CN113952251B - 一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药品和化妆品技术领域，公开了一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物及其制备方法与应用。该多糖组合物，包括：银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，这是基于发明人研究发现，银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖、黄芪多糖对皮肤微生态具有协同增效的效果，将上述多糖配合得到的多糖组合物应用于皮肤，能够调节皮肤微生态，有利于宿主皮肤稳态的建立和维持。

Description

一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于药品和化妆品技术领域，具体涉及一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤是人体表面积最大的器官，具有三大屏障系统。第一层为微生态屏障，由皮肤表面的多种微生物群构成；第二层为物理屏障，主要由脂质层构成；第三层为免疫屏障，是免疫系统发挥非特异性免疫的“第一道屏障”。其中，微生态屏障可以通过微生物的生物拮抗和代谢物的分泌，影响皮肤表层水油平衡及炎症状况，直接或间接对另外两种皮肤屏障产生影响。
基于皮肤屏障原理，目前已有改善物理屏障的相关护肤品，其主要研究方法为测定皮肤pH、水分含量、经皮失水率和油脂含量等指标，确定物理屏障的变化情况。而微生态屏障作为最重要的皮肤屏障之一，专利文献CN110664647A公开了一种保持皮肤微生态平衡的护肤品及其制备方法，结果表明其增加了皮肤表面微生物的相对丰度，但并未明确主要有益菌的变化情况。
宏基因组研究表明，皮肤微生态以四大类菌群为主：放线菌门(丙酸杆菌和棒状杆菌)、厚壁菌门(葡萄球菌)、变形菌门和拟杆菌门。在不同个体之间，由于油脂分泌及汗腺数量差异，皮肤菌群的结构和数量具有差异性。但相似的生态环境通常具有相似的微生物构成，如干燥部位以变形菌门如大肠杆菌(41％)为主，潮湿部位以棒状杆菌(28％)和变形菌门(26％)为主，脂溢部位则以放线菌门的丙酸杆菌(46％)为主。
当皮肤微生态遭到破坏，皮肤的免疫系统也相应受到影响，即产生皮肤病或发生感染。研究发现，特应性皮炎(AD)患者皮肤表面的菌群随着皮损不同时期而变化，在急性期间，皮肤菌群多样性显著下降，与疾病的严重程度密切相关。在慢性创伤性皮损中也发现了菌群多样性的下降，伴随葡萄球菌和丙酸杆菌含量的降低。痤疮患者皮肤中的痤疮丙酸杆菌比例显著升高，黄褐斑患者皮损区的路菌棒杆菌、需氧革兰阴性杆菌、微球菌及其他产色素的微球菌丰度显著升高，表明痤疮及黄褐斑的产生与皮肤微生态息息相关。
基于皮肤微生态原理，近年来在化妆品开发中出现了“益生元”类原料，当其作用于皮肤时可以提高表明有益菌丛的活性，从而达到对有害菌群的选择性抑制作用，进而调节皮肤生理活动、促进新陈代谢、延缓皮肤细胞衰老。多糖是构成生命的四大基本物质之一，在自然界中广泛存在，具有广泛的生物学效应。但是，暂无通过多糖调节皮肤微生态的技术公开。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物在制备产品中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，所述多糖组合物包括：银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖。
优选地，所述石斛为铁皮石斛。
优选地，所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为(1～10)：(0.5～10)：(0.5～10)：(1～10)；进一步为(1～3)：(0.5～2)：(0.5～2)：(1～3)；更进一步为(1～2)：(1～2)：(1～2)：(1～2)。
优选地，所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖可以市购获得，也可以分别以银耳、石斛、雪莲和黄芪为原料提取得到。
优选地，所述提取的方式为溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶提法、超滤法、超声提取和微波提取中的至少一种；进一步为超声提取。
优选地，所述提取的溶剂为水。
优选地，所述银耳多糖的制备方法为：1)将银耳与水混合，超声浸提，固液分离，得到粗多糖提取液；2)将粗多糖提取液浓缩至原体积的1/3～1/2，脱蛋白，固液分离，得到银耳多糖。
优选地，步骤1)中所述银耳混合前粉碎至全部过40目筛。
