CN111919888A - 空间诱变罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌复合发酵剂及其在制备益生菌酸奶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了空间诱变罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌复合发酵剂及其在制备益生菌酸奶中的应用。本发明以经“天宫二号”和“神舟十一号”飞船搭载诱变后的罗伊氏乳杆菌9‑79和植物乳杆菌SS18‑5为研究对象，对其酸奶发酵工艺条件和菌株的高密度发酵条件进行优化，研制出液态复合发酵菌剂与干粉复合发酵菌剂，用之开发出发酵速度快、益生功效好，具有独特炒麦香味的益生菌酸奶。本发明利用太空环境诱变后，选育出发酵性能优良的空间诱变菌株9‑79和SS18‑5作为复合发酵菌剂生产益生菌酸奶，填补了国内太空益生菌酸奶复合发酵剂的空白，为太空益生菌酸奶产品研发成果的产业化应用提供技术支撑。

Description

空间诱变罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌复合发酵剂及其在制备 益生菌酸奶中的应用
技术领域
本发明属于微生物与食品加工技术领域，具体涉及空间诱变罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌复合发酵剂及其在制备益生菌酸奶中的应用。
背景技术
酸奶作为一种营养、健康的食品，很早就在全世界范围内流行，在部分发达国家和地区甚至占据液态奶市场50％以上份额。随着我国居民生活水平提高、健康意识增强，乳制品在居民膳食结构中的地位明显提高，酸奶作为一种具有健康功能的食品，更是受到消费者的喜爱。近年来，我国酸奶市场增长率领跑全球，每年保持两位数的高速增长。2016年中国酸奶行业市场规模达到1010.17亿元，市场首次突破千亿元；2017年牛奶销售额同比增长4％，而酸奶销售额首次超过牛奶，约为1192亿元，同比增长18％，增速远快于牛奶；2018年中国酸奶行业市场规模突破1400亿元。专家预计，乳制品消费将会进一步增长，并且人们对乳制品的需求也更趋向多元化、功能化。功能性乳制品如益生菌酸牛奶、营养强化牛乳等进一步增强，成为未来发展的重要方向。
益生菌(Probiotic)又称微生态调节剂、活菌制剂，是指能够促进宿主肠道菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活的微生物制剂。人体肠道内存在大量微生物，分为有益菌、有害菌和中性菌。正常情况下，肠道菌群处于平衡状态，相互依赖又相互制约，与人体之间互利共存。肠道为细菌提供生长空间和营养物质，菌群则为人体提供生长因子。肠道菌群失调会导致腹泻和感染等一系列生理功能紊乱。
发酵乳是益生菌良好的载体，益生菌行业以其健康的基因、强大的科技背景，积淀成为食品工业健康转型的重要支撑。在国家“健康中国”战略推动下，具有健康功能的益生菌市场规模快速扩大。但是，在益生菌市场不断扩大的同时，行业的隐忧也日趋引发关注。中国益生菌产业缺乏核心的菌株资源，市场上流通的益生菌产品，大多数都来源于国际上的一些进口菌株。此外，大型企业发酵乳制品菌种几乎全部依靠进口，不仅生产成本高，更重要的是制约了乳酸菌和发酵乳制品产业化、标准化、规模化发展。另外，与国外菌株相比，国产菌株在安全性与功能性方面的研究仍然存在一定的差距。
目前我国酸奶产量不断增加，品种日益丰富，而酸奶发酵剂是生产酸奶过程中保证其质量稳定及形成优良感官品质，以及组织状态的关键所在，对酸奶发酵剂进行优化显得至关重要。但目前市售酸奶多采用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，但该复合菌种不耐受胃酸和胆盐，在肠道中很难定植，存活率极低，很难发挥其益生功效。
近年来，国内外专家学者大多集中于空间微生物制药方面的研究且以美国居多。但由于空间搭载的细菌资源有限，有关真实的太空环境对常见细菌影响的研究甚少，且国内外仍处于起步阶段，而对空间诱变益生菌应用于食品的研究少之又少。
发明内容
本发明的目的是提供利用空间诱变罗伊氏乳杆菌与植物乳杆菌制备的复合发酵菌剂及其在制备益生菌酸奶中的应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)或其发酵产物与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或其发酵产物的新用途。
本发明提供了罗伊氏乳杆菌或其发酵产物与植物乳杆菌或其发酵产物在如下A1)-A3)任一种中的应用：
A1)制备发酵乳制品；
A2)制备益生菌酸奶；
A3)制备复合发酵菌剂。
为了实现上述目的，本发明又提供了一种复合菌。
本发明提供的复合菌由罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌组成。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种复合发酵菌剂。
本发明提供的复合发酵菌剂的活性成分为罗伊氏乳杆菌菌剂和植物乳杆菌菌剂。
进一步的，所述罗伊氏乳杆菌菌剂可为罗伊氏乳杆菌液态发酵剂或罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂。
所述植物乳杆菌菌剂可为植物乳杆菌液态发酵剂或植物乳杆菌干粉发酵剂。
所述罗伊氏乳杆菌菌剂和所述植物乳杆菌菌剂的CFU(每毫升或每克所含活菌数)之比可为1:(5-15)，具体可为1:10。
更进一步的，所述罗伊氏乳杆菌液态发酵剂和所述植物乳杆菌液态发酵剂的CFU(每毫升所含活菌数)之比可为1:(5-15)，具体可为1:10。
