CN114774326A - 一株植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其应用。本发明所述植物乳酸菌A21136可有效降低幽门螺旋杆菌尿素酶的活性、降低幽门螺旋杆菌的黏附率、增强对幽门螺旋杆菌的互交凝集率和降低幽门螺旋杆菌感染细胞中IL‑8的分泌量，进而达到抑制幽门螺旋杆菌的作用。

Description

一株植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性的微需氧细菌，迄今为止，幽门螺旋杆菌感染被认为是世界范围内最常见的细菌感染。在我国各个地区感染幽门螺旋杆菌的概率有明显差异，平均感染率为59％。作为公认的病原体和致癌物，幽门螺旋杆菌可引起活动性胃炎、消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌等疾病，感染临床表现的严重程度与细菌负荷有关。虽然有些免疫力较强感染者并未发现有不适症状，但是幽门螺杆菌的感染始终是一个危险因素，一旦感染者的免疫力下降幽门螺杆菌就会诱发严重的胃部损伤和病变。

目前，幽门螺杆菌治疗最普遍的现行疗法是通过几种抗生素和质子泵抑制剂的组合来根除病原体，如抗生素三联疗法、四联疗法等。现行疗法在根除幽门螺杆菌的同时也导致了严重的副作用和幽门螺杆菌的耐药性。一方面，现行疗法使用两种以上的抗生素会导致肠道菌群的失调，引起胃肠道功能紊乱。另一方面，抗生素疗法中的抑酸药物使得胃部pH升高，胃酸的屏障作用被削弱，使得更多的病原菌或其它条件致病菌可以通过胃部顺利到达肠道，从而引起其它的消化道疾病。由于治疗的副作用和抗生素耐药性的增加，导致根除幽门螺旋杆菌的成功率低于80％。

研究表明，幽门螺旋杆菌在胃部的定植和致病机制与其鞭毛和尿素酶有密切关系。幽门螺旋杆菌在代谢过程中产生大量的尿素酶，可以将胃中天然存在的尿素分解产生氨气，从而使得幽门螺旋杆菌周围的局部微环境pH升高，保护幽门螺旋杆菌免受胃酸的破坏。幽门螺旋杆菌的鞭毛使其具有游动性，能够通过黏液层而黏附并定植于胃黏膜表面。因此，幽门螺旋杆菌尿素酶活性和细胞黏附能力是幽门螺旋杆菌生存和终生定植于胃部至关重要的因素。为了能够更好地抑制幽门螺旋杆菌的感染，减少幽门螺旋杆菌对机体造成的伤害，亟需发展现行的抗生素疗法外的新的抑制幽门螺旋杆菌的方式或物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌及其应用，本发明所述植物乳酸菌对幽门螺旋杆菌具有显著抑制作用。

本发明提供了一株具有抑制幽门螺旋杆菌功能的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)A21136，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，所述植物乳杆菌A21136的保藏编号为GDMCC No.62225。

本发明还提供了所述的植物乳杆菌A21136在制备抑制幽门螺旋杆菌的产品中的应用。

优选的，所述产品包括食品和/或微生态产品。

优选的，所述食品包括功能性食品和/或发酵制品。

优选的，所述功能性食品包括益生菌制品；所述发酵制品包括乳制品和/或果蔬制品。

优选的，所述产品的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或液体剂。

优选的，所述微生态产品还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述食品还包括食品上可接受的配料和/或添加剂。

本发明还提供了所述的植物乳杆菌A21136在如下(Ⅰ)～(Ⅴ)中任意一种或多种中的应用；

(Ⅰ)制备抑制幽门螺旋杆菌生存和定植的产品；

(Ⅱ)制备抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性的产品；

(Ⅲ)制备降低幽门螺旋杆菌对细胞的黏附率的产品；

(Ⅳ)制备对幽门螺旋杆菌的互交凝集率具有增强作用的产品；

(Ⅴ)制备抑制幽门螺旋杆菌感染细胞中IL-8的分泌量的产品。

本发明还提供了一种抑制幽门螺旋杆菌的产品，所述抑制幽门螺杆菌的产品含有包括上述技术方案所述的植物乳杆菌A21136。

有益效果：

本发明提供了一种具有抑制幽门螺旋杆菌功能的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)A21136，且已完成生物保藏。本发明所述植物乳酸菌A21136可有效降低幽门螺旋杆菌尿素酶的活性、降低幽门螺旋杆菌的黏附率、增强对幽门螺旋杆菌的互交凝集率和降低幽门螺旋杆菌感染细胞中IL-8的分泌量，进而达到抑制幽门螺旋杆菌的作用。

