CN116807957A - 一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物及其制备方法应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，包括植物乳杆菌后生元粉和果聚糖按质量比1～1.5:1混合得到，植物乳杆菌后生元粉是将活化后的植物乳杆菌YC2022菌株，经过扩大培养和高密度发酵，得到含有灭活的7～8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液，在发酵液中加入保护剂进行喷雾干燥得到后生元粉。海藻多糖、果聚糖作为保护剂可以保护灭活后的益生菌体，提高发挥功效的菌体数量。果聚糖还能作为益生元，调节口腔，胃肠道的菌群结构。本发明可以显著提升后生元粉组合物的抑制口臭作用，并且能应用于口腔护理产品中，用于制备咀嚼片、牙膏和漱口水产品，形成口腔护理体系，在抑制口臭方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种植物乳杆菌YC 2022后生元粉剂与果聚糖复合配方组合物的制备方法及其在制备抑制口臭的咀嚼片、牙膏和漱口水等口腔护理产品中的应用。
背景技术
目前有部分人群有口臭症状，极度影响他们的生活。口臭与胃肠道疾病密切相关，同时会加剧口腔疾病，并且影响正常生活社交。口臭的主要原因是那些引起口腔疾病的菌群。如何抑制口腔有害菌群成为治疗口臭的关键。目前，治疗口臭往往使用抗菌的化学药物或含漱剂，但长期使用会导致细菌产生耐药性，并且还有一定的副作用。
近些年来，后生元疗法逐渐受到人们的关注。后生元具有应用广泛，稳定性高，安全性高和菌数含量高等优点，具有一定的研究开发价值，市场前景广阔。植物乳杆菌作为一种常见的乳酸菌，既拥有乳酸菌的产酸特性，又具有较强的耐酸耐胆盐能力，应用前景广阔。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，将植物乳杆菌后生元粉与果聚糖复配，本发明通过加入果聚糖增强后生元效果，有效的缓解抑制口臭。
本发明采用的技术方案如下：
一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，所述植物乳杆菌后生元粉组合物包括植物乳杆菌后生元粉和果聚糖，植物乳杆菌后生元粉和果聚糖的质量比为1～1.5:1。
进一步，所述植物乳杆菌后生元粉含有浓度为7～8×1010CFU/mL的灭活的植物乳杆菌菌体及代谢产物。
所述植物乳杆菌后生元粉按以下方法制得：
取活化后的植物乳杆菌YC 2022菌株，以3.5～4vol％的接种量接种于MRS培养基，36.5～37℃扩大培养12h后，以3.5～4vol％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵，发酵36h，得到含有7～8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液；培养得到的植物乳杆菌发酵液灭活后加入保护剂，混匀后喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉；
所述保护剂为海藻多糖和果聚糖，海藻多糖的质量用量为发酵液质量的7.5～8％，果聚糖的质量用量为发酵液质量的3.5～4％；更优选海藻多糖、果聚糖的质量比为2:1～1.5。
所述植物乳杆菌Lacobacillus plantarum YC 2022菌株是申请人从益生菌饲料中筛选得到，现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20221872，保藏日为2022年12月5日。
所述MRS培养基包括以下质量分数的成分：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖10～12.5g/L，蛋白胨27.5～30g/L，酵母粉7～7.5g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
进一步，所述高密度发酵的条件优选为：温度36.5～37℃，湿度60～70％，pH值＝6.5～7。
进一步，所述喷雾干燥的条件优选为：进风温度155～160℃，出风温度85～90℃。
本发明还提供所述抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物的制备方法，所述方法为：
