CN113736683A - 一株抑制幽门螺杆菌的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株新筛选的嗜热链球菌菌株及其在预防或治疗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染方面的应用，属于应用微生物技术领域。该嗜热链球菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年7月6日，保藏编号为CGMCCNo.20189。将其与嗜酸乳杆菌混合培养，并通过牛津杯法进行H.pylori体外抑菌实验，抑菌效果判定为高度敏感，对H.pylori有明显抑菌效果，为开发抑制幽门螺杆菌的酸奶和保健品提供了菌种和研究基础。

Description

一株抑制幽门螺杆菌的嗜热链球菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株新筛选的嗜热链球菌菌株及其在预防或治疗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染方面的应用，属于应用微生物技术领域。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种定植于人类胃黏膜表面的微需氧革兰阴性螺旋杆菌，于1983年被首次报道。幽门螺杆菌作为世界上最常见的感染菌之一，超过半数以上的人口为既往感染。其中慢性幽门螺杆菌感染是公认的导致胃癌最严重的危险因素之一，幽门螺杆菌感染也是慢性胃炎的主要病因。1994年，H.pylori被世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)列为胃癌的Ⅰ类致癌原。
随着人们对相关疾病的关注，幽门螺杆菌的感染和防治逐渐成为科研人员研究的热点。有多种方法可以减轻感染H.pylori的风险，在众多的预防措施中，根除幽门螺杆菌是预防胃癌最有效的方法。H.pylori感染的治疗包括三联疗法、四联疗法、序贯疗法、中药或中西医结合辅助治疗及混合益生菌的治疗等。幽门螺杆菌治疗在临床上获得了较大进展，但因为抗生素的广泛应用、部分耐药菌株持续产生，加上吸烟、饮酒和口腔疾病等，根除幽门螺杆菌面临较大难度，所以，探究有效的治疗方案及抗生素的合理应用成为目前研究的新问题，同时，新的思路如微生物制剂、中医中药和疫苗等的使用也为进一步探寻新的治疗方案提供了曙光和支持。
益生菌是一类通过定植于宿主肠道，改善肠道微生态平衡，对宿主健康发挥有益作用的微生物的总称。研究发现益生菌不但可调节肠道菌群，治疗相关的不良反应，还可以提高H.pylori治疗效果、改善胃组织病理。
益生菌联合三联、四联药物和序贯疗法，是目前治疗H.pylori的一种新型方案。用于临床的益生菌种类最常用的有乳酸菌(如嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌等)、芽孢杆菌和酵母菌等。其中乳酸菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业，被公认为安全的食品级微生物。研究表明，乳酸菌在体外具有抑制H.pylori的作用，能够提高H.pylori的根除率，减少不良反应，起到辅助治疗H.pylori的目的。将益生菌添加到标准的三联或序贯疗法中治疗H.pylori，可以提高H.pylori去除率约10％。
乳酸菌有两大特性：一、具有耐酸、耐胆盐的特性，其活菌在胃肠道中可以粘附或是短暂停留以发挥益生功能；二、具有某些特定的益生功能，如调节胃肠道菌群平衡、提供机体免疫功能或是抑制病原菌功能等。用于替代或辅助三联、四联药物和序贯疗法治疗H.pylori感染有很大优势。
大量研究表明：乳酸菌对减少H.pylori感染具有重要作用。1999年Michetti P等人研究了嗜酸乳杆菌(约氏)培养上清液对人类感染幽门螺杆菌的影响。体外试验证明：约氏乳杆菌La1培养上清液在体外对幽门螺杆菌具有部分地、与酸无关的和长期的抑制作用；2003年Gotteland和Cruchet等报道：定期摄入含约氏乳杆菌的酸奶能调节感染儿童体内的幽门螺杆菌定植，同年有人报道经常摄入约氏乳杆菌对无症状志愿者幽门螺杆菌定植的抑制作用；2008年，Gotteland等报道蔓越莓汁和约氏乳杆菌La1对调节儿童幽门螺杆菌定植都有作用，但两者没有协同作用；2012年Pei-Shan Hsieh等人发现约氏乳杆菌MH-68和唾液乳杆菌AP-32能有效抑制幽门螺杆菌，用于益生菌时，他们可协助降低胃炎的发病率，甚至减少幽门螺杆菌感染。有研究指出，给H.pylori患者服用复合嗜乳酸杆菌后发现H.pylori值持续降低。2016年河北北方学院附属第一医院杜三军报道：改良序贯疗法混合双歧四联活菌或复方嗜酸乳杆菌均可提高单纯改良序贯疗法的H.pylori根除率，减少不良反应。2017年日本东海大学Aiba等人发现约氏乳杆菌No.1088具有抗菌活性，可以抗幽门螺杆菌和抑制小鼠的胃酸分泌。他们认为这个菌株是一种独特的乳酸杆菌，有利于用三联疗法根除幽门螺杆菌，包括使用质子泵抑制剂(PPI)和预防胃食管反流。还可能有益于治疗由于使用PPI治疗幽门螺杆菌感染导致的胃食管反流。目前未见二联培养乳酸菌抗H.pylori的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一株抑制幽门螺杆菌的嗜热链球菌株，该菌株与嗜酸乳杆菌混合培养，实现了二联培养乳酸菌抗H.pylori，为开发抑制幽门螺杆菌的酸奶和保健品提供了菌种和研究基础。
