CN104195093A - 一种唾液乳杆菌及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离自人胃粘膜的可用于防治由幽门螺杆菌引起的胃病的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，其保藏号为：CGMCC No.8379。本发明还提供了用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其活性成分包括所述唾液乳杆菌。此外，本发明还提供了一种用于抑制幽门螺杆菌的制品，其活性成分包括所述唾液乳杆菌。本发明还证实了筛选出的所述唾液乳杆菌不仅能很好的适应人胃环境，具有很强的抗幽门螺杆菌生长、粘附、定值的能力，同时还能显著降低小鼠胃组织中由幽门螺杆菌引起的炎症。

Description

一种唾液乳杆菌及其制药用途

技术领域

本发明属于微生物生物技术领域，特别涉及一种分离自人胃粘膜的可用于防治由幽门螺杆菌引起的胃病的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏染色阴性、单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的微需氧细菌。研究表明，它是慢性胃炎、十二指肠炎、消化性溃疡的主要致病因素，也是胃癌的主要诱发因子，世界卫生组织已经将其列为I类致癌物质。H.pylori在全球的感染率多达50％，发展中国家高达90％。所以防治H.pylori感染对保护人类健康具有重要的临床意义。

H.pylori相关疾病的治疗策略是将其清除，从一种或多种抗生素联合杀菌发展为抗生素与质子泵抑制剂、胃粘膜保护剂合用。这些措施曾一度取得有效的疗效，H.pylori的根除率也能达到60％-90％。但随着治疗的深入，人们发现它们只在疾病早期效果显著，对再次感染者的疗效差，并且停药后会复发，对不同个体间的疗效存在差异。长期治疗会产生疗效不稳定，菌株抗生素耐药，药物副作用，患者依从性差等负面效应。

面对上述问题，人们不得不寻找新的治疗途径，例如研发H.pylori相关疫苗和微生态制剂，以彻底清除H.pylori。乳杆菌是人体胃内的重要菌群，在调节胃内微生态平衡和抵御致病菌的侵犯中起到主要作用，并且越来越多的乳杆菌被证实可发挥益生菌的功能。它们被应用到基础研究领域中治疗肥胖，肝脏损伤，胃炎，肠炎等疾病。目前围绕着乳杆菌与H.pylori相互作用的研究很多，Yoon JH等报道利用乳杆菌抗H.pylori的效应，并联合二联或三联疗法可根除H.pylori；Rokka S等和Lorca GL等均发现小鼠模型中加氏乳杆菌能有效降低H.pylori的定植及其对胃粘膜的炎症损伤。程胜平等利用复方嗜酸乳杆菌片联合四联疗法治疗H.pylori阳性的消化性溃疡疗效显著，且不良反应少。但这些乳杆菌并不是从人胃中分离得到的，同时没有验证其能否适应人胃环境，这使开发益生乳杆菌在人胃中发挥抗幽门螺杆菌感染、定值和所致炎症的效果受到影响。

发明内容

本发明基于上述领域的空白，对从人胃粘膜分离出的6株乳杆菌(Bacterium lacticum)菌株分别进行了体外耐胃环境测试及体外和体内抗幽门螺杆菌功能的验证，最终筛选出一株唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius)，该菌株于2013年10月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.8379。本发明证实了所述唾液乳杆菌菌株能在pH2.5和0.2％胆盐条件下生长，并能在体外抑制幽门螺杆菌生长和粘附GES-1细胞。同时，本发明还发现所述唾液乳杆菌菌株在无菌昆明小鼠模型中能降低幽门螺杆菌定值并缓解其导致的炎症。

