CN113249244B - 一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌 - Google Patents

一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)AR340菌株，该副干酪乳杆菌AR340菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15762，保藏时间为2018年5月14日。本发明的副干酪乳杆菌AR340菌株具有良好的自聚能力、共聚能力和疏水性能，即不在咽部和口腔大量聚集，同时保证一定数量的菌体粘附在口腔粘膜上发挥作用，在一定程度上减少了乙型溶血性链球菌菌株的自聚，降低致病菌的存活率，还能有效拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的生长，降低巨噬细胞NO产生量，可用于调节咽部菌群，缓解炎症反应，预防、减轻或治疗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌导致的感染症状。

Description

一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及功能性乳酸菌的生产开发领域，具体涉及一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌。
背景技术
咽炎是咽部粘膜，粘膜下组织的炎症，常为上呼吸道感染的一部分，以喉咙痛、干痒、恶心、欲吐等不适症状为主，也是世界上最常见的疾病之一。在乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌侵袭下，咽部菌群失调，菌群多样性发生变化，原籍优势菌群减少、条件致病菌增多，引起原籍菌群拮抗能力下降和宿主免疫力降低，进而导致咽炎疾病的发生或加重疾病程度。咽炎在污染严重的发展中国家发病率极高，致病人群广泛，以学龄儿童和青少年中发病最为常见。作为临床多发病，咽炎病程长，反复发作，已严重影响和危害人体健康，同时给大众生活带来极大的不便。临床常采用抗生素、中成药等药物进行治疗，一般见效慢，副作用大，长期使用抗生素扰乱口腔原有菌群，且易产生耐药性长期，降低治疗效果；中成药复方制剂类主要以金银花、绿茶等为主要成分，药效显著的少有。
乳酸菌是指发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌资源在自然界分布十分广泛，具有很强的适应能力，繁殖快并且可以与其它微生物建立起共生关系。乳酸菌除了具有传统的改善食品风味，提高食品营养价值，提高食品保藏性和附加值等作用，还在维护肠道功能和宿主健康中发挥着关键作用。大量研究表明乳酸菌具有特殊的生理功能，诸如治疗结肠炎症，调节机体肠道正常菌群，保持微生态平衡，增强免疫力，改善血脂，改善肝功能，防癌抗癌，延缓衰老，甚至预防龋齿、抗诱变、促进营养物质利用等。基于此，添加有功能性乳酸菌的食品如酸奶、含片、喷雾剂、口香糖等相继被开发出来用于治疗肠道、血压、口腔等方面的疾病。
近年来，国外有相关研究表明益生菌有缓解及治疗咽炎的功效，唾液链球菌K12等能有效定殖于口腔粘膜细胞上，临床验证可预防链球菌所导致的咽喉炎，国内方面鲜有报道，仅有的专利《具有缓解咽喉部炎症功效的益生菌食品组合物及食品》(授权公告号：CN103798392B)主要采用具有抗胃幽门螺旋杆菌的能力的唾液乳杆菌和增加活性异黄酮含量动物双歧杆菌作为治疗咽炎的益生菌。
因此，筛选出本身具抑制咽炎致病菌乙型溶血性链球菌和抗炎性能的乳酸菌，为未来开发能调节咽喉菌群的微生态制剂对咽炎进行靶点治疗，指导临床对咽炎疾病进行菌群调节及针对性的治疗提供了一定的依据，具有非常重要的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌。
本发明提供了一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)AR340菌株，具有这样的特征：该副干酪乳杆菌AR340菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15762，保藏时间为2018年5月14日。
本发明还提供了副干酪乳杆菌AR340菌株在发酵制备用于调节咽部菌群、降低咽炎炎症以及预防、缓解、减轻咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的感染症状的产品中的应用。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌AR340，具有高安全性，同时经体外评估可知，由于具有抑制乙型溶血性链球菌的能力和一定的抗炎效果，细胞表面特性数据表明副干酪乳杆菌AR340不在咽部和口腔大量聚集，同时可以保证一定数量的菌体粘附在口腔粘膜上发挥作用，还在一定程度上减少了乙型溶血性链球菌菌株的自聚，降低致病菌菌株的存活率，有利于机体健康，从而可开发成保健食品或药品，调节咽部菌群，降低咽炎炎症，预防、缓解、减轻咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的感染症状的咽炎疾病。
附图说明
图1是本发明的实施例中副干酪乳杆菌AR340对乙型溶血性链球菌的抑制结果示意图；
图2是本发明的实施例中副干酪乳杆菌AR340抗炎能力评估示意图；
图3是本发明的实施例中pH对副干酪乳杆菌AR340生长情况的影响示意图；
图4是本发明的实施例中副干酪乳杆菌AR340的自聚能力、共聚能力及疏水性评估示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
本发明提供一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)AR340菌株，其特征在于，所述副干酪乳杆菌AR340菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15762，保藏时间为2018年5月14日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了副干酪乳杆菌AR340菌株在发酵制备用于调节咽部菌群、降低咽炎炎症以及预防、缓解、减轻咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的感染症状的产品中的应用。
本发明中，产品为食品、保健品或药品。
实施例：
实施例中的副干酪乳杆菌AR340筛选自上海微生物工程技术研究中心保藏菌株。
1.可拮抗咽炎致病菌的副干酪乳杆菌的筛选
1.1抑制乙型溶血性链球菌的乳酸菌的筛选