所述罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂和所述植物乳杆菌干粉发酵剂的CFU(每克所含活菌数)之比可为1:(5-15)，具体可为1:10。
为了实现上述目的，本发明还提供了上述复合发酵菌剂的制备方法。
本发明提供的上述复合发酵菌剂的制备方法为如下C1)或C2)：
C1)将罗伊氏乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到罗伊氏乳杆菌液态发酵剂；
将植物乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到植物乳杆菌液态发酵剂；
所述复合发酵菌剂由所述罗伊氏乳杆菌液态发酵剂和所述植物乳杆菌液态发酵剂组成；
C2)将罗伊氏乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到罗伊氏乳杆菌发酵液，将所述罗伊氏乳杆菌发酵液离心，弃上清液，得到罗伊氏乳杆菌菌泥；将所述罗伊氏乳杆菌菌泥和冻干保护剂混匀，冻干，得到罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂；
将植物乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到植物乳杆菌发酵液，将所述植物乳杆菌发酵液离心，弃上清液，得到植物乳杆菌菌泥；将所述植物乳杆菌菌泥和冻干保护剂混匀，冻干，得到植物乳杆菌干粉发酵剂；
所述复合发酵菌剂由所述罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂和所述植物乳杆菌干粉发酵剂组成。
上述方法中，所述C1)中，所述发酵培养的方法包括如下步骤：将罗伊氏乳杆菌或植物乳杆菌接种于培养基中进行发酵培养，得到罗伊氏乳杆菌发酵液或植物乳杆菌发酵液；然后将所述发酵液以3％(体积百分浓度)的接种量接种于灭菌后的原料乳中，于37℃培养至凝乳状态，得到罗伊氏乳杆菌液态发酵剂或植物乳杆菌液态发酵剂。
进一步的，所述罗伊氏乳杆菌液态发酵剂和所述植物乳杆菌液态发酵剂的CFU(每毫升所含活菌数)之比可为1:(5-15)，具体可为1:10。
所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养条件如下：培养基初始pH为6.5、发酵温度为37℃、发酵时间为22h、接种量为4％；
所述植物乳杆菌的发酵培养条件如下：培养基初始pH为7.0、发酵温度为35℃、发酵时间为18h、接种量为4％。
所述灭菌的条件如下：115℃灭菌20min。所述原料乳为牛乳。
更进一步的，所述牛乳为全灭菌伊利百利包240mL袋装纯牛乳。
所述发酵培养的培养基为MRS培养基。
上述方法中，所述C2)中，所述罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂和所述植物乳杆菌干粉发酵剂的CFU(每克所含活菌数)之比可为1:(5-15)，具体可为1:10。
所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养条件如下：控制培养基pH为6.0(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)、发酵温度为37.2℃、发酵时间为18.1h、接种量为3.8％、转速为200r/min。
所述植物乳杆菌的发酵培养条件如下：控制培养基pH为6.6(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)、发酵温度为35.5℃、发酵时间为18.0h、接种量为3.3％、转速为200r/min。
所述冻干保护剂为10％脱脂奶粉+5％麦芽糊精(10g/100mL脱脂奶粉+5g/100mL麦芽糊精)。
进一步的，所述离心的条件如下：4℃、4000r/min离心20min。
所述冻干的条件如下：真空度为0.12～0.16mBar冻干48～60h至粉末状。
更进一步的，所述冻干保护剂的用量是离心之前发酵液体积的1/10。
上述复合菌或复合发酵菌剂或按照上述方法制备的复合发酵菌剂在制备发酵乳制品或益生菌酸奶中的应用也属于本发明的保护范围。
为了实现上述目的，本发明最后提供了一种发酵乳制品或益生菌酸奶的生产方法。
本发明提供的发酵乳制品或益生菌酸奶的生产方法包括以牛乳或羊乳或其乳粉为原料乳，白砂糖为辅料，利用上述复合菌或复合发酵菌剂或按照上述方法制备的复合发酵菌剂进行发酵生产的步骤。
上述发酵乳制品或益生菌酸奶的生产方法包括如下步骤：
1)将原料乳进行加热，然后加入白砂糖，混匀后过滤，得到过滤后产物；
2)将所述过滤后产物进行均质(目的是使乳凝固均匀，质地细密平滑，防止脂肪上浮)，得到均质后产物；
3)将所述均质后产物进行杀菌，得到灭菌乳；
4)将上述复合发酵菌剂接种于灭菌乳中，混匀后分装，于37℃条件下保温发酵至凝乳状态。
进一步的，所述1)中，所述原料乳可为牛乳。
所述加热为加热至60℃。
所述白砂糖的加入量为6％(每100mL原料乳加入6g白砂糖)。
所述2)中，所述均质的条件如下：8～10MPa。
所述3)中，所述杀菌的条件如下：90℃条件下保温5～10min。
所述4)中，每毫升所述灭菌乳中添加的上述C1)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量不低于4.0×106CFU，植物乳杆菌的含量不低于4.0×107CFU。具体的，每毫升所述灭菌乳中添加的上述C1)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量为4.0×106CFU，植物乳杆菌的含量为4.0×107CFU。
