发酵后的培养基，分离去除残渣，获得菜籽肽的粗提液；
f.将步骤e所得菜籽肽粗提液经过脱色、脱苦、脱盐、分离纯化和干燥获得菜籽肽粉。
2.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤a中，所述菜籽粕的原料是普通油菜籽或双低油菜籽，粉碎后的菜籽粕粉的粒径为200~800μm，粉碎后的菜籽粕直接用于发酵或者经过105℃~121℃温度灭菌或湿热灭菌后用于发酵。
3.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤b中，所述的具有产蛋白酶能力的细菌为枯草芽孢杆菌，霉菌为雅致放射毛霉菌。
4.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤b中，制备发酵剂的步骤为：
b-1.配制无菌营养液，其组成为：葡萄糖与无菌营养液体积的质量体积比为0.5%～1%g/mL，KH2PO4与无菌营养液体积的质量体积比为0.3%～0.5%g/mL，pH为6.0~8.0；
b-2.将活化、扩大培养后的微生物菌种，用步骤b-1中配置的无菌营养液配制成菌种量为1×106～1×108个/mL的菌悬液，即为发酵剂。
5.如权利要求3所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤c中，发酵剂的加入总量为菜籽粕质量的1～1.5倍，枯草芽孢杆菌与雅致放射毛霉菌发酵剂体积比为1:1～4:1，中性蛋白酶添加量为50～250U/g，发酵剂与中性蛋白酶同步或分步接入菜籽粕粉中，发酵温度为25℃～45℃，发酵时间为1～5天，环境湿度40%～100%，发酵容器为固态发酵罐或发酵池。
6.如权利要求5所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤c中，中性蛋白酶经温度为40℃的温水活化1h后接入菜籽粕粉。
7.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤d中，灭酶条件为：水浴，温度95℃～100℃，时间10~15min。
8.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤e中所述的水为去离子水、蒸馏水或自来水，固态发酵后的培养基与水的固液比1:5～1:30g/mL，提取温度为15℃~80℃，提取时间为30~180min，提取1~3次。
9.如权利要求1或8所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤e中，分离去除残渣的方法为过滤或离心，其中，所述过滤采用真空过滤器或压力过滤器，所述离心的离心力为1000～14000g。
10.如权利要求1所述的菌酶协同发酵菜籽粕制备菜籽肽的方法，其特征在于：步骤f中，所述脱色、脱苦的步骤采用活性炭；所述脱盐的步骤采用离子交换色谱或反渗透；所述分离纯化的步骤为：通过截留分子量为30KDa、10KDa、5kDa，3kDa和1kDa的超滤膜超滤，获得五种不同生物活性的菜籽肽，或采用离子交换、凝胶层析、亲和层析方法，获得生物活性专一的菜籽肽；所述干燥的步骤为热风干燥、冷冻干燥或喷雾干燥。
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