CN108102976B - 一种空间罗伊氏乳杆菌ss23-27及其在制备纯种益生菌酸奶中的应用 - Google Patents

一种空间罗伊氏乳杆菌ss23-27及其在制备纯种益生菌酸奶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种空间罗伊氏乳杆菌SS23‑27及其在制备纯种益生菌酸奶中的应用。本发明公开的空间罗伊氏乳杆菌SS23‑2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15153；在利用空间罗伊氏乳杆菌SS23‑27制备纯种益生菌酸奶时，将空间罗伊氏乳杆菌SS23‑27对原料乳进行发酵，即得到纯种益生菌酸奶。实验证明，利用本发明的空间罗伊氏乳杆菌SS23‑27得到的纯种益生菌酸奶，有浓郁的炒麦风味，口感细腻和润滑，酸甜度适中，酸度为65～70°T，凝乳结实，乳清析出较少，凝乳时间缩短至3～4h，填补了空间食品微生物工程菌的研究空白。

Description

一种空间罗伊氏乳杆菌SS23-27及其在制备纯种益生菌酸奶 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种空间罗伊氏乳杆菌SS23-27及其在制备纯种益生菌酸奶中的应用。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)细胞形态从短杆状、长短不等的长杆状到丝状，单生或短链状排列，革兰氏阳性耐氧或微好氧菌，于MRS培养基平板上菌落大小为1～2mm、表面光滑湿润、边缘不规则、扁平、半透明、灰白色，可进行异型乳酸发酵，能发酵葡萄糖产生乳酸、乙酸、乙醇和CO2。该菌常栖息于人和动物的肠道内，在生长代谢过程中能产生胞外多糖，使其对肠黏膜具有很强的黏附能力，拮抗肠道致病菌的定殖，可调节肠道菌群平衡，改善肠道健康，对缓解由于肠道菌群失衡导致的小儿便秘具有很好效果。此外，该菌在生长代谢过程中能利用甘油产生一种特殊的抑菌物质--罗伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羟基丙醛(3-HPA)，属于非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、李斯特菌、弧菌、梭菌、葡萄球菌、幽门螺旋杆菌等胃肠道致病菌的生长，避免罹患肠道疾病，对预防和治疗小儿腹泻效果较好。
空间微生物由于受到太空微重力效应、高真空、极端温差、弱磁场和高能粒子(电子、质子、重离子)辐射等诱变作用，可显著提高突变频率而发生基因突变，将导致其生物学性状(如个体形态、菌落特征、生理生化特性、免疫原性等)、发酵生产性能(如生物量、产物量、酶活力、效价、发酵速度等)发生改变。目前国内外学者对空间微生物的研究主要集中在空间病原菌、空间腐蚀菌和微生物制药方面，而且国内学者对罗伊氏乳杆菌酸奶的研究，也仅仅限于在嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种基础上添加罗伊氏乳杆菌研制复合益生菌酸奶。有关空间罗伊氏乳杆菌及其纯种益生菌酸奶的发酵生产方法，尚未见国内外发明专利和文献报道。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何制备罗伊氏乳杆菌纯种益生菌酸奶。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种可用于制备纯种益生菌酸奶的菌株—罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27，该菌株可简称为空间罗伊氏乳杆菌SS23-27，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15153。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27。
所述菌剂的用途可为制备罗伊氏乳杆菌纯种益生菌酸奶。
所述菌剂具体可为将所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27在液体乳中进行培养得到的培养物。所述液体乳可为脱脂乳和/或全乳。所述脱脂乳和/或全乳可为脱脂牛乳和/或牛乳。
上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为糖醇类、蛋白类或维生素类物质；所述糖醇类载体可为海澡糖、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘露醇和山梨醇中的至少一种；所述蛋白类载体为脱脂乳粉、乳清粉、酵母粉和酪蛋白的至少一种；所述维生素类载体可为维生素C和/或维生素E。所述液体载体可为甘油、植物油或水。所述菌剂中，所述活性成分可以以培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
为解决上述技术问题，本发明还提供了酸奶的制备方法，所述方法包括：向原料乳中添加所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27进行发酵，得到酸奶。
上述方法中，所述发酵的体系中所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27的含量可为下述a1)或a2)或a3)：
