CN109680021A - 一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用 - Google Patents

一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用 Download PDF

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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Abstract

本发明涉及一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用，本发明通过使用生物发酵剂与深海鱼骨进行发酵，提取得到一种低分子量(6000‑10000Da)的硫酸软骨素，该硫酸软骨素对小鼠AD模型、PC12细胞都显示出积极作用，效果明显优于普通方法获得的CS(市售鲨鱼骨来源的硫酸软骨素)及先前专利报道的低分子量硫酸软骨素(<5000Da)；本发明在分离纯化过程中，通过对pH、体系中NaCl、乙醇浓度的调节，得到的硫酸软骨素产品纯度高(>90％)。本发明对新型硫酸软骨素的生产及应用具有重要意义。

Description

一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默 病中的应用
技术领域
本发明属于生物发酵提取及医药领域，具体涉及一种低分子量硫酸软骨素及其制备工艺与在治疗阿尔茨海默病中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是德国精神病学和神经发病学家Alzheimer Alois于1906年首次发现并命名的中枢神经系统退行性疾病。AD患者主要的临床表现为认知功能障碍、记忆力减退、智商低能、语言表达不清和行为诡异等(叶勤,李海林,李箕君.阿尔茨海默病与血管性痴呆患者精神行为症状和认知功能损害的比较[J].临床精神医学杂志.2015,25(1):46-47.)。鉴于此病多发于 60岁以上人群，亦称“老年性痴呆”；其实不然，由于AD导致的痴呆占总痴呆病例的60-80％，故而得名(张旻,黄晓琳,张凤霞.重复经颅磁刺激在阿尔茨海默病治疗中的作用[J].内科急危重症杂志.2017,23(3):177-181.)。人类进入21世纪，全球人口老龄化加剧，特别是80岁以上老人中高达70-80％伴有不同程度的痴呆病症(赵文姣,孙德群.以糖原合成酶激酶-3为靶标的抗老年痴呆新药研究进展[J]. 有机化学.2018,38:1596-1607.)；所以，AD将成为全社会医疗、健康和维稳最重的负担之一。因此，发现和研制高效低毒的AD防治药物是目前的迫切任务。
硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)属于糖胺聚糖类(Glycosaminoglycans，GAGs)物质，以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、皮肤、玻璃体及血管等组织中，根据结构特点CS可分为CS-A，CS-B，CS-C，CS-D，CS-E，CS-F， CS-H，CS-K，CS-L和CS-M等，常见的CS中，CS-A是GalNAc的O-4位硫酸化，CS-B是GalNAc的O-4位和GlcA的O-2位硫酸化，CSC是GalNAc 的O-6位硫酸化，CS-D是GalNAc的O-6位和GlcA的O-2位硫酸化，CS-E 是GalNAc的O-6位和O-4位硫酸化(王金凤，等，硫酸软骨素的结构和相对分子质量对其生物活性影响的研究进展[J].药物生物技术.2014,21(2):185-188.)。目前利用鱼骨等动物骨提取硫酸软骨素的方法主要有碱提法、中性盐提法和酶提法等方法，不同提取方法得到的CS其硫酸化位点、硫酸化程度、相对分子量(Mr) 等均存在差异，这些差异往往是影响CS生物活性的关键因素。已有报道，采用鲨鱼软骨来源的低分子量(<5000Da)硫酸软骨素(ChondroitinSulfate，CS)用于治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病(例如AD，CN103342758A)。为了获得一种对AD有显著疗效的新型低硫酸软骨素，本发明利用生物发酵技术对鱼骨(鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨和比目鱼骨)中硫酸软骨素进行提取和纯化，获得一种高纯度低分子量的硫酸软骨素(6000-10000Da)。
发明内容
本发明提供一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：
(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15 分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。
步骤(1)中所述的深海鱼骨选自鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨、比目鱼骨中的一种或几种；所述粉碎优选粉碎至10-20目；所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。深海鱼骨、生物发酵剂、水的质量比为1:0.1-2:2-8，优选1:0.1-0.5:2-5。
步骤(5)中所述收集沉淀选自采用离心或过滤收集沉淀的方法，所述干燥选自冷冻干燥或真空干燥。
本发明所述低分子量硫酸软骨素的重均分子量优选为6000-10000Da，进一步优选为6000-9000Da。
本发明的另一实施方案提供上述低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15 分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。
步骤(1)中所述的深海鱼骨选自鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨、比目鱼骨中的一种或几种；所述粉碎优选粉碎至10-20目；所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。深海鱼骨、生物发酵剂、水的质量比为1:0.1-2:2-8，优选1:0.1-0.5:2-5。
步骤(5)中所述收集沉淀选自采用离心或过滤收集沉淀的方法，所述干燥选自冷冻干燥或真空干燥。