同时，本发明所述植物乳杆菌A21136对生物体胃肠道环境具有良好的耐受性和适应性，可定植于胃肠道中；且不会引起溶血等不良反应，安全性高。

生物保藏信息

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)A21136，于2022年1月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCC No.62225。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为植物乳杆菌A21136的菌落形态图；

图2为实施例2中菌株的尿素酶相对活力结果；

图3为实施例3中先感染模型的AGS细胞黏附率的结果；

图4为实施例3中后感染模型的AGS细胞黏附率的结果；

图5为实施例4中AGS细胞中IL-8浓度检测结果；

图6为实施例9中植物乳杆菌A21136菌株溶血评价结果。

具体实施方式

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)A21136，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，所述植物乳杆菌A21136的保藏编号为GDMCC No.62225。本发明所述植物乳杆菌具有抑制幽门螺旋杆菌的作用。

本发明所述植物乳杆菌A21136优选从广西合浦县健康百岁老人的新鲜粪便样品中筛选获得。本发明所述植物乳杆菌A21136的16S rDNA优选如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CCGTTGGGGCGTGCTTATACATGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCGTAAGGTGAAACAAAAT-3’，该菌株与NCBI数据库中的植物乳杆菌2191的同源性高达99.8％，说明此菌株与植物乳杆菌有极高的相似性，因此，将此菌株命名为植物乳杆菌A21136。

本发明所述植物乳杆菌A21136在MRS固体培养基上的菌落形态为：菌落为圆形，乳白色略微偏黄，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明(图1)。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。

本发明还提供了所述的植物乳杆菌A21136在制备抑制幽门螺旋杆菌的产品中的应用。

本发明所述产品优选包括食品和/或微生态产品，所述食品优选包括功能性食品和发酵制品。本发明所述功能性食品优选包括益生菌制品。本发明所述发酵制品优选包括乳制品和果蔬制品，更优选包括乳制品。本发明以上述列举的食品类型进行说明，但不能仅仅将其认定为本发明的全部保护范围，包括本发明所述的植物乳杆菌A21136的产品均为本发明的保护范围。

本发明所述产品的剂型优选包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或液体剂。

当采用本发明所述的植物乳杆菌A21136制备微生态产品时，所述微生态产品优选还包括药学上可接受的辅料。当采用本发明所述植物乳杆菌A21136制备食品时，所述食品还包括食品上可接受的配料和添加剂。

本发明还提供了所述的植物乳杆菌A21136在如下(Ⅰ)～(Ⅴ)中任意一种或多种中的应用；

(Ⅰ)制备抑制幽门螺旋杆菌生存和定植的产品；

(Ⅱ)制备抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性的产品；

(Ⅲ)制备降低幽门螺旋杆菌对细胞的黏附率的产品；

(Ⅳ)制备对幽门螺旋杆菌的互交凝集率具有增强作用的产品；

(Ⅴ)制备抑制幽门螺旋杆菌感染细胞中IL-8的分泌量的产品。

本发明所述的植物乳杆菌A21136可显著降低幽门螺旋杆菌对胃腺癌细胞的黏附率，降低胃腺癌细胞中IL-8的分泌量，进而抑制幽门螺旋杆菌尿素酶的活性以及幽门螺旋杆菌的生存和定植；同时，其还能增强对幽门螺旋杆菌的互交凝集率，二者形成凝集体，有助于将幽门螺旋杆菌排除体外。再者，本发明所述植物乳杆菌A21136对人工胃肠液和胆盐具有良好的耐受性，能够更好地适应胃肠道环境，可定植于胃肠道中。另外，本发明所述植物乳杆菌A21136不引起溶血，安全性较高。