取活化后的植物乳杆菌YC 2022菌株，以3.5～4vol％的接种量接种于MRS培养基，36.5～37℃扩大培养12h后，以3.5～4vol％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵，发酵36h，得到含有7～8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液；将培养得到的植物乳杆菌发酵液灭活后加入保护剂，混匀后喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉；
将植物乳杆菌后生元粉与果聚糖按照质量比例1～1.5:1混合复配，烘干，制得所述植物乳杆菌后生元粉组合物。
所述烘干的温度优选为55～60℃，时间优选为20-30分钟，烘干至水分含量在2％以下。
所述海藻多糖、果聚糖原料均分别经过粉碎机粉碎，过100目筛备用。
进一步的，本发明还提供所述抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物在口腔护理产品中的应用，进一步，所述口腔护理产品包括抑制口臭的后生元咀嚼片、抑制口臭的后生元牙膏或抑制口臭的后生元漱口水等。
本发明还提供一种抑制口臭的后生元咀嚼片，所述后生元咀嚼片按以下方法制得：
将植物乳杆菌后生元粉组合物和低聚异麦芽糖以质量比1：4质量比混合，然后经过造粒、烘干，制备得到后生元咀嚼片。
本发明还提供一种抑制口臭的后生元牙膏，所述牙膏按以下方法制得：
将3质量份植物乳杆菌后生元粉组合物、6质量份聚乙二醇、15质量份甘油、1质量份羟乙基纤维素、12质量份山梨醇、15质量份二氧化硅、1质量份糖精钠混合，加水至100质量份，搅拌、均质，真空灌装，制得抑制口臭的后生元牙膏。
本发明还提供一种抑制口臭的后生元漱口水，所述漱口水由以下质量分数的成分组成：
植物乳杆菌后生元粉组合物3％、麝香草酚0.1％、儿茶素0.1％、薄荷醇0.2％、花青素0.08％、木糖醇2％、山梨酸钾0.5％、维生素C 0.05％、食用香精0.3％、乙醇6.5％、甘油10％和离子水77.17％。
本发明具有以下技术效果：
本发明提供了一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，可以用于缓解患者的口臭症状。植物乳杆菌后生元可以抑制口臭，同时加入的果聚糖可以增强后生元的作用效果，增强其抑制口臭的功效。与此同时后生元粉组合物还能加入到咀嚼片、牙膏和漱口水中，作为制备以上产品的原料。制备成咀嚼片、牙膏和漱口水等产品形式后，可以使后生元与口腔充分接触，保证治疗效果。本发明可以为口臭患者提供治疗口臭的口腔护理产品体系，实现治疗效果与便利性的有机结合。
附图说明
图1为不同菌株抑菌效果对比图。
图2喷雾干燥保护剂对口臭患者口腔异味气体含量的治疗效果对比图。
图3为治疗前后口臭人群比例的变化图。
图4为治疗前后口腔中异味含量的变化图。
图5为治疗前后口腔菌群结构的变化图。
图6为治疗前后唾液中细菌数量变化图。
图7为灭活的植物乳杆菌抑菌实验结果图。
图8为治疗前后龋齿患者严重程度变化图。
图9为治疗前后口腔溃疡患者发病率变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物按以下方法制得：
植物乳杆菌后生元粉组合物的制备方法如下：将各组分材料分别经过粉碎机粉碎，过100目筛备用。取活化后的植物乳杆菌YC 2022菌株(植物乳杆菌YC 2022菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221872，保藏日为2022年12月5日)，以4vol％的接种量接种于200mLMRS培养基，37℃扩大培养12h后，以4vol％的接种量接种于发酵培养基中进行4L高密度发酵，发酵36h，得到含有8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液。将培养得到的植物乳杆菌发酵液灭活后加入保护剂，混匀后喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉。将植物乳杆菌后生元粉与果聚糖按照质量比例1:1进行复配，放入烘箱烘干，制得植物乳杆菌后生元粉组合物。
MRS培养基含有蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
发酵培养基含有葡萄糖12g/L，蛋白胨30g/L，酵母粉7g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
