CN101654696B - 一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用,可以有效提高产品的可溶性氮含量和生物活性。所述微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,包括以下步骤:(1)将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基;(2)将微生物接入液态发酵培养基,进行液态发酵;(3)发酵后的液态培养基经固液分离,得到菜籽肽的粗提液;(4)粗提液经提纯得到菜籽肽。所述有产蛋白酶能力的菌种为雅致放射毛霉、宇佐美曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母。本发明生产工艺简单,利用微生物液态发酵,产生多种代谢产物和酶类,充分发挥其水解蛋白质和降解硫甙作用,提高产品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法。
背景技术
我国是世界上油菜籽产量最大的国家,年产量已近1200万吨,菜籽粕是菜籽油加工的主要副产物,占菜籽总量的65%,其中含蛋白35%~42%。菜籽蛋白氨基酸组成合理,赖氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量较高,与WHO/FAO推荐的氨基酸组成模式相近,营养价值等于或优于动物蛋白,是一种优良的植物蛋白。但由于菜籽粕存在一些抗营养因子,如硫代葡萄糖甙、植酸、多酚类物质等,加工过程中难以脱除,使菜籽粕只能应用于饲料或肥料工业,利用效能低,资源浪费严重。因此,开发利用菜籽蛋白质资源已成为大势所趋,由于菜籽蛋白水解成多肽后,具有更好的生物活性和加工特性,因此加强对菜籽肽的研究与开发,并使之工业化,对有效利用我国的植物蛋白资源,提高我国人民的营养水平,具有重大的社会意义和良好的经济效益。
目前我国对菜籽肽的研究生产刚刚起步,其方法主要为酶法,即是以菜籽分离蛋白为原料,利用商业蛋白酶制剂水解菜籽蛋白制备菜籽肽。该方法以菜籽分离蛋白为原料,生产所用酶制剂用量大且价格昂贵,导致生产成本较高,并且由于菜籽粕或菜籽分离蛋白中抗营养因子不能完全脱除,影响了蛋白酶的活性,水解程度不高,难以形成大规模工业化生产。
CN200810243461.6、CN200810106919.3公开了生物发酵方法对菜籽粕改性的方法,虽然脱除了菜籽蛋白中的硫代葡萄糖甙(以下简称硫甙)等有害物质,得到菜籽肽或含有菜籽肽的产品,但是产品的可溶性氮含量和生物活性仍有待进一步提高。
发明内容
本发明提供一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用,可以有效提高产品的可溶性氮含量和生物活性。
所述微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,包括以下步骤:
(1)将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基;
(2)将微生物接入液态发酵培养基,进行液态发酵;
(3)发酵后的液态培养基经固液分离,得到菜籽肽的粗提液;
(4)粗提液经提纯得到菜籽肽。
所述有产蛋白酶能力的菌种为雅致放射毛霉、宇佐美曲霉、枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母。
步骤(1)中,菜籽粕粉的粒径不大于200μm。菜籽粕粉与营养液按固液比1∶5~1∶40g/mL配制液态发酵培养基,其中营养液的pH为4.0~10.0。本领域的普通技术人员可以根据菌种选择合适的营养液及固液比。作为优选方案,所述有产蛋白酶能力的菌种为雅致放射毛霉、宇佐美曲霉、乳酸菌或产朊假丝酵母时,固液比为1∶15~1∶30g/mL,营养液中包括葡萄糖0.1%~5%,KH2PO4 0.1%~2.0%,pH为6~7;所述有产蛋白酶能力的菌种为枯草芽孢杆菌时,固液比为1∶15~1∶20g/mL,营养液中包括葡萄糖0.1%~2%,MnSO4 0.1%~2.0%,pH为8.5~9.5,上述百分比均为质量体积百分比,质量体积百分比是指100ml溶液中含某种物质多少克,即1%=1g/100ml。
步骤(2)中,将有产蛋白酶能力的菌种接入液态发酵培养基,使菌体浓度为105~107个/mL,发酵温度20~40℃,优选25~40℃,发酵时间1~5天。其中发酵温度可以由本领域的普通技术人员根据菌种经实验确定,优选的是,雅致放射毛霉的发酵温度为26~30℃,宇佐美曲霉的发酵温度为26~30℃,枯草芽孢杆菌的发酵温度为30~37℃,乳酸菌的发酵温度为32~35℃,产朊假丝酵母的发酵温度为26~30℃。
优选的方案是,有产蛋白酶能力的菌种分别经活化、扩大培养得到菌体浓度为107~108个/mL的种子液,接入液态发酵培养基。种子液的接种量优选为2%~8%,更优选为3%-5%,以种子液相对于液态发酵培养基体积的百分比计。所述有产蛋白酶能力菌种的活化、扩大培养均采用常规方法,本领域技术人员可以根据不同的菌种选择合适的工艺。
步骤(3)可以公知的方法进行固液分离,如可以采用真空过滤器或压力过滤器去除残渣,也可以采用离心法,相对离心力为1000g~15000g。
作为本发明的优选方案,步骤(4)中,所述提纯方法为:脱色、脱盐和干燥。优选的方案是,将粗提液采用活性炭脱色,离子交换树脂或反渗透脱盐,采用减压浓缩、热风干燥、冷冻干燥或喷雾干燥方式干燥,得到菜籽肽粉。
作为本发明的另一种优选方案,步骤(4)中,所述提纯方法包括离子交换、疏水层析和凝胶过滤,收集具有抗氧化生物活性的组分,经冷冻干燥得到抗氧化性专一的菜籽肽。当然也可以采用其余的分离纯化方法,如超滤膜进行超滤,收集不同截留分子量的滤液,经脱盐柱脱盐,经过凝胶过滤色谱柱,收集具有生物活性专一的组分,经冷冻干燥后得到菜籽肽。
