CN115820450A

CN115820450A - 一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的植物乳植杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115820450A
Application number: CN202210607143.3A
Authority: CN
Inventors: 倪海平; 段治; 张景燕; 刘金; 程淑敏; 郭超群; 崔洪昌; 吴松洁
Original assignee: Shandong Baiwo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN115820450B

Abstract

本发明涉及益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有预防或治疗龋齿和牙周病的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）及其应用。该菌株是从发酵泡菜中筛选到的，能够显著抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌，半放线聚集杆菌等口腔病原菌的生长繁殖，并能在口腔内有效定植，已于2022年3月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022174。该菌株可广泛用于制备保健品、药品，以及漱口水、牙膏等口腔护理用品，有效预防或治疗龋齿、牙周病等口腔疾病，促进口腔菌群平衡的恢复。

Description

一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的植物乳植杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的植物乳植杆菌及其应用。

背景技术

口腔是消化系统和呼吸系统的入口，是人体的一个免疫器官，口腔内存在多种厌氧和好氧微生物，如唾液链球菌，发酵乳杆菌，变异链球菌，血链球菌等，这样微生物相互之间制衡，维持健康，一旦致病的微生物大量繁殖，就会导致各种口腔疾病，如龋病、牙周疾病，口腔溃疡，口臭等。病原微生物是主要致病因素，变异链球菌是现今公认的龋病主要致病菌，牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集放线菌等是引起牙周病的主要病原菌。

益生菌是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，能够产生确切的健康功效从而改善宿主的微生态平衡，发挥有益作用。2001 年，联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）对益生菌做了如下定义：在摄入足够数量的情况下，对宿主产生健康益处的活性微生物。

越来越多的证据表明，益生菌对于人体的健康影响不仅局限于肠道，还有更广泛的作用范围，如内分泌平衡调节、免疫平衡调节、神经系统调节、呼吸系统调剂等。益生菌还可以与口腔病原微生物粘附，阻止病原微生物的在口腔定植，起着占位、争夺营养或拮抗作用，从而抑制病原菌生物膜的形成，有效预防口腔疾病，在口腔微生态系统中起着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）及其在口腔疾病防治中的应用。该菌株是从发酵泡菜中筛选到的，能够显著抑制变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌，半放线聚集杆菌等口腔病原菌的生长繁殖，并能在口腔内有效定植，有利于恢复菌群平衡，可广泛用于预防或治疗龋齿、牙周炎等口腔疾病。

本发明一方面提供了一种植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）VHProbi O10株，已于2022年3月1日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022174。

所述植物乳植杆菌VHProbi O10株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

所述植物乳植杆菌VHProbi O10株，其Riboprinter 指纹图谱如图1所示；其蛋白质谱如图2所示。

本发明所提供的植物乳植杆菌VHProbi O10株在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。

本发明所提供的植物乳植杆菌VHProbi O10株在制备具有预防或治疗龋齿功能的制品中的应用。

本发明所提供的植物乳植杆菌VHProbi O10株在制备具有预防或治疗牙周病功能的制品中的应用。

所述的制品为保健品、药品或口腔护理用品。

所述的口腔护理用品，为牙用凝胶、牙粉、牙膏、口香糖、牙线、牙齿清洁液、漱口剂、口喷剂、牙齿清洁泡沫中的任意一种。

本发明还提供了一种口腔护理用品，包含植物乳植杆菌VHProbi O10株的裂解液。

所述的裂解液是通过将植物乳植杆菌VHProbi O10新鲜菌液超声破碎后，再进行热灭活得到的。

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10筛选自发酵泡菜，生物安全性好，对人工胃肠液耐受性强，且具有较强的抗氧化性能，对羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别为18.1%和25.6%。

植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌和具核梭状杆菌这五种口腔病原菌都有明显的抑制效果，其中，该菌株的发酵菌液对变异链球菌和粘性放线菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径分别达到25mm和22.5mm，且发酵菌液的抑菌效果要略优于裂解液，取得了意料不到的技术效果。

植物乳植杆菌VHProbi O10能够在口腔中有效定植，6h时的自凝集率达到44.3%；可与变异链球菌、具核梭状杆菌、牙龈卟啉单胞菌和半放线聚集杆菌四种常见的口腔病原菌高效结合，显著抑制其粘附到牙齿或者牙龈上，其中，植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达62.37%和55.59%，取得了意料不到的技术效果。

