CN115851551B - 一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌a21358及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358，从广西健康长寿老人的粪便样品中分离获得。该菌株对幽门螺杆菌的共聚集作用和抑制作用，可有效降低幽门螺杆菌尿素酶活力，能降低幽门螺杆菌对AGS细胞黏附率的作用，可有效降低经幽门螺杆菌感染的AGS细胞中IL‑8的表达，增加经幽门螺杆菌感染的AGS细胞中IL‑10的表达，同时对胃肠液的耐受能力强。

Description

一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领，涉及一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种常见的人类致病菌，可定植于胃部，会引起慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡最后演变为胃癌。幽门螺杆菌感染率高，感染情况与经济水平和卫生条件以及进食习惯有关，在发展中国家人群中的检出率为70-90％，发达国家中的检出率为25-50％。

目前抗生素是治疗幽门螺杆菌感染的主要方法，但随着幽门螺杆菌越来越高的耐药性以及抗生素对肠道菌群的破坏，人们开始寻找其他更安全更健康的治疗手段。研究表明，乳酸菌结合三联/四联使用能够有效提高单一三联/四联法对幽门螺杆菌的根除率，服用乳酸菌还能显著改善抗生素带来的不良反应。乳酸菌通过共聚集作用、分泌抑菌物质、竞争性黏附、增强胃部屏障和调控炎症反应等途径来抑制幽门螺杆菌的生长和定植。CN114317334 A中国发明专利申请公开了一株能够与幽门螺杆菌共聚集的清酒乳杆菌及其应用。CN111607538B的中国发明专利公开了一株鼠李糖乳杆菌及其在抑制幽门螺杆菌中的应用，证明鼠李糖乳杆菌CCFM1119可减少缓解幽门螺杆菌感染患者体内幽门螺杆菌的数量并缓解胃肠症状，提高了幽门螺杆菌的清除率，可用于制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的产品。

但是，乳酸菌受到活性、耐酸碱能力、定植能力等方面的影响，研究表明灭活后乳酸菌的抑制幽门螺杆菌能力会出现下降趋势。

因此，筛选一株能耐受胃肠环境，且在灭活情况下仍具有良好共聚集和抗幽门螺杆菌能力的乳杆菌成为研究的重点和难点。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358，能耐受胃肠环境且同时具有共聚集能力和抗幽门螺杆菌。

为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明所述的一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358，于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：63040，提议的分类学名称为：Pediococcus pentosaceus。

所述的一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358的16S rDNA序列如下：

所述具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358的筛选方法，包括以下步骤：

(1)将0.1mL或0.1g待分离健康长寿老人的粪便样本加入0.9mL无菌生理盐水，震荡混合均匀得到样本悬液；

(2)使用生理盐水进行10倍稀释样本悬液，获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释梯度系列，将各梯度的稀释液取0.1mL涂布于MRS固体培养基，将平板置于恒温培养箱中培养；

(3)选取菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈杆状或圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性；

(4)使用平板划线的方法对菌株进行纯化，将平板置于恒温培养箱中培养；

(5)挑取纯化平板上的单菌落接种于MRS液体培养基，于恒温培养箱中37℃培养18h，将菌液与甘油混合，保存于-80℃。

所述平板划线恒温培养条件为37℃培养48h。

所述将单菌落接种于MRS液体培养基的接种量为4％。

步骤(5)所述培养条件为37℃静置培养18h。

所述MRS液体培养基按以下方法制备：葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL，pH 6.6-6.8，配置固体培养基时，加入琼脂20g，115℃高压灭菌20min。

所述具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358在治疗幽门螺旋杆菌感染药物上的应用。

本发明获得的有益效果是：

本发明所述的戊糖片球菌A21358菌株能够高效与幽门螺杆菌形成共聚体，其对幽门螺杆菌的共聚集率为78.72％，抑菌圈直径为16mm。能抑制幽门螺杆菌的生长定植，提高宿主体内幽门螺杆菌的清除率，进而减少炎症的发生。所述戊糖片球菌A21358菌株在胃、肠液都表现很强的耐受力，在pH＝3.0的胃液中3h后存活率为63％；在pH＝8.0肠液中8h仍能存活繁殖，存活率为127％。