所述4)中，每毫升所述灭菌乳中添加的上述C2)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量不低于4.0×107CFU，植物乳杆菌的含量不低于4.0×108CFU。具体的，每毫升所述灭菌乳中添加的上述C2)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量为4.0×107CFU，植物乳杆菌的含量为4.0×108CFU。
所述复合发酵菌剂的接种量可为4‰-4％。具体的，上述C1)所述复合发酵菌剂的接种量为4％(质量体积百分浓度)，上述C2)所述复合发酵菌剂的接种量为4‰(质量体积千分浓度)。
所述4)中还包括将凝固好的酸奶置于4℃条件下冷藏过夜后熟的步骤。
更进一步的，所述原料乳为全灭菌伊利百利包240mL袋装纯牛乳。
上述任一所述应用或复合菌或复合发酵菌剂或方法中，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-9-79CGMCC No.14943；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-SS18-5 CGMCC No.14917。
本发明以经“天宫二号”和“神舟十一号”宇宙飞船搭载返回地面诱变后的罗伊氏乳杆菌9-79和植物乳杆菌SS18-5为研究对象，对其酸奶发酵条件进行优化，从而确定该益生菌酸奶的最优生产工艺。进一步优化益生菌酸奶直投式发酵剂高密度发酵条件、筛选保护剂配方及冻干菌粉接种量，进行直投式工业化生产小试、中试，从而研制出发酵速度快、益生功效好，且具有独特炒麦香味的益生菌酸奶。本发明一方面填补了国内太空益生菌酸奶复合发酵剂的空白，为后续空间食品益生菌的研究及应用提供理论依据；另一方面，利用太空的特殊环境[高真空度10-7～10-4Pa，微重力10-5g，极端温差+140～+120℃(有阳光面)～-120℃(无阳光面)，弱磁场，UV射线和电离辐射(电子、质子、重离子等)]诱变后，经过筛选(初筛、复筛试验)、分离与纯化，以及50代次遗传稳定性试验，选育出的发酵性能优良的空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5菌株作为复合发酵菌剂生产益生菌酸奶，为太空益生菌酸奶产品研发成果的产业化应用提供技术支撑。
附图说明
图1为9-79(左)和SS18-5(右)菌株的生长曲线。
图2为发酵温度对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图3为MRS培养基起始pH对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图4为发酵时间对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图5为接种量对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图6为发酵温度对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响。
图7为加糖量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响。
图8为接种量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响。
图9为益生菌酸奶保质期期间pH和酸度的变化。
图10为益生菌酸奶保质期期间粘度的变化。
图11为益生菌酸奶保质期期间活菌数的变化。
图12为益生菌酸奶保质期期间感官评价的变化。
图13为MRS培养基pH对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图14为发酵温度对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图15为发酵时间对9-79菌株活菌数的影响。
图16为接种量对9-79(左)和SS18-5(右)菌株活菌数的影响。
图17为9-79菌株发酵因素交互作用响应面图。
图18为SS18-5菌株发酵因素交互作用响应面图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的主要试剂及配方如下：
MRS培养基的溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：蛋白胨1g/100mL、牛肉膏1g/100mL、酵母膏0.5g/100mL、KH2PO4 0.2g/100mL、柠檬酸三钠0.2g/100mL、乙酸钠0.2g/100mL、葡萄糖2g/100mL、Tween 80 0.1mL/100mL、MgSO4·7H2O 0.058g/100mL、MnSO4·4H2O0.025g/100mL，pH6.0，115℃灭菌20min。在上述MRS培养基配方中，加入17g/100mL琼脂，即为MRS固体培养基。
0.85％无菌生理盐水：氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。
下述实施例中的主要仪器及型号及购买处：MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；BCN-1360B型无菌超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；GHP-9160型恒温培养箱：上海一恒；TGL-21M型高速台式冷冻离心机：上海卢湘仪离心机有限公司；BS224S型电子天平：德国Sartorius集团；ATSE-AM6250C型磁力搅拌器：西化仪(北京)科技有限公司；CR3i冷冻离心机：美国Thermo公司；UV-2600型紫外分光光度计：美国unico公司；真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；SHT-Ⅱ型数显搅拌恒温电热套：上海帅登仪器有限公司；Biofuge stratos型大容量台式冷冻离心机：美国热电公司。