a1)(0.9～1.8)×108CFU/mL；
a2)(1.2～1.6)×108CFU/mL；
a3)1.4×108CFU/mL或1.6×108CFU/mL。
上述方法中，所述向原料乳中添加所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27可通过向所述原料乳中添加所述菌剂实现。
在所述菌剂中所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27的活菌数量为4.6×109CFU/mL时，所述菌剂的接种量可为a11)或a22)或a33)：
a11)2.0％～4.0％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27的活菌数为(0.9～1.8)×108CFU/mL；
a22)2.5％～3.5％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27的活菌数为(1.2～1.6)×108CFU/mL；
a33)3.0％或3.5％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27的活菌数为1.4×108CFU/mL或1.6×108CFU/mL。
上述方法中，所述发酵的温度可为b1)、b2)或b3)：
b1)33℃～41℃；
b2)35℃～39℃；
b3)37℃。
上述方法中，所述发酵的体系中还可含有c1)或c2)：
c1)蔗糖；
c2)绵白糖。
上述方法中，所述发酵的体系中所述蔗糖的含量可为d1)或d2)或d3)：
d1)3.8g/100mL～5.7g/100mL；
d2)4.3g/100mL～5.2g/100mL；
d3)4.8g/100mL或5.2g/100mL；
所述发酵的体系中所述绵白糖的含量可为e1)或e2)或e3)：
e1)4.0g/100mL～6.0g/100mL；
e2)4.5g/100mL～5.5g/100mL；
e3)5g/100mL或5.5g/100mL。
所述绵白糖具体可为北京中糖糖业发展有限公司产品。
所述原料乳为哺乳动物乳汁或由所述哺乳动物乳汁得到的液体乳制品，可用来制备酸奶。
上述方法中，所述原料乳可为f1)或f2)：
f1)哺乳动物乳；f2)牛乳。
上述方法中，所述酸奶可为纯种益生菌酸奶。
所述酸奶的制备方法还可包括在所述发酵结束后进行后熟。所述后熟的温度可为4℃。所述后熟的时间可为12小时。
所述后熟结束后的酸奶的酸度为65～70°T，酸奶的pH为4～5，空间罗伊氏乳杆菌SS23-27活菌数为1.6×109CFU/mL。
所述酸奶的制备方法还可包括在进行所述发酵前对所述原料乳进行灭菌。所述灭菌的条件为90℃保温5～10分钟。
本发明还提供了利用所述酸奶的制备方法制备的酸奶。
本发明还提供了所述制备酸奶的酸奶贮藏方法。
所述酸奶的制备方法还包括酸奶后熟结束后的贮藏保存。所述贮藏保存的温度可为4℃，所述贮藏保存的时间可为28天。
所述贮藏保存结束后的酸奶的酸度为90.76°T，酸奶的pH为3.78，空间罗伊氏乳杆菌SS23-27活菌数为1.2×109CFU/mL。
本发明利用天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的罗伊氏乳杆菌，以地面原始的罗伊氏乳杆菌作对照，选育出发生正向突变的发酵性能优良的菌株空间罗伊氏乳杆菌SS23-27，再通过优化发酵条件，研发了一种利用该菌株制备酸奶的方法，可用于研发生产纯种益生菌酸奶。利用本发明的空间罗伊氏乳杆菌SS23-27得到的纯种益生菌酸奶，有浓郁的炒麦风味，口感细腻和润滑，酸甜度适中，酸度为65～70°T，凝乳结实，乳清析出较少，凝乳时间缩短至3～4h，突破了利用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种两种菌的共生作用生产商品化普通酸奶的凝乳时间(发酵时间为5～6h)。本发明对空间罗伊氏乳杆菌的选育及其在纯种益生菌酸奶中的应用，填补了空间食品微生物工程菌的研究空白。另外，本发明制作纯种益生菌酸奶的原料来源方便，发酵工艺简单，发酵周期短，操作简单，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)
生物材料的菌株编号：Fullarton-H-SS23-27
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2018年01月02日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15153
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的MRS液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度分别为：酪蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、吐温-80 1mL/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L，pH6.8。MRS固体培养基为向MRS液体培养基中加入琼脂粉1.7g/L得到的培养基。
实施例1、对发酵牛乳性能优良的空间罗伊氏乳杆菌菌株的筛选
(一)菌株的分离纯化