本发明还提供了一种抑制幽门螺旋杆菌的产品，包括上述技术方案所述的植物乳杆菌A21136。本发明所述抑制幽门螺旋杆菌的产品中，所述的植物乳杆菌A21136的有效活菌数为优选为1×10⁷～1×10¹²CFU/mL，进一步优选为1×10⁷～10×10⁷CFU/mL，或1×10⁸～10×10⁸CFU/mL，或1×10⁹～10×10⁹CFU/mL，或1×10¹⁰～10×10¹⁰CFU/mL，或1×10¹¹～10×10¹¹CFU/mL，或1×10¹²～10×10¹²CFU/mL。本发明所述产品优选包括食品和/或微生态产品，本发明所述食品或微生态产品的类型和相应参数如前文所述，在此不再赘述。当本发明所述食品优选为发酵牛乳时，所述发酵牛乳的制备方法包括：将37℃的杀菌牛乳与植物乳杆菌菌粉混合，发酵，得到所述发酵牛乳。

本发明所述杀菌的方法优选为巴氏杀菌。本发明对所述巴氏杀菌的步骤没有特殊限定，采用本领域常规巴氏杀菌步骤即可。本发明所述发酵的温度优选为37～40℃；所述发酵的时间优选8h。

本发明所述植物乳杆菌菌粉的制备方法优选包括：

将植物乳杆菌A21136种子液接种在MRS液体培养基中发酵，离心，得到植物乳杆菌A21136菌体；

将所述植物乳杆菌A21136菌体清洗后，与冻干保护剂等体积混合，冷冻干燥和研磨，得到所述植物乳杆菌菌粉。

本发明优选将植物乳杆菌A21136种子液接种在MRS液体培养基中发酵，离心，得到植物乳杆菌A21136菌体。本发明所述植物乳杆菌A21136种子液的接种量优选为所述MRS液体培养基体积2％。本发明所述发酵的温度优选为37℃；所述发酵的时间优选为24h。本发明所述离心的转速优选为4000～6000r/min；所述离心的时间优选为10min；所述离心的温度优选为4℃。

得到所述植物乳杆菌A21136菌体后，本发明优选将所述植物乳杆菌A21136菌体清洗后，与冻干保护剂等体积混合，得到植物乳杆菌A21136菌悬液。本发明优选采用无菌生理盐水对所述植物乳杆菌A21136菌体进行清洗，所述清洗的次数优选为2次。本发明所述冻干保存剂优选包括脱脂乳粉或葡萄糖。

得到所述植物乳杆菌A21136菌悬液后，本发明优选将所述植物乳杆菌A21136菌悬液冷冻干燥和研磨，得到所述植物乳杆菌菌粉。本发明所述冷冻干燥优选包括将所述植物乳杆菌A21136菌悬液于4℃平衡30min后，-40℃冷冻6h。本发明对所述研磨方式没有特殊限定，采用本领域常规研磨方式即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

植物乳杆菌A21136菌株分离及鉴定

取长寿老人的新鲜粪便样品1.0g加入9mL无菌生理盐水震荡混合均匀制备菌悬液。取5mL上述菌悬液加入45mL富集培养基中，37℃厌氧培养7d。将培养好的富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释至10^-7，取0.1mL稀释度为10^-5、10^-6、10^-7的稀释菌液涂布于含有溴甲酚紫的MRS显色培养基上，37℃厌氧培养2～4天。挑取产生黄色变色圈时间较早、变色圈较大的单菌落，划线于MRS平板上，重复三次直至菌株纯化。

挑取纯化好的待鉴定菌株单菌落于无菌水中制成菌悬液作为PCR模板进行菌落PCR扩增菌株16S rDNA。PCR引物采用如SEQ ID NO.2序列所示的27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和如SEQ ID NO.3所示的1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。反应采用25μL体系：2×San Taq PCR Mix12.5μL，模板1μL，上下游引物各1μL，补足ddH₂O至25μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共执行30个循环，最后72℃延伸10min。反应产物经测序所得序列提交NCBI进行Blast比对，发现其中一株与NCBI数据库中植物乳杆菌2191的同源性高达99.8％，因此将该菌鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌A21136，菌落形态如图1所示，具体为：菌落为圆形，乳白色略微偏黄，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.62225。

