CN117683698B

CN117683698B - 一种植物乳杆菌jylp-376及后生元菌剂、制备方法和应用

Info

Publication number: CN117683698B
Application number: CN202410155684.6A
Authority: CN
Inventors: 司书锋; 刘锦程; 王丽媛; 田华; 邓爱欣; 曹维超
Original assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Current assignee: Shandong Zhongke Jiayi Bio Engineering Co ltd
Priority date: 2024-02-04
Filing date: 2024-02-04
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2044-02-04
Also published as: CN117683698A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌JYLP‑376及后生元菌剂、制备方法和应用。植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）JYLP‑376已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18099。本发明提供的植物乳杆菌JYLP‑376可以制备成植物乳杆菌JYLP‑376的后生元菌剂用于改善复发性口腔溃疡，减少口腔溃疡数目和口腔溃疡直径，调节复发性口腔溃疡引起的T细胞亚群失衡，降低复发性口腔溃疡引起的焦虑情绪。

Description

一种植物乳杆菌JYLP-376及后生元菌剂、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体一种植物乳杆菌JYLP-376及后生元菌剂、制备方法和应用。

背景技术

复发性口腔溃疡又称复发性阿弗他溃疡、复发性阿弗他口炎、复发性口疮，是临床最常见的口腔黏膜疾病，也就是人们常说的上火导致口腔溃疡。西医并无上火的概念，中医学认为本病是由于情志不遂，素体虚弱，外感六淫之邪致使肝失条达、脾失健运、肝郁气滞，郁热化火、虚火上炎熏蒸于口而患病。复发性口腔溃疡可发生在口腔黏膜的任何部位，如唇、舌尖，舌边缘，颊等处，牙龈和硬腭也有发生但很少见，具有局限性、复发性、自愈性的特点。溃疡呈孤立或多发，局部有明显的灼热疼痛，虽无全身症状，但影响患者的说话与进食，不同程度地影响患者的身心、工作和生活质量。

后生元又称为灭活益生菌，是益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括菌体与代谢产物。有研究表明，益生菌对身体有益的健康帮助，不一定和活菌有直接关系，反倒是活菌的代谢产物或菌体成分才是促进健康的推手。

缓解和治疗复发性口腔溃疡的方法有很多。在饮食上，可以多吃富含维生素B的食物避免加重口腔溃疡，可以多吃富含锌的食物，促进口腔溃疡的愈合。在医药上，不论中药组方或者西药化合物都存在副作用，而且治标不治本，易复发，很难根除，甚至会破坏菌群平衡，带来长期的口腔问题，进而会引发患者的心理焦虑问题。针对复发性口腔溃疡问题，目前还没有植物乳杆菌及其后生元制剂对于复发性口腔溃疡的干预研究被公开。

发明内容

针对现有复发性口腔溃疡干预改善手段存在副作用的技术问题，本发明提供一种植物乳杆菌JYLP-376及后生元菌剂、制备方法和应用。

第一方面，本发明提供一种改善复发性口腔溃疡的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）JYLP-376，已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18099。

第二方面，本发明提供一种上述植物乳杆菌JYLP-376在制备改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂方面的应用。

进一步的，改善复发性口腔溃疡包括减少口腔溃疡数目，减小口腔溃疡直径。

进一步的，改善复发性口腔溃疡包括改善复发性口腔溃疡引起的T细胞亚群失衡。

进一步的，改善复发性口腔溃疡包括改善复发性口腔溃疡引起的焦虑情绪。

第三方面，本发明提供一种改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂，包括上述的植物乳杆菌JYLP-376。

进一步的，改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂包含1.0×10¹⁰cfu/g的灭活的植物乳杆菌JYLP-376菌体及其代谢产物。