与已发现的抗幽门螺杆菌的罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌相比，本发明提供的戊糖片球菌A21358菌株除了具有高的共聚集能力，同时其菌体孵育上清液还具备抑制尿素酶活性、调节IL-8和IL-10表达的作用。

附图说明

图1为戊糖片球菌A21358菌株的菌落形态图。

图2为戊糖片球菌A21358菌株的革兰氏染色镜检图。

图3为戊糖片球菌A21358的系统发育树。

图4为戊糖片球菌A21358与幽门螺杆菌的共聚集能力。

图5为戊糖片球菌A21358在肠液中的存活能力。

图6为戊糖片球菌A21358对尿素酶活力的影响。

图7为戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌黏附力的影响。

图8为戊糖片球菌A21358对经幽门螺杆菌感染的AGS细胞IL-8表达量的影响。

图9为戊糖片球菌A21358经幽门螺杆菌感染的AGS细胞IL-10表达量的影响。

图10为戊糖片球菌A21358对小鼠胃组织匀浆物尿素酶活力的影响。

图11为戊糖片球菌A21358对小鼠胃组织匀浆物中IL-10表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行描述。

实施例1

本实施例涉及本发明所述菌株的分离、纯化及鉴定。

戊糖片球菌A21358菌株是从广西健康长寿老人的粪便样品中分离获得，所述戊糖片球菌A21358菌株的分离、纯化、鉴定方法如下所述：

MRS培养基的配制：葡萄糖20g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，蒸馏水1000mL，pH 6.6-6.8，配置固体培养基时，加入琼脂20g，115℃高压灭菌20min。

(1)将0.1mL或0.1g待分离样本加入0.9mL无菌生理盐水，震荡混合均匀得到样本悬液。

(2)使用生理盐水进行10倍稀释获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释梯度系列，将各梯度的稀释液取0.1mL涂布于MRS固体培养基，将平板置于恒温培养箱中37℃培养48h；

(3)选取菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈杆状或圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性；

(4)使用平板划线的方法对菌株进行纯化，37℃恒温培养48h。

菌株在MRS培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘齐整，不透明。获得戊糖片球菌A21358菌株在MRS平板上生长形态如图1所示。挑取纯化平板上的单菌落进行革兰氏染色并镜检，菌株呈紫色，圆球形。镜检图如图2所示。

(5)挑取纯化平板上的单菌落接种于MRS液体培养基，37℃静置培养约18h后，将菌液与40％甘油以1:1的比例进行混合，保存于-80℃。

菌株16S rDNA鉴定：经过分离纯化后，挑取乳酸菌特征菌落，混匀于30μL PBS(10mmol/L,pH 7.4)缓冲液，制成菌悬液。取1μL菌悬液加入16SrDNA扩增体系中，50μL扩增体系为：1μL菌悬液为模板，引物27F(SEQ IDNo.2)和引物1492R(SEQ ID No.3)各1μL，2×EsTaq Mix加入25μL，ddH2O 22μL，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃终延伸2min。扩增结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约1500bp的16S rDNA，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得戊糖片球菌A21358菌株的16S rDNA序列如SEQUENCE LISTING(SEQ ID No.1)所示，使用数据库NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)和RDP(http://rdp.cme.msu.edu/)的BLAST工具对获得的16SrDNA序列进行比对并构建系统发育树，系统发育树结果如图3所示。A21358菌株与戊糖片球菌的亲缘关系最近，与戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus strain 4348菌株(GenBank:MT544887.1)的相似性最高，为99.93％，初步鉴定该菌株为戊糖片球菌。该菌株已于2022年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：63040。