1、菌株
空间罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SS23：由地面罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GS23经天宫2号和神州11号飞船搭载返回的太空诱变菌种，保藏于富乐顿生物工程科技(北京)有限公司航天微生物菌种库。为了区别航天搭载前后的菌株差异，将地面罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GS23搭载之后的太空诱变菌株标记为空间罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)SS23。
2、菌株活化
将冻存于-80℃冰柜的地面罗伊氏乳杆菌GS23和空间罗伊氏乳杆菌SS23甘油保藏管分别按2％～3％接入5mL MRS液体培养基中，37℃培养16h，连续三代活化后用于后续试验。
3、菌株的分离纯化
将地面罗伊氏乳杆菌GS23经天宫2号和神州11号飞船搭载返回，得到太空诱变菌种SS23，以地面罗伊氏乳杆菌GS23的个体形态和菌落特征为对照，在MRS固体培养基上从太空诱变菌种SS23中分离纯化得到115株菌株，分别标记菌株代号为SS23-1至SS23-115。
分离纯化方法：取空间SS23菌种活化后的培养液1mL，以9mL无菌生理盐水+0.1％吐温80制备稀释菌液，漩涡充分振荡后，以平板划线法接种于MRS固体培养基，置于37℃培养后挑取与地面GS23菌种的菌落特征差异较大的单菌落纯化培养于MRS固体培养基斜面试管，并镜检观察个体形态和纯度。将培养物转接连续传代培养，保种备用。
(二)空间罗伊氏乳杆菌发酵优良菌株的初筛
将上述空间罗伊氏乳杆菌SS23-1至SS23-115的液体MRS培养物，按2％的接种量接入5mL脱脂乳试管中，另以地面罗伊氏乳杆菌GS23作为对照，置于37℃培养至乳凝固后，记录各菌株(F1代)凝乳时间，并描述凝乳情况。再如此连续操作3代(F2-F4)，记录每代的凝乳时间和凝乳情况(如表1所示)，从中筛选出凝乳时间较短(发酵牛乳速度较快)，凝乳结实，乳清析出较少的发酵优良菌株。
表1空间罗伊氏乳杆菌凝乳时间和凝乳状态
Figure BDA0001569213960000051
Figure BDA0001569213960000061
Figure BDA0001569213960000071
Figure BDA0001569213960000081
由表1可见，地面原始菌株GS23于脱脂乳试管中凝乳时间较长，一般需要2～3d使牛乳凝固。只有SS23-12、SS23-22、SS23-24、SS23-27、SS23-30、SS23-36、SS23-38、SS23-46、SS23-84、SS23-88空间罗伊氏乳杆菌的凝乳时间明显缩短，其中SS23-12、SS23-27、SS23-36、SS23-38、SS23-46、SS23-84、SS23-88空间罗伊氏乳杆菌的凝乳时间缩短至7h，且凝乳结实，说明该7株空间罗伊氏乳杆菌在太空环境条件下相关基因发生了正突变。
(三)空间罗伊氏乳杆菌发酵优良菌株的复筛
按2％接种量将上述筛选的SS23-12、SS23-27、SS23-36、SS23-38、SS23-46、SS23-84、SS23-88空间罗伊氏乳杆菌脱脂乳试管纯粹培养物以2％(体积百分数)接种量移入盛有100mL灭菌脱脂乳(牛乳)的三角瓶中，37℃培养至牛乳凝固后进行菌种发酵剂活力测定，包括凝乳时间、酸度、pH、活菌计数，从中选取发酵性能优良的菌株，制备酸奶(酸奶发酵条件：发酵剂接种量3％，绵白糖用量5g/100mL，37℃)记录酸奶凝固时间，并按表2和表3对酸奶品质进行感官评价。空间罗伊氏乳杆菌发酵剂活力测定结果和发酵剂制作酸奶感官评价结果见表4和表5。
表2酸奶品质评分标准
Figure BDA0001569213960000082
Figure BDA0001569213960000091
表3酸奶质量标准
Figure BDA0001569213960000092
表4空间罗伊氏乳杆菌发酵剂活力测定及酸奶凝乳时间
Figure BDA0001569213960000093
由表4可见，利用SS23-36、SS23-84、SS23-88空间罗伊氏乳杆菌制作发酵剂的凝乳时间均为11～12h，酸奶凝乳时间为7h；而SS23-12、SS23-27、SS23-38、SS23-46、菌株发酵剂凝乳时间均为7h，酸奶凝乳时间为3～4h，且酸度和活菌数均较高。结论：空间罗伊氏乳杆菌SS23-12、SS23-27、SS23-38、SS23-46菌株为发酵速度最快、产酸较高的菌株。
表5空间罗伊氏乳杆菌发酵剂制作酸奶感官评价结果
Figure BDA0001569213960000094
Figure BDA0001569213960000101
由表5可见，利用空间罗伊氏乳杆菌的发酵剂分别制作酸奶，进行感官评价，其中SS23-27菌株制作酸奶的感官评分最高，其次是SS23-88、SS23-46、SS23-12、SS23-38菌株，有浓郁的炒麦风味，酸甜度适中，口感细腻和润滑，凝乳结实，乳清析出较少。因此，空间SS23-27、SS23-88、SS23-46、SS23-12、SS23-38菌株为发酵牛乳性能优良的菌株。
(四)空间罗伊氏乳杆菌株的遗传稳定性