进一步的，改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂还包括麦芽糊精。

进一步的，改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂是药品。

第四方面，本发明提供一种改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂的制备方法，植物乳杆菌JYLP-376接种于液体培养基中培养，离心得到菌泥；菌泥溶于蒸馏水中进行灭菌、冻干，得到灭菌菌粉；用麦芽糊精稀释灭活菌粉得到的植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂即改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种植物乳杆菌JYLP-376，该菌株制备成植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂可以改善复发性口腔溃疡。实验证明，在筛选过程中，植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂对口腔链球菌、乳酸杆菌、口腔白色念珠菌、牙周可疑致病菌和伴放线聚集杆菌这些常见的口腔细菌有良好的抑制效果。在大鼠复发性口腔溃疡模型中，植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂灌胃大鼠，可以减少大鼠口腔溃疡数目和口腔溃疡直径，表现出对复发性口腔溃疡具有良好的改善效果，而且还能调节复发性口腔溃疡引起的T细胞亚群失衡，降低复发性口腔溃疡引起的焦虑情绪。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是大鼠口腔直径总和过程变化图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1 菌种分离

1、菌源：酸奶、牧草、动物粪便，2018年7月采集于新疆伊犁州。

2、菌株的分离：

（1）从采集的多个菌源样品中各取1g分别加入到含有无菌生理盐水的锥形瓶中，4℃搅拌振荡30min得混合溶液，备用；

（2）混合溶液稀释制成不同浓度梯度的样品溶液，分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，备用；

（3）制备含0.5% CaCO₃的MRS平板培养基：

MRS平板培养基的组成及制备方法如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、CaCO₃5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；

将上述培养基原料混合，调pH为6.8，加热混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用；

（4）培养：将步骤（2）中的不同稀释浓度的样品溶液分别使用涂布棒在固体培养基上进行涂布，于37℃、厌氧条件下培养48h；

（5）挑选菌落：按照以下菌落特征挑选菌落：

菌落特征：直径1-2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起，溶钙圈较大。

（6）分离纯化

根据外观形态判断，步骤（5）的菌落特征挑选出34个单菌落，采用划线法接种至步骤（3）的培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，重复上述操作2-3次，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏，作为备选菌株。

实施例2 备选菌株的后生元菌剂制备

（1）液体培养基的组成及制备方法如下：

蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；

将上述原料混合后，调pH为6.8，加热混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

（2）菌液制备

将34株分离的菌株，采用实施例1步骤（6）的划线法培养，分别挑取一接种环单菌落，接种于液体培养基中，37℃，培养24h得发酵液，备用。

（3）后生元菌剂制备

将各菌株的发酵液分别进行离心得到菌泥，分别取各个菌株的1g菌泥进行平板计数；另取各个菌株的1g菌泥，溶于3g蒸馏水西林瓶中，115℃条件下灭菌30min，冷却，冻干成灭活菌粉，称重，冷藏。灭活菌粉包括灭活的菌及其代谢产物。借助检测菌泥菌数，用麦芽糊精（购于保龄宝生物股份有限公司）分别稀释各个菌株的灭活菌粉成1.0×10¹⁰cfu/g的后生元菌剂。

实施例3 备选菌株的抑菌能力测试

（1）口腔菌制备

从口腔门诊取患有不同口腔疾病的患者样本20个，样品放入厌氧盒中，冷藏保存备用。将样本混合，按1%（v/v）接种量分别接入20mL的不同培养基（具体培养基见表1，培养基购于青岛海博生物技术有限公司）中，并按表1的培养条件活化培养24h，得到菌液。培养结束后，将菌液分别按5%（v/v）接种量接入各自对应的20mL新鲜培养基中，并同时分别加入不同样品，对照组加入0.2g麦芽糊精，后生元菌剂组分别加入34个菌株的后生元菌剂（具体见表2），再培养48h，分别检测600nm下的OD值，计算每种后生元菌剂在不同培养基中对口腔菌的抑制作用，计算公式如下：

抑菌能力（%）=（（对照组OD值-后生元组OD值）/对照组OD值）×100%

检测结束后，挑选抑菌能力最强的三种后生元菌剂中包含的三株菌株，分别命名为JYLP-376、JYL4-336和JYL7-358，检测结果如表3所示。由表3可以看出，JYLP-376、JYL4-336、JYL7-358制备的后生元菌剂对常见口腔菌都有一定的抑制作用，其中JYLP-376的后生元菌剂最为突出，表明菌株JYLP-376对常见口腔菌表现出良好的抑菌能力。