为实现本发明目的，本发明具体技术方案如下：
本发明首先筛选出一株新菌株--嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年7月6日，保藏编号为CGMCC No.20189，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。然后将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST混合培养应用于抗H.pylori。
所述应用方法为：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST混合发酵培养，将获得的发酵液接种至放置于含幽门螺杆菌的平板上的牛津杯中，于37℃微需氧培养以验证抑制幽门螺杆菌生长的效果。
进一步，所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST发酵液浓度为1×108cfu/mL。
进一步，所述发酵液按如下方法制备：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST一起接种至MRS培养基，在37℃静置发酵培养36～48h；所述MRS培养基组成：蛋白胨5.0～15.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、牛肉膏5.0～15.0g/L、酵母膏3.0～8.0g/L、乙酸钠3.0～8.0g/L、磷酸氢二钾1.0～3.0g/L、柠檬酸铁铵1.0～3.0g/L、硫酸镁0.1～0.3g/L、硫酸锰0.02～0.08g/L、吐温800.5～1.5g/L，溶剂为去离子水，pH值6.2～6.5。
进一步，所述发酵液种子按如下方法制备：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST接种至斜面培养基，于37℃静置培养36～48h以获得斜面菌体；所述斜面培养基质量终浓度组成为：蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖1.5～2.5％、牛肉膏0.5～1.5％、酵母膏0.2～0.8％、乙酸钠0.2～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.3％、柠檬酸铁铵0.1～0.3％、硫酸镁0.01～0.03％、硫酸锰0.002～0.008％、吐温800.05～0.15％、琼脂1.0～2.5％，溶剂为蒸馏水，pH值6.2～6.5；再将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃静置培养36～48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨0.5～1.5％、葡萄糖1.5～2.5％、牛肉膏0.5～1.5％、酵母膏0.2～0.8％、乙酸钠0.2～0.8％、磷酸氢二钾0.1～0.3％、柠檬酸铁铵0.1～0.3％、硫酸镁0.01～0.03％、硫酸锰0.002～0.008％、吐温800.05～0.15％，溶剂为蒸馏水，pH值6.2～6.5。
进一步，所述幽门螺杆菌浓度为1×107cfu/mL，本发明所述幽门螺杆菌为本实验室保藏的菌株。
本发明所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST体外抑制幽门螺杆菌过程中，可以通过牛津杯法对所筛选到的候选菌株培养液及培养48h的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST混合培养发酵液进行抑菌活性测试。根据抑菌圈直径大小，评价抑菌效果(用空白MRS培养基做空白对照)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
利用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ST混合培养产物抑制H.pylori，体外抑菌实验达到高度敏感程度，为开发抑制幽门螺杆菌的酸奶和保健品提供菌种和研究基础。并首次发现这两株乳酸菌混合培养液抗H.pylori的效果优于各自单菌培养液的效果，说明它们具有协同作用。填补了二联培养乳酸菌抗H.pylori的空白。
附图说明
图1为6株菌株的生长曲线；
图2为6株乳酸菌发酵的产酸曲线；
图3为6株菌株耐酸性结果；
图4为16S rRNA基因的PCR扩增结果；
图5为基于16S rRNA序列构建的系统发育树；图A为嗜酸乳杆菌LA(Lactobacillusacidophilus)，图B为嗜热链球菌ST(Streptococcus thermophilus)；
图6为温度对2株菌株生长的影响；
图7为pH对2株菌株生长的影响；
图8为接种量对2株菌株生长的影响；
图9为接种种龄对2株菌株生长的影响；
图10为装液系数对2株菌株生长的影响；
图11为培养时间对2株菌株生长的影响。
具体实施方式
为对本发明进行更好的说明，特举实施例如下，但本发明的保护范围不限于此，以下若没有特别说明均为重量百分比或体积百分比。