本发明与现有的技术相比,直接以菜籽粕为原料微生物液态发酵生产生物活性专一的菜籽肽,原料来源广泛,价格低廉,不需要对其进行酸、碱的处理,更不需要分离出菜籽蛋白,生产工艺简单、成本低,而且变废为宝,有利于环境保护,以微生物发酵取代纯酶制剂水解菜籽蛋白制备多肽,可以节省大量昂贵的生物酶制剂;进行液态发酵,产生多种代谢产物和酶类,充分发挥其水解蛋白质作用和降解硫甙作用,能有效降解菜籽粕种的有毒物质,水解蛋白质,达到人和动物的食用标准,提高产品的可溶性氮含量、生物活性和菜籽肽得率,还含有多种对人体有益的功能因子。总之,本发明对环境友好,反应条件温和,能充分发挥微生物的水解蛋白质作用和降解硫甙作用,是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽肽的方法。
具体实施方式
实施例1枯草芽孢杆菌(产碱性蛋白酶)液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖2.0g,MnSO4 1.0g,自来水1000mL,pH为9.5。将双低菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶15g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl 5,琼脂20g,自来水1000mL,pH7.2-7.4。
种子培养基配方:牛肉膏3g,蛋白胨10,NaCl 5g,自来水1000mL,pH 7.0。
从活化后的菌种培养斜面中,挑取两环枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中,8层纱布封口,37℃,120r/min,摇床培养24h,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为32℃,转速180r/min震荡培养,定时通风,发酵1-2天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,先用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣,再用12000g相对离心力高速离心去杂,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为33.5%。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5~7.5,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1h,然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂,上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10,流速30mL/min)脱盐,在经截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤,喷雾干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉。所述菜籽肽蛋白质含量90%(干基,N×6.25),可溶性氮含量95%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量70%,硫甙未检出;抗氧化生物活性指标如下:
菜籽肽还原能力:产品浓度1mg/mL时,A700nm为1.051;
自由基清除率:产品浓度1mg/mL时,DPPH·自由基清除率为86%;
金属螯合力:产品浓度5mg/mL时,金属螯合力为43%;
脂质氧化抑制率:产品浓度1mg/mL时,脂质氧化抑制率为60%。
实施例2枯草芽孢杆菌液态发酵制备抗氧化性专一的菜籽肽
与实施例1不同之处在于,按下述方法进行(4)提纯:
调节菜籽肽粗提液pH至6.5~7.5,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1h,然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂,上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10,流速30mL/min)脱盐,喷雾干燥得到具有生物活性的菜籽肽粉,其中蛋白质含量88%(干基,N×6.25),可溶性氮含量92%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量62%,硫甙未检出。
菜籽肽的抗氧化生物活性指标如下:
菜籽肽还原能力:产品浓度1mg/mL时,A700nm为0.716;
自由基清除率:产品浓度1mg/mL时,DPPH·自由基清除率为75%;
金属螯合力:产品浓度5mg/mL时,金属螯合力为41%;
脂质氧化抑制率:产品浓度1mg/mL时,脂质氧化抑制率为43%。
实施例3 雅致放射毛霉液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖50g,KH2PO4 2g,自来水1000mL,pH为6.5。将普通菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶30g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:马铃薯300g,葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000mL。
平板扩大培养基配方:马铃薯300g,葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000mL。
将雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天,然后接种于平板于28℃进行扩大培养,4天后用无菌水洗下孢子,转入带玻璃珠的三角瓶中,震荡打散孢子,用4层无菌镜头纸过滤孢子悬液,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为30℃,转速180r/min震荡培养,定时通风,发酵3天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,经压力过滤装置过滤去除粕渣,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为29.5%。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5~7.5,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1h,然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂,上清液经反渗透柱脱盐后,喷雾干燥得菜籽肽,其中蛋白质含量85%(干基,N×6.25),可溶性氮含量90%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量54%,硫甙含量11μmoL/g。