表1 口腔中常见菌活化培养条件

注1：牙周可疑致病菌：包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌等。

表2 后生元抑制口腔常见菌培养条件

表3 后生元抑菌能力对照表

实施例4 菌株JYLP-376鉴定与保藏

将菌株JYLP-376送去鉴定，鉴定单位是生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：

引物序列：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

该菌株被鉴定为Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌），其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus。

该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JYLP-376的基因序列为：

AGTTTGATCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTA

将植物乳杆菌JYLP-376送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下：

该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JYLP-376于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC NO.18099。

实施例5 植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂

挑取一接种环植物乳杆菌JYLP-376，按实施例2的方法制备1.0×10¹⁰cfu/g的植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂。

对比例1 JYL4-336后生元菌剂

挑取一接种环JYL4-336，按实施例2的方法制备1.0×10¹⁰cfu/g的JYL4-336的后生元菌剂。

对比例2 JYL7-358后生元菌剂

挑取一接种环JYL7-358，按实施例2的方法制备1.0×10¹⁰cfu/g的JYL7-358的后生元菌剂。

实验例1 植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂对改善大鼠复发性口腔溃疡的作用

选用免疫法建立复发性口腔溃疡模型，与其他造模形式相比更接近于人类的发病机制，并且对于干预手段敏感，更能反映出实验效果。

（1）大鼠分组

选用6周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体重183g±12g，适应性饲喂2周后，随机分为5组。分组如下：

对照组：20只，正常饲喂，0.1g麦芽糊精灌胃，持续2周。

模型组：10只，正常饲喂，0.1g麦芽糊精灌胃，持续2周。

JYLP-376组：10只，正常饲喂，每天0.1g实施例5的植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂灌胃，持续2周。

JYL4-336组：10只，正常饲喂，每天0.1g对比例1的JYL4-336的后生元菌剂灌胃，持续2周。

JYL7-358组：10只，正常饲喂，每天0.1g对比例2的JYL7-358的后生元菌剂灌胃，持续2周。

（2）大鼠复发性口腔溃疡造模

2周后，进行大鼠复发性口腔溃疡模型建立，操作如下：

将对照组中随机10只大鼠处死，保证无菌环境中，在口腔黏膜的下层注射生理盐水，随即剥离口腔黏膜，之后清理黏膜及除去杂质。然后用玻璃研钵研磨后加入PBS缓冲液制备成匀浆，与完全弗氏佐剂（美国sigma公司）按照1:1的比例制备成组织乳化剂。将除对照组之外四组的总共40只SD大鼠脊柱两侧剪去背毛，用75%（v/v）酒精擦拭清理注射部位，大鼠脊柱两侧皮内各注射0.1mL组织乳化剂，每周1次，总共注射7次。

（3）溃疡结果评估

造模结束后，对大鼠口腔溃疡的数量和直径进行统计。如表4所示，可以看出JYL7-358组的口腔溃疡指标与模型组相比有所下降，JYLP-376组与模型组相比有显著下降。说明JYLP-376后生元对复发性口腔溃疡有减轻症状的作用。

表4 后生元菌剂对复发性口腔溃疡的影响

注：与模型组对照，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

（4）T细胞亚群比例变化

溃疡评估结束后，取各组大鼠眼眶血，利用T细胞亚群检测试剂盒（美国BD公司），加入CD3⁺抗体、CD4⁺抗体、CD8⁺抗体，避光静置30min，加入红细胞裂解液裂解30min，离心取细胞沉淀，反复洗涤3次后，再次悬浮，用流式细胞仪检测T细胞亚群中CD4⁺和CD8⁺细胞数量，并计算CD4⁺/CD8⁺的比例。如表5所示，模型组与对照组相比，三项指标有显著差异；JYLP-376组与模型组相比，三项指标有显著差异，与对照组相比没有显著差异，说明JYLP-376后生元对复发性口腔溃疡引起的T细胞亚群失衡有改善作用。