植物乳植杆菌VHProbi O10裂解液能够有效抑制变异链球菌的增殖，其中，对照组的变异链球菌在接种10 h后开始快速增长，生长20 h左右达到稳定期；而添加了植物乳植杆菌VHProbi O10裂解液上清的实验组，变异链球菌在24 h内几乎没有增长，效果显著。

植物乳植杆菌VHProbi O10不仅能有效抑制变异链球菌粘附到牙齿上，还能高效去除变异链球菌形成的生物膜。其中，菌悬液即单纯的菌体对生物膜的去除率高达66.06%，说明菌体细胞膜上有变异链球菌的结合位点，单纯的菌体自身也能够与变异链球菌结合，短时间内去除部分生物膜；而发酵液和裂解液中除了含有菌体自身外，还含有较多的代谢物质，能够更高效去除变异链球菌形成的生物膜，去除率达100%，取得了意料不到的技术效果。

细胞实验结果进一步证实，植物乳植杆菌VHProbi O10对人正常牙龈上皮细胞没有毒性，对细胞的粘附力强，能在口腔内实现有效定植。植物乳植杆菌VHProbi O10裂解液还能显著抑制牙周致病菌在人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善所述致病菌引起的牙周炎，牙龈出血等症状。

所述植物乳植杆菌VHProbi O10可广泛用于制备保健品、药品，以及漱口水、牙膏等口腔护理用品，有效预防或治疗龋齿、牙周病等口腔疾病，促进口腔菌群平衡的恢复。

附图说明

图1为植物乳植杆菌VHProbi O10的Riboprinter指纹图谱；

图2为植物乳植杆菌VHProbi O10的蛋白质谱图；

图3为植物乳植杆菌VHProbi O10与四株致病菌的凝集试验；其中，A为植物乳植杆菌对照，B为植物乳植杆菌+变异链球菌；C为植物乳植杆菌+牙龈单胞卟啉菌；D为植物乳植杆菌+具核梭状杆菌；E为植物乳植杆菌+半放线聚集杆菌；

图4为植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌的抑制生长曲线；

图5为植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌的抑制粘附试验；其中，A为对照组，B为实验组；

图6为植物乳植杆菌VHProbi O10抑制牙龈卟啉单胞菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图7为植物乳植杆菌VHProbi O10抑制具核梭状杆菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图8为植物乳植杆菌VHProbi O10抑制半放线聚集杆菌粘附到牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组。

具体实施方式

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10（Lactiplantibacillus plantarumVHProbi O10）符合法规要求，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。经多相分类学鉴定，植物乳植杆菌VHProbi O10为一株新发现的菌株。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10能有效抑制常见的口腔病原菌，具有重要的应用价值。

申请人于2022年3月1日将所述植物乳植杆菌VHProbi O10保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022174。

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。

实施例1 菌株的分离筛选

1、初筛

取10g发酵泡菜，捣碎机捣碎，然后用90 mL的生理盐水浸泡10 min，放入无菌样品袋中用均质机拍打混匀，悬浊液进行梯度稀释，分别取10^-1、10^-2、10^-3三个稀释梯度100 μL涂布于MRS固体培养基上，厌氧条件下37℃培养箱中培养48h，待平板长出单菌落后，进行镜检，挑选形状为杆菌的乳酸菌共16株，分别命名为P1，P2，…，P16。

2、抗变异链球菌菌株复筛

（1）准备底层平板

提前准备好底层1.5%琼脂平板，晾干。

（2）变异链球菌菌液制备

分别在BHI平板上划线活化变异链球菌ATCC 25175，CCTCC AB 99010，BNCC700610，然后挑取单菌落到BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，然后按照1%的比例转接到新的BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液，新鲜菌液按照1：1：1等体积混匀，即得到变异链球菌菌液。

以下实施例中所述的变异链球菌菌液均与本实施例相同。

采用三株不同的变异链球菌作为指示菌株，更能体现筛选的乳酸菌对变异链球菌的抑菌能力。

（3）牛津杯抑菌实验

准备0.7%的琼脂含量的BHI培养基，灭菌，等温度降到47℃以下，加入0.3%（体积比）混合好的变异链球菌混合菌液，摇匀；取7ml倾倒底层琼脂平板上，等凝固后，放上牛津杯，在孔里加入150μL初筛乳酸杆菌的发酵菌液，37℃培养48h，观察有无抑菌圈。