本发明的技术方案如下：

一种唾液乳杆菌菌株，其保藏号为：CGMCC No.8379。

用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述唾液乳杆菌菌株。

用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述唾液乳杆菌菌株。

所述制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。

用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述唾液乳杆菌菌株。

用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述唾液乳杆菌菌株。

所述制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。

所述唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述的唾液乳杆菌菌株。

所述唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的唾液乳杆菌菌株。

本发明采集21例胃镜检查者的胃粘膜组织标本，经选择平板培养、分纯培养，并结合形态、生化反应鉴定以及乳杆菌16S rDNA特异性引物确认，最终获得6株乳酸杆菌菌株并分别命名为L1-L6。

本发明在同等的实验条件下，分别对分离出的6株乳杆菌菌株及标准菌株L.acidophilusATCC4356进行了耐酸能力测定，耐胆盐能力测定，牛津杯法抑菌(H.pylori)能力测定以及与H.pylori竞争性粘附GES-1细胞实验，结果发现：菌株L3在pH2.5、pH3.0时，培养4小时后其菌量增加了180％，且在pH4.0、pH4.5时，相对于其它菌株也保持稳定生长优势；在耐胆盐能力测定中，菌株L3在胆盐浓度达到0.2％时还能缓慢生长；在用牛津杯法测定上述菌株抑制幽门螺杆菌的能力的实验中，菌株L3的抑菌环直径最大；将上述各菌株分别加入含有H.pylori的GES-1细胞培养液中，测定最终幽门螺杆菌对GES-1细胞的粘附率，结果发现经菌株L3处理的培养液中幽门螺杆菌对GES-1的粘附率最低。上述实验结果充分说明菌株L3具有极好的耐胃环境的能力以及很强的抗幽门螺杆菌生长和粘附胃黏膜细胞的作用。

筛选出的这株乳杆菌菌株L3经16S rDNA特异性引物扩增比对确认为一株唾液乳杆菌，菌落形态为菌落较大，圆形突起，乳黄色，表面光滑，革兰阳性，两端圆且排列不一杆状，可发酵葡萄糖、乳糖等。所述菌株已经送保藏，其保藏信息如下：

保藏信息

菌种保藏名称：唾液乳杆菌

保藏号：CGMCC No.8379

拉丁名：Lactobacillus salivarius

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013-10-21

此外，本发明还验证了所述唾液乳杆菌CGMCC No.8379在模式生物：无菌的昆明小鼠中的抑菌和抗炎症功能。结果证实了该菌株在小鼠体内能有效抑制幽门螺杆菌的感染并能显著降低胃组织中的MPO等因子，从而改善胃粘膜局部的病例损伤达到降低胃组织炎症的功效。

本发明除提供了上述具有耐胃环境能力和抑制幽门螺杆菌作用的唾液乳杆菌CGMCCNo.8379外，还提供了以该乳杆菌作为活性成分的用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，所述制品的制备方法是本领域技术人员熟知的常规手段，例如但不限于：《一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途》(CN1663573B)，《灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法》(CN101612169B)，《一种乳酸杆菌微生态制剂的制备方法》(CN101530160A)等现有技术中公开的制备方法或操作步骤，目前市场上公开销售使用的“双歧杆菌乳杆菌三联活菌片”、“复方嗜酸乳杆菌片”的制备工艺等等。以所述唾液乳杆菌菌株CGMCC No.8379为活性成分，本领域技术人员可以按照所述常规手段和/或现有技术文献中公开的制备方法或操作步骤或目前市场上公开销售使用的产品的制备工艺，或通过合乎逻辑的分析、推理对上述制备方法进行适应性改进，可以获得用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，或者用于抑制致病性细菌的制品。

所述制品的剂型优选但不限于：片剂、胶囊剂等。

附图说明

图1为分离出的6株人胃源乳杆菌菌株的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图谱。

图2为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在不同酸环境下生长4小时后的菌量比较图谱。

图3为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在0.05％胆盐浓度下各自的生长率。

图4为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在0.1％胆盐浓度下各自的生长率。

图5为6株人胃源乳杆菌菌株和标准菌株L.acidophilus ATCC4356在0.2％胆盐浓度下各自的生长率。

图6为经唾液乳杆菌菌株CGMCC No.8379和/或幽门螺杆菌菌株H.pylori M13处理的昆明小鼠中胃组织的MPO含量检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