优选地，步骤1)中所述银耳与水的质量比为1:(20～40)。
优选地，步骤1)中所述超声浸提的条件为70～90℃下浸提20～40min。
优选地，所述步骤1)重复1～4次。
优选地，步骤1)所述中超声浸提后还包括加热处理。
优选地，所述加热处理的条件为70～90℃下加热1～3h。
优选地，步骤1)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心8～12min。
优选地，步骤2)中所述脱蛋白的方法为：加入乙醇，使乙醇终浓度为72～78％。
优选地，步骤2)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心10～20min。
优选地，所述银耳多糖的制备方法还包括如下步骤：去除乙醇，干燥。
优选地，所述石斛多糖的制备方法为：1)将石斛与水混合，超声浸提，固液分离，得到粗多糖提取液；2)将粗多糖提取液浓缩至原体积的1/3～1/2，脱蛋白，固液分离，得到石斛多糖。
优选地，步骤1)中所述石斛混合前粉碎至全部过60目筛。
优选地，步骤1)中所述石斛与水的质量比为1:(30～50)。
优选地，步骤1)中所述超声浸提的条件为50～70℃下浸提20～40min。
优选地，所述步骤1)重复1～4次。
优选地，步骤1)所述中超声浸提后还包括加热处理。
优选地，所述加热处理的条件为50～70℃下加热1～3h。
优选地，步骤1)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心8～12min。
优选地，步骤2)中所述脱蛋白的方法为：加入乙醇，使乙醇终浓度为72～78％。
优选地，步骤2)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心10～20min。
优选地，所述石斛多糖的制备方法还包括如下步骤：去除乙醇，干燥。
优选地，所述雪莲多糖的制备方法为：1)将雪莲与水混合，超声浸提，固液分离，得到粗多糖提取液；2)将粗多糖提取液浓缩至原体积的1/3～1/2，脱蛋白，固液分离，得到雪莲多糖。
优选地，步骤1)中所述雪莲混合前粉碎至全部过60目筛。
优选地，步骤1)中所述雪莲与水的质量比为1:(20～40)。
优选地，步骤1)中所述超声浸提的条件为40～60℃下浸提20～40min。
优选地，所述步骤1)重复1～4次。
优选地，步骤1)所述中超声浸提后还包括加热处理。
优选地，所述加热处理的条件为40～60℃下加热1～3h。
优选地，步骤1)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心8～12min。
优选地，步骤2)中所述脱蛋白的方法为：加入乙醇，使乙醇终浓度为72～78％。
优选地，步骤2)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心10～20min。
优选地，所述雪莲多糖的制备方法还包括如下步骤：去除乙醇，干燥。
优选地，所述黄芪多糖的制备方法为：1)将黄芪与水混合，超声浸提，固液分离，得到粗多糖提取液；2)将粗多糖提取液浓缩至原体积的1/3～1/2，脱蛋白，固液分离，得到黄芪多糖。
优选地，步骤1)中所述黄芪混合前粉碎至全部过60目筛。
优选地，步骤1)中所述黄芪与水的质量比为1:(10～30)。
优选地，步骤1)中所述超声浸提的条件为40～60℃下浸提20～40min。
优选地，所述步骤1)重复1～4次。
优选地，步骤1)所述中超声浸提后还包括加热处理。
优选地，所述加热处理的条件为40～60℃下加热1～3h。
优选地，步骤1)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心8～12min。
优选地，步骤2)中所述脱蛋白的方法为：加入乙醇，使乙醇终浓度为72～78％。
优选地，步骤2)中所述固液分离的方式为离心。
优选地，所述离心的条件为7000～9000rpm/min离心10～20min。
优选地，所述黄芪多糖的制备方法还包括如下步骤：去除乙醇，干燥。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物在制备产品中的应用。
优选地，所述产品包括化妆品和药品。
优选地，所述化妆品包括洁面乳、化妆水、乳液、膏霜和精华液。
优选地，所述药品的剂型包括液体、乳膏、凝胶、喷雾、冻干制剂、颗粒、片剂和胶囊。
优选地，所述产品具有调节皮肤微生态作用。
优选地，所述调节皮肤微生态为(1)～(4)中任一种：
(1)促进皮肤菌群种类的增加；
(2)促进皮肤菌群多样性的增加；
(3)抑制有害菌的生长与增殖；
(4)促进益生菌的生长与增殖；
所述有害菌包括葡萄球菌属、罗尔斯顿菌属和大肠杆菌属；