下述实施例中的植物乳杆菌SS18-5，全称为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Fullarton-SS18-5，于2017年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14917。
下述实施例中的罗伊氏乳杆菌9-79，全称为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)Fullarton-9-79，于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14943。
实施例1、空间诱变益生菌酸奶小试发酵工艺优化
一、9-79和SS18-5菌株生长曲线的测定及其发酵条件的优化
1、9-79和SS18-5菌株生长曲线的测定
分别将空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5活化两代后，接种于MRS培养基中，于37℃培养24h。从0h开始每2h取样检测其于600nm处光密度值，以培养时间为横坐标，以光密度值为纵坐标分别绘制9-79和SS18-5菌株生长曲线。
结果如图1所示。由图1(左)可知，9-79菌株在第2～6h后开始进入对数生长期，6～18h菌体密度迅速增加；18h菌体密度最大，为对数生长期的末期(对数生长期与稳定期的拐点)；在18h后进入稳定期，故确定9-79菌株的最佳培养时间为18h。由图1(右)可知，SS18-5菌株在第2h后开始进入对数生长期，2～12h菌体密度迅速增加；16h菌体密度最大，为对数生长期的末期；在16h后进入稳定期，故确定SS18-5菌株的最佳培养时间为16h。
2、9-79和SS18-5菌株小试发酵条件的优化
在含有200mL MRS培养基的锥形瓶中，分别将罗伊氏乳杆菌9-79和植物乳杆菌SS18-5在不同发酵温度(31℃、33℃、35℃、37℃、39℃和41℃)、不同MRS培养基起始pH(5、5.5、6、6.5、7和7.5)、不同发酵时间(12h、14h、16h、18h、20h和22h)和不同接种量(1％、2％、3％、4％和5％)条件下进行单因素多水平试验，以发酵液活菌数为试验指标，分析确定适宜的发酵条件；根据上述单因素多水平试验结果，再以培养基起始pH、发酵温度、发酵时间、接种量四因素三水平正交试验[L9(34)]分别优化9-79和SS18-5菌株的高密度发酵条件。
(1)培养温度对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响
发酵温度是影响乳酸菌生长繁殖的重要因素。发酵温度不仅直接影响菌体发酵过程中的各种酶的反应速度和生长速度，并且还可以改变发酵液的溶氧、传质速率和菌体对养分的吸收率等物理性质。
发酵温度对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图2所示。由图2(左)可知，9-79菌株活菌数随着温度升高，先增高再降低，在37℃条件下，活菌数达到最大为4.14×108CFU/mL，故确定9-79菌株的适宜发酵温度为37℃；由图2(右)可知，SS18-5菌株活菌数亦随着温度升高，先增高再降低，于35℃条件下，活菌数达到最大为7.05×109CFU/mL，故确定SS18-5菌株的适宜发酵温度为35℃。
(2)培养基起始pH对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响
培养基起始pH会影响菌体细胞各种酶的活性，以及影响基质的利用速率和细胞的结构，这些原因最终会影响菌体的生长和代谢产物的合成。
MRS培养基起始pH对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图3所示。由图3(左)可知，9-79菌株活菌数随着pH增大，先升高后降低，在培养基起始pH为6.5时，活菌数达到最大为4.31×108CFU/mL，故确定9-79菌株的适宜培养基起始pH为6.5；由图3(右)可知，SS18-5菌株活菌数亦随着pH的增大，先升高后降低，于培养基起始pH为7.0时，活菌数达到最大为7.15×109CFU/mL，故确定SS18-5菌株的适宜培养基起始pH为7.0。
(3)发酵时间对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响
发酵时间亦是影响菌体活菌数高低的重要因素。发酵时间太短，菌体生长繁殖未达到对数生长期的末期，导致菌体活菌数偏低；培养时间太长，菌体生长达到稳定期之后进入衰亡期，会降低菌种代谢活力，甚至导致菌体衰老死亡和自溶。
发酵时间对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图4所示。由图4(左)可知，9-79菌株活菌数随着发酵时间的增加而升高，在第20h时，活菌数达到最大为4.37×108CFU/mL，故确定9-79菌株的适宜发酵时间为20h；由图4(右)可知，SS18-5菌株活菌数亦随着发酵时间的增加而升高，进入稳定期后，活菌数不再增长。发酵时间为16h时，活菌数最高为7.25×109CFU/mL，菌种活力最强，故确定SS18-5菌株的适宜发酵时间为16h。
(4)接种量对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响