生物材料的来源及记载出处

21例无痛胃镜检查者胃粘膜组织标本采集自第三军医大学附属西南医院(经患者许可后获取)。无菌的昆明小鼠来自第三军医大学实验动物中心，标准菌株L.acidophilusATCC4356来自美国菌种保藏中心，幽门螺杆菌菌株H.pylori M13来自第三军医大学临床微生物学教研室。

主要试剂和耗材

MRS液体培养基(配方：称取MRS干粉55.0g至1L水中)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)，Skirrow血平板(配方：1L水中含蛋白胨15.0g，胰蛋白胨2.5g，酵母提取物5.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g；每200mL上述培养基中再加入10mL冻溶小牛血清、10％葡萄糖10mL，抗生素混悬液1mL(10μg/mL万古霉素，2500国际单位多粘菌素B，5μg/mL甲氧苄啶)，GES-1细胞培养液(含10％胎牛血清的F12培养基(上海信裕生物科技有限公司))，无菌牛津杯，细菌基因组提取试剂盒，MPO Elisa检测试剂盒。实施例1唾液乳杆菌CGMCC No.8379的分离与功能鉴定

一、6株人胃源乳杆菌的分离

方法和步骤：

采集第三军医大学附属西南医院21例无痛胃镜检查者胃粘膜组织标本，(标本经许可后获取)，以分区划线法涂布于MRS选择性平板，37℃微需氧培养箱中培养2-5天，挑取乳白色单个菌落，革兰染色阳性的进一步分纯培养，再对生长的菌落按《伯杰斯细菌鉴定手册》进行形态和生化反应鉴定。提取经分离纯化后的细菌的基因组用乳杆菌16SrDNA特异性引物(F:5’-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3’，R:5’-ATTTCACCGCTACACATG-3’)进行PCR扩增，目的条带为344bp，纯化后测序，并在NCBI上比对该序列。结合形态、生化反应鉴定和16SrDNA结果确定菌株名称。

分离鉴定结果：

21例人胃粘膜组织经MRS琼脂平板培养后，共分离出6株乳杆菌。分离菌株在此平板上的菌落特征及镜下形态如表1，生化特性见表2。乳杆菌16SrDNA特异性引物扩增平板上单个菌落细菌DNA后，1.5％的琼脂糖凝胶电泳如图1；同时将PCR产物纯化送invitrogen公司测序，将测序结果在NCBI中进行Blast相似性比对，结合分离菌株的菌落特征及镜下形态，将上述6株乳杆菌确定为L1、L2为口腔乳杆菌，L3为唾液乳杆菌，L4为卷曲乳杆菌，L5为加氏乳杆菌，L6为德氏乳杆菌。

表1 分离菌株的菌落特征及镜下形态

表2 分离菌株的生化特性

注：+代表实验结果阳性，-代表实验结果阴性

二、人胃源乳杆菌的耐酸能力测定

方法和步骤：

配置pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的MRS液体培养基，各株乳杆菌依次接种于以上培养基，菌接种浓度为1×10⁸cfu/mL，37℃分别培养4h后取无菌MRS液体培养基作空白对照，在OD595nm下测定菌浓度。

耐酸能力测定结果：

7株乳杆菌在不同酸环境下的生长情况见图2，菌株L3在pH2.5、pH3.0时，培养4h后其菌量增加了180％，且在pH4.0、pH4.5时，相对于其它菌株也保持稳定生长优势。L2和标准菌株L.acidophilus ATCC4356也表现出一定程度的耐低酸能力。其它菌株在低pH环境时，生长优势没有上述菌株明显。