将分离于泡菜、黄酒等食品来源的乳酸菌利用琼脂扩散方法进行体外抑菌实验：1％的比例将乳酸菌接种到液体MRS培养基中，37℃过夜静置培养；同时乙型溶血性链球菌接种到葡萄糖浸液肉汤培养基中，37℃过夜培养；在血平板上均匀涂布乙型溶血性链球菌，放置3个灭菌的牛津杯；向每个牛津杯孔中加入乳酸菌菌液(约200μL)；室温放置使乳酸菌菌液充分扩散，37℃静置培养24h，结果显示来源于加拿大冻干泡菜的副干酪乳杆菌AR340菌株能显著抑制乙型溶血性链球菌。
1.2抗炎乳酸菌的筛选
取处于对数生长期的小鼠巨噬细胞细胞RAW264.7，用2.5g/L的胰酶消化细胞，调节细胞浓度为1×106个/mL，接种于96孔板，100微升/孔。待细胞长至80％时汇合后分组，脂多糖LPS组：1μg/mL的脂多糖LPS刺激巨噬细胞24h。AR340组：1μg/mL的脂多糖LPS刺激巨噬细胞24h，加入AR340乳酸菌发酵混合液。加入量为100微升，浓度104CFU/mL。培养24h后收集上清，采用试剂盒测定NO含量。脂多糖LPS组在LPS(1μg/ml)存在下培养的巨噬细胞产生了大约53μmol/l。相比之下，与副干酪乳杆菌AR340能有效抑制巨噬细胞NO产生量，与脂多糖LPS组相比减少了约10％。
1.3形态特征鉴定
对AR340单菌落培养24h进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，结果显示AR340为革兰氏阳性、过氧化氢阴性。
1.4 16S rDNA基因鉴定
对副干酪乳杆菌AR340进行24h的厌氧培养后，提取基因组DNA，用引物27F和1492R克隆16S rDNA基因，纯化后送上海生工测序公司测序，所得序列经Blast比对，发现AR340与Lactococcus paracasei的同源性达到99％，故将分离株归为副干酪乳杆菌，其中，引物27F的序列如SEQ ID No：1所示，引物1492R的序列如SEQ ID No：2所示。
将副干酪乳杆菌AR340保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15762，保藏日期为2018年5月14日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.可拮抗咽炎致病菌的副干酪乳杆菌的生物学特性
2.1 pH对副干酪乳杆菌AR340的影响
将副干酪乳杆菌AR340以2％接种量分别接种于pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9的MRS液体培养基中，于37℃静置培养，每隔2h取样，测定其在600nm波长下的吸光度。AR340在pH4到pH9范围内仍保持较好的生长活性。
2.2溶菌酶对副干酪乳杆菌AR340的影响
采用牛津杯法考察副干酪乳杆菌AR340对溶菌酶的耐受情况。下层培养基为1.5％(W/V)的琼脂，上层为0.7％(W/V)的MRS培养基与乳酸杆菌的混合物(107CFU/mL)。利用牛津杯在上层培养基中打孔，然后在每个孔中加入100μL的不同浓度的溶菌酶溶液(0.2-3.0mg/mL)。将上述平板在37℃培养过夜，根据抑菌圈的情况分析副干酪乳杆菌AR340对溶菌酶的耐受性。人体口腔腺体和全唾液中溶菌酶浓度为2-80μg/mL，在溶菌酶的存在下，副干酪乳杆菌AR340耐受200μg/mL的溶菌酶。
2.3副干酪乳杆菌AR340细胞表面疏水性测定
用生理盐水调整副干酪乳杆菌AR340菌液浓度，使菌悬液在600nm波长下A值约为0.2(A600nm＝0.2)。取2mL细菌悬液与2mL二甲苯混合，涡旋120s，室温静置30min分层。取1mL水相，以生理盐水为空白对照组，测定A600nm，每株细菌平行做3管重复。
细菌表面疏水率(CSH)计算：
H％＝[(A0-At)/A0]×100％
其中：H即CSH。A0和At分别是与二甲苯混匀前后水相测定所得的A600值。
副干酪乳杆菌AR340的细菌表面疏水率为78.21％。这表明AR340细胞表面可能存在着较多的类蛋白物质。这些类蛋白物质一方面可能对细胞有较好的保护作用，另一方面可能在细胞和粘膜的非特异性吸附中起着促进作用。
2.4副干酪乳杆菌AR340自聚能力测定
副干酪乳杆菌AR340菌株悬液制备同2.3。取4mL制备好的细菌悬液(A600nm＝1.0)置于15mL离心管中，室温静置分层，分别在静置1h，5h后吸取1mL上层悬液测A600nm值，记作At，每个菌株每个时间点平行做3管重复。
细菌自聚率(AP)计算：
AP％＝[(A0-At)/A0]×100％
其中：A0和At分别是自聚前后上层悬液在600nm下测量所得的A值。
自聚集是指细胞自我聚集的一种性能，其对细胞的存活起到重要作用。副干酪乳杆菌AR340菌株在1h和5h时的自聚能力分别是9.43％和22.92％，表明AR340具有一定自聚能力，有助于菌株在口腔环境中快速的繁殖与生存。
2.5副干酪乳杆菌AR340共聚能力测定
乙型溶血性链球菌在葡萄糖浸液肉汤液体培养基中培养20h进行活化，副干酪乳杆菌AR340菌悬液和乙型溶血性链球菌菌悬液用PBS缓冲液调整浓度，使菌悬液浓度分别为A600nm＝0.5，将副干酪乳杆菌AR340菌悬液和乙型溶血性链球菌菌悬液各取5mL混合，混匀，37℃静置培养，测定混合后5h时上层液体的吸光值，每个菌株做3管重复。
细菌共聚率(CP)计算:
CP％＝[1-2Ax+y/(Ax+Ay)]×100％
其中：Ax和Ay分别是0h时乙型溶血性链球菌、副干酪乳杆菌AR340菌悬浮液在600nm下测量所得的A值，A(x+y)表示混合Sh时上层悬液在600nm下测量所得的A值。
结果表明细菌共聚率为23.56％，说明副干酪乳杆菌AR340能有效的与乙型溶血性链球菌产生共聚，并且在一定程度上减少了乙型溶血性链球菌菌株的自聚。
实施例的作用与效果
由实施例可知，副干酪乳杆菌AR340的抑菌能力强，可有效拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌；副干酪乳杆菌AR340菌株培养24h后，具有一定的抗炎效果，能有效拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的生长，有效降低巨噬细胞产生的NO含量；具有较好的口腔耐受性，在200μg/mL的溶菌酶环境下生长良好，能有效存活；适用pH范围广，在pH4.0-9.0条件下均生长良好；具有良好的自聚能力、共聚能力和疏水性能，即细胞表面特性佳，使其不在咽部和口腔大量聚集，同时能够保证一定数量的菌体粘附在口腔粘膜上发挥作用，还在一定程度上减少了乙型溶血性链球菌菌株的自聚，降低致病菌的存活率，有利于机体健康。
此外，本实施例的副干酪乳杆菌AR340从泡菜中筛选获得，其来源为食物，因此具有高安全性，能够应用在食品和药品当中，对人体不产生有害效果。