所述益生菌包括乳杆菌属、别样杆菌属、阿克曼氏菌属和双歧杆菌属。
优选地，所述产品还包括药品或化妆品上可接受的辅料。
本发明的第四个方面，提供一种产品，包括本发明第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物。
优选地，所述产品包括化妆品和药品。
优选地，所述化妆品包括洁面乳、化妆水、乳液、膏霜和精华液。
优选地，所述药品的剂型包括液体、乳膏、凝胶、喷雾、冻干制剂、颗粒、片剂和胶囊。
优选地，所述产品具有调节皮肤微生态作用。
优选地，所述调节皮肤微生态为(1)～(4)中任一种：
(1)促进皮肤菌群种类的增加；
(2)促进皮肤菌群多样性的增加；
(3)抑制有害菌的生长与增殖；
(4)促进益生菌的生长与增殖；
所述有害菌包括葡萄球菌属、罗尔斯顿菌属和大肠杆菌属；
所述益生菌包括乳杆菌属、别样杆菌属、阿克曼氏菌属和双歧杆菌属。
优选地，所述产品还包括药品或化妆品上可接受的辅料。
一种膏霜，包含：本发明第一方面的具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物和丙二醇。
优选地，所述膏霜还包含pH调节剂和水。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种多糖组合物，包括：银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，这是基于发明人研究发现，银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖、黄芪多糖对皮肤微生态具有协同增效的效果，将上述多糖配合得到的多糖组合物应用于皮肤，能够调节皮肤微生态，有利于宿主皮肤稳态的建立和维持：使用后，人体额头、左脸颊和右脸颊皮肤菌群的种类和多样性增加，具体表现为：增加额头皮肤菌群中的乳杆菌属和双歧杆菌属，增加左脸颊皮肤菌群中的双歧杆菌属，增加右脸颊皮肤菌群中的乳杆菌属、芽孢杆菌属、阿克曼氏菌属和别样杆菌属，从而加强皮肤微生态屏障，间接影响皮肤的物理屏障及免疫屏障，有效改善皮肤状态，同时，可以增强皮肤的抗氧化活力，促进皮肤的免疫反应，有利于宿主皮肤稳态的建立和维持预防皮肤病的发生，激发皮肤的抗氧化活力，延缓皮肤衰老。上述四种多糖均提取于纯天然植物，毒副作用较低，而且价格相对便宜，可用于制备药品和化妆品。
附图说明
图1是不同多糖及多糖组合物对益生菌(长双歧杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌)体外生长情况的影响图：其中，A是不同多糖及多糖组合物对长双歧杆菌体外生长情况的影响图；B是不同多糖及多糖组合物对短双歧杆菌体外生长情况的影响图；C是不同多糖及多糖组合物对植物乳杆菌体外生长情况的影响图；D是不同多糖及多糖组合物对副干酪乳杆菌体外生长情况的影响图。
图2是多糖组合物对额头皮肤菌群的OTU数量的影响图。
图3是多糖组合物对额头皮肤菌群的Shannon指数的影响图。
图4是多糖组合物对额头皮肤菌群组成(门水平)的影响图。
图5是多糖组合物对额头皮肤菌群组成(属水平，相对丰度前20)的影响图。
图6是多糖组合物对左脸皮肤菌群的OTU数量的影响图。
图7是多糖组合物对左脸皮肤菌群的Shannon指数的影响图。
图8是多糖组合物对左脸皮肤菌群组成(门水平)的影响图。
图9是多糖组合物对左脸皮肤菌群组成(属水平，相对丰度前20)的影响图。
图10是多糖组合物对脸颊皮肤菌群的OTU数量的影响图。
图11是多糖组合物对脸颊皮肤菌群的Shannon指数的影响图。
图12是多糖组合物对脸颊皮肤菌群组成(门水平)的影响图。
图13是多糖组合物对脸颊皮肤菌群组成(属水平，相对丰度前20)的影响图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料，所述水可以为去离子水、纯化水或蒸馏水。
下述实施例中银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖、黄芪多糖的制备方法如下：
银耳多糖的制备方法如下：取晒干之后的银耳，除去有虫或变质部位，用粉碎机粉碎，过40目筛；取药材粉，按照1:30料液比(质量比)加入水，80℃超声浸提30min后保持温度加热2小时；收集上清液冷却后离心，以8000rpm/min离心10min，剩下的滤渣重复提取二次，将三次离心的上清液进行合并在50℃下减压浓缩蒸发至原体积的1/3，再将95％(v/v，下同)乙醇缓慢加入到浓缩液中并搅拌使乙醇最终浓度达到75％，静置24h，沉淀蛋白质；8000r/min高速离心分离15min，得上清液，真空旋转干燥去除乙醇后得多糖提取液；冻干48h，得到银耳多糖。