本发明所述低分子量硫酸软骨素的重均分子量优选为6000-10000Da，进一步优选为6000-9000Da。
本发明的另一实施方案提供上述低分子量硫酸软骨素在制备治疗、改善和/ 或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病优选阿尔茨海默病。
本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以上述低分子量硫酸软骨素为有效成分。该药物组合物还可任选包括其他对阿尔茨海默病有效的药物。该药物组合物还可包括药学上可接受的辅料，例如注射用水、药用载体、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、抗氧剂、稳定剂、增溶剂等。该药物组合物可按照制药领域技术规范和要求分别制备成符合临床治疗AD需求的制剂及其适宜的各种规格与剂型(包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂)如缓释、控释和肠溶性胶囊、片剂、混悬剂、微乳剂、亚微乳剂或注射剂。
本发明药物组合物涉及到的剂型的制备方法，属于药剂学领域常规的制备方法，是本领域技术人员根据现有技术(例如药典、教科书及制药领域的其他技术规范)就可以实现制备，本发明对上述剂型的常规制备方法不再赘述。
本发明中涉及调pH的步骤，均根据体系的酸碱性选自盐酸或氢氧化钠(或氢氧化钠溶液)进行pH调节，其中盐酸优选摩尔浓度为1-4mol/L的盐酸，氢氧化钠溶液优选质量分数为10％-50％的氢氧化钠溶液。本发明涉及使用“水”优选使用蒸馏水或去离子水。
与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明通过使用生物发酵剂与深海鱼骨进行发酵，提取得到一种低分子量(6000-10000Da)的硫酸软骨素，该硫酸软骨素对小鼠AD模型、PC12细胞都显示出积极作用，效果明显优于普通方法获得的CS(市售鲨鱼骨来源的硫酸软骨素)及先前专利报道的低分子量硫酸软骨素(<5000Da)；(2)本发明在分离纯化过程中，通过对pH、体系中NaCl、乙醇浓度的调节，得到的硫酸软骨素产品纯度高(>90％)。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好地理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与枯草芽孢杆菌(粉剂， 100g，有效菌数≥1.0×1011CFU/g，商品名：畅益康G1000)、去离子水(2.0kg) 混合均匀，于30℃下，发酵12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1mol/L，再调pH至6-7，于10-12℃下搅拌8小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-12℃搅拌16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至85℃，搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达60％；静置16小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(3.45g，以下简称产品A，为7895，纯度98.6％)。
实施例2
(1)将干燥的鮟鱇鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与嗜酸乳杆菌(粉剂， 2.0kg，有效菌数≥1.0×1010CFU/g，商品名：畅益康S100)、去离子水(8.0kg)混合均匀，于42℃下，发酵5小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠使体系中氯化钠的浓度达3mol/L，再调pH至6-7，于18-20℃下搅拌3小时后，再加氢氧化钠调pH至12-13，保持18-20℃搅拌8小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(4mol/L)调pH至7-9，并升温至70℃，搅拌30分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(4mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数10％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇使体系中乙醇的体积分数达40％；静置48小时后，离心收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(2.89g，以下简称产品B，为6958，纯度97.3％)。
实施例3
(1)将干燥的鲟鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与酵母菌(粉剂，500g，有效菌数≥1.0×108CFU/g)、水(3.0kg)混合均匀，于35℃下，发酵8小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达2mol/L，再调pH至6-7，于15-16℃下搅拌5小时后，再加质量分数10％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持15-16℃搅拌10小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(1mol/L)调pH至7-9，并升温至75℃，搅拌20分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(1mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌12分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数20％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入蒸馏水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数90％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达50％；静置30小时后，过滤收集沉淀、冷冻干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(3.23g，以下简称产品C，为7268，纯度97.8％)。