实施例4雅致放射毛霉液态发酵制备抗氧化性专一的菜籽肽
与实施例3不同之处在于,按下述方法进行(4)提纯:
将上述粗提液经过离子交换(HiTrapTM离子交换柱SP XL;流速:1mL/min,磷酸盐缓冲液pH 6.0,温度:25℃),疏水层析(HiTrapTM疏水层析柱PhenyL FF;流速:1mL/min;温度:25℃)和凝胶过滤(Superdex Peptide HR 10/30;流速:0.2mL/min;温度:25℃),收集具有抗氧化生物活性的组分,经冷冻干燥后得到抗氧化性专一的菜籽肽。
该菜籽肽产品的抗氧化生物活性指标如下:
菜籽肽还原能力:产品浓度1mg/mL时,A700nm为0.888;
自由基清除率:产品浓度1mg/mL时,DPPH·自由基清除率为82%;
金属螯合力:产品浓度5mg/mL时,金属螯合力为50%;
脂质氧化抑制率:产品浓度1mg/mL时,脂质氧化抑制率为45%。
实施例5宇佐美曲霉液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖50g,KH2PO4 2g,自来水1000mL,pH为6.0。将普通菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶30g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:马铃薯300g,葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000mL。
平板扩大培养基配方:马铃薯300g,葡萄糖20g,琼脂20g,自来水1000mL。
将雅致放射毛霉接种到斜面培养基上于28℃恒温培养4天,然后接种于平板于28℃进行扩大培养,4天后用无菌水洗下孢子,转入带玻璃珠的三角瓶中,震荡打散孢子,用4层无菌镜头纸过滤孢子悬液,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为28℃,转速180r/min震荡培养,定时通风,发酵3天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,经压力过滤装置过滤去除粕渣,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为28%。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至6.5,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1h,然后高速离心(相对离心力为12000g)去杂,上清液经反渗透柱脱盐后,喷雾干燥得菜籽肽,其中蛋白质含量84%(干基,N×6.25),可溶性氮含量85%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量34%,,硫甙含量9μmoL/g。
实施例6产朊假丝酵母液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖3g,KH2PO4 3g,自来水1000mL,pH为7.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶20g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:麦芽浸膏3g,葡萄糖10g,酵母浸膏3g,蛋白胨5g,琼脂20g,自来水1000mL。
种子培养基配方:麦芽浸膏3g,葡萄糖10g,酵母浸膏3g,蛋白胨5g,自来水1000mL。
从活化后的菌种培养斜面中,挑取两环产朊假丝酵母接种于种子培养基中,8层纱布封口,35℃,120r/min,摇床培养24h,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为30℃,转速150r/min震荡培养,定时通风,发酵3天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,经低速离心(2500g相对离心力)分离去除粕渣,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为26.45%。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至7.0,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1.5h,然后高速离心(相对离心力为10000g)去杂,上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10,流速30mL/min)脱盐后,喷雾干燥得菜籽肽,其中蛋白质含量(干基,N×6.25)83%,可溶性氮含量80%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量32%,硫甙含量4μmoL/g。
实施例7乳酸菌液态发酵制备菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖4g,KH2PO4 1g,自来水1000mL,pH为6.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶25g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:酵母膏5g,碳酸钙6g,琼脂15~20g,5°Bè麦芽汁1000mL,pH6.0。