结果显示，本发明初筛获得的16株乳酸杆菌中，只有P3菌株对变异链球菌有抑制效果，出现明显的抑菌圈，其发酵菌液产生的抑菌圈直径达到25mm，取得了意料不到的技术效果。

实施例2 菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

将P3菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见单菌落呈乳白色或浅黄色无光泽，菌落表面不平整，菌落中心有凸起，边缘不规则，菌落直径在1-2mm。显微镜下呈短杆状。

2、碳源代谢试验鉴定

利用API 50CHL试剂条测定P3菌株对49种碳源的代谢作用。

在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm离心5 min，用pH7.0 磷酸缓冲液洗2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。新鲜菌悬液按照10%的添加量加到API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面，石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10mL的无菌去离子水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24-48h，观察颜色变化，若菌生长则颜色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。然后记录试验结果，上传到鉴定软件APIweb。

结果显示，P3菌株能利用核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、山梨糖醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-葡萄糖苷、苦杏仁苷、黄柏素、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、密二糖、棉子糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊粉、D-土伦糖、D-来苏糖和2-酮基葡萄糖酸钾；不能利用甘油、D-侧金盏花醇、半乳糖、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L-木糖、β-甲基-D-木糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露糖醇、糖原、木糖醇、D-岩藻糖、松三糖、龙胆二糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、D-塔格糖、葡萄糖酸盐和5-酮葡糖酸钾。

API鉴定结果：P3菌株为植物乳植杆菌，ID=99.9%, T值=1，鉴定结果极好。

3、分子生物学鉴定

3.1.1 基因组DNA提取

挑取平板上P3菌株的单菌落于MRS培养基中，37℃培养24h，然后取500 μL发酵菌液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP302）操作，得到该菌株的基因组。

3.1.2 16s rDNA 基因扩增

（1）引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

（2）反应体系（50μL）

表1. 16s rDNA PCR扩增体系

成分	反应体积
		10×PCR buffer	5μL
dNTPs	4μL
		27F	2μL
1492R	2μL
		DNA	2.5μL
rTaq	0.5μL
		ddH2O	34μL

（3）电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

（4）PCR产物测序

通过测序获得P3菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI 数据库中进行比对，初步确定P3菌株为植物乳植杆菌。

3.2 Riboprinter 指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的P3菌株单菌落，将其放入缓冲液的样品管中，用手持搅拌棒使其在缓冲液中悬浮，然后将样品放入加热器中灭活后放入Riboprinter 系统中，样品经过DNA制备、转模、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。

鉴定结果显示，P3菌株为植物乳植杆菌，其指纹图谱见图1。

3.2蛋白质谱鉴定

用牙签沾取平板上的P3菌株单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求加入1 μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

蛋白质谱如图2所示，经鉴定P3菌株为植物乳植杆菌，匹配率为93.29%。

3.4全基因组测序

把P3菌株的菌液按照1%的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃培养22小时，然后8000rpm离心10 min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列。将全基因序列上传至NCBI基因数据库，GenBank 号为CP097163和CP097164。其中CP097163为基因组序列号，CP097164为质粒的序列号。

综上，结合P3菌株的菌落形态、生理生化特性和分子生物学的鉴定结果，确定该菌株为一株新的植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌VHProbi O10（Lactiplantibacillus plantarum VHPribo O10）。

实施例3 植物乳植杆菌VHProbi O10的溶血性试验

1、血细胞培养基准备：

称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15 min，等培养基冷却到50℃的时候，加入5%的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。

2、划线培养：

将菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24~48h观是否有溶血现象。

3、实验结果：

血细胞平板没有变化，说明植物乳植杆菌 VHProbi O10不产生溶血素，不能够溶解血细胞。

实施例4 植物乳植杆菌VHProbi O10抗氧化能力测定

1、菌悬液制备

将生长状态优良的单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2%的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mL pH 7.0磷酸缓冲液洗涤菌体2遍，再加入1mL磷酸缓冲液重悬菌体备用。

2、清除羟自由基能力的测定

将100 μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100 μL 5mM 的硫酸亚铁，500 μL去离子水和200μL乳酸菌菌悬液混匀后加入100μL 3%过氧化氢溶液，37℃水浴15 min后，4000rpm离心10 min收集上清在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。

清除率%=（A 样品-A 控制）/（A 空白-A 控制）×100%。

其中： A 控制为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度， A 空白为硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。