接种量的多少决定了菌体在培养基中的生长速度和菌体浓度，适宜的接种量有利于菌体自身的生长繁殖。
接种量对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图5所示。由图5(左)可知，9-79菌株活菌数随着接种量增大而升高，在接种量为3％～5％时，活菌数达到最大的稳定值为4.26×108CFU/mL，故确定9-79菌株的适宜接种量为3％；由图5(右)可知，SS18-5菌株活菌数随接种量增大而升高，在接种量为3％～5％时，活菌数达到最大的稳定值为7.21×109CFU/mL，故确定SS18-5菌株的适宜接种量为3％。
(5)正交试验优化9-79和SS18-5菌株高密度发酵条件
根据上述单因素多水平试验结果，设计培养基起始pH、发酵温度、发酵时间和接种量四因素三水平[L9(34)]正交试验(见表1)，每组3次重复，以MRS发酵液中活菌数为试验指标，通过对结果的极差分析(R)和K值分析确定9-79和SS18-5菌株较优的高密度发酵条件。
9-79菌株优化发酵条件正交试验结果如表1所示。由表1可见，根据正交试验极差分析RB＞RD＞RA＞RC可知，不同发酵条件对菌株9-79活菌数的影响顺序为：发酵温度＞接种量＞发酵培养基起始pH＞发酵时间；根据正交试验K值分析KA2＞KA3＞KA1、KB2＞KB3＞KB1、KC3＞KC2＞KC1、KD3＞KD2＞KD1可知，菌株9-79高密度发酵条件的最优组合为A2B2C3D3，即发酵培养基起始pH为6.5、发酵温度为37℃、发酵时间为22h、接种量为4％。
表1、9-79菌株优化发酵条件正交试验结果
Figure BDA0002637680100000071
注：表中数据为n＝3测定之平均值。
SS18-5菌株优化发酵条件正交试验结果如表2所示。由表2可见，根据正交试验极差分析RB＞RA＞RC＞RD可知，不同发酵条件对菌株SS18-5活菌数的影响顺序为：发酵温度＞发酵培养基起始pH＞发酵时间＞接种量；根据正交试验K值分析KA2＞KA3＞KA1、KB2＞KB3＞KB1、KC3＞KC2＞KC1、KD3＞KD2＞KD1可知，菌株SS18-5高密度发酵条件的最优组合为A2B2C3D3，即发酵培养基起始pH为7.0、发酵温度为35℃、发酵时间为18h、接种量为4％。
表2、SS18-5菌株优化发酵条件正交试验结果
Figure BDA0002637680100000072
Figure BDA0002637680100000081
注：表中数据为n＝3测定之平均值。
(6)最优发酵条件验证试验
根据正交试验优化得到的9-79菌株的最优发酵条件为发酵培养基起始pH6.5、发酵温度37℃、发酵时间22h、接种量4％。在此优化条件下发酵三次取平均值，得到9-79菌株的活菌数为4.24×108CFU/mL的发酵液。
根据正交试验优化得到的SS18-5菌株的最优培养条件为发酵培养基起始pH7.0、发酵温度35℃、培养时间为18h，接种量为4％。在此优化条件下发酵三次取平均值，得到SS18-5菌株的活菌数为7.23×109CFU/mL的发酵液。
二、空间诱变益生菌酸奶小试发酵工艺流程及其发酵工艺优化
1、空间诱变益生菌酸奶小试发酵的工艺流程
(1)原料乳：采用全灭菌伊利百利包240mL袋装纯牛乳。
(2)预热、配料和过滤：将原料乳加热到60℃，加入6％白砂糖(每100mL原料乳加入6g白砂糖)，混匀后过滤。
(3)均质：在8～10MPa压力下对预热的原料乳进行均质。目的是使乳凝固均匀，质地细密平滑，防止脂肪上浮。
(4)杀菌：将原料乳于90℃条件下保温5～10min，得到灭菌乳。
(5)接种复合液态酸奶发酵剂：待灭菌乳冷却至37℃，将空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5液态酸奶发酵剂按照CFU之比为1:10的比例混合，得到复合发酵菌剂，再将复合发酵菌剂以4％(质量体积百分浓度)的接种量接种于步骤(4)获得的灭菌乳(每毫升所述灭菌乳中添加的所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌含量为4.0×106CFU，植物乳杆菌含量为4.0×107CFU)中，混匀，得到接种后的牛乳。
上述空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79液态酸奶发酵剂的制备方法如下：将罗伊氏乳杆菌9-79甘油保藏菌种接种于10mL的MRS培养基中，于37℃培养24h活化两代后，再接种于100mL的MRS培养基中，37℃培养18h后得到种子液；将该种子液接种于MRS培养基中，在发酵培养基起始pH为6.5、发酵温度为37℃、发酵时间为22h、接种量为4％的优化发酵条件下进行高密度发酵，得到活菌数为4.24×108CFU/mL的菌株9-79发酵液；再将菌株9-79发酵液以3％(体积百分浓度)的接种量接种于灭菌(115℃灭菌20min)后的原料乳中，于37℃培养至凝乳状态，制成罗伊氏乳杆菌9-79液态酸奶发酵剂(罗伊氏乳杆菌9-79液态酸奶发酵剂的活菌数为4.32×108CFU/mL)。
上述空间诱变植物乳杆菌SS18-5液态酸奶发酵剂的制备方法如下：将植物乳杆菌SS18-5甘油保藏菌种接种于10mL的MRS培养基中，于37℃培养24h活化两代后，再接种于100mL的MRS培养基中，37℃培养16h后得到种子液；将该种子液接种于MRS培养基中，在发酵培养基起始pH为7.0、发酵温度为35℃、发酵时间为18h，接种量为4％的优化发酵条件下进行高密度发酵，得到活菌数为7.23×109CFU/mL的菌株SS18-5发酵液，再将菌株SS18-5发酵液以3％(体积百分浓度)接种量接种于灭菌(115℃灭菌20min)后的原料乳中，于37℃培养至凝乳状态，制成植物乳杆菌SS18-5液态酸奶发酵剂(植物乳杆菌SS18-5液态酸奶发酵剂的活菌数为5.12×109CFU/mL)。