实施例4
(1)将干燥的比目鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与地衣芽孢杆菌(粉剂，1.0kg，有效菌数≥1.0×109CFU/g)、水(4.0kg)混合均匀，于38℃下，发酵10 小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠溶液(5mol/L)使体系中氯化钠的浓度达1.5mol/L，再调pH至6-7，于15-16℃下搅拌6小时后，再加质量分数30％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持15-16℃搅拌12小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(3mol/L)调pH至7-9，并升温至80℃，搅拌12分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌12分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数30％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达55％；静置24小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(2.95g，以下简称产品D，为7642，纯度98.1％)。
实施例5
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与风味蛋白酶(粉剂，100g，活力20U/mg)、去离子水(2.0kg)混合均匀，于30℃下，发酵12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1mol/L，再调pH至6-7，于10-12℃下搅拌8小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-12℃搅拌16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至85℃，搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达60％；静置20小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(3.75g，以下简称产品E，为8898，纯度96.9％)。
实施例6
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与胰蛋白酶(粉剂，100g，活力200U/mg)、去离子水(2.0kg)混合均匀，于30℃下，发酵12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1mol/L，再调pH至6-7，于10-12℃下搅拌8小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-12℃搅拌16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至85℃，搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达60％；静置20小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得硫酸软骨素(4.23g，以下简称产品F，为12475，纯度95.8％)。
实施例7
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与中性蛋白酶(粉剂，500g，活力50U/mg)、去离子水(5.0kg)混合均匀，于35℃下，发酵10小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达2.0mol/L，再调pH至6-7，于18-20℃下搅拌5小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持18-20℃搅拌12小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至80℃，搅拌20分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数40％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40％；静置48小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得硫酸软骨素(4.05g，以下简称产品G，为10560，纯度97.2％)。
实施例8
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与酸性蛋白酶(粉剂，200g，活力100U/mg)、去离子水(4.0kg)混合均匀，于42℃下，发酵12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达3.0mol/L，再调pH至6-7，于10-12℃下搅拌8小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-12℃搅拌16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至85℃，搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至2-3，室温下搅拌15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至 5.0-6.5，并于室温下，加入去离子水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达60％；静置24小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(3.69g，以下简称产品H，为9652，纯度96.5％)。
实施例9