结果显示，植物乳植杆菌VHProbi O10对羟基自由基的清除率为18.1%。

3、清除 DPPH 自由基能力的测定

取1mL待测菌株的菌悬液，加入1mL 0.4 mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度 A 样品，测 3次平行。对照组样品以等体积缓溶液和 DPPH·乙醇混合液，并以等体积菌悬液和乙醇混合液空白调零。计算清除率。

清除率%=[1-（A样品-A空白）/A对照]×100%。

结果显示，植物乳植杆菌VHProbi O10对DPPH自由基的清除率为25.6%。

实施例5 植物乳植杆菌VHProbi O10对人工胃液和人工肠液的耐受性

1、菌液制备：

将冷冻保存的植物乳植杆菌VHProbi O10菌株划线接种于MRS固体培养基中，37℃培养24~48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5%的接种量把植物乳植杆菌VHProbiO10接种到新鲜的MRS液体培养基中40℃振荡培养24~48h，获得新鲜的菌液。

2、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115 ℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

3、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77mL 0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20 min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

4、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm 离心5min 收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到9mL已温浴1h的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm转速振荡2h，分别于0h和2h时取样1mL，检测活菌量。然后取1mL消化2h后的人工胃液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床（200rpm）3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工胃液和人工肠液后的活菌量的LOG（CFU/mL）如表2。

表2 人工胃肠液消化后的活菌量

菌株	人工胃液前	人工胃液消化后	人工肠液消化后
				植物乳植杆菌VHProbi O10	7.72 + 0.02	7.68 + 0.05	7.42 + 0.04

从表2中可以看出，植物乳植杆菌VHProbi O10经过人工胃液和人工肠液消化后，活菌量仅有少量下降，说明该菌株对人工胃液和人工肠液具有较强的耐受性，可以在肠道内发挥积极的益生作用。

实施例6 植物乳植杆菌VHProbi O10菌液对口腔致病菌的抑菌效果试验

1、裂解液制备

按照1%的接种量（体积比）把待测菌种接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24 h后停止培养，即得新鲜菌液。将部分菌液用超声破碎仪超声破碎20 min，超声条件：功率30%，超声2s，停止2s； 80℃水浴锅中灭活60 min，得到无活菌的裂解物溶液。

参照实施例1中牛津杯抑菌法实验步骤，分别测定植物乳植杆菌VHProbi O10菌液和裂解液对变异链球菌（三株）、粘性放线菌ATCC27044，牙龈卟啉单胞菌BNCC353909、具核梭状杆菌BNCC 336949和半放线聚集杆菌BNCC336945这五种口腔常见致病菌的抑菌效果。抑菌圈直径见表3。

表3植物乳植杆菌VHProbi O10对口腔致病菌的抑菌效果

口腔致病菌	O10发酵菌液的抑菌圈直径	O10裂解液的抑菌圈直径
			变异链球菌	25mm	24mm
粘性放线菌	22.5mm	20mm
			牙龈卟啉单胞菌	12.5mm	11mm
具核梭状杆菌	10mm	10mm
			伴放线聚集杆菌	10mm	10mm

从表3的结果可知，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌、粘性放线菌、具核梭状杆菌、牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌这五种口腔致病菌都有明显的抑制效果，抑菌谱较广。其中，该菌株对变异链球菌和粘性放线菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到20mm-25mm，且发酵菌液的抑菌效果要略优于裂解液，取得了意料不到的技术效果。

实施例7 植物乳植杆菌VHProbi O10对口腔致病菌的凝集效果试验

共聚集是细胞和细胞蛋白质之间的相互作用。益生菌可以通过与致病菌凝集，防止其在口腔中定植和粘附，从而预防龋齿。凝集试验分为两种，一种是根据乳酸杆菌在一定条件下是否与致病菌结合形成可见的絮状沉淀及沉淀的大小来判断凝集作用，另一种是通过测定凝集率来确定共凝集效果。

1、菌悬液制备

按照1%的接种量（体积比）把植物乳植杆菌VHProbi O10接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24 h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0 磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，至菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

2、致病菌菌悬液制备：

按照1%的接种量（体积比）把变异链球菌菌液接种到BHI肉汤培养基，37℃有氧培养24h后停止培养，得新鲜菌液；按照1%的接种量（体积比）把牙龈单胞卟啉菌，半放线聚集杆菌和具核梭状杆菌菌液接种到BHI肉汤培养基（添加5%的牛血清），37℃厌氧培养48h后停止培养，得新鲜菌液；