实施例2

本实施例是戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌的共聚集作用实施例，具体步骤如下：

幽门螺旋杆菌的培养

幽门螺旋杆菌固体培养基：青岛海博哥伦比亚基础培养基23.5g，BHI培养基9g，琼脂14g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌15min，倒平板前温度降至45℃时加入50ml脱纤维绵羊血，混匀后倒平板。将菌种库中取出的幽门螺旋杆菌悉尼株SS1菌株划线于幽门螺旋杆菌固体培养基，于37℃三气培养箱(氧气5％、二氧化碳10％，氮气85％)培养3d，活化2次。

幽门螺旋杆菌液体培养：青岛海博哥伦比亚基础培养基23.5g，BHI培养基9g，蒸馏水950ml,121℃灭菌15min，待培养基冷却至室温后在使用前往培养基中加入5％胎牛血清，挑取单菌落接种于液体培养基中，于37℃三气培养箱(氧气5％、二氧化碳10％，氮气85％)培养3d，得到活化三代幽门螺杆菌菌液；将幽门螺杆菌菌液8000g离心10min，得到幽门螺杆菌菌体。

将上述幽门螺杆菌菌体用PBS洗涤两次，用pH＝4.0的人工胃液(0.9％NaCl、0.3％胃蛋白酶原)重悬至OD600＝1.0±0.05，得到幽门螺杆菌菌悬液。

戊糖片球菌A21358的培养

将乳杆菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按4％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到活化三代菌液；将菌液经8000g离心10min，得到乳杆菌菌体。

将上述乳杆菌菌体用PBS洗涤两次，用pH＝4的人工胃液(0.9％NaCl、0.3％胃蛋白酶原)重悬至OD600＝1.0±0.05，得到乳杆菌悬液。

幽门螺杆菌与乳杆菌共培养

分别取步骤(1)得到的用人工胃液重悬的幽门螺杆菌菌悬液2mL，分别与步骤(2)得到的调整浓度后的乳杆菌菌悬液2mL混合，充分震荡5min后放置在37℃中培养2h，测定不同时间上清液的600nm吸光值。结果如图4所示。

幽门螺旋杆菌共凝集率计算公式如下：

Ax＝0h乳酸菌的吸光值，Ay＝0h幽门螺旋杆菌的吸光值，Amix＝混合th的吸光值。

将购买的罗伊氏乳杆菌DSM17648制剂用150mL人工胃液重悬，菌浓为OD600＝1.0±0.05，得到罗伊氏乳杆菌DSM17648菌悬液；用来做阳性参照。

热灭活后戊糖片球菌A21358的共聚集能力

按照步骤(1)得到幽门螺杆菌菌悬液；

按照步骤(2)得到乳杆菌菌悬液，70℃水浴灭活30min，将灭活的乳杆菌用人工胃液重悬，得到灭活A21358和DSM17648菌悬液。

按照步骤(3)测定灭活乳杆菌对幽门螺杆菌的共聚集能力，结果如图4所示。

结果显示，戊糖片球菌A21358与幽门螺杆菌的共聚集率在75％以上，高于阳性对照组。热灭活后的戊糖片球菌A21358仍具有效果，与幽门螺杆菌的共聚集率在56.06％，大于市售罗伊氏乳杆菌DSM17648(42.60％)，且为灭活的戊糖片球菌A21358共聚集能力明显高于灭活后，说明灭活会对菌株共聚集效果产生不利的影响。

实施例3戊糖片球菌A21358对胃肠液的耐受能力测定

菌体的培养方法同实施例2，具体步骤如下：

用浓度为1mol/L的无菌HCl及1mol/L NaOH将购自的人工胃液的pH分别调至3.0。将戊糖片球菌A21358接种于MRS液体培养基，37℃培养18h后，分别取菌液1mL加入9mL pH 3.0的人工胃液中，充分混匀后取100μL进行梯度稀释并进行活菌计数，其余置于37℃恒温培养，3h后取样进行稀释计数，以0h的活菌数为100％，结果见表1。