将上述复筛得到的发酵性能优良的罗伊氏乳杆菌SS23-12、SS23-27、SS23-36、SS23-38、SS23-46、SS23-84、SS23-88菌株，于5mL MRS液体培养基连续传代50代(F50代)(接种量2％～3％，37℃培养16h)，而后按2％的接种量接入5mL脱脂乳试管中，于37℃培养至乳凝固后，记录凝乳时间和凝乳状态。在牛乳中如此连续操作6代，50代传代的空间罗伊氏乳杆菌凝乳时间和凝乳状态结果如表6所示。
表6 50代传代的空间罗伊氏乳杆菌凝乳时间和凝乳状态结果
Figure BDA0001569213960000102
表6中的由表6可见，经50代传代后，空间罗伊氏乳杆菌SS23-27在牛乳中经6次发酵验证，F53代后凝乳时间均保持在7h，显示其发酵性能遗传最稳定。而SS23-12、SS23-36、SS23-38、SS23-46、SS23-84、SS23-88菌株的凝乳发酵性能稳定性有所降低。
结论：空间罗伊氏乳杆菌SS23-27为遗传稳定性最好，且发酵牛乳性能最好的菌株，可成为开发功能性发酵乳制品的最有潜力菌株。
(五)空间罗伊氏乳杆菌的形态学鉴定与分子学鉴定
将SS23-27菌株进行革兰氏染色，结果显示SS23-27菌株为革兰氏阳性菌。形态学观察，SS23-27菌株的菌体呈短杆状、长短不等的长杆状到丝状，单生或短链状排列；于MRS固体培养基平板上菌落大小为1～2mm、表面光滑湿润、边缘不规则、扁平、半透明、灰白色。
检测SS23-27菌株的16S rDNA，测序结果如序列表的序列1所示。16s rDNA鉴定结果显示SS23-27菌株与罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri的相似性达到100％。经过形态学及16S rDNA鉴定，可以确定SS23-27菌株属于罗伊氏乳杆菌。
(六)空间罗伊氏乳杆菌SS23-27菌株的保藏
将SS23-27菌株命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27，于2018年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.15153。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27以下简称为空间罗伊氏乳杆菌SS23-27。
实施例2、空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件的优化
(一)空间罗伊氏乳杆菌SS23-27酸奶发酵剂的制备
将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27利用脱脂乳(牛乳)活化，将活化后的脱脂乳试管培养物按2％～3％(体积百分数)接种量移入盛有200mL灭菌脱脂乳的三角瓶中，37℃培养至牛乳凝固，凝乳时间为7h，得到空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂。检测发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数量为4.6×109CFU/mL。
所述空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂的检测方法：取1mL发酵剂放入含有99mL灭菌生理盐水中，采用拍击式匀质器以8 000～10 000r/min的速度处理2min，充分振荡后，制成10-2的均匀稀释液。再以9mL灭菌生理盐水做10倍递增稀释至10-8，取10-6～10-8的稀释液各1mL置于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46℃的MRS固体培养基约15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀，每个稀释度3次重复。同时将MRS固体培养基注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱中培养(48±2)h，待菌落长出后即可计数。
(二)单因素多水平试验优化菌株SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件
1、发酵温度的确定
将纯牛奶(利乐枕包装，净含量240mL/袋，内蒙古伊利实业集团股份有限公司)加热至60℃时加入5g/100mL绵白糖(蔗糖质量含量为95％，北京中糖糖业发展有限公司)，继续加热至90℃保温5～10min后，冷却至37℃，得到灭菌牛乳；以3％(体积百分数)的接种量将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接入上述灭菌牛乳中，分别于33℃、35℃、37℃、39℃、41℃发酵至牛乳凝固，记录凝乳时间，测定酸奶4℃后熟后(置于4℃，12h)的酸度和pH，并按表2和表3内容对酸奶品质进行感官评价。空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同发酵温度的酸奶综合指标结果如表7所示。
表7空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同发酵温度的酸奶综合指标结果
Figure BDA0001569213960000121