高密度发酵条件为温度36.5～37℃，湿度60～70％，pH值＝6.5～7，通气量0.75～1vvm，搅拌机功率1.8～2kwh/m3。
喷雾干燥保护剂为，海藻多糖的质量比为发酵液的8％，果聚糖的质量比为发酵液的4％，海藻多糖:果聚糖的质量比＝2:1。
喷雾干燥条件为进风温度155～160℃，出风温度85～90℃，进料泵速6.5～7％。
烘箱的烘干温度为55℃，时间为30分钟，至水分含量在2％以下。
实施例2
制备抑制口臭的后生元咀嚼片：
将植物乳杆菌后生元粉组合物和低聚异麦芽糖以质量比1：4的比例放入混合机中混合30分钟，混合均匀后备用。
将混合料加入造粒机中进行造粒。然后将得到的产品置于60℃的烘箱中烘干30分钟。最终得到后生元咀嚼片。
实施例3
制备抑制口臭的后生元牙膏：
取植物乳杆菌后生元粉组合物3公斤、聚乙二醇6公斤、甘油15公斤、羟乙基纤维素1公斤、山梨醇12公斤、二氧化硅15公斤、糖精钠1公斤，水加至100公斤，充分搅拌，用均质机进行均质后，抽真空进行灌装，制备得到抑制口臭的后生元牙膏。
实施例4
制备抑制口臭的后生元漱口水：
漱口水组成的质量比例：植物乳杆菌后生元粉组合物3％、麝香草酚0.1％、儿茶素0.1％、薄荷醇0.2％、花青素0.08％、木糖醇2％、山梨酸钾0.5％、维生素C 0.05％、食用香精0.3％、乙醇6.5％、甘油10％和离子水77.17％。取上述材料混合均匀后分装，制备得到抑制口臭的漱口水。
实施例5
通过以下实验验证效果
1.实验仪器与材料
1.1.实验仪器
粉碎机，高压灭菌锅，喷雾干燥机，离心机，混合机，超净台，漩涡振荡器，恒温培养箱，口气测定仪。
1.2.实验材料
海藻多糖，果聚糖，低聚异麦芽糖，改良碎肉肉汤培养基(牛肉浸，胰酪蛋白胨，酵母浸粉，磷酸氢二钾，刃天青)。
1.3.实验菌株
植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，副干酪乳杆菌，植物乳杆菌，牙龈卟啉单胞菌，变异链球菌，具核梭杆菌，齿状密螺旋体，中间普雷沃菌。
2.实验方法
2.1.抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物
按实施例1的方法制备植物乳杆菌后生元粉组合物。
2.2.人群实验
2.2.1.试验人群
抽取患有口臭症状的患者，并根据口腔异味气体数值分为轻度患者(100<ppb<150)，中度患者(150<ppb<200)和重度患者(ppb>200)各20人进行测试。受试者签署知情同意书。
2.2.2.实验流程
试验人群在实验开始前完成口腔异味气体含量测定和收集唾液，并持续每天食用1g植物乳杆菌后生元粉组合物6个月后，再次进行相关指标测定。
2.2.2.1.口腔异味气体含量测试
测试时先闭口两分钟，调试机器，志愿者口含圆管，屏气。到机器数值开始稳步下降时记录数据。重复三次，观察测量稳定性，取平均值作为咀嚼前口气基线数值。
2.2.2.2.不同菌株抑菌效果比对
将植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，副干酪乳杆菌，凝结芽孢杆菌分别与牙龈卟啉单胞菌，变异链球菌以4％的接种量进行接种，共培养后涂布计数。
2.2.2.3.保护剂对植物乳杆菌后生元粉组合物抑菌效果
试验人群在实验开始前完成口腔异味气体含量测定，分为两组，一组持续每天食用1g植物乳杆菌后生元粉组合物，另一组持续每天使用1g未添加保护剂植物乳杆菌后生元粉组合物，6个月后，再次进行相关指标测定。
未添加保护剂的植物乳杆菌后生元粉组合物按以下方法制得：
制备方法同实施例1，只是在含有8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液直接进行喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉。然后将植物乳杆菌后生元粉与果聚糖按照质量比例1:1进行复配，放入烘箱烘干，制得未添加保护剂的植物乳杆菌后生元粉组合物。
2.2.2.4.口腔菌群测定
收集试受人群唾液并进行16s测序。首先进行基因组DNA的提取和PCR扩增，并对PCR产物进行混样品和纯化，最后建立文库并上机。
2.2.2.5.唾液细菌数量
收集试受人群唾液并进行涂布测定数量。
2.3.抑菌实验
分别将低剂量(0.1％)，中剂量(1％)，高剂量(10％)植物乳杆菌与牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌，齿状密螺旋体，中间普雷沃菌，福氏拟杆菌共培养后涂布计数。
2.4.龋齿人群实验