MRS显色培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.6g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，溴甲酚紫0.1g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL，pH6.5，115℃灭菌20min。

实施例2

幽门螺旋杆菌尿素酶抑制实验

将菌幽门螺旋杆菌悉尼株SS1接种于哥伦比亚血琼脂平板，在三气培养箱培养72～96h。收集幽门螺旋杆菌菌体，用PBS缓冲液洗2次，用BHI培养基重悬并调节菌体浓度为1×10⁷CFU/mL得到幽门螺旋杆菌菌悬液。

将待测菌株接种于MRS液体培养基培养，接种量为MRS液体培养基体积的1％，培养16-24h后于6000rpm/min离心5min，收集上清发酵液，并用0.22um微孔滤膜对上清发酵液进行过滤得到待测发酵液。待测菌株包括实施例1中的植物乳杆菌A21136、鼠李糖乳杆菌LGG(来源于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为ATCC 53103)和罗伊氏乳杆菌17938(来源于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，保藏编号为DSM17938)。

在无菌96孔板中，设置6个实验组，均为40μL幽门螺旋杆菌菌悬液(HP)和10μL对应菌株待测发酵液，如表1所示。HP模型组加入40μL幽门螺旋杆菌菌悬液和10μLPBS缓冲液，混合均匀后放入三气培养箱中共培养48h。然后取出加入150μL尿素酶测试液，振荡后用酶标仪测定550nm的吸光值。以HP模型组OD₅₅₀值为100％计算各实验组中幽门螺旋杆菌尿素酶相对活力。选取能将幽门螺旋杆菌尿素酶相对活力降至25％以下的菌株备用。各菌株抑制幽门螺旋杆菌尿素酶相对活力结果如表1和图2所示。

表1菌株尿素酶相对活力

菌株组别	尿素酶相对活力(％)
		HP模型组	100
HP+植物乳杆菌A21136发酵上清	22.69
		HP+鼠李糖乳杆菌LGG发酵上清	26.09
HP+罗伊氏乳杆菌17938发酵上清	50.89

由表1和图2可知，与表1中的其他菌株相比，植物乳杆菌A21136菌株发酵上清液对幽门螺旋杆菌尿素酶具有较强的抑制能力。

实施例3

幽门螺旋杆菌细胞粘附力抑制实验

AGS细胞准备：在无菌96孔板中接种AGS细胞(人胃腺癌细胞)，细胞接种量为2×10⁴个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。

幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。

待测菌菌悬液准备：培养好的待测菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL，待测菌菌株包括植物乳杆菌A21136和鼠李糖乳杆菌LGG。

先感染模型：96孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.1mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.1mL待测菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.2mL尿素酶试剂，并于550nm处检测各孔的OD值。

后感染模型：96孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.1mL待测菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的待测菌，加入0.1mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为HP模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.2mL尿素酶试剂，并于550nm处检测各孔的OD值。

HP模型组黏附率计算以HP模型组OD值减去空白组OD值为100％，实验组黏附率计算公式为：

计算结果如表2和图3、图4所示：

表2AGS细胞黏附率

由表2和图3可知，先感染模型中，和HP模型对比，经A21136菌株处理后幽门螺旋杆菌对细胞的粘附率降低到30.56％；由表2和图4可知，后感染模型中，A21136菌株可将幽门螺旋杆菌对细胞粘附率降低到28.96％。由此结果可知，植物乳杆菌A21136菌株可显著降低幽门螺旋杆菌对细胞的黏附率，且所述A21136菌株对先感染模型和后感染模型中AGS细胞黏附率的降低也能充分说明本发明所述A21136菌株对幽门螺旋杆菌的预防和治疗均有显著效果。

实施例4

AGS细胞IL-8分泌量检测

AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为1×10⁵个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。

幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。

待测菌菌悬液准备：培养好的待测菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。

24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.5mL待测菌悬液，在三气培养箱中共培养24h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白对照组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为HP模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后收集细胞培养液，在4℃以4000rpm/min离心10min，收集上清液。上清液根据ELISA试剂盒(购自上海江莱生物公司)提供的方法进行IL-8含量检测。检测结果如表3和图5所示：