表5 各组大鼠血液中T细胞亚群的细胞比例（x±s）

注：与对照组对照，^*P＜0.05；与模型组对照，^#P＜0.05。

实验例2 植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂对改善复发性口腔溃疡大鼠症状的作用

选用免疫法建立复发性口腔溃疡模型，对造模后诱发复发性口腔溃疡的大鼠进行灌胃后生元菌剂对比溃疡减轻效果和复发状况。

（1）大鼠造模

选用6周龄雄性SPF级SD大鼠60只，体重191g±14g，适应性饲喂2周后，进行大鼠复发性口腔溃疡模型建立，操作如下：

随机选取10只大鼠处死，保证无菌环境中，在口腔黏膜的下层注射生理盐水，随即剥离口腔黏膜，之后清理黏膜及除去杂质。然后用玻璃研钵研磨后加入PBS缓冲液制备成匀浆，与完全弗氏佐剂（美国sigma公司）按照1:1的比例制备成组织乳化剂。50只大鼠中，10只正常饲喂作为后续实验对照组，其余40只SD大鼠脊柱两侧剪去背毛，用75%（v/v）酒精擦拭清理注射部位，大鼠脊柱两侧皮内各注射0.1mL组织乳化剂，每周1次，总共注射7次。

（2）大鼠分组实验

造模结束后，对大鼠进行实验分组，如下：

对照组：10只，正常饲喂，0.1g麦芽糊精灌胃，持续2周。

模型组：10只，正常饲喂，0.1g麦芽糊精灌胃，持续2周。

（3）口腔溃疡直径

分组实验开始后，对口腔溃疡的直径进行过程检测2周，记录口腔溃疡直径总和（口腔溃疡直径总和=每组大鼠所有口腔溃疡的直径之和/每组大鼠数量）的变化情况，具体结果见图1所示。

由图1可以看出，模型组口腔溃疡直径总和一直处于较高水平，且有反复的情况，说明造模成功。JYLP-376组明显优于其他两个实验组，口腔溃疡治愈率最高，且在2周内没有再复发的情况。

（4）焦虑水平评估

检测实验2周后各大鼠血清中5-羟色胺（5-HT）和皮质醇水平，评估大鼠焦虑程度。

血清取样：配制10%(wt/vol，单位是g/mL)水合氯醛，按照大鼠体重3mL/kg的注射量进行腹腔麻醉，麻醉后从腹部动脉取血样，置于4℃，3500r/min离心10min，取血清0.5mL放于EP管中，存于-80℃冰箱备用。

ELISA检测：分别参照大鼠5-HT ELISA检测试剂盒和大鼠皮质醇ELISA检测试剂盒（上海卡努生物）进行操作，设置标准孔（50μL）和样本孔（10μL+40μL稀释液），加入酶标试剂后，37℃孵育60min；经过配液、洗涤、显色后，37℃避光15min，在450nm波长下检测吸光度，根据标准曲线计算5-HT和皮质醇含量。检测结果如表6所示。

由表6可以看出，模型组与对照组相比5-HT水平和皮质醇水平均有显著性差异，说明造模成功；JYLP-376组与对照组相比没有显著性差异，明显优于其他两组实验组。说明JYLP-376后生元对复发性口腔溃疡引起的焦虑有改善作用。

表6 各组大鼠血清中5-HT和皮质醇水平（x±s）

注：与对照组对照，^*P＜0.05；与模型组对照，^#P＜0.05。

尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种植物乳杆菌JYLP-376，其特征在于，植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）JYLP-376已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18099。

2.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌JYLP-376在制备改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，改善复发性口腔溃疡包括减少口腔溃疡数目，减小口腔溃疡直径。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，改善复发性口腔溃疡包括改善复发性口腔溃疡引起的T细胞亚群失衡。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，改善复发性口腔溃疡包括改善复发性口腔溃疡引起的焦虑情绪。

6.一种改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的植物乳杆菌JYLP-376。

7.如权利要求6所述的改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂，其特征在于，改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂包含1.0×10¹⁰cfu/g的灭活的植物乳杆菌JYLP-376菌体及其代谢产物。

8.如权利要求6或权利要求7所述的改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂，其特征在于，还包括麦芽糊精。

9.一种如权利要求6所述的改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌JYLP-376接种于液体培养基中培养，离心得到菌泥；菌泥溶于蒸馏水中灭菌、冻干，得到灭菌菌粉；用麦芽糊精稀释灭活菌粉得到的植物乳杆菌JYLP-376的后生元菌剂即改善复发性口腔溃疡的后生元菌剂。