铁皮石斛多糖的制备方法如下：取晒干之后的铁皮石斛，除去有虫或变质部位，用粉碎机粉碎，过60目筛；取药材粉，按照1:40料液比(质量比)加入水，60℃超声浸提30min后保持温度加热2小时；收集上清液冷却后离心，以8000rpm/min离心10min，剩下的滤渣重复提取二次，将三次离心的上清液进行合并在50℃下减压浓缩蒸发至原体积的1/3，再将95％乙醇缓慢加入到浓缩液中并搅拌使乙醇最终浓度达到75％，静置24h，沉淀蛋白质。8000r/min高速离心分离15min，得上清液，真空旋转干燥去除乙醇后得多糖提取液；冻干48h，得到铁皮石斛多糖。
雪莲多糖的制备方法如下：取晒干之后的雪莲，除去有虫或变质部位，用粉碎机粉碎，过60目筛。取药材粉，按照1:30料液比(质量比)加入水，50℃超声浸提30min后保持温度加热2小时；收集上清液冷却后离心，以8000rpm/min离心10min，剩下的滤渣重复提取二次，将三次离心的上清液进行合并在50℃下减压浓缩蒸发至原体积的1/3，再将95％乙醇缓慢加入到浓缩液中并搅拌使乙醇最终浓度达到75％，静置24h，沉淀蛋白质；8000r/min高速离心分离15min，得上清液，真空旋转干燥去除乙醇后得多糖提取液；冻干48h，得到雪莲多糖。
黄芪多糖的制备方法如下：取晒干之后的黄芪，除去有虫或变质部位，用粉碎机粉碎，过60目筛；取药材粉，按照1:20料液比(质量比)加入热水，50℃超声浸提30min后保持温度加热2小时；收集上清液冷却后离心，以8000rpm/min离心10min，剩下的滤渣重复提取二次，将三次离心的上清液进行合并在50℃下减压浓缩蒸发至原体积的1/3，再将95％乙醇缓慢加入到浓缩液中并搅拌使乙醇最终浓度达到75％，静置24h，沉淀蛋白质；8000r/min高速离心分离15min，得上清液，真空旋转干燥去除乙醇后得多糖提取液；冻干48h，得到黄芪多糖。
下述实施例中涉及的培养基如下：
营养琼脂培养基：牛肉膏，1g；酵母膏，2g；蛋白胨，5g；NaCl，5g；琼脂，15g；蒸馏水，1000mL；pH＝7.4。
MRS固体培养基：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母膏，5g；柠檬酸氢二铵，2g；葡萄糖，20g；乙酸钠，5g；琼脂，20g；K2HPO4，2g；MgSO4·7H2O，0.58g；MnSO4·4H2O，0.25g；吐温-80，1mL；蒸馏水，1000mL；pH＝6.4。
MRS液体培养基：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母膏，5g；柠檬酸氢二铵，2g；葡萄糖，20g；乙酸钠，5g；K2HPO4，2g；MgSO4·7H2O，0.58g；MnSO4·4H2O，0.25g；吐温-80，1mL；蒸馏水，1000mL；pH＝6.4。
MRS改良培养基：在MRS液体培养基基础上，以不同种类多糖取代葡萄糖作为碳源，添加浓度为2.0％(w/w)。
下述实施例中涉及的实验菌株均来自于江南大学食品生物中心菌种保藏中心：其中，长双歧杆菌CCFM687已在专利文献CN109055269A中公开，短双歧杆菌CCFM1025已在专利文献CN109055269A中公开、植物乳杆菌N13已在专利文献CN102586155A中公开、副干酪乳杆菌CCFM1176已在专利文献CN113122478A中公开。
实施例采用的皮肤菌群采样、皮肤生理状态、皮肤微生物菌群组成分析的方法如下。
1)皮肤菌群采样：根据Grice等人发表在Science上关于人类皮肤微生物组学的多样性研究(Grice et al.Topographical and Temporal Diversity of the Human SkinMicrobiome.Science,2009,324:1190-1193)，面部皮肤采样拟选取额头、左脸颊和右脸颊3个部位，采样方法参照文献进行，采样后保存于-20℃。
2)皮肤微生物菌群组成分析
收集皮肤样品后，按照本实验室成熟的微生物菌群组成分析方案进行高通量测序，简述如下：按照Fast Spin Kit for Soil试剂盒的说明书，提取基因组；采用PCR扩增16S rDNA的V3-V4区，并进行胶回收PCR产物；采用QuBit对胶回收产物定量；混样，按照TruSeq DNA HT Sample Prep Kit说明书进行测序文库构建；在MiSeq测序平台进行高通量测序；数据分析。
测序完成后，对测序原始数据进行过滤处理，得到优化序列，采用QIIME2平台进行生物信息学分析。一般情况下，不同的16S rRNA序列的相似性大于98％即可将其定义为一个OTU，也就是每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种，通过OTU分析可知道样品中不同微生物的丰度。Shannon指数描述物种的多样性，Shannon值越大，说明群落多样性越高。