MRS培养基组成：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸铁铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温801g/L，溶剂为去离子水，pH值6.2～6.5。
0.5％碳酸钙—MRS固体培养基组成：蛋白胨10.0g/L、葡萄糖20.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸铁铵2.0g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温801.0g/L，碳酸钙5.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
H.pylori液体培养基组成：
Figure BDA0003110312100000071
蛋白胨10.0g/L，牛脑浸出粉10.0g/L，牛心浸出粉9.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖2.0g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，7％羊血，万古霉素100.0μg/mL，两性霉素B 50.0μg/mL，甲氧苄啶50.0μg/mL，溶剂为去离子水，pH值7.4±0.2。
H.pylori琼脂培养基组成：
Figure BDA0003110312100000072
蛋白胨10.0g/L，牛脑浸出粉10.0g/L，牛心浸出粉9.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖2.0g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，7％羊血，万古霉素100.0μg/mL，两性霉素B 50.0μg/mL，甲氧苄啶50.0μg/mL，琼脂20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值7.4±0.2。
实施例1 菌种的筛选及生物学特性探究
1、菌株筛选
从河南省郑州市某超市酸菜中抽取样本10份，每份100.0g，取酸菜样本5.0～10.0g，加入盛有20.0mL蒸馏水的50.0mL离心管中，室温振荡过夜。取培养液1.0mL，用无菌水做10倍梯度稀释，至10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，每个梯度取0.1mL均匀涂布于MRS平板中，于37℃培养箱中培养48h；选取合适梯度生长平板挑取菌落形态特征不同的菌落，经过两次划线分离纯化，获得10株初筛菌株R1-R10。
将初筛获得的菌株接种于0.5％碳酸钙—MRS固体培养基，在37℃培养箱中培养48h；选取具有明显融钙圈的菌落，对其进行3次平板划线纯化分离培养，获得6株复筛菌株。
表1 10株菌株产生融钙圈的情况
Figure BDA0003110312100000081
注：+：有融钙圈，－：无融钙圈。
由上表得知：从发酵酸菜中分离的10株菌株中有6株菌株能溶解CaCO3产生融钙圈。
2、生物学特性探究
(1)生长曲线
6株菌株经活化后接种于液体MRS培养基中，在37℃静置培养60h，每间隔2h取样，检测其发酵液的OD600nm，记录并制作菌株生长曲线。
6株菌株的生长曲线见图1，可知菌株R1-R3具体相似的生长曲线，而菌株R7-R9也具体相似的生长曲线，但大体生长情况相同。在0h～4h适应期生长缓慢，在4h后迅速进入对数生长期，生长迅速，新陈代谢加快，在16h后进入稳定期，生长速度变慢，菌体密度基本稳定，但到48h时，菌体浓度达到最高，而且培养液中的次级代谢产物浓度也达到峰值，若继续培养时间过长，菌体浓度会逐渐减少；48h稳定期结束开始进入衰退期，菌体开始自溶出现死亡现象。故选用48h作为培养结束时间。另外，从生长曲线可以看出：菌株R1-R3对数期具有较快的增殖速率，但到稳定期的最终菌浓度比R7-R9稍低。
(2)菌株产酸能力测定
将6株待测菌液按4％接种量分别接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃静置培养48h。移取27mL MRS液体培养基于离心管中，向各管中移取3mL活化后的菌液，此步骤重复5次，得到5支混有菌液培养基的离心管。将离心管置于37℃静置培养，每隔12h取样，取样点分别为0h、12h、24h、36h、48h，用精密pH计测定其pH值，筛选出产酸能力最强的菌株。
由图2可知：R2、R3和R8菌株在发酵初期产酸速率较慢，pH变化不明显；而R1、R7和R93株菌株在发酵初期产酸速率最快，pH变化明显。在12h后，6株菌株pH下降均较快，产酸速率加快；在24h后pH变化基本稳定，48h达到较低，可用作对比菌株产酸能力大小。发酵结束发现R1、R7和R93个菌株的产酸能力较另外3株强。
(3)菌株耐酸性
用2mol/L的HCl溶液，分别将3组MRS液体培养基的pH调节至2.0、3.0和4.0，pH为6.2的MRS培养基作为对照组，通过测定活菌数对6个菌株的耐酸性进行探究。因每株菌之间得到的活菌数差异悬殊，为易比较且得出准确的实验结果，将活菌数等量替换成菌株存活率来表示，其耐酸性能结果如图3(本部分实验所有菌株的对照存活率均为100％，故图中没有作出)。