将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0 磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，调整菌悬液的初始吸光度 OD600为0.5-0.6之间，备用。

3、凝集点试验

取植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液300μL加入24孔板，再加入300μL致病菌菌悬液作为反应样本，另取等量的植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液和缓冲液混合作为对照，每个对照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400 rpm，室温，振荡孵育。每振荡30 min，停机30 min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态。

从图3的结果可知，2 h内植物乳植杆菌VHProbi O10与变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌都有凝集点出现。其中，该菌株对变异链球菌有较多较大的凝集点，凝集力较强；对具核梭状杆菌有小而多的凝集点出现，对牙龈卟啉单胞菌有一个很小的凝集点出现，凝集力相对较弱。从而说明植物乳植杆菌VHProbi O10能够与常见口腔致病菌有效结合，显著抑制其粘附到牙齿或者牙龈上。

4、乳酸菌自凝集率和共凝集率的测定

（1）自凝集率测定

将制备的乳酸菌悬液取1ml加入24孔板内，室温静置。取100μL在波长600nm条件测定初始吸光值A0，在随后的6h内每隔2h吸取菌悬液上层，在波长600nm条件下测量吸光值At。计算自聚力（R_自）。结果见表4。

R_自=1-At/A0；

式中：R_自为自聚力，%；At为t时间的吸光度，t =2、4和 6h；A0为植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液初始吸光度。

表4植物乳植杆菌VHProbi O10的自凝集率

凝集时间	自凝集率
		2h	22.8%
4h	36.3%
		6h	44.3%

从表4的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10 6h的自凝集率达到44.3%。从而说明植物乳植杆菌VHProbi O10具有较强的自凝集作用，有利于其在口腔中实现有效定植。

（2）共凝集率测定

取100μL植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液和致病菌菌悬液测定初始吸光值OD600，然后将等量的植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液和致病菌菌悬液混合，摇匀，室温静置，每个样品三个平行，每隔2h取上层悬浮液100μL测定吸光值OD600。计算共聚力（R_共）。结果见表5。

R_共=1-2At/（A0+B0）；

式中：R_共为共聚力，%；At为t时间的吸光度t=2h、4h和6h；A0为植物乳植杆菌VHProbi O10初始吸光度；B0为致病菌菌悬液初始吸光度。

表5植物乳植杆菌VHProbi O10对口腔致病菌的共凝集效果

从表5的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10可与变异链球菌、具核梭状杆菌、牙龈卟啉单胞菌和半放线聚集杆菌四种常见的口腔致病菌有效结合，2-6h时内共凝集率达到12.03%-61.37%。其中，植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达62.37%和55.59%，取得了意料不到的技术效果。

植物乳植杆菌VHProbi O10与致病菌有效结合，可以随着唾液流动和口腔清洁等行为，减少口腔内致病菌的数量，进而达到减少致病菌在口腔内荷载的效果。

实施例8 植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球的抑制生长试验

1、裂解液上清制备

将植物乳植杆菌VHProbi O10新鲜菌液用超声细胞破碎仪破碎细胞壁，然后80℃处理60 min，然后用0.22 μL微孔滤膜过滤除去不溶物，制备得到裂解液上清。

2、接种液制备

将新鲜变异链球菌菌液用pH7.0 磷酸缓冲液洗涤两次，同体积重悬。然后稀释5倍，作为接种液。

3、96 孔板培养

每孔加入50 µL BHI肉汤培养基和10 μL变异链球菌菌液，其中实验组加入20 μL裂解液上清液，对照组加入20 μL无菌水；然后每孔用无菌水补充体积到200 μL，加入50 μL液体石蜡，每组设置4个平行。将 96 孔板放置于 37℃酶标仪中，设置每间隔10 min测定一次OD600，测定24 h，得到变异链球菌的生长曲线，如图5所示。

从图4可以看出，对照组的变异链球菌在接种10h后开始快速增长，20h左右达到稳定期；而添加了植物乳植杆菌VHProbi O10裂解液上清的实验组，变异链球菌在24 h内几乎没有增长，从而说明植物乳植杆菌VHProbi O10能够显著抑制变异链球菌的增殖。