将序列进行下述分析：α-多样性差异分析(OUT种类、Shannon指数)、物种组成分析(柱状图/热图)、群落差异分析(如置换多元方差分析)，探究多糖组合物对皮肤微生态的影响。
实施例1一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为2:1:1:2。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
实施例2一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为2:1:1:1。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
实施例3一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为1:2:1:1。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
实施例4一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为1:1:2:1。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
实施例5一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为1:1:1:2。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
实施例6一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物
1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，该多糖组合物包括：银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖，银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为1:1:1:1。
2.上述具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、铁皮石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
效果实施例
1.多糖组合物的体外抑菌实验
菌株活化：预先将金黄色葡萄球菌及大肠杆菌分别接入相对应的营养琼脂培养基进行活化，置于37℃恒温培养箱中培养24h，然后分别挑取1环已活化好的菌种放入9mL无菌水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液，浓度约为107CFU/mL，备用。
琼脂扩散滤纸片法测量抑菌圈：将定性滤纸加工成9mm的圆形滤纸片，放入干燥的平皿中，121℃干热灭菌20min后，浸入各组分多糖稀释液(100mg/mL)以及实施例1～6得到的多糖组合物(100mg/mL)，使其充分吸收，备用；将已灭菌的营养琼脂培养基熔化后倒入平皿中，待冷却凝固后，用取液器分别加入0.4mL菌悬液，然后用无菌涂布器涂布均匀，用无菌镊子夹取浸泡处理过的滤纸片贴在上述含菌平皿中，每一浓度的滤纸片间隔一定距离，并以浸泡过无菌水的滤纸片作为对照；每个平皿贴5片，每一种菌种做3个重复；然后将各平皿倒置于37℃恒温培养箱中48h；取出，测量抑菌圈的直径。
结果如表1所示：银耳多糖对金黄色葡萄球菌无抑制作用，对大肠杆菌具有一定的抑制作用；虽然铁皮石斛多糖、雪莲多糖、黄芪多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有一定的抑制作用，但是，在相同浓度下，实施例提供的多糖组合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用增强(实施例提供的多糖组合物的抑菌圈直径大于各组分多糖的抑菌圈直径)，尤其，实施例1、3、5、6提供的多糖组合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著增强；实施例1、3、5、6提供的多糖组合物对大肠杆菌的抑制作用显著增强；可见，多糖复组合物中各组分多糖具有协同增效作用。
表1单组分多糖及其组合物对两株菌的抑菌圈测定结果
注：表1数据为3次重复实验的平均值；—，无抑菌现象。
2.多糖组合物的体外促生长实验
菌株活化：将不同益生菌菌株(长双歧杆菌CCFM687、短双歧杆菌CCFM1025、植物乳杆菌N13、副干酪乳杆菌CCFM1176)接入MRS固体培养基中，于37℃培养16h后，挑取单菌落接入MRS液体培养基中于37℃培养18h活化，连续传代2次得到实验用菌液；6000rpm离心菌体8min，0.9％生理盐水洗涤菌体两次后得到菌体用于后续实验。