温度是影响酸奶发酵速度(凝乳时间)的重要因素。由表7可知，当33℃到37℃时，随着温度的升高，凝乳时间随之缩短；当37℃～41℃时，随着温度的升高，凝乳时间随之延长；当发酵温度为37℃时，凝乳时间最短。此外，温度也是影响酸奶感官品质的主要因素。当33℃～39℃时，随着温度的升高，pH随之降低，而发酵温度41℃时，pH有所上升。当33℃～41℃时，酸度也随着温度的上升而升高。当发酵温度为37℃时，酸奶的酸甜度适中，有浓郁的炒麦风味，感官评价分数较高。结合各试验指标综合确定罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶的最佳发酵温度为37℃。
2、发酵剂接种量的确定
将纯牛奶(利乐枕包装，净含量240mL/袋，内蒙古伊利实业集团股份有限公司)加热至60℃时加入5g/100mL绵白糖(蔗糖质量含量为95％)，继续加热至90℃保温5～10min后，冷却至37℃，得到灭菌牛乳；分别以2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％(体积百分数)的接种量将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接入上述灭菌牛乳中，于37℃发酵至牛乳凝固，记录凝乳时间，测定酸奶4℃后熟后(置于4℃，12h)的酸度和pH，并按表2和表3内容对酸奶品质进行感官评价。空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同接种量的酸奶综合指标结果如表8所示。
表8空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同接种量的酸奶综合指标结果
Figure BDA0001569213960000122
由表8可知，发酵剂的添加量直接影响酸奶的酸度，接种量与pH、凝乳时间关联较大。于较优发酵温度37℃条件下，在2.0％～3.0％之间pH随接种量的增加而增大，在3.0％～4.0％之间pH随接种量的增大而降低；菌种量越大，产酸越多，酸度亦越高。但接种量过大，产酸量过高，则影响酸奶的感官品质。当接种量3.0％～3.5％时，酸奶的酸甜度适中，凝乳时间均在4h以内，但3.0％接种量比3.5％的感官评价分数较高。结合各试验指标综合确定罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶的最佳发酵剂接种量为3.0％(体积百分数，发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为4.6×109CFU/mL，即发酵体系中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为1.4×108CFU/mL)。
3、加糖量的确定
将纯牛奶(利乐枕包装，净含量240mL/袋，内蒙古伊利实业集团股份有限公司)加热至60℃时，分别加入4.0g/100mL、4.5g/100mL、5.0g/100mL、5.5g/100mL、6.0g/100mL绵白糖(蔗糖质量含量为95％，即蔗糖用量分别为3.8g/100mL、4.3g/100mL、4.8g/100mL、5.2g/100mL、5.7g/100mL)，继续加热至90℃保温5～10min后，冷却至37℃，分别得到不同加糖量的灭菌牛乳；以3％(体积百分数)的接种量将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接入上述不同加糖量的灭菌牛乳中，于37℃发酵至牛乳凝固，记录凝乳时间，测定酸奶4℃后熟后(置于4℃，12h)的酸度和pH，并按表2和表3内容对酸奶品质进行感官评价。空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同加糖量的酸奶综合指标结果如表9所示。
表9空间罗伊氏乳杆菌SS23-27不同加糖量的酸奶综合指标结果
Figure BDA0001569213960000131
由表9可知，加糖量的多少直接影响酸奶的感官品质，尤其影响其酸甜度。于较优发酵温度37℃、最佳接种量3％条件下，加糖量在4.0g/100mL～5.5g/100mL之间时，酸度随加糖量的增加而增大，但pH随加糖量的变化无线性规律。此外，由表9可见，加糖量的多少也影响凝乳时间的长短，随着加糖量的增加，凝乳时间随之缩短。当加糖量为5.0g/100mL时酸奶凝乳结实，乳清析出较少，口感细腻和润滑，酸甜度适中，风味最佳，感官评分较高。结合各试验指标综合确定罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶的最佳加糖量为5.0g/100mL。
综上所述，通过单因素多水平试验，确定空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件为：发酵温度37℃，空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接种量为3.0％(体积百分数，发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数量为4.6×109CFU/mL，即发酵体系中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为1.4×108CFU/mL)，绵白糖用量5.0g/100mL(即蔗糖用量为4.8g/100mL)。