(1)将干燥的鲨鱼骨(1.0kg)粉碎至10-20目后与枯草芽孢杆菌(粉剂， 100g，有效菌数≥1.0×1011CFU/g，商品名：畅益康G1000)、去离子水(2.0kg) 混合均匀，于30℃下，发酵12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入饱和氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1mol/L，再调pH至6-7，于10-12℃下搅拌8小时后，再加质量分数50％氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-12℃搅拌16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸(2mol/L)调pH至7-9，并升温至85℃，搅拌10分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入体积分数95％的乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达60％；静置16小时后，过滤收集沉淀、真空干燥即得所述低分子量硫酸软骨素(3.36g，以下简称产品I，为7936，纯度75.3％)。
实施例10
按照中国发明专利(申请号：201310284520.5)实施例1中记载的方法，制备得到一种低分子量硫酸软骨素(为3928，以下简称产品J)
本发明测试重均分子量采用如下方法：仪器：Waters 515HPLC，DAWN EOS多角度激光光散射仪，OPTILAB示差检测器；分离条件：分离柱TSK GMPWXL(300×7.8mm,TosoHaas,Montgomeryville,美国)，流动相： 0.2mol/L NaNO3,流速1.0mL/min；待测样品的制备：分别称取标准品CS、产品 A-G各10mg，溶于流动相(1mL)中，0.22μm滤膜过滤后备用。样品测定：按照以上分离条件，进样(100μL)，采用Wyatt ASTRA software(5.3版本)计算产品 A-J的
实施例11生物活性实验
1.1实验试剂和仪器：Aβ25-35购自美国Singma公司(产品编号A5509)；生理盐水、戊巴比妥钠、多聚甲醛等常规试剂均为市售；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法，96T；批号20171208)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA 法，100管；批号20171103)，购自南京建成生物工程研究所。ST51600型脑立体定位仪购自美国stoelting公司；SMG-2型程控水迷宫购自中国医学科学院药物研究所；SBA-2型程控避暗箱购自中国医学科学院药物研究所；70VB0370型半自动生化仪购自成都美生实业有限公司(代理法国的产品)；imark型酶标仪购自济南来宝医疗器械有限公司(代理Bio-Rad美国伯乐的产品)。
1.2实验动物：C57BL/6小鼠，SPF级，体重18-22g，雌雄各半，由空军军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2012-0007；动物饲养在独立换气笼盒(IVC系统)饲养(上海绍丰实验动物设备有限公司)，所需饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司出品)、饮用水(农夫山泉饮用天然水：生产许可证标号SC106610326 00241，陕西省太白山饮料有限公司出品)和舒克贝塔SPF 级精选刨花垫料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司出品)等均为市购标准用品。
1.3试药：产品A-J均由西安颂天乐济生物科技有限公司按照本发明实施例中记载的制备，标准品CS是通过商业购买的鲨鱼骨来源的硫酸软骨素。阳性对照药“维生素E”(VitE，国药准字H36022361，江西圣德药业有限公司生产，批号 201712022)和“安理申片”(盐酸多奈哌齐片：卫材(中国)药业有限公司出品，批号170920A)为市购产品。
1.4实验方法
1.4.1试药抗AD活性：按照文献(Wang CF,Xiao Y,Yang BY.Isolation andscreened neuroprotective active constituents from the roots and rhizomes ofValeriana amurensis[J].Fitoterapia.2014,96:48)方法即MTT法，筛查产品A-J及安理申片等试药的抗AD活性，以酶标仪检测各试药对Aβ1-42所致PC12细胞损伤的保护作用 (按公式“细胞活力＝A各组细胞/A空白对照组细胞×100％”计算)。
1.4.2试药对AD模型小鼠水迷宫潜伏期的影响
1.4.2.1AD小鼠模型制备：按照文献(王红梅,宋彩梅,刘新民.六味地黄丸对肾虚型老年痴呆动物模型的改善作用[J].中国实验方剂学杂志.2012,18(5):112-116.) 方法操作并略做改进。取C57BL/6小鼠使用35mg/kg戊巴比妥钠麻醉，固定于脑立体定位仪，常规头顶部皮肤消毒和备皮，手术暴露前囟，定位右侧脑室，由前囟向后约1.8mm，矢状缝旁开约1.5mm，颅骨表面向下约2.5mm部位，注射 3μLAβ25-35(2μg/μL-0.85％NaCl溶液)，对照组小鼠行相同手术但注射等体积的 0.85％NaCl溶液；关颅，缝合，正常饲养。
1.4.2.2动物分组和给药方法：制模小鼠饲养1周后，随机分成8组，即AD模型组、对照组、产品A、B、E、J、标准品CS组(120mg/kg)、安理申片阳性对照组(10μg/kg)；模型组和对照组均灌胃等体积0.85％NaCl溶液；全程实验给药4周即28天。
1.4.2.3小鼠水迷宫潜伏期测定：产品A、B、E、J、标准品CS和安理申片等试药灌胃给药2周(14天)时造模，小鼠术后恢复第3天开始学习训练，即由固定位置入水后，记录小鼠300秒钟内找到出口直到平台的时间为潜伏期，如果不能在300 秒钟内到达平台，实验者训其到达，连续驯化2次，每日1次；造模后第6天检测各组小鼠的学习潜伏期。
1.4.3试药对AD模型小鼠避暗箱潜伏期的影响：C57BL/6小鼠的造模、分组和各试药剂量及给药时间等均同前。小鼠造模后第7天开始避暗箱测试，连续训练2 次，每日1次，每次180秒钟。造模后第9天检测并记录各组小鼠第一次进入暗箱时间即潜伏期及180秒钟内的错误次数。