抽取患有龋齿的患者20人。对其进行时长12个月的实验，10人为空白组，10人每日服用1g植物乳杆菌后生元粉组合物，每两个月对其龋齿严重程度进行评定。
2.5.口腔溃疡人群实验
抽取患有周期性口腔溃疡的患者20人。对其进行时长12个月的实验，10人为空白组，10人每日服用1g植物乳杆菌后生元粉组合物，每两个月计算期间患有口腔溃疡的人群比例。
3.实验结果
植物乳杆菌YC 2022菌株，鼠李糖乳杆菌，副干酪乳杆菌，凝结芽孢杆菌分别与牙龈卟啉单胞菌，变异链球菌共培养后涂布计数的结果如图1所示，图1说明植物乳杆菌YC2022相对于其他常见菌株，具有更强的抑制口腔细菌效果。
分别食用添加保护剂和不添加保护剂的植物乳杆菌后生元粉组合物的口臭患者在食用6个月组合物后，口腔异味气体含量图如图2所示。图2说明保护剂可以提高植物乳杆菌后生元粉抑制口臭的效果。
治疗前后口臭人群比例的变化图如图3所示，图3说明长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物可以有效的缓解口臭症状，轻度、中度和重度口臭患者都得到了显著的治疗，口臭人群比例大幅下降。其中轻度口臭患者降低为11％，中度口臭患者降低为22％，重度口臭患者降低为42％。
治疗前后口腔中异味气体含量的变化图如图4所示，图4说明长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物有效降低了口腔中异味气体的含量，轻度、中度和重度口臭患者都得到了显著的治疗，口臭有关的异味气体含量大幅下降。其中轻度口臭患者异味气体含量由114.8ppb降低为33.3ppb，中度口臭患者由166ppb降低为73ppb，重度口臭患者由225ppb降低为74.6ppb。
图5为长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物后，受试人群的口腔菌群门水平上的变化，其中左图A图为服用前，右图B图为服用后。A图和B图对比可见，β-变形菌，拟杆菌，γ-变形菌等细菌比例上调，梭杆菌等细菌比例下调。可见服用植物乳杆菌后生元粉组合物可以提高口腔菌群物种丰度。
治疗前后唾液中细菌数量变化图如图6所示，图6说明长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物能有效抑制口腔中细菌数量，轻度、中度和重度口臭患者都得到了显著的治疗。其中轻度口臭患者唾液中细菌数由2.7×108CFU/mL降低为1.1×108CFU/mL，中度口臭患者由4.8×108CFU/mL降低为2.4×108CFU/mL，重度口臭患者由8.5×108CFU/mL降低为2.3×108CFU/mL。
灭活的植物乳杆菌抑菌实验结果图如图7所示，图7说明在灭活的植物乳杆菌抑菌实验中，灭活的植物乳杆菌显著抑制了牙龈卟啉单胞菌，变异链球菌，具核梭杆菌，齿状密螺旋体，中间普雷沃菌的生长。并且，抑菌效果与灭活的植物乳杆菌的浓度成正相关，浓度越高，抑菌效果越显著。
治疗前后龋齿患者严重程度变化图如图8所示，图8说明龋齿患者在长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物后，龋齿症状得到有效缓解，降低了龋齿恶化的速度。第12个月，空白组患者龋齿严重程度为57.7％，治疗组患者龋齿严重程度为33.3％。龋齿评分见表1，严重程度为评定分/10分×100％。
表1龋齿评分标准
治疗前后口腔溃疡患者发病率变化图如图9所示，图9说明周期性口腔溃疡患者在长期服用植物乳杆菌后生元粉组合物后，口腔溃疡患病率显著降低。第12个月，空白组患者口腔溃疡发病率为84.3％，治疗组患者口腔溃疡发病率为9％。
以上实验结果说明，口服植物乳杆菌后生元粉组合物，可以增加菌体和代谢物在口腔中的时间，提高后生元效果，有效缓解了口臭症状，口腔菌群结构得到改善，物种丰度提高，同时引起口臭相关的龋齿，口腔溃疡等疾病也得到了缓解。
Claims (12)
1.一种抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌后生元粉组合物包括植物乳杆菌后生元粉和果聚糖，植物乳杆菌后生元粉和果聚糖的质量比为1～1.5:1。
2.如权利要求1所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌后生元粉含有浓度为7～8×1010CFU/mL的灭活的植物乳杆菌菌体及代谢产物。
3.如权利要求1所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌后生元粉按以下方法制得：