实施例9 植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌的拮抗粘附试验

变形链球菌是目前公认的龋病主要致病菌，其在口腔内的定植和黏附是龋齿形成的主要原因。因此，口腔益生菌通过与致病菌形成凝集，抑制其生长和粘附，并有效减少口腔疾病。

1、菌悬液制备

按照1%的接种量（体积比）把植物乳植杆菌VHProbi O10接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24 h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0 磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

2、变异链球菌菌悬液制备：

参照实施例1所述方法制备变异链球菌菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬。

将500µL植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液及500µL变异链球菌菌悬液混合均匀，静置5min后，取500μL上层溶液添加至已置入无菌细胞爬片的24孔板中，于37℃的温度下培养2h，再移除该上层溶液，以pH7.0磷酸盐缓冲液清洗后，加入0.5mL甲醇固定10min，然后弃去。最后加入300μL吉姆萨染液染色10min，然后弃去染液，用pH7.0磷酸缓冲液冲洗一遍，将细胞爬片置于载玻片上观察细胞爬片上的菌量。

结果如图5所示，对照组的细胞爬片上爬满了变异链球菌，而添加了植物乳植杆菌VHProbi O10的实验组细胞爬片上几乎看不到变异链球菌，只有粘附力比较强的植物乳植杆菌（植物乳植杆菌的菌体比变异链球菌的菌体大，在显微镜下很容易辨认）。说明植物乳植杆菌菌体能够有效抑制变异链球菌粘附到细胞爬片上。

上述结果也进一步表明植物乳植杆菌VHProbi O10能够有效阻止病原菌粘附到牙齿上，进而起到预防龋齿的作用。

实施例10 植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌的生物膜消除作用

变异链球菌在牙齿表面粘附和聚集会形成一层生物膜，进而产酸性导致龋齿。因此，去除变异链球菌形成的生物膜，对预防龋齿非常重要。

1、参照实施例1所述方法制备新鲜的变异链球菌菌液。

2、按照1%的接种量（体积比）把植物乳植杆菌VHProbi O10接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜发酵液。将发酵液分三部分进行如下处理：

（1）将部分发酵液8000rpm离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬，制备得到活菌菌悬液；

（2）将部分发酵液用超声破碎仪超声破碎20 min，超声条件：功率30%，超声2s，停止2s；80℃灭活60 min，得到无活菌的裂解液；

（3）部分发酵液不进行任何处理。

3、准备无菌的带细胞爬片的24孔板

每孔加入600 µL变异链球菌的菌液，变异链球菌在细胞爬片上粘附形成一层生物膜，然后弃除孔内培养液和未粘附的菌体，用pH7.0 磷酸缓冲液洗涤两次;孔内分别加入600µL的植物乳植杆菌VHProbi O10发酵液、菌悬液和无活菌的裂解液，其中每组做3个平行，并以等量MRS肉汤培养基作对照。

让待测样品和变异链球菌形成的生物膜37℃共培养24h，然后弃去孔内的液体后，加入600μL pH7.0磷酸缓冲液清洗，将每孔清洗3次，清洗时需不断强烈振动以除去未粘附的细菌，然后通过细胞爬片上变异链球球的数量对比来判断待测样品生物膜去除率。

将细胞爬片置于无菌均质袋内，超声清洗10 min，使菌体扩散到缓冲液中，然后通过一系列稀释，取100 μL涂布到添加了200 U/L杆菌肽的轻质唾液链球菌培养基上，37℃有氧培养24小时，检测变异链球菌的菌量，通过以下公式计算变异链球菌生物膜的去除率：去除率（%）=（1-实验组菌量/对照组菌量）×100%。具体结果见表6。

表6植物乳植杆菌VHProbi O10对变异链球菌生物膜的去除效果

分组	变异链球菌数量（CFU）	生物膜去除率
			对照组	27700	-
发酵液	0	100%
			菌悬液	9400	66.06%
裂解液	0	100%

从表6的数据可知，植物乳植杆菌VHProbi O10能高效去除变异链球菌形成的生物膜。其中，菌悬液即单纯的菌体对生物膜的去除率为66.06%，说明菌体细胞膜上有变异链球菌的结合位点，单纯的菌体自身也能够与变异链球菌结合，短时间内去除部分生物膜；而发酵液和裂解液中除了含有菌体自身外，还含有较多的代谢物质，能够更高效去除变异链球菌形成的生物膜，去除率高达100%。因此，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10能有效预防和治疗由变异链球菌引起的龋齿，可广泛用于药品、保健品以及牙膏和漱口水等口腔护理用品中。