表1

	0h活菌数(CFU/mL)	3h活菌数(CFU/mL)	存活率(％)
				A21358	2.43×108	1.53×108	62.76

在pH 3.0的人工胃液3h后，戊糖片球菌A21358存活率为62.76％，表明戊糖片球菌A21358对pH 3.0人工胃液有较强的耐受性。

在40mL过滤后的NaHCO₃中加入10mL人工肠液，将pH调为8.0，取加菌3h的胃液1mL加入9mL pH＝8.0的人工肠液中，在0、2、4、8h分别取样进行稀释涂布，以0h的活菌数为100％，结果见图5。

结果显示戊糖片球菌A21358在pH 8.0的胃液中仍具有活性，且在8h时活菌数增加，说明A21358可在肠液中有良好的耐受性。

实施例4戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌的抑制作用

(1)改良MRS：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、七水硫酸镁0.2g、无水硫酸锰0.1g，加超纯水1L，121℃灭菌15min。挑乳杆菌单菌落接种于改良MRS中37℃培养18h。

(2)从甘油管中吸取100μl菌液滴加于幽门螺旋杆菌固体平板，用涂布棒均匀涂布，静置1min待菌液晾干后在每块平板上各放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入待测液200μl(待测液体分别为乳杆菌菌悬液、阳性对照、空白对照)。于37℃三气培养箱培养48-72h，测量抑菌圈直径。

结果如表2所示。

表2

组别	第一次(mm)	第二次(mm)	第三次(mm)	均值(mm)
					DSM17648	12	14	13.5	13
A21358	16	15.5	16.5	16
					改良MRS	0	0	0	0

从表2可以看出，改良MRS对幽门螺杆菌无抑制作用,戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌的抑制能力大于市售罗伊氏乳杆菌DSM17648。

实施例5戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌尿素酶活力的影响

菌体的培养方法同实施例2，具体步骤如下：

(1)尿素酶试剂配制：0.9％NaCl，20mmol/L尿素，14μg/mL苯酚红。用HCl调pH至6.8。

(2)将活化培养好的幽门螺旋杆菌菌体从平板上刮入幽门螺旋杆菌液体培养基中，制备成幽门螺杆菌菌悬液，调节菌体浓度约为1×10⁸CFU/ml。取一块96孔板，孔中加入90μl幽门螺杆菌菌悬液及10μl待测乳杆菌菌液(对HP模型组用幽门螺旋杆菌液体培养基代替待测乳杆菌菌液)，混合均匀后将96孔板置于三气培养箱中培养48h。培养结束后孔中加入100μl尿素酶试剂，混合均匀后室温下开盖反应30min，振荡后用酶标仪测定每个孔430nm、560nm和620nm处的吸光值。

尿素酶活力计算公式为：

以HP模型组的尿素酶活力为100％，计算其余各待测组的尿素酶相对活力。

结果如图6所示。

戊糖片球菌A21358组的尿素酶活力为8.15％，与模型组(100％)相比降低了91.85％。说明戊糖片球菌A21358可有效降低幽门螺杆菌尿素酶活力。

实施例6戊糖片球菌A21358对幽门螺杆菌粘附力的影响

菌体的培养方法同实施例2，具体步骤如下：

AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞(人胃腺癌细胞)，细胞接种量为2×10⁴个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。

幽门螺旋杆菌悬液准备：将培养好的新鲜幽门螺旋杆菌平板上的菌体刮入F12K+10％胎牛血清培养基中，重悬制成菌悬液，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/ml。

待测乳杆菌菌悬液准备：将培养好的待测乳杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10⁷CFU/mL。

先感染模型：24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.5mL待测乳杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测乳杆菌处理的AGS细胞为模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测乳杆菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.3mL尿素酶试剂，于生物安全柜中在室温下敞口反应30min，取0.2ml反应液于96孔板中用酶标仪在550nm处检测各孔的OD值。

后感染模型：24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5mL待测乳杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的待测菌，加入0.5mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测乳杆菌处理的AGS细胞为HP模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测乳杆菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后用PBS洗3次，再加入0.3mL尿素酶试剂，于生物安全柜中在室温下敞口反应30min，取0.2ml反应液于96孔板中用酶标仪在550nm处检测各孔的OD值，测定。