(三)正交试验优化空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件
将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27经灭菌脱脂乳活化、扩大培养，制成单一菌种的发酵剂。在根据单因素多水平试验确定菌株SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件结果基础上，设计发酵温度、发酵剂接种量、绵白糖用量三因素三水平[L9(34)]正交试验[见表10，其他条件均同步骤(二)]，并对成品益生菌酸奶按表2和表3内容进行感官评价，记录凝乳时间，测定4℃后熟后(置于4℃，12h)酸奶的酸度和pH，通过对试验结果的极差分析和K值分析确定较优的益生菌酸奶发酵工艺条件。正交试验优化菌株SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件结果如表11所示。
表10三因素三水平[L9(34)]正交试验表
Figure BDA0001569213960000141
表11正交试验[L9(34)]优化菌株SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件结果
Figure BDA0001569213960000142
Figure BDA0001569213960000151
注：表11中数据均为三次重复试验的平均值。
由表11可见，根据正交试验极差分析，不同发酵条件对酸奶感官品质的影响顺序为：发酵温度＞加糖量＞接种量；根据正交试验K值分析，pH、酸度、凝乳时间、感官评价四个试验指标的发酵条件组合分别为A1B1C1、A1B1C3、A2B3C3、A1B3C3，由此得出较优发酵条件组合为A1B1C3或A1B3C3。依据酸奶的加糖量应与接种量成正相关的原理，加糖量的增加需要适当加大接种量，否则将影响成品酸奶的感官品质和适中的酸甜度，当加糖量为5.5g/100mL时，接种量则应适当调整为3.5％。故综合确定纯种益生菌酸奶的最优发酵条件组合为A1B3C3，即发酵温度37℃、发酵剂接种量3.5％、绵白糖用量5.5g/100mL。
综上所述，本试验研究罗伊氏乳杆菌纯种益生菌酸奶的优化发酵条件，主要从酸奶感官评价、凝乳时间、酸度和pH指标来考虑。经极差分析和K值析，确定空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶优化发酵条件组合是A1B3C3，即发酵温度为37℃、空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接种量为3.5％(体积百分数，发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为4.6×109CFU/mL，即发酵体系中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为1.6×108CFU/mL)、绵白糖用量为5.5g/100mL(即蔗糖用量为5.2g/100mL)。
(四)菌株SS23-27纯种益生菌酸奶正交试验验证试验
在上述正交试验得出的优化发酵条件基础上，将纯牛奶(利乐枕包装，净含量240mL/袋，内蒙古伊利实业集团股份有限公司)加热至60℃时，分别加入5.5g/100mL绵白糖(蔗糖含量为95％)，继续加热至90℃保温5～10min后，冷却至37℃，得到灭菌牛乳；以3.5％(体积百分数)的接种量将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接入上述灭菌牛乳中，于37℃发酵至牛乳凝固，记录凝乳时间，测定酸奶4℃后熟后(置于4℃，12h)的酸度和pH，并对成品益生菌酸奶按表2和表3内容进行感官评价，同时以发酵温度37℃、发酵剂接种量3％(体积百分数)、绵白糖用量5g/100mL为对照组，结果如表12所示。
表12菌株SS23-27纯种益生菌酸奶发酵条件优化结果与初始发酵条件结果对照
Figure BDA0001569213960000161
注：表12中数据均为三次重复试验测定平均值。
由表12可见，在优化发酵条件下空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶的感官品质评分最高，为58.5分，且凝乳时间较短，为3.79h，而对照组感官品质评分为55.45分。因此，在优化发酵条件下，空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶的感官品质评分是优化前的1.06倍，有浓郁的炒麦风味，口感细腻和润滑，酸甜度适中，酸度为65～70°T，pH为4～5，凝乳结实，乳清析出较少，凝乳时间缩短至3～4h，突破了利用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种两种菌的共生作用生产商品化普通酸奶的凝乳时间(发酵时间为5～6h)。
(五)空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶活菌保质期试验