种子培养基配方:酵母膏5g,碳酸钙6g,5°Bè麦芽汁1000mL,pH 6.0。
从活化后的菌种培养斜面中,挑取两环乳酸菌接种于种子培养基中,8层纱布封口,37℃,120r/min,摇床培养24h,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为35℃,转速150r/min震荡培养,定时通风,发酵2天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为30.56%。
(4)提纯
调节菜籽肽粗提液pH至7.0,加入10g/L的活性炭,于50℃脱色、脱苦1.5h,然后高速离心(相对离心力为10000g)去杂,上清液经脱盐柱(HiPrepTM 26/10,流速30mL/min)脱盐,喷雾干燥得菜籽肽,其中蛋白质含量(干基,N×6.25)≥81%,可溶性氮含量86%,分子量在1000Da~5000Da的肽含量35%,硫甙含量8μmoL/g。
实施例8乳酸菌液态发酵制备生物活性专一的菜籽肽
(1)制备液态发酵培养基
营养液成分:葡萄糖4g,KH2PO4 1g,自来水1000mL,pH为6.0。将菜籽粕粉碎至粒径为100μm左右,用营养液按固液比1∶20g/mL的比例与菜籽粕混合均匀,在121℃下灭菌30min后得到液态发酵培养基置于发酵罐内。
(2)液态发酵
①种子液的制备:
斜面培养基配方:酵母膏5g,碳酸钙6g,琼脂15~20g,5°Bè麦芽汁1000mL,pH6.0。
种子培养基配方:酵母膏5g,碳酸钙6g,5°Bè麦芽汁1000mL,pH 6.0。
从活化后的菌种培养斜面中,挑取两环乳酸菌接种于种子培养基中,8层纱布封口,37℃,120r/min,摇床培养24h,得到菌体浓度达到108个/mL的种子液。
②取种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中,使菌体浓度为106个/mL,调发酵温度为35℃,转速150r/min震荡培养,定时通风,发酵2天。
(3)固液分离,得到菜籽肽的粗提液
取出发酵培养基,用2500g相对离心力低速离心分离去除粕渣,得菜籽肽粗提液,将该菜籽肽粗提液喷雾干燥后测得菜籽肽得率为30.6%。
(4)提纯
将上述粗提液分别通过截留分子量为3kDa的超滤膜进行超滤,分子量≤3kDa的组分经过凝胶过滤(柱:SOURCETM 5RPC,流速1mL/min,温度25℃;磷酸盐缓冲液pH7.0),收集具有抗氧化生物活性的组分,经冷冻干燥后得到生物活性专一的菜籽肽。
该生物活性专一的菜籽肽降血压生物活性指标:抑制50%的ACE(血管收缩素转移酶)活性所需抑制剂的浓度(IC50)为0.2mg/mL。
本发明所得菜籽肽可溶性氮含量和分子量在1000Da~5000Da的肽含量都很高,因此产品的溶解性较好,有利于肠道吸收和生物活性功能的发挥。
Claims (6)
1. 一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将菜籽粕粉与营养液混合制备液态发酵培养基;
(2)将有产蛋白酶能力的菌种接入液态发酵培养基,进行液态发酵;
(3)发酵后的液态培养基经固液分离,得到菜籽肽的粗提液;
(4)粗提液经提纯得到菜籽肽;
所述有产蛋白酶能力的菌种为枯草芽孢杆菌,步骤(1)中,菜籽粕粉与营养液按固液比1:15~1:20g/mL配制液态发酵培养基,其中营养液中包括葡萄糖0.1%~2%,MnSO4 0.1%~2.0%,pH为8.5~9.5,上述百分比为质量体积百分比。
2.如权利要求1所述的微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于步骤(1)中,菜籽粕粉的粒径不大于200μm。
3.如权利要求1或2所述的微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于步骤(2)中,将有产蛋白酶能力的菌种接入液态发酵培养基,使菌体浓度为105~107个/mL,发酵温度20~40℃,发酵时间1~5天。
4.如权利要求3所述的微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于步骤(2)中,有产蛋白酶能力的菌种经活化、扩大培养得到菌体浓度为107~108个/mL的种子液,接入液态发酵培养基。
5.如权利要求1或2所述的微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于步骤(4)中,所述提纯方法包括离子交换、疏水层析和凝胶过滤,收集具有抗氧化生物活性的组分,经冷冻干燥得到抗氧化性专一的菜籽肽。
6.如权利要求1或2所述的微生物液态发酵制备菜籽肽的方法,其特征在于步骤(4)中,所述提纯方法包括超滤膜分离收集不同分子量的滤液,然后将滤液采用离子交换树脂或反渗透脱盐。
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CN101434981A (zh) * | 2008-12-25 | 2009-05-20 | 南京财经大学 | 一种微生物固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法 |
CN101434982A (zh) * | 2008-12-25 | 2009-05-20 | 南京财经大学 | 一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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鞠兴荣等.菜籽肽的制备分离和化学修饰研究进展.《中国油脂》.2008,第33卷(第12期),32-35. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108419915A (zh) * | 2018-05-22 | 2018-08-21 | 乐山恒峰华邦生物科技有限公司 | 一种发酵菜籽粕饲料 |
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