实施例11 植物乳植杆菌VHProbi O10对人正常牙龈上皮细胞的毒性试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，二氧化碳培养箱培养至所需量，待细胞密度生长至80%左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10⁵cells/mL,然后取500 μL细胞悬液接种至24孔板，接种密度为2.5×10⁵cells/孔，细胞培养24 h后进行后续实验。

2、灭活菌液制备

植物乳植杆菌VHProbi O10新鲜菌液置于80℃水浴锅中灭活20min，然后用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，用细胞培养液重悬菌体，并调整菌体浓度OD600=0.4-0.5之间。

3、细胞培养

实验组：将灭活后的菌液按MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）值为10的比例加入24孔板的细胞中，

空白对照组：加入与灭活菌液等体积的细胞培养液。

在待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，使其终浓度为0.3g/L；将24孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育3h，小心弃掉上清；每个24孔板细胞培养孔中加入500 μL的DMSO，37℃下孵育30 min，使紫色结晶充分溶解；在波长490nm下检测吸光度值。

结果显示，空白对照组的吸光值是0.668，而实验组的吸光值是0.686，基本相当。从而说明植物乳植杆菌VHProbi O10对人正常牙龈上皮细胞的增殖活性均无显著影响，安全性良好，无细胞毒性。

实施例12 植物乳植杆菌VHProbi O10对牙龈上皮细胞的粘附性

粘附性是益生菌在口腔中定植的重要先决条件，粘附性高在这个生态系统中有竞争优势。

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80%左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10⁵cells/mL。然后取500 μL细胞悬液接种至带细胞爬片的24孔板，接种密度为2.5×10⁵cells/孔，细胞过夜培养至完全贴壁后弃培养液，用新鲜培养液漂洗2次，备用。

2、菌悬液制备

将植物乳植杆菌VHProbi O10新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使 OD600=0.4-0.5之间。

3、细胞培养

在已准备好的含人原代牙龈上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500 μL，于二氧化碳培养箱中共生培养2 h，终止培养，用 pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，去除未粘附的乳杆菌。

4、镜检

细胞爬片用甲醇固定 15 min，然后吉姆萨染液染色5min，pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视细胞表面的植物乳植杆菌，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差。

粘附指数 = 粘附细菌数/细胞数。

结果显示，一个牙龈上皮细胞上大约粘附4个菌体，粘附指数是3.83，从而说明植物乳植杆菌VHProbi O10对牙龈上皮细胞粘附力较强，能够在口腔中定植。

实施例13 植物乳植杆菌VHProbi O10在细胞水平上对牙周病原菌的拮抗粘附试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80%左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10⁵cells/mL。然后取500 μL细胞悬液接种至加细胞爬片的24孔板，过夜培养至完全贴壁后，弃培养液，用新鲜培养液漂洗2次，备用。

2、菌悬液制备

将植物乳植杆菌VHProbi O10新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600= 0.4-0.5之间。

采样同样方法分别制备得到牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌菌悬液。

3、细胞培养

实验组：将植物乳植杆菌VHProbi O10菌液和致病菌菌悬液按照体积比1:1的比例混匀，然后取500 μL加入到上述准备好的24孔板内。

对照组：将致病菌菌悬液和磷酸缓冲液按照1:1的比例混匀，然后取500 μL加入到上述准备好的24孔板内。为同菌量的致病菌菌液加上相应体积的缓冲液。将24孔板置于二氧化碳培养箱中共生培养2h，终止培养，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，去除未粘附的乳杆菌。

5、镜检

每个孔加入500μL甲醇固定15 min，然后吉姆萨染液染色5 min，pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤冲洗干净后，取出孔内的细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择50个细胞，并计算其可视细胞表面的致病菌数量，运用统计学方法计算粘附指数的均数和标准差。具体结果见表7。镜检结果如图6-8所示。

粘附指数（%）=粘附细菌数/细胞数。

表7植物乳植杆菌VHProbi O10对牙周致病菌的拮抗粘附效果

从图6-8以及表7的数据可以看出，与对照组相比，添加植物乳植杆菌VHProbi O10菌悬液的实验组牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌对牙龈上皮细胞的粘附指数普遍下降79%-89%。从而说明，植物乳植杆菌VHProbi O10能显著抑制常见牙周致病菌对牙龈上皮细胞的粘附作用，取得了意料不到的技术效果。