由图3得：在pH为2的酸性较强的情况下6株菌株的存活率仍有40％～75％，因此6株菌株均可以耐受低pH环境，说明他们的耐酸性能均较好。
(4)体外抑菌性能
选用实验室保藏的标准菌株E.coli(ATCC25922)、S.aureus(ATCC29213)和H.pylori(实验室保藏)为指示菌(调整浓度为1×107cfu/mL)，将复筛获得的6株菌株(调整浓度为1×108cfu/mL)作为供试菌株。选用牛津杯法对培养48h的发酵液进行抑菌活性测试。根据抑菌圈直径大小，评价其抑菌效果(用空白MRS培养基做空白对照)。
表2 6株乳酸菌发酵液对指示菌的抑菌实验结果
Figure BDA0003110312100000101
注：抑菌圈直径4mm判定为不敏感；抑菌圈直径5～10mm判定为低度敏感；抑菌圈直径11～15mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感。
抑菌结果表明(表2)：6株乳酸菌发酵48h只能产生抑制革兰氏阳性菌S.aureus和H.pylori，不能产生具有抑制革兰氏阴性菌E.coli的次生代谢物，其中R1和R9抑菌效果明显，抑制S.aureus和H.pylori的抑菌圈直径分别超过15mm和10mm。乳酸菌能够产生抑菌次生代谢产物如细菌素、有机酸、酒精和二氧化碳等，在有氧的条件下乳酸菌还可产生过氧化氢，由于乳酸菌缺乏过氧化氢酶，过氧化氢的蓄积可对一些微生物如S.aureus产生抑制作用。
实施例2 菌株鉴定
(1)菌落特征
菌株R1的细胞形态为：长杆状，较细，菌落较小(直径约0.5mm)，乳白色，凸起，表面粗糙，边缘卷曲。
菌株R9的细胞形态为：呈球状，排列成长短不等的链状，菌落呈灰白色，表面光滑，边缘整齐，菌落大小为8mm左右。
根据菌落特征的显微镜观察结果判断R1和R9均为细菌。
(2)分子特征
将R1和R9菌株的单菌落37℃培养过夜，取新鲜发酵液进行DNA提取和PCR反应。
PCR引物选用16S rRNA通用引物27F和1492R(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3')。PCR反应体系由无菌H2O 22μL、PCR Mix 25μL、上下游引物各1μL及Template 1μL配制成50μL反应液；按照96℃预变性2min；96℃变性10s，50℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸7min设置PCR反应条件。
反应完成后，将电泳缓冲液(1×TAE buffer)倒入电泳槽中，放入1％琼脂糖凝胶块，使电泳缓冲液没过凝胶块；加入样品和Trans 2K Plus II DNA Marker 4μL，设置电压140V，时间15min；电泳结束后，取出胶块，通过自动对焦凝胶成像分析仪观察目的条带，结果符合要求的PCR原液送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。
将目的基因测序结果提交至NCBI GeneBank数据库进行比对分析，并借助MEGA8.5软件，将目的基因序列与相关序列进行序列比对，最后用Neighthot-Joining法构建系统发育树。
从图4中可观察到在1600bp左右处有一明亮的特征条带(细菌16S rRNA平均大小为1540bp)，表明扩增16S rRNA成功。
将测序结果进行Blast分析，结果为：菌株R1和R9分别与GenBank数据库中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的同源性达100％。
选取合适的序列，使用MEGA 8.5中Neighbor-Joining Tree构建发育树，如图5。通过对系统发育树分析表明，菌株R1和R9与Lactobacillus和Streptococcus属在同一个分支，综合形态学特征和分子生物学鉴定结果，确定分离得到的菌株R1和R9分别是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
实施例3 培养条件优化
在250mL锥形瓶中装入40％体积MRS培养基，调节初始pH至6.2～6.5；灭菌、冷却后接入4％嗜酸乳杆菌LA(R1)或4％嗜热链球菌ST(R9)种子，37℃静置培养48h后使用系列稀释倾注法检测活菌数。
(1)培养温度选择33℃、35℃、37℃、39℃和41℃，考察培养温度对发酵的影响，结果如图6所示。由图6可以看出，温度对混合发酵中菌株生长的影响较大，当温度在33℃～37℃范围内，随着温度升高，LA和ST活菌数均逐渐增加，在37℃时，活菌数均达到最高，分别为0.26×109cfu/mL和0.97×109cfu/mL，温度高于37℃，活菌数明显下降。故37℃为菌株生长最适温度。
(2)改变培养基初始pH分别为5.2、5.7、6.2、6.7和7.2，考察pH对发酵的影响，由图7中的结果可以看出：初始pH在5.2～6.2范围内，随着初始pH升高，LA和ST活菌数逐渐增加，当初始pH在6.2时活菌数达到最高，说明pH较低或较高都不利于菌株的生长。故发酵的最适初始pH为6.2。
(3)改变接种量，考察不同接种量对发酵的影响。本发明LA和ST的接种量按照2％、4％、6％、8％和10％5种不同的比例接入MRS培养基中，结果如图8所示。由结果可以明显看出随着接种量的增加，当接种量为4％时培养情况最理想，而此时继续增加接种量活菌数不再增加，反而下降明显，因此最佳接种量为4％。