菌株生长情况测定：以菌体吸光度值的变化，考察不同种类多糖作为碳源对益生菌体外增殖的效果，分别接种定量浓缩菌液(终浓度约为5×106CFU/mL)于分装好的、MRS液体培养基及MRS改良培养基(以各组分多糖、实施例1～6提供的多糖组合物为碳源的MRS液体培养基，各组分多糖及多糖组合物的浓度为2％)中，37℃厌氧培养12h后取样测定吸光度值；吸光度测定波长为600nm，无菌培养基做空白对照；每组做三次平行实验。
结果如图1所示：在相同浓度下，与单组分多糖相比，以实施例提供的多糖组合物为碳源的长双歧杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌的吸光度值提高：与单组分多糖相比，以实施例1～6提供的多糖组合物为碳源的长双歧杆菌的吸光度值提高；以实施例1提供的多糖组合物为碳源的短双歧杆菌的吸光度值提高；以实施例1～6提供的多糖组合物为碳源的植物乳杆菌的吸光度值提高；以实施例1～4、6提供的多糖组合物为碳源的副干酪乳杆菌的吸光度值提高；可见，本实施例提供的多糖组合物可以提高长双歧杆菌和/或短双歧杆菌和/或植物乳杆菌和/或副干酪乳杆菌的体外增殖：多糖复合物中各组分多糖具有协同增效作用。
3.多糖组合物对人体额头皮肤菌群组成及生理指标的影响
1)实验方法
招募74名女性志愿者，年龄在20～55岁之间，平均年龄为30岁。根据志愿者皮肤特点，皮肤共分为干性皮肤、油性皮肤和混合皮肤3类，将上述三种皮肤性质的志愿者随机平均分为I、Ⅱ组。试验化妆品包括基础膏霜(基础组)和添加实施例1的多糖组合物(0.08％，w/w)的基础膏霜(复合多糖化妆品)，其中I组志愿者额头使用基础膏霜，II组志愿者的额头使用添加多糖组合物的基础膏霜(多糖组)。基础膏霜的成分为：5％丙二醇(w/w)，去离子水余量，柠檬酸调节pH＝6。
试验用化妆品每天早、晚各用一次，每次使用量为0.3±0.1g，整个干预期为1个月；干预前、干预后每周取样一次，即第0天、7天、14天、21天和28天分别取样，总计5次；每次在3个部位取样，测定皮肤的微生物菌群组成；取样同时，分别记录志愿者的皮肤状况，并测定皮肤的生理指标。
2)实验结果
由图2、图3可知，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，额头皮肤菌群的种类显著增加(p＝0.006)，多样性也显著增加(p＝0.003)。
研究表明，皮肤受损常伴随着菌群多样性的下降，因此增加皮肤菌群多样性有助于增强皮肤屏障，表明含多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够通过调节皮肤微生态增强皮肤的稳定性。
由图4可知，在门水平上，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，额头皮肤菌群中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度降低，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度增加，表明添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够影响额头皮肤门水平的菌群组成。
由图5可知，在属水平上，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，额头皮肤菌群中乳杆菌属(Lactobacillus)、别样杆菌属(Alistipes)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等菌属的相对丰度增加，而罗尔斯顿菌属(Ralstonia)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等菌属的相对丰度降低。
目前已有相关研究表明，乳杆菌属能够抑制细菌性皮肤感染，并激发皮肤细胞的抗氧化活力，具有一定抵抗光老化的效果；如一株植物乳杆菌KLDS1.0667对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌具有较强的抑菌和杀菌效果，能够抵抗细菌性皮肤感染；联合中草药及乳杆菌发酵上清液对皮肤进行擦拭实验，发现其具有良好的消毒、抑菌效果，且对皮肤刺激性小、无异味；而双歧杆菌属和别样乳杆菌属中的部分菌种能够利用皮脂中的成分生成短链脂肪酸，如乙酸、丁酸等具有抗菌作用的物质，有助于维持皮肤酸性环境，进而防止病原性微生物在皮肤上的定植；阿克曼氏菌属作为下一代益生菌，则能够为共生菌营造理想的生存环境，激发并促进皮肤应答反应；一项研究指出，嗜黏蛋白阿克曼氏菌能够抵抗氧化应激，减少ROS的生长，从而减缓氧化导致的皮肤衰老；罗尔斯顿菌是导致医院内感染的少见条件致病菌，可导致肺内感染和脑膜炎等相关疾病，对人体的免疫稳态有一定影响；在特异性皮炎期间金黄色葡萄球菌丰度显著上升，表明葡萄球菌属丰度的增加可能对皮肤稳态造成影响。