三、人胃源乳杆菌的耐胆盐能力测定

方法和步骤：

配置胆盐浓度为0.05％、0.1％、0.2％的MRS液体培养基，将各株乳杆菌依次接种于以上培养基，菌接种浓度为1×10⁸cfu/mL，37℃分别培养4h、8h、12h后，取无菌MRS液体培养基作空白对照，在OD595nm下测定菌浓度。

耐胆盐能力测定结果：

7株乳杆菌的耐胆盐结果见图3、4、5，L6和标准菌株L.acidophilus ATCC4356对胆盐不耐受，均不生长；其它菌株在0.05％胆盐浓度下均能生长，随着胆盐浓度的增加，其生长率大幅下降，当胆盐浓度达到0.2％时，只有L3菌株缓慢生长，12h后菌量增加了15％，其它菌株生长都被抑制。

四、琼脂扩散牛津杯法检测6株人胃源乳杆菌的抗幽门螺杆菌能力

方法和步骤：

取200μL1×10⁷cfu/mL的H.pylori M13菌液均匀涂布在含4％TTC的Skirrow血平板上，待无明显水滴后，每平板内等距放置无菌牛津杯，每只牛津杯内加入240μL1×10⁸cfu/mL的乳杆菌活菌液，以MRS液体培养基为阴性对照，并做2次平行试验。37℃微需氧孵箱中培养血平板48h，测量抑菌环直径。

检测结果：

7株乳杆菌上清液对H.pylori生长的抑菌环直径详见表3。结果显示，7株乳杆菌对H.pylori均有一定程度的抑菌作用，其中L3的抑菌环直径最大。

表3 乳杆菌上清液抑制幽门螺杆菌抑菌环直径

五、人胃源乳杆菌抑制幽门螺杆菌粘附胃粘膜上皮细胞的能力测定

方法和步骤：

根据乳杆菌与幽门螺杆菌加入的先后顺序，将实验分为2组：H-L组(先加幽门螺杆菌(H.pylori M13)后加乳杆菌)；L-H组(先加乳杆菌后加幽门螺杆菌)；H或L单菌加入孵育1h后，PBS洗3次，再加入另一菌L或H孵育1h，PBS洗3次。取100μL1×10⁵个/mL的GES-1细胞加入96孔板中培养2d使其单层铺布，PBS洗3次后备用。将100μl的幽门螺杆菌或乳杆菌液加入上述平板中(菌杆菌浓度为1×10⁸cfu/mL，幽门螺杆菌浓度为1×10⁷cfu/mL)，孵育2h，后每孔中加入100μl脲酶试剂在37℃培养箱内反应30min取出，酶标仪上检测OD_540nm值，以GES-1细胞孔中只含H.pylori为阳性对照，最后以粘附计算公式计算粘附率：

H.pylori粘附率＝OD实验/OD阳性对照

检测结果：

将乳杆菌加入H.pylori与GES-1细胞培养液后，H.pylori粘附GES-1细胞的能力均有不同程度的下降，H.pylori粘附率如表4，不加乳杆菌时H.pylori的粘附率为100％。7株乳杆菌中，经L3处理后，H.pylori的粘附率均为最低，说明L3有最强的抗粘附效果。

表4 乳杆菌处理后H.pylori对GES-1细胞粘附率

综上所述，本发明通过对21例人胃粘膜组织进行分离培养，筛选出了6株乳杆菌，对这6株人胃源乳杆菌进行体外耐酸、耐胆盐、抑菌环、粘附率实验，筛选到了一株耐胃环境强并具有抗幽门螺杆菌生长和粘附的乳杆菌，它是唾液乳杆菌，并将该菌株送保藏。