表3IL-8浓度检测结果

菌株组别	IL-8浓度(pg/mL)
		空白对照组	3.60
HP模型组	28.64
		HP+A21136	6.28

由表3和图5可以得出，和对照组相比，感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞上清液IL-8浓度显著增加到28.64pg/mL；经A21136菌株处理后，和HP模型组相比AGS细胞IL-8的分泌量减少78.07％，AGS细胞的IL-8浓度显著减少到6.28pg/mL。由于幽门螺旋杆菌感染细胞后会诱导细胞分泌IL-8，因而该结果表明，植物乳杆菌A21136可以显著抑制幽门螺旋杆菌对细胞的感染。

实施例5

菌株对幽门螺旋杆菌的抑制

将活化好的幽门螺旋杆菌接入BHI+5％胎牛血清液体培养基中，在37℃、5％氧气、10％二氧化碳条件下培养至菌液浓度为1×10⁸CFU/mL。取0.1mL幽门螺旋杆菌菌液涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，制备成幽门螺旋杆菌平板。

将待测菌株转接活化2次后接入MRS液体培养基中37℃下厌氧培养24h。培养好的菌液于6000rpm/min条件下离心5min，取上清液用0.22微米无菌微孔滤膜过滤得待测上清液。用牛津杯法检测待测上清液对幽门螺旋杆菌的抑制效果。检测效果如表4所示：

表4菌株抑菌圈测量结果

组别	抑菌圈直径(mm)
		空白MRS培养基	0
植物乳杆菌A21136	12.1±0.2

由表4可知，本发明所述植物乳杆菌A21136抑菌圈直径显著大于空白MRS培养基的抑菌圈，说明本发明所述植物乳杆菌A21136对幽门螺旋杆菌具有显著的抑制作用。

实施例6

菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力

菌悬液制备：将活化好的待测菌及幽门螺旋杆菌菌体用无菌PBS缓冲液洗涤2次，用PBS缓冲液重悬后调整菌悬液浓度为1×10⁸CFU/mL。

将待测菌菌悬液及幽门螺旋杆菌菌悬液进行等量混合，震荡3～5min充分混合均匀后置于37℃静置培养，并于0h、2h、16h取样上层液体进行OD₆₀₀吸光值检测。根据公式计算待测菌对幽门螺旋杆菌的互交凝集率，待测菌包括植物乳杆菌A21136和鼠李糖乳杆菌LGG。

Aa：0h待测菌悬液OD₆₀₀值；

Ab：0h幽门螺旋杆菌菌悬液OD₆₀₀值；

Amix：各检测时间点的混合菌悬液OD₆₀₀值。

检测结果如表5所示。

表5菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力

由表5可以得出，植物乳杆菌A21136菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率随着时间的延长而增加，16h时A21136菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率达到47.16％。这表明A21136菌株与幽门螺旋杆菌具有较强的结合能力，二者形成凝集体有助于将幽门螺旋杆菌排除体外。

实施例7

菌株对人工胃肠液的耐受性

菌悬液制备：将菌株从保藏斜面上转接活化2次后接入MRS培养基培养16～24h，将菌悬液浓度调整至1×10⁹CFU/mL。

耐人工胃液实验：取1mL菌悬液添加入9mL pH值2.5的人工胃液中，在37℃厌氧培养3h；分别于0h和3h对培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。根据公式计算存活率。

人工胃液存活率＝(3h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％

耐人工肠液实验：取1mL菌悬液添加入9mLpH值2.5的人工胃液中，37℃厌氧培养3h后取1mL加入到9mL Ph值8.0的人工肠液中，37℃厌氧培养7h；加入人工肠液后分别于0h和7h取培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数，根据公式计算存活率。

人工肠液存活率＝(7h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％

存活率统计结果如表6所示。

表6菌株人工胃肠液耐受检测结果

菌株编号	人工胃液存活率(％)	人工肠液存活率(％)
			植物乳杆菌A21136	179	39.0

有表6可以看出，植物乳杆菌A21136可以很好的耐受胃酸环境，对肠液也具有较好的耐受性。

实施例8

菌株对胆盐的耐受性

菌悬液制备：将菌株从保藏斜面上转接活化2次后接入MRS培养基培养16-24h，并将培养液浓度调整至1×10⁷CFU/mL。

取1mL菌悬液加入9mL含有0.3％牛胆盐的MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，分别于0h、24h取培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数，根据公式计算存活率。