(4)根据生长曲线分别选择对数生长期12h、稳定期前期24h、稳定期中期36h和稳定期后期48h的菌液进行接种，考察接种种龄对发酵的影响，从图9结果可以看出，发酵液培养到稳定期中期36h时，作为种子进行接种所得到的活菌数均为最高。对数期和稳定期前、后期的种子液培养情况与稳定期中期相比逊色不少，而稳定期中期的种子液培养情况较好，探究其原因可能是稳定期中期菌体仍保持较高活力且菌体数量足够多。
(5)改变装液系数分别为20％、30％、40％、50％和60％，考察装液系数对发酵的影响。由图10可以看出，装液系数为40％时，本发明LA和ST的活菌数均达到最高。过多过少装液系数都不利于菌株生长，说明这两个菌株为微需氧微生物。本实验选择装液系数为40％作为发酵的最适装液系数，在此装液系数下不仅能够获得较高的活菌数，也有利于降低成本。
(6)通过改变培养时间为24h、36h、48h、60h和72h，考察培养时间对发酵的影响。由图11看出，培养时间24～48h时，本发明LA和ST的活菌数呈上升趋势，48h达到最高，而且培养液中的次级代谢产物浓度也达到峰值，继续培养至72h活菌数明显下降。时间过短或过长都不利于菌株生长，可能与菌株的生命周期有关。所以本实验选择48h作为发酵的最适培养时间，在此时间下能够获得较高的活菌数，培养液中次级代谢产物浓度达到峰值，也有利于降低培养成本。
(7)通过单因素实验确定了最佳培养温度、初始pH、接种量、接种种龄、装液系数和培养时间后，再选取影响乳酸菌活菌数的主要因素：培养温度、初始pH和接种量为正交实验因素，通过设计正交实验各设立3个水平，来进一步研究其最佳培养条件。用SPSS 20.0软件设计L9(33)正交表(表3)，以乳酸菌活菌数为实验指标，通过对实验结果的极差分析(表4)确定两株乳酸菌最适发酵条件。
表3正交试验因素水平表
Figure BDA0003110312100000141
Figure BDA0003110312100000151
表4各菌株最佳培养条件的L9(33)正交实验结果分析表
Figure BDA0003110312100000152
根据表4所示，由极差分析可知，各因素对本发明LA和ST活菌数影响的强弱顺序为A＞C＞B，即LA和ST的培养温度影响最大，其次是接种量，最后是pH。通过比较K值大小可得各菌株最佳培养条件为：A2C2B2，即培养温度37℃、接种量4％、pH 6.2时发酵液中活菌数最多，因此确定该条件为最佳培养条件。
实施例4 二联复合乳酸菌体外抗H.pylori实验
(1)菌种复苏、活化和培养
H.pylori：将H.pylori在含7％羊血、万古霉素100.0μg/mL、两性霉素B 50.0μg/mL、甲氧苄啶50.0μg/mL的H.pylori培养基琼脂平板上划线接种，于微需氧条件(85％N2，10％CO2，5％O2)下37℃培养72h复苏。经活化2代后，在H.pylori琼脂培养基平板上涂布，37℃培养72h后将菌体用H.pylori液体培养基冲下制成菌悬液，调整浓度为1×107cfu/mL。
发酵液A：LA和ST混合培养的二联复合乳酸菌发酵液。将本发明二联复合乳酸菌按4％接种量(LA和ST接种比例为1：1)在装液量40％(250mL锥形瓶)和初始pH 6.2的MRS液体培养基中37℃静置培养48h，调整发酵液浓度为1×109cfu/mL。
发酵液B：乳酸菌LA和ST单菌培养完成后，再按照1:1的菌液混合比例得到的混合发酵液，调整发酵液浓度为1×109cfu/mL。
(2)实验操作
先将H.pylori(浓度为1×107cfu/mL)涂布在营养琼脂平板上，再将牛津杯放置在平板上30min，最后分别各取0.2mL的发酵液A和发酵液B加入相应牛津杯中，置于37℃微需氧条件下培养72h，观察并记录抑菌圈大小(表5)，用空白MRS培养基做空白对照。
表5二联复合乳酸菌体外抗H.pylori实验结果
Figure BDA0003110312100000161
Figure BDA0003110312100000171
注：抑菌圈直径4mm判定为不敏感；抑菌圈直径5～10mm判定为低度敏感；抑菌圈直径11～15mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感。
由上表得：发酵液A的抑菌圈直径达到20mm，抑菌效果判定为高度敏感。其抑菌效果均比发酵液B及单菌株效果明显(2株单菌株抑菌圈直径分别为11mm和13mm)，说明本发明得到的菌株LA和ST对H.pylori具有明显的协同抑菌效果。

Claims (5)

1.一株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年7月6日，保藏编号为CGMCCNo.20189，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST的应用，其特征在于，将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ST混合培养应用于预防或治疗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染。