上述细胞实验结果表明，植物乳植杆菌VHProbi O10对人正常牙龈上皮细胞没有毒性，且能够粘附在细胞上，在口腔内实验有效定植，平衡口腔菌群。植物乳植杆菌VHProbiO10能够显著抑制牙龈卟啉单胞菌、半放线聚集杆菌和具核梭状杆菌等牙周病原菌在人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和缓解牙周炎，牙龈出血等牙周疾病的症状。

综上，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10对引起龋齿的变异链球菌和粘性放线菌，引起牙周疾病的牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌等致病菌的生长、粘附具有明显的抑制作用，可以作为口腔益生菌使用，有效预防和改善口腔疾病。植物乳植杆菌VHProbi O10的裂解液还能有效去除变异链球菌形成的生物膜以及抑制变异链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的生长繁殖，广泛添加到药品、保健品以及牙膏、漱口水等口腔护理产品中使用。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi O10对人工胃液和人工肠液具有很强的耐受性，能够在肠道内发挥益生作用。

序列表

<110> 山东百沃生物科技有限公司

<120> 一株具有预防或治疗龋齿和牙周病功效的植物乳植杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1409

<212> DNA

<213> 植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 1

cccaccgact ttgggtgtta caaactctca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg 60

ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccgac ttcatgtagg 120

cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa tggctttaag agattagctt actctcgcga 180

gttcgcaact cgttgtacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat 240

gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc accagagtgc 300

ccaacttaat gctggcaact gataataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 360

tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta tccatgtccc cgaagggaac 420

gtctaatctc ttagatttgc atagtatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgtagcttc 480

gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagc 540

cttgcggccg tactccccag gcggaatgct taatgcgtta gctgcagcac tgaagggcgg 600

aaaccctcca acacttagca ttcatcgttt acggtatgga ctaccagggt atctaatcct 660

gtttgctacc catactttcg agcctcagcg tcagttacag accagacagc cgccttcgcc 720

actggtgttc ttccatatat ctacgcattt caccgctaca ccaggagttc cactgtcctc 780

ttctgcactc aagtttccca gtttccgatg cacttcttcg gttgagccga aggctttcac 840

atcagactta aaaaaccgcc tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga caacgcttgc 900

cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaaatacc 960

gtcaatacct gaacagttac tctcagatat gttcttcttt aacaacagag ttttacgagc 1020

cgaaaccctt cttcactcac gcggcgttgc tccatcagac tttcgtccat tgtggaagat 1080

tccctactgc tgcctcccgt aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatta 1140

ccctctcagg tcggctacgt atcattgcca tggtgagccg ttaccccacc atctagctaa 1200

tacgccgcgg gaccatccaa aagtgatagc cgaagccatc tttcaagctc ggaccatgcg 1260

gtccaagttg ttatgcggta ttagcatctg tttccaggtg ttatcccccg cttctgggca 1320

ggtttcccac gtgttactca ccagttcgcc actcactcaa gtgtaaatca tgatgcaagc 1380

accaatcaat accagagttc gttcgactt 1409

Claims

1.一种植物乳植杆菌，其特征在于，所述的植物乳植杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2022174。

2.如权利要求1所述的植物乳植杆菌，其特征在于，所述的植物乳植杆菌的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的植物乳植杆菌，其特征在于，所述的植物乳植杆菌的Riboprinter 指纹图谱如图1所示，蛋白质谱如图2所示。

4.权利要求1所述的植物乳植杆菌在制备具有抗氧化功能的制品中的应用。

5.权利要求1所述的植物乳植杆菌在制备具有预防或治疗龋齿功能的制品中的应用。

6.权利要求1所述的植物乳植杆菌在制备具有预防或治疗牙周病功能的制品中的应用。

7.如权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的制品为保健品、药品或口腔护理用品。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的口腔护理用品为牙用凝胶、牙粉、牙膏、漱口剂、口喷剂、口香糖、牙线、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫中的任意一种。

9.一种口腔护理用品，其特征在于，所述的口腔护理用品包含权利要求1所述的植物乳植杆菌的裂解液。

10.如权利要求9所述的口腔护理用品，其特征在于，所述的裂解液是通过将权利要求1所述的植物乳植杆菌新鲜菌液超声破碎后，再进行热灭活得到的。