在上述正交试验得出的优化发酵条件基础上，将纯牛奶(利乐枕包装，净含量240mL/袋，内蒙古伊利实业集团股份有限公司)加热至60℃时，分别加入5.5g/100mL绵白糖(蔗糖含量为95％)，继续加热至90℃保温5～10min后，冷却至37℃，以3.5％(体积百分数)的接种量将空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂(发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数量为4.6×109CFU/mL，即发酵体系中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为1.6×108CFU/mL)接入上述灭菌牛乳中，于37℃发酵至牛乳凝固，测定酸奶4℃后熟后(置于4℃，12h)第1d的酸度、pH和活菌数量，以及测定贮藏于4℃条件下的第7d、第14d、第21d、第28d的酸度、pH和活菌数量，同时以发酵温度37℃、空间罗伊氏乳杆菌SS23-27发酵剂接种量3％(体积百分数，发酵剂中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数量为4.6×109CFU/mL，即发酵体系中空间罗伊氏乳杆菌SS23-27的活菌数为1.4×108CFU/mL)、绵白糖用量5.0g/100mL为对照组，结果如表13所示。
所述方法中，成品酸奶益生菌活菌数量的检测方法：取25mL酸奶放入含有225mL灭菌生理盐水中，采用拍击式匀质器以8 000～10 000r/min的速度处理2min，充分振荡后，制成10-1的均匀稀释液。再以9mL灭菌生理盐水做10倍递增稀释至10-8，取10-6～10-8的稀释液各1mL置于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46℃的MRS固体培养基约15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀，每个稀释度3次重复。同时将MRS固体培养基注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱中培养(48±2)h，待菌落长出后即可计数。成品酸奶益生菌的活菌数量如表13所示。
表13菌株SS23-27纯种益生菌酸奶活菌保质期试验结果
Figure BDA0001569213960000171
由表13可知，第1d～28d随着贮藏天数的增加，成品酸奶的pH随之降低，酸度随之升高，第1d～7d酸度增加较快，第7d～28d酸度增加较缓慢，贮藏至第28d酸度由68.63°T升高至90.76°T(优化条件组)和由68.63°T升高至87.89°T(对照条件组)，仍然符合成品酸奶对酸度90°T的要求。第1d～28d随着贮藏天数的增加，成品酸奶的活菌数量缓慢下降，从1.6×109CFU/mL下降至1.2×109CFU/mL(优化条件组)和从1.3×109CFU/mL下降至1.1×109CFU/mL(对照条件组)，远远满足成品酸奶对益生菌的活菌数大于106CFU/mL的要求，显示仍可发挥罗伊氏乳杆菌益生菌酸奶的保健功效。
结论：在较优发酵条件下制作的空间罗伊氏乳杆菌SS23-27纯种益生菌酸奶，于4℃条件下贮藏的活菌保质期为28天，此时成品酸奶中益生菌的活菌数量为1.2×109CFU/mL，酸度为90.76°T，符合成品酸奶对益生菌活菌数和酸度的要求，仍可发挥罗伊氏乳杆菌纯种益生菌酸奶的保健功效。
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tggttaggcc accgactttg ggcgttacaa actcccatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc 120
gtgtaggcga gttgcagcct acagtccgaa ctgagaacgg ctttaagaga ttagcttact 180
ctcgcgagct tgcgactcgt tgtaccgtcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatctgacgt cgtccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcact 300
agagtgccca acttaatgct ggcaactagt aacaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgacg accatgcacc acctgtcatt gcgtccccga 420
agggaacgcc ttatctctaa ggttagcgca agatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct ccggcactga 600
agggcggaaa ccctccaaca cctagcactc atcgtttacg gcatggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt cgctacccat gctttcgagc ctcagcgtca gttgcagacc agacagccgc 720
cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcattccac cgctacacat ggagttccac 780