(6)分装与发酵：将接种后的牛乳分装于100mL无菌塑料容器中，于37℃条件下发酵，直至乳凝固性状良好，发酵成熟，得到益生菌酸奶。
(7)冷藏与后熟：将益生菌酸奶置于4℃条件下冷藏过夜后熟，即可食用。
2、空间诱变益生菌酸奶小试发酵工艺优化
按照实施例1步骤二的1中的工艺流程制备益生菌酸奶，根据发酵温度(33℃、35℃、37℃、39℃、41℃)、接种量(2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％)、加糖量(4.0g/100mL、4.5g/100mL、5.0g/100mL、5.5g/100mL、6.0g/100mL)进行单因素多水平试验，以感官评分(按表3进行酸奶感官评价)为试验指标，分析确定适宜的酸奶发酵工艺条件；根据单因素多水平试验结果，设计发酵温度、加糖量和接种量三因素三水平正交试验[L9(33)]，并按表3对酸奶进行感官评价和打分，同时记录凝乳时间，测定4℃后熟后(置于4℃放置12h后)酸奶的酸度和pH，通过对试验结果的极差分析(R)和K值分析确定较优的益生菌酸奶发酵工艺条件。
表3、酸奶感官要求
Figure BDA0002637680100000091
表4、GB 19302—2010标准乳酸菌活菌数
Figure BDA0002637680100000092
(1)发酵温度对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响
发酵温度对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响如图6所示。由图6可知，当温度较低时，凝乳时间较长，组织状态松散，风味欠佳；当温度较高时，有乳清析出，麦香风味不够浓郁，风味失调；当发酵温度为37℃时，凝乳时间较短，凝乳结实，风味良好，感官评价得分最高，故确定复合菌种发酵益生菌酸奶的适宜发酵温度为37℃。
(2)加糖量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响
加糖量直接影响乳酸菌的生长繁殖(白砂糖可作为一种碳源)和益生菌酸奶的风味。加糖量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响如图7所示。由图7可知，当加糖量为5％时，组织状态最好，风味最佳，感官评价得分最高，故确定复合菌种发酵益生菌酸奶的适宜加糖量为5％。
(3)接种量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响
接种量直接影响乳酸菌发酵速度和凝乳时间。接种量太低，菌种生长缓慢，凝乳时间太长；接种量太高，发酵乳产酸太快，导致乳清析出，风味失调。
接种量对复合菌种发酵益生菌酸奶感官评价的影响如图8所示。由图8可知，当接种量为3％时，凝乳时间较短，组织状态良好，具有浓郁的炒麦香味，故确定复合菌种发酵益生菌酸奶的适宜接种量为3％。
(4)正交试验优化空间诱变益生菌酸奶发酵工艺
空间诱变益生菌酸奶优化发酵工艺条件正交试验结果如表5所示。由表5可见，根据正交试验极差分析RA＞RC＞RB可知，不同发酵工艺条件对益生菌酸奶感官评价得分影响顺序为：发酵温度＞接种量＞加糖量；根据正交试验K值分析KA2＞KA3＞KA1、KB3＞KB2＞KB1、KC3＞KC2＞KC1可知，益生菌酸奶发酵工艺条件的最优组合为A2B3C3，即培养温度为37℃、加糖量为6％、接种量为4％。
表5、空间诱变益生菌酸奶优化发酵工艺条件正交试验结果
Figure BDA0002637680100000101
(5)空间诱变益生菌酸奶最优发酵工艺条件验证试验
根据正交试验优化得到的益生菌酸奶最优发酵工艺条件为发酵温度37℃、加糖量6％，接种量4％，在此优化发酵工艺条件下发酵三次进行酸奶感官评价后取平均值为55.34分。而发酵工艺条件为发酵温度37℃、加糖量5％、接种量3％的对照组酸奶的感官评价结果为54.36分。因此，优化发酵工艺后的益生菌酸奶感官评价结果更优。
三、空间诱变益生菌酸奶保质期贮藏试验
1、pH和酸度测定
采用pH计(型号PHS-25，上海雷磁)分别检测发酵成熟的益生菌酸奶(按照实施例1步骤二的1中的工艺流程制备益生菌酸奶)于4℃贮存期第0d、7d、14d、21d和28d的pH。同时分别检测发酵成熟的益生菌酸奶于4℃贮存期第0d、7d、14d 21d和28d的酸度。酸度测定方法依据国标GB5413.34-2010第二法。称取10g(精确到0、.001g)已混匀的试样，置于150mL锥形瓶中，加入20mL新煮沸冷却至室温的蒸馏水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至pH8.3为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0mL酚酞指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在30s内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入以下公式进行计算。
Figure BDA0002637680100000111
式中：X2——试样的酸度，单位为度(°T)；
c2——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V2——滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升(mL)；
m2——试样的质量，单位为克(g)；
0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升(mol/L)。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