1.4.4试药对AD模型小鼠脑组织SOD、MDA含量的影响：小鼠依次完成水迷宫和避暗箱潜伏期检测后，冷冻条件下(0℃以下)取脑，分离嗅球和小脑后称留左侧皮质脑组织约100mg，用预冷的生理盐水制成1％匀浆，3000r/min，离心10min，取上清液，测定方法按照试剂盒说明书。脑组织MDA含量测定：取材同上，制成10％匀浆，3000r/min，离心10min，取上清液，测定方法按照试剂盒说明书操作。
1.4.5统计分析：实验结果采用均数±标准误表示，本实验数据统计分析使用SPSS18.0统计软件完成；Students t-检验，P<0.05和P<0.01二级表示数据的显著性差异程度。
2实验结果
2.1试药抗AD活性：MTT法检测各试药的抗AD活性如表1所示，产品A-E、G-J 在50μg/mL浓度下对PC12细胞显示出很强的保护作用，尤其是产品A-E对PC12细胞显示出极强的保护作用(超过产品J)，其中产品A-D对PC12细胞的保护作用超过89％。
表1各试药在50μg/mL浓度下对受损的PC12细胞的保护作用(％)
与模型组细胞活力值(50.18±2.91)％比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
2.2试药对AD模型小鼠水迷宫潜伏期、避暗箱潜伏期的影响：表2结果说明，模型组小鼠的水迷宫潜伏期长、避暗箱错误次数高，与对照组比较具有显著差异(P<0.05或P<0.01)，说明AD造模成功；产品A、B、E水迷宫潜伏期和避暗箱错误次数与产品J、标准品CS比较均有所降低(P<0.05或P<0.01)，而避暗箱潜伏期均显著延长(P<0.01)。由此可见，本发明低分子量硫酸软骨素(例如产品A、B、E)对AD模型小鼠被动回避条件反射记忆功能及空间记忆功能具有明显改善作用。
表2试药对AD小鼠水迷宫和避暗箱潜伏期及错误次数的影响
与模型组比较：**P＜0.01,*P＜0.05；与对照组比较：##P＜0.01,#P＜0.05。★剂量单位是μg/kg。
2.3试药对AD模型小鼠脑组织SOD活性的影响：结果见表3。模型组小鼠SOD 显著降低、MDA显著增高，与对照组比较具有显著差异(P<0.05)；各试药组和安理申阳性药组SOD含量均升高、MDA含量(P<0.05或P<0.01)，但鲨鱼和鲟鱼骨中提取纯化的CS作用更显著(P<0.01)。
表3试药对AD模型小鼠脑组织MDA、SOD活性的影响
与模型组比较：**P＜0.01,*P＜0.05；与对照组比较：##P＜0.01,#P＜0.05。★剂量单位是μg/kg。

Claims (10)

1.一种低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：
(1)将干燥的深海鱼骨粉碎后与生物发酵剂、水混合均匀，于30-42℃下，发酵5-12小时后，收集发酵液；
(2)向步骤(1)得到的发酵液中加入氯化钠或氯化钠溶液使体系中氯化钠的浓度达1-3mol/L，再调pH至6-7，于10-20℃下搅拌3-8小时后，再加氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至12-13，保持10-20℃搅拌8-16小时后，过滤、收集滤液；
(3)向步骤(2)得到的滤液中加入盐酸调pH至7-9，并升温至70-85℃，搅拌10-30分钟后，过滤，收集滤液；
(4)向步骤(3)得到的滤液中加入盐酸调pH至2-3，室温下搅拌10-15分钟后，过滤，收集滤液；
(5)向步骤(4)得到的滤液中加入氢氧化钠或氢氧化钠溶液调pH至5.0-6.5，并于室温下，任选加入适量的水使体系中氯化钠的浓度达1.0mol/L，并加入无水乙醇或乙醇溶液使体系中乙醇的体积分数达40-60％；静置16-48小时后，收集沉淀、干燥即得所述低分子量硫酸软骨素。
2.权利要求1所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)所述生物发酵剂选自酶类或微生物菌剂，优选微生物菌剂，其中酶类选自风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等；微生物菌剂选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌。
3.权利要求1-2任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)所述酶的活力≥20U/mg，所述微生物菌剂的有效菌数≥108CFU/g，优选≥109CFU/g。
4.权利要求1-3任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)深海鱼骨、生物发酵剂、水的质量比为1:0.1-2:2-8，优选1:0.1-0.5:2-5。
5.权利要求1-4任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(1)中所述的深海鱼骨选自鲨鱼骨、鮟鱇鱼骨、鲟鱼骨、比目鱼骨中的一种或几种；所述粉碎优选粉碎至10-20目。
6.权利要求1-5任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于步骤(5)中所述收集沉淀选自采用离心或过滤收集沉淀的方法，所述干燥选自冷冻干燥或真空干燥。
7.权利要求1-6任一项所述的低分子量硫酸软骨素，其特征在于所述低分子量硫酸软骨素的重均分子量优选为6000-10000Da，进一步优选为6000-9000Da。
8.权利要求1-7任一项所述的低分子量硫酸软骨素的制备方法，其特征在于包括权利要求1-7任一项所述的方法、步骤。
9.权利要求1-7任一项所述的低分子量硫酸软骨素在制备治疗、改善和/或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物中的应用。所述神经系统疾病优选阿尔茨海默病。
10.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以权利要求1-7任一项所述的低分子量硫酸软骨素为有效成分。该药物组合物还可任选包括其他对阿尔茨海默病有效的药物。该药物组合物还可包括药学上可接受的辅料，例如注射用水、药用载体、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、抗氧剂、稳定剂、增溶剂等。该药物组合物可按照制药领域技术规范和要求分别制备成符合临床治疗和戒毒毒瘾需求的制剂及其适宜的各种规格与剂型(包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂)如缓释、控释和肠溶性胶囊、片剂、混悬剂、微乳剂、亚微乳剂或注射剂。
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