保藏信息如下：

菌种保藏名称：唾液乳杆菌

保藏号：CGMCC No.8379

拉丁名：Lactobacillus salivarius

保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013-10-21。

实施例2唾液乳杆菌CGMCC No.8379在模式生物昆明小鼠中的抗菌功能验证

一、无菌昆明小鼠中唾液乳杆菌CGMCC No.8379抗H.pylori的定量检测

方法和步骤：

将32只无菌昆明小鼠分成4组，每组8只，H组(只灌胃H.pylori M13)、L组(只灌唾液乳杆菌CGMCC No.8379)、HL组(先灌胃H.pylori M13后灌唾液乳杆菌CGMCC No.8379)、LH组(先灌唾液乳杆菌CGMCC No.8379后灌胃H.pylori M13)。以0.5mL1×10⁹cfu/ml的菌液对无菌昆明小鼠进行灌胃，一天2次，灌胃2天，末次灌胃2h后恢复给食给水。在双悉生模型中，灌胃第一种菌后4周，再灌胃第二种菌，第二种菌灌胃4周后脱臼处死昆明小鼠；在单悉生模型中，灌胃菌后8w脱臼处死昆明小鼠。解剖小鼠依次取出胃，清除残留物，称其重。其中1/4胃组织立即液氮保存用于MPO含量检测；另1/4胃组织4℃保存于1ml4％多聚甲醛溶液中用于组织切片检查；最后1/2胃组织的粘膜涂抹H.pylori选择性血平板和MRS琼脂平板各一块后置于研磨管内用于基因组提取。

将上述研磨后胃组织液12000r/min离心5min后弃上清，取沉淀按细菌基因组提取试剂盒操作说明书抽提细菌基因组。定量PCR检测引物为：乳杆菌Lsp-F：

TGGAAACAGATGCTAATACCG，Lsp-R：CGTCCATTGTGGTAGAT-

TCCCT；H.pylori–F:TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC，H.pylori-R：

CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC。探针为：乳杆菌探针Lsp–probe：FAM-

CTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGG-Eclipse；H.pylori–probe：FAM-

CGTGCCAGCAGCCGCGGT-TAMRA，每个样本均做复孔。反应条件预变性95℃预变性30s，40个循环95℃变性5s，60℃延伸30s。按标准曲线计算出每样本的每克组织中所含细菌的拷贝数。

检测结果：

单悉生H组胃内H.pylori菌量达10⁷copies/g(表5)，在LH和HL组中，由于唾液乳杆菌CGMCC No.8379的存在，H.pylori的定值量都下降了一个数量级，这说明唾液乳杆菌CGMCC No.8379对H.pylori在小鼠体内有明显的抑制作用。在LH和HL组中，H.pylori感染后服用乳杆菌，HL组中的H.pylori定值量比LH组低3倍。

表5 荧光定量PCR检测唾液乳杆菌和H.pylori定量值

二、无菌昆明小鼠中CGMCC No.8379抗H.pylori炎症胃组织MPO含量检测

方法和步骤：

采用双抗体一步夹心ELISA法，液氮中取出标本液化，加入瓷珠研磨，悬液转移至干净无菌EP管，3000r/min离心20min后取上清备用。按小鼠髓过氧化物酶(MPO)Elisa检测试剂盒说明书检测胃组织MPO含量。

检测结果：

通过检测胃组织中MPO含量来分析唾液乳杆菌在体内抗H.pylori导致的炎症情况。其胃组织中的MPO含量如图6，H组中MPO含量是LH组和HL组的1.2倍和1.4倍。综上，说明唾液乳杆菌通过降低胃组织中MPO等因子，改善了胃粘膜局部的病理损伤，从而降低了胃组织的炎症。

上述小鼠试验证实了，本发明所述的唾液乳杆菌菌株CGMCC No.8379能显著降低小鼠胃组织中的幽门螺杆菌定值，并能有效缓解由幽门螺杆菌引起的胃组织炎症。

Claims (9)

1.一种唾液乳杆菌菌株，其保藏号为：CGMCC No.8379。

2.用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。

3.用于预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。

4.根据权利要求2或3所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。

5.用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。

6.用于抑制幽门螺杆菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。

7.根据权利要求5或6所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。

8.权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。

9.权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备预防和/或治疗由幽门螺杆菌引起的胃病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的唾液乳杆菌菌株。