益生菌酸奶保质期期间pH和酸度的变化结果如图9所示。贮藏期间，虽然益生菌酸奶贮存于4℃低温条件下，但是其中的益生乳酸菌仍缓慢继续生长繁殖，分解乳糖产生乳酸，使pH和酸度发生变化。由图9可知，0～28d贮藏期间，益生菌酸奶pH随着贮藏时间延长而逐渐下降，酸度随着贮藏时间的延长而逐渐上升。
2、粘度测定
采用NDJ-8S数显粘度计分别检测发酵成熟的酸奶(按照实施例1步骤二的1中的工艺流程制备益生菌酸奶)于4℃贮存期第0d、7d、14d、21d和28d的粘度，检测条件：采用3号转子，30r/min测定粘度。
益生菌酸奶保质期期间粘度的变化结果如图10所示。贮藏期间，由于益生菌酸奶的后酸化，使产酸增加，促进发酵乳凝乳，同时9-79和SS18-5益生乳酸菌在贮藏期间缓慢生长过程中产生具有稳定增稠作用的胞外多糖，使益生菌酸奶组织状态凝固更加结实，从而导致粘度升高。由图10可知，0～28d贮藏期间，益生菌酸奶随着贮藏时间的延长而粘度逐渐增加，且其粘度与贮藏时间呈正相关。
3、活菌数检测
采用梯度稀释平板倾注法分别检测发酵成熟的酸奶(按照实施例1步骤二的1中的工艺流程制备益生菌酸奶)于4℃贮存期第0d、7d、14d、21d和28d的活菌数。取1mL益生菌酸奶样品加入9mL无菌生理盐水中进行10倍递增梯度稀释，分别选取10-6、10-7和10-8三个稀释梯度样品1mL于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46℃的MRS固体培养基约15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀，每个稀释度3次重复。同时将MRS固体培养基注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱中培养(48±2)h，待菌落长出后即可计数。
益生菌酸奶保质期期间活菌数的变化结果如图11所示。贮藏期间，发酵乳酸度不断增加，pH不断降低，抑制了益生乳酸菌的生长繁殖，甚至导致部分死亡，因而活菌数在贮藏期间缓慢下降。由图11可知，在第0d时，益生菌酸奶活菌数最高为2.38×109CFU/mL；在第28d时，益生菌酸奶活菌数下降至7.53×108CFU/mL，但仍然符合益生菌酸奶乳酸菌活菌数大于106CFU/mL的GB 19302—2010标准(见表4)。
4、感官评价
选取10位专业人员组成评价小组，依据表3中的酸奶感官要求内容分别对发酵成熟的酸奶(按照实施例1步骤二的1中的工艺流程制备益生菌酸奶)于4℃贮存期第0d、7d、14d、21d和28d进行感官评价。
益生菌酸奶保质期期间感官评价的变化结果如图12所示。由图12可见，0～28d贮藏期间，由于酸奶的后酸化导致发酵乳的pH下降，虽然口感偏酸，但香味浓郁，组织状态凝固结实，感官评价得分虽然略有下降，由55.3分降至54.4分，但口感和风味仍保持良好。
实施例2、空间诱变益生菌酸奶中试发酵工艺优化
一、9-79和SS18-5菌株中试发酵条件优化
1、菌种的活化与扩大培养
取甘油保种的空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5，活化至10mL MRS培养基试管中，经2～3次传代活化后，再扩大培养至100mL MRS培养基锥形瓶中，35～37℃培养18～22h，作为5L发酵罐种子，于4℃保存备用。
2、单因素多水平试验确定9-79和SS18-5菌株中试发酵条件
(1)发酵培养基pH的确定：在含有2L MRS培养基的两个5L发酵罐中，分别在控制罗伊氏乳杆菌9-79发酵温度为37℃、发酵时间为22h、接种量为4％，以及控制植物乳杆菌SS18-5发酵温度为35℃、发酵时间为18h、接种量为4％的前提条件下，设计控制发酵罐MRS培养基pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)，设置发酵罐的转速为200r/min，并采用MRS固体培养基梯度稀释平板倾注法检测发酵液中9-79和SS18-5菌株的活菌数，研究不同pH对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响。
MRS培养基pH对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图13所示。由图13(左)可知，随着培养基pH的升高，9-79菌株的活菌数先增长后降低，在pH为6.0时活菌数最高为2.15×109CFU/mL，故确定9-79菌株适宜的中试发酵培养基pH为6.0；由图13(右)可知，随着培养基pH的升高，SS18-5菌株的活菌数亦先增加后降低，在pH为6.5时活菌数最高为4.80×1010CFU/mL，故确定SS18-5菌株适宜的中试发酵培养基pH为6.5。
(2)发酵温度的确定：在上述确定发酵培养基pH的试验结果基础上，设计发酵温度为31℃、34℃、37℃、40℃、43℃，研究不同发酵温度对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响。
发酵温度对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图14所示。由图14(左)可知，随着发酵温度的升高，9-79菌株的活菌数先增长后降低，在37℃时活菌数最高为2.19×109CFU/mL，故确定9-79菌株适宜的中试发酵温度为37℃；由图14(右)可知，随着发酵温度的升高，SS18-5菌株活菌数亦先增高后降低，于35℃时活菌数最高为4.6×1010CFU/mL，故确定SS18-5菌株适宜的中试发酵温度为35℃。