tgtcctcttc tgcactcaag ttgcccggtt tccgatgcac ttcttcggtt aagccgaagg 840
ctttcacatc agacctaagc aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa atccggataa 900
cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtga ctttctggtt 960
ggataccgtc actgcgtgaa cagttactct cacgcacgtt cttctccaac aacagagctt 1020
tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gtgttgctcc atcaggcttg cgcccattgt 1080
ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtatggacc gtgtctcagt tccattgtgg 1140
ccgatcagtc tctcaactcg gctatgcatc atcgccttgg taagccgtta ccttaccaac 1200
tagctaatgc accgcaggtc catcccagag tgatagccaa agccatcttt caaacaaaag 1260
ccatgtggct tttgttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaaatgtta tcccccgctc 1320
cggggcaggt tacctacgtg ttactcaccc gtccgccact cactggtgat ccatcgtcaa 1380
tcaggtgcaa gcaccatcaa tcagttgggc cagtgcgtac gactgc 1426

Claims (17)

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15153。
2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-H-SS23-27。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为将权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27在液体乳中进行培养得到的培养物；
所述液体乳为脱脂乳和/或全乳。
4.酸奶的制备方法，包括：向原料乳中添加权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27进行发酵，得到酸奶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27的含量为0.9×108CFU/mL～1.8×108CFU/mL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27的含量为1.2×108CFU/mL～1.6×108CFU/mL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) Fullarton-H-SS23-27的含量为1.4×108CFU/mL或1.6×108CFU/mL。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为33℃～41℃。
9.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为35℃～39℃。
10.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为37℃。
11.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中还含有c1）或c2）：
c1）蔗糖；
c2）绵白糖。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中所述蔗糖的含量为3.8g/100mL～5.7g/100mL；
或，所述发酵的体系中所述绵白糖的含量为4g/100mL～6g/100mL。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中所述蔗糖的含量为4.3g/100mL～5.2g/100mL；
或，所述发酵的体系中所述绵白糖的含量为4.5g/100mL～5.5g/100mL。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述发酵的体系中所述蔗糖的含量为4.8g/100mL或5.2g/100mL；
或，所述发酵的体系中所述绵白糖的含量为5g/100mL或5.5g/100mL。
15.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述原料乳为哺乳动物乳。
16.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述原料乳为牛乳。
17.利用权利要求4-16中任一所述方法制备的酸奶。
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