0.3％胆盐存活率＝(24h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％。存活率统计结果如表7所示。

表7菌株0.3％浓度胆盐存活率

菌株编号	0.3％胆盐存活率(％)
		植物乳杆菌A21136	1355.56

由表7可以得出，植物乳杆菌A21136对0.3％浓度的胆盐具有很好的耐受能力，在0.3％浓度的胆盐条件下菌株的生长不受到抑制。

实施例9

菌株溶血评价

在无菌条件下，菌株转接活化2次后用无菌接种环划线接种于含有5％绵羊血的血平板上，37℃厌氧培养48h，观察血平板上是否有溶血圈出现。菌株培养结果如图6所示。

由图6可以看出，菌落周围的培养基没有出现溶血圈，表明培养基中的红细胞没有被溶解，该菌株具有相对安全性。

实施例10

冻干菌粉及益生菌菌剂的制作

将实施例1中植物乳杆菌A21136接种至MRS固体培养基中进行活化，将活化后的菌株按照MRS液体培养基体积1％的接种量，接种至MRS液体培养基中培养24h，制备得到种子液。制备好的种子液以2％的体积接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h进行大批量发酵。发酵结束镜检确认无污染后，将菌液在4℃条件下4000～6000r/min离心10min收集菌体。

收集好的菌体用无菌生理盐水洗2次后在菌体中按1：1的体积比加入脱脂乳粉等常规冻干保护剂，混合均匀制备成菌株浓度为1×10¹⁰CFU/mL的菌悬液。将菌液转移至冻干容器中，梯度降温冷冻，再用真空冷冻干燥机进行冻干。将冻干的菌体进行粉碎研磨后即可得到植物乳杆菌A21136冻干菌粉。

植物乳杆菌A21136冻干菌粉与常用辅料进行混合后经过压片或填充胶囊可制作成片剂或胶囊等益生菌菌剂。

实施例11

含有植物乳杆菌A21136的发酵牛乳制作

将牛乳或脱脂牛乳按常规工艺进行巴氏杀菌，冷却至37℃后加入实施例10中制备的植物乳杆菌A21136菌粉，搅拌均匀。在37～40℃条件下发酵8h，即得含有植物乳杆菌A21136浓度大于1×10⁶CFU/mL的发酵牛乳。

由以上实施例可以得出，本发明所述的植物乳杆菌A21136可以有效抑制幽门螺旋杆菌。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 广西爱生生命科技有限公司

广西自贸区爱生生物技术有限公司

<120> 一株植物乳杆菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgttggggc gtgcttatac atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60

catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120

agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180

ccgagtttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240

atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420

aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600

cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660

tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720

cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac 960

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt 1020

cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg 1140

gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga 1260

gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt 1440

ttaggaacca gccgcgtaag gtgaaacaaa at 1472

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)A21136，其特征在于，所述植物乳杆菌A21136保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62225。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌A21136在制备抑制幽门螺旋杆菌的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品和/或微生态产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食品包括功能性食品和/或发酵制品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述功能性食品包括益生菌制品；所述发酵制品包括乳制品和/或果蔬制品。

6.根据权利要求2～5任一项所述的应用，其特征在于，所述产品的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂或液体剂。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微生态产品还包括药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述食品还包括食品上可接受的配料和/或添加剂。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌A21136在如下(Ⅰ)～(Ⅴ)中任意一种或多种中的应用；

(Ⅰ)制备抑制幽门螺旋杆菌生存和定植的产品；

(Ⅱ)制备抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性的产品；

(Ⅲ)制备降低幽门螺旋杆菌对细胞的黏附率的产品；

(Ⅳ)制备对幽门螺旋杆菌的互交凝集率具有增强作用的产品；

(Ⅴ)制备抑制幽门螺旋杆菌感染细胞中IL-8的分泌量的产品。

10.一种抑制幽门螺旋杆菌的产品，其特征在于，所述抑制幽门螺杆菌的产品含有权利要求1所述的植物乳杆菌A21136。

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