因此，本发明的副干酪乳杆菌AR340具有高安全性，同时经体外评估可知，由于具有抑制乙型溶血性链球菌的能力和一定的抗炎效果，细胞表面特性数据表明副干酪乳杆菌AR340不在咽部和口腔大量聚集，同时可以保证一定数量的菌体粘附在口腔粘膜上发挥作用，还在一定程度上减少了乙型溶血性链球菌菌株的自聚，降低致病菌菌株的存活率，有利于机体健康，从而可开发成保健食品或药品，调节咽部菌群，降低咽炎炎症，预防、缓解、减轻咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的感染症状的咽炎疾病。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海理工大学
<120> 一种拮抗咽炎致病菌乙型溶血性链球菌的副干酪乳杆菌
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1066
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggcccgtggg gggtgcctat acatgcagtc gacgagttct cgttgatgat cggtgcttgc 60
accgagattc aacatggaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct 120
taagtggggg ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc atagatccaa gaaccgcatg 180
gttcttggct gaaagatggc gtaagctatc gcttttggat ggacccgcgg cgtattagct 240
agttggtgag gtaatggctc accaaggcga tgatacgtag ccgaactgag aggttgatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggct ttcgggtcgt 420
aaaactctgt tgttggagaa gaatggtcgg cagagtaact gttgtcggcg tgacggtatc 480
caaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600
gccctcggct taaccgagga agcgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660
agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780
agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttggagg gtttccgccc 840
ttcagtgccg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta tttcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg gtcttgacat cttttgatca cctgagagat caggttttcc 1020
cctttcgggg caaaatgaca ggggggtggc atgggttgtt cgttcg 1066
<210> 2
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
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tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg 120
cgtgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcgtgta ggcgagttgc agcctacagt 180
ccgaactgag aatggcttta agagattagc ttgacctcgc ggtctcgcaa ctcgttgtac 240
catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc 300
ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc ttactagagt gcccaactaa atgctggcaa 360
ctagtcataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacaaccat gcaccacctg tcattttgcc cccgaagggg aaacctgatc tctcaggtga 480
tcaaaagatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc 600
aggcggaatg cttaatgcgt tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag 660
cattcatcgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt 720
cgagcctcag cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat 780
atctacgcat ttcaccgcta cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc 840
cagtttccga tgcgcttcct cggttaagcc gagggctttc acatcagact taaaaaaccg 900
cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960
ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttggga taccgtcacg ccgacaacag 1020
ttactctgcc ggaccaat 1038

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1. 一种副干酪乳杆菌AR340菌株在制备抑制乙型溶血性链球菌的药物中的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌AR340菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15762，保藏时间为2018年5月14日。
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