综上，添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够增加额头皮肤菌群中的乳杆菌属和双歧杆菌属，降低葡萄球菌属，表明其能够通过调节皮肤微生态改善皮肤状态，预防皮肤病的发生，激发皮肤的抗氧化活力，延缓皮肤衰老。
4.多糖组合物对人体左脸颊皮肤菌群组成及生理指标的影响
1)实验方法
招募74名女性志愿者，年龄在20～55岁之间，平均年龄为30岁。根据志愿者皮肤特点，皮肤共分为干性皮肤、油性皮肤和混合皮肤3类，将上述三种皮肤性质的志愿者随机平均分为I、Ⅱ组。试验化妆品包括基础膏霜(基础组)和添加实施例1的多糖组合物(0.08％，w/w)的基础膏霜(复合多糖化妆品)，其中I组志愿者额头使用基础膏霜，II组志愿者的左脸使用添加多糖组合物的基础膏霜(多糖组)。基础膏霜的成分为：5％丙二醇(w/w)，去离子水余量，柠檬酸调节pH＝6。
试验用化妆品每天早、晚各用一次，每次使用量为0.3±0.1g，整个干预期为1个月；干预前、干预后每周取样一次，即第0天、7天、14天、21天和28天分别取样，总计5次；每次在3个部位取样，测定皮肤的微生物菌群组成；取样同时，分别记录志愿者的皮肤状况，并测定皮肤的生理指标。
2)实验结果
由图6、图7可知，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，左脸颊皮肤菌群的种类和多样性不存在显著差异(p>0.05)。
由图8可知，在门水平上，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，左脸颊皮肤菌群的组成类似，各门的相对丰度相近，不存在明显的差异。
由图9可知，在属水平上，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)28天后，左脸颊皮肤菌群中双歧杆菌属的相对丰度增加。
相关研究表明，双歧杆菌属中的部分菌种能够利用皮脂中的成分生成短链脂肪酸，后者具有抗菌作用，有助于维持皮肤酸性环境，进而防止病原性微生物在皮肤上的定植。因此，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够调节宿主的皮肤微生态，增加左脸皮肤菌群中双歧杆菌属的数量，从而有效防止皮肤的细菌性感染，增强皮肤的水油平衡，对宿主的皮肤稳态具有显著改善作用。
5.多糖组合物对同一人群左、右脸颊皮肤菌群组成及生理指标的影响
1)实验方法
招募74名女性志愿者，年龄在20～55岁之间，平均年龄为30岁。根据志愿者皮肤特点，皮肤共分为干性皮肤、油性皮肤和混合皮肤3类。试验化妆品包括基础膏霜(基础组)和添加实施例1的多糖组合物(0.08％，w/w)的基础膏霜(复合多糖化妆品)，其中左脸使用基础膏霜(基础组)，右脸使用添加多糖组合物的基础膏霜(多糖组)。基础膏霜的成分为：5％丙二醇(w/w)，去离子水余量，柠檬酸调节pH＝6。
试验用化妆品每天早、晚各用一次，每次使用量为0.3±0.1g，整个干预期为1个月；干预前、干预后每周取样一次，即第0天、7天、14天、21天和28天分别取样，总计5次；每次在3个部位取样，测定皮肤的微生物菌群组成；取样同时，分别记录志愿者的皮肤状况，并测定皮肤的生理指标。
2)实验结果
由图10、图11可知，在使用化妆品28天后，同一人群左脸颊和右脸颊皮肤菌群的种类和多样性存在差异；与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)后，右脸脸颊皮肤菌群的种类和多样性较左脸脸颊显著提高。
研究表明，皮肤受损常伴随着菌群多样性的下降，因此增加皮肤多样性有助于增强皮肤屏障。在相同的环境下，与基础膏霜相比，使用添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够通过增加右脸皮肤菌群的多样性，增强皮肤的稳定性。
由图12可知，在门水平上，连续使用基础膏霜和添加多糖组合物的基础膏霜(多糖组)28天后，左脸颊与右脸颊皮肤菌群组成存在较大的差异。与左脸颊相比，添加多糖组合物的基础膏霜(多糖组)使用后右脸颊皮肤菌群中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroid etes)的相对丰度较高，而变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度较低，表明添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)能够影响额头皮肤门水平的菌群组成。