3.如权利要求2所述的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST的应用，其特征在于，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ST培养条件分别为：培养温度33～41℃，初始pH 5.2～7.2，接种量2～10％，接种种龄12～48h，装液系数20％～60％，培养时间24～72h。
4.如权利要求3所述的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST的应用，其特征在于，培养温度30～37℃，接种量4％，pH 6.2。
5.嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ST在乳制品及保健品中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231449A (zh) * 2021-12-09 2022-03-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN115261251A (zh) * 2022-05-06 2022-11-01 河北一然生物科技股份有限公司 嗜热链球菌s869及其在调节免疫和调节肠道功能中的应用
CN115386523A (zh) * 2022-09-30 2022-11-25 北京诺安百汇医药科技有限公司 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用
CN116103197A (zh) * 2022-12-19 2023-05-12 威凯海思(山东)生物工程有限公司 一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200409597A (en) * 2002-12-02 2004-06-16 Uni President Entpr Corp A yogurt formula capable of inhibiting H. pylori
JP2008271931A (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Takeshi Aiba 新規な乳酸菌及び当該乳酸菌を使用して加工した各種製品
CN109576175A (zh) * 2018-12-06 2019-04-05 石家庄君乐宝乳业有限公司 嗜热链球菌jmcc0022、其分离纯化方法及应用
CN111118106A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la-10a及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200409597A (en) * 2002-12-02 2004-06-16 Uni President Entpr Corp A yogurt formula capable of inhibiting H. pylori
JP2008271931A (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Takeshi Aiba 新規な乳酸菌及び当該乳酸菌を使用して加工した各種製品
CN109576175A (zh) * 2018-12-06 2019-04-05 石家庄君乐宝乳业有限公司 嗜热链球菌jmcc0022、其分离纯化方法及应用
CN111118106A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一株可以抑制幽门螺旋杆菌的嗜酸乳杆菌la-10a及其应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231449A (zh) * 2021-12-09 2022-03-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN114231449B (zh) * 2021-12-09 2023-08-25 江南大学 一株具有共聚幽门螺杆菌能力的嗜酸乳杆菌及其应用
CN115261251A (zh) * 2022-05-06 2022-11-01 河北一然生物科技股份有限公司 嗜热链球菌s869及其在调节免疫和调节肠道功能中的应用
CN115386523A (zh) * 2022-09-30 2022-11-25 北京诺安百汇医药科技有限公司 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用
CN115386523B (zh) * 2022-09-30 2024-01-30 北京诺安百汇医药科技有限公司 一株乳酸乳球菌及其在抗幽门螺杆菌感染的应用
CN116103197A (zh) * 2022-12-19 2023-05-12 威凯海思(山东)生物工程有限公司 一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用
CN116103197B (zh) * 2022-12-19 2024-01-02 威凯海思(山东)生物工程有限公司 一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用

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