实验组黏附率计算公式为：

HP模型组黏附率计算以HP模型组OD值减去空白组OD值为100％。

结果如图7所示。

结果表示，戊糖片球菌A21358具有降低幽门螺杆菌对AGS细胞黏附率的作用。经戊糖片球菌A21358处理后，幽门螺杆菌对AGS细胞的黏附率从模型组(Hp组)的100％下降到约76％。

实施例7戊糖片球菌A21358对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后的IL-8表达的影响

AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为1×10⁵个细胞/孔，以F12K+10％胎牛血清为培养基，培养过夜贴壁。

幽门螺杆菌和乳杆菌菌悬液按照实施例6的步骤(2)和步骤(3)进行。

孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5mL幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。

培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.5mL待测乳杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养24h。

培养结束后收集细胞培养液，在4℃以4000rpm离心10min，收集上清液。上清液根据ELISA试剂盒(购自上海江莱生物公司)提供的方法进行IL-8含量检测。

以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白对照组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为HP模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组，计算各组IL-8浓度。

结果如图8所示。

结果表明，经戊糖片球菌A21358处理后，感染幽门螺杆菌的AGS细胞的IL-8表达量明显减少，抑制率约49％。说明戊糖片球菌A21358可有效降低经幽门螺杆菌感染的AGS细胞中IL-8的表达。

实施例8戊糖片球菌A21358对经幽门螺杆菌感染AGS细胞后的IL-10表达的影响

按照实施例7的方法获得细胞上清液。上清液根据ELISA试剂盒(购自江苏酶免生物公司)提供的方法进行IL-10含量检测。

以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白对照组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为HP模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组，计算各组IL-10浓度。

结果如图9所示。

结果表明，经戊糖片球菌A21358处理后，感染幽门螺杆菌的AGS细胞的IL-10表达量明显高于模型组，且相对于模型组相比升高了约173％。说明戊糖片球菌A21358可有效增加经幽门螺杆菌感染的AGS细胞中IL-10的表达。

实施例9戊糖片球菌A21358对感染幽门螺杆菌小鼠胃组织匀浆物尿素酶活力的影响

具体步骤如下：

使用C57小鼠，6-8周龄，体重18-20g，0-7d进行适应性喂养，7-14d用戊糖片球菌A21358菌液(1010CFU/ml)对小鼠进行灌胃，再灌胃5d幽门螺杆菌菌液(109CFU/ml)5d进行造模，然后再分别灌胃戊糖片球菌A21358至第46d，取得胃组织匀浆物后在4℃以4000rpm离心10min，获得上清液。最后测定胃组织尿素酶活性。其结果如图10所示。

以市售植物乳杆菌CN2018作为阳性对照。

表9戊糖片球菌A21358对小鼠胃组织匀浆物尿素酶活性的影响

试验结果表明，本发明的戊糖片球菌A21358可以降低小鼠体内尿素酶活性，且效果优于阳性对照。相对于模型组(100％)，经A21358处理后小鼠胃组织匀浆物的尿素酶活力降低了约32％。

实施例10戊糖片球菌A21358对感染幽门螺杆菌小鼠胃组织匀浆物IL-10表达的影响

按照实施例9的步骤获得小鼠胃组织匀浆物上清液，上清液根据ELISA试剂盒(购自江苏酶免生物公司)提供的方法进行IL-10含量检测。

结果如图11所示。

从图可以看出，戊糖片球菌A21358和阳性对照菌株均能够提高小鼠胃组织匀浆物中的IL-10表达量，其中戊糖片球菌A21358效果最佳，相对于模型组(100％)提高了约37％。

Claims (2)

1.一株具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）A21358，其特征在于，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO：63040。

2.权利要求1所述具有抗幽门螺杆菌作用的戊糖片球菌A21358在制备治疗幽门螺旋杆菌感染药物上的应用。