由图13可知，在属水平上，与左脸颊相比，使用复合多糖化妆品后右脸颊皮肤菌群中乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)和别样杆菌属(Alistipes)等的相对丰度较高，罗尔斯顿菌属(Ralstonia)和葡萄球菌属(Staphylococcu s)等的相对丰度较低。
研究表明，乳杆菌属能够抑制细菌性皮肤感染，并激发皮肤细胞的抗氧化活力，具有一定抵抗光老化的效果；如一株瑞士乳杆菌NS-8经体外实验证明在角质细胞中可以显著抑制其ROS的生长，说明具有较强的皮肤抗氧化能力；通过建立紫外线诱导的小鼠模型，进一步验证瑞士乳杆菌NS-8可以有效缓解小鼠的皮肤光老化，如减少紫外线引起的表皮增厚和跨膜失水量，降低皮肤的脂质过氧化水平。
在芽胞杆菌属中，枯草芽孢杆菌含有特异性生产透明质酸所必须的关键酶-透明质酸合酶，因此常用于生产透明质酸；透明质酸是天然存在的一种具有高黏弹性、高保湿性的大分子糖胺聚糖，具有防皱、美容和恢复皮肤生理功能的作用。
而阿克曼氏菌属作为下一代益生菌，则能够为共生菌营造理想的生存环境，激发并促进皮肤应答反应；一项研究指出，嗜粘阿克曼氏菌能够抵抗氧化应激，减少ROS的生长，从而减缓氧化导致的皮肤衰老。
别样杆菌属中的部分菌种能够利用皮脂中的成分生成短链脂肪酸，如乙酸、丁酸等具有抗菌作用的物质，有助于维持皮肤酸性环境，进而防止病原性微生物在皮肤上的定植。
罗尔斯顿菌是导致医院内感染的少见条件致病菌，可导致肺内感染和脑膜炎等相关疾病，对人体的免疫稳态有一定影响。
在特异性皮炎期间金黄色葡萄球菌丰度显著上升，表明葡萄球菌属丰度的增加可能对皮肤稳态造成影响。
综上，添加多糖组合物的基础膏霜(复合多糖化妆品)的使用能够提高乳杆菌属、双歧杆菌属及阿克曼氏菌属的相对丰度，降低葡萄球菌属的相对丰度，从而增强皮肤的抗氧化活力，促进皮肤的免疫反应，防皱美容，且有利于宿主皮肤稳态的建立和维持。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有调节皮肤微生态作用的多糖组合物，由以下组分组成：银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖；
所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为（1～10）：（0.5～10）：（0.5～10）：（1～10）。
2.根据权利要求1所述的多糖组合物，其特征在于，
所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为（1～3）：（0.5～2）：（0.5～2）：（1～3）。
3.根据权利要求2所述的多糖组合物，其特征在于，
所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖的质量比为（1～2）：（1～2）：（1～2）：（1～2）。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的多糖组合物，其特征在于：
所述银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖分别以银耳、石斛、雪莲和黄芪为原料提取得到。
5.权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物的制备方法，将银耳多糖、石斛多糖、雪莲多糖和黄芪多糖混合，得到。
6.权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物在制备产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述产品包括化妆品和药品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
所述产品具有调节皮肤微生态作用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述调节皮肤微生态为（1）～（4）中任一种：
（1）促进皮肤菌群种类的增加；
（2）促进皮肤菌群多样性的增加；
（3）抑制有害菌的生长与增殖；
（4）促进益生菌的生长与增殖；
所述有害菌包括葡萄球菌属、罗尔斯顿菌属和大肠杆菌属；
所述益生菌包括乳杆菌属、别样杆菌属、阿克曼氏菌属和双歧杆菌属。
10.一种产品，包含权利要求1～4中任一项所述的多糖组合物。
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