取活化后的植物乳杆菌YC 2022菌株，以3.5～4vol％的接种量接种于MRS培养基，36.5～37℃扩大培养12h后，以3.5～4vol％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵，发酵36h，得到含有7～8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液；培养得到的植物乳杆菌发酵液灭活后加入保护剂，混匀后喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉。
4.如权利要求3所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌YC 2022菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221872，保藏日为2022年12月5日。
5.如权利要求3所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述保护剂为海藻多糖和果聚糖，海藻多糖的质量用量为发酵液质量的7.5～8％，果聚糖的质量用量为发酵液质量的3.5～4％。
6.如权利要求3所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物，其特征在于，所述MRS培养基包括以下质量分数的成分：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉8.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2；
所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖10～12.5g/L，蛋白胨27.5～30g/L，酵母粉7～7.5g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，吐温80 1.0g/L，pH值5.7±0.2。
7.如权利要求1～6之一所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物的制备方法，其特征在于所述方法为：
取活化后的植物乳杆菌YC 2022菌株，以3.5～4vol％的接种量接种于MRS培养基，36.5～37℃扩大培养12h后，以3.5～4vol％的接种量接种于发酵培养基中进行高密度发酵，发酵36h，得到含有7～8×1010CFU/mL活菌数和代谢产物的发酵液；将培养得到的植物乳杆菌发酵液灭活后加入保护剂，混匀后喷雾干燥，并经过40目筛，得到植物乳杆菌后生元粉；
将植物乳杆菌后生元粉与果聚糖按照质量比例1～1.5:1混合复配，烘干，制得所述植物乳杆菌后生元粉组合物。
8.如权利要求1～6之一所述的抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物在制备抑制口臭的口腔护理产品的应用。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述抑制口臭的植物乳杆菌后生元粉组合物在制备抑制口臭的后生元咀嚼片、后生元漱口水或后生元牙膏中的应用。
10.一种抑制口臭的后生元咀嚼片，其特征在于所述后生元咀嚼片按以下方法制得：
将如权利要求1～6之一所述的植物乳杆菌后生元粉组合物和低聚异麦芽糖以质量比1：4质量比混合，然后经过造粒、烘干，制备得到后生元咀嚼片。
11.一种抑制口臭的后生元牙膏，其特征在于所述牙膏按以下方法制得：
将3质量份如权利要求1～6之一所述的植物乳杆菌后生元粉组合物、6质量份聚乙二醇、15质量份甘油、1质量份羟乙基纤维素、12质量份山梨醇、15质量份二氧化硅、1质量份糖精钠混合，加水至100质量份，搅拌、均质，真空灌装，制得抑制口臭的后生元牙膏。
12.一种抑制口臭的后生元漱口水，其特征在于所述漱口水由以下质量分数的成分组成：
如权利要求1～6之一所述的植物乳杆菌后生元粉组合物3％、麝香草酚0.1％、儿茶素0.1％、薄荷醇0.2％、花青素0.08％、木糖醇2％、山梨酸钾0.5％、维生素C 0.05％、食用香精0.3％、乙醇6.5％、甘油10％和离子水77.17％。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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