(3)发酵时间的确定：在上述确定发酵培养基pH、发酵温度的试验结果基础上，设计发酵时间为12h、14h、16h、18h、20h、22h，研究不同发酵时间对9-79菌株活菌数的影响。
发酵时间对9-79菌株活菌数的影响如图15所示。由图15可知，随着发酵时间的延长，9-79菌株的活菌数逐渐增高，在发酵时间为20h时活菌数最高为2.18×109CFU/mL，故确定9-79菌株适宜的中试发酵时间为20h。
(4)接种量的确定：在上述确定发酵培养基pH、发酵温度和发酵时间的试验结果基础上，设计接种量为1％、2％、3％、4％、5％，研究不同接种量对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响。
接种量对9-79和SS18-5菌株活菌数的影响如图16所示。由图16(左)可知，随着接种量的加大，9-79菌株活菌数逐渐增高后达到峰值，在接种量为3％时活菌数最高为2.18×109CFU/mL，故确定9-79菌株适宜的中试发酵接种量为3％；由图16(右)可知，随着接种量的加大，SS18-5菌株活菌数亦逐渐增高后达到峰值，在接种量为3％时活菌数最高为4.73×1010CFU/mL，故确定SS18-5菌株适宜的中试发酵接种量为3％。
3、响应面试验优化9-79和SS18-5菌株中试发酵条件
根据实施例2步骤一的2中的单因素多水平试验结果确定适宜的中试发酵培养基pH、发酵温度、发酵时间和接种量设计正交旋转回归试验，设置发酵罐的转速为200r/min，采用MRS培养基梯度稀释平板倾注法分别检测发酵液中9-79和SS18-5菌株的活菌数，以发酵液活菌数为响应值，据此通过二次响应面回归分析得出优化9-79和SS18-5菌株高密度中试发酵条件。
(1)9-79菌株发酵条件响应面优化结果
根据9-79菌株单因素多水平试验结果，选取各个试验因素中心点，利用DesignExpert软件进行响应面设计，并进行29批次中试发酵试验，其试验结果见表6。
表6、罗伊氏乳杆菌9-79优化Box-Behnken试验设计及结果
Figure BDA0002637680100000131
Figure BDA0002637680100000141
表7、罗伊氏乳杆菌9-79响应面方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 1.14 14 0.082 34.46 <0.0001 *
A-培养基pH 0.011 1 0.011 4.56 0.051
B-发酵温度 0.027 1 0.027 11.42 0.0045
C-发酵时间 3.33E-05 1 3.33E-05 0.014 0.9073
D-接种量 0.049 1 0.049 20.84 0.0004
AB 8.10E-03 1 8.10E-03 3.42 0.0858
AC 2.50E-05 1 2.50E-05 0.011 0.9197
AD 2.25E-04 1 2.25E-04 0.095 0.7626
BC 2.25E-04 1 2.25E-04 0.095 0.7626
BD 3.60E-03 1 3.60E-03 1.52 0.2381
CD 4.00E-04 1 4.00E-04 0.17 0.6875
A<sup>2</sup> 0.47 1 0.47 198.84 <0.0001
B<sup>2</sup> 0.72 1 0.72 303.99 <0.0001
C<sup>2</sup> 0.013 1 0.013 5.44 0.0351
D<sup>2</sup> 9.53E-03 1 9.53E-03 4.02 0.0647
残差项 0.033 14 2.37E-03
失拟项 0.031 10 3.06E-03 4.71 0.0744
误差 2.60E-03 4 6.50E-04
总和 1.18 28
由表7可知，构建模型极显著(P＜0.001)，模型的失拟项P值＞0.05，说明失拟项不显著，表明模型在整个回归区域的拟合度较好。模型的确定系数R2＝0.9718，表明模型与实际情况拟合，其校正系数Radj2＝0.9436，说明响应值变化中的94.36％能被二阶回归方程所解释。通过Design-Expert软件进行二次响应面回归分析，9-79菌株发酵因素交互作用响应面图如图17所示，由方程计算可知，当培养基pH为6.03、培养温度为37.15℃、发酵时间18.12h和接种量3.8％时，9-79菌株活菌数的最大估值为9.38lg(CFU/mL)，即2.40×109CFU/mL。
据此，得到如下多元二次响应面回归方程模型：活菌数lg(CFU/mL)＝9.35+0.03*A+0.048*B+0.001667*C+0.064*D-0.045*AB-0.0025*AC-0.0075*AD-0.0075*BC+0.03*BD+0.01*CD-0.27*A2-0.33*B2-0.045*C2-0.038*D2。
(2)SS18-5菌株发酵条件响应面优化结果
根据SS18-5菌株单因素多水平试验结果，选取各个试验因素中心点，利用DesignExpert软件进行响应面设计，并进行17批次中试发酵试验，其试验结果见表8。
表8、植物乳杆菌SS18-5优化Box-Behnken实验设计及结果
Figure BDA0002637680100000151
表9、植物乳杆菌SS18-5响应面方差分析
Figure BDA0002637680100000152
Figure BDA0002637680100000161
由表9可知，构建模型极显著(P＜0.001)，模型的失拟项P值＞0.05，说明失拟项不显著，表明模型在整个回归区域的拟合度较好。模型的确定系数R2＝0.9825，表明模型与实际情况拟合，其校正系数Radj2＝0.9599，说明响应值变化中的95.99％能被二阶回归方程所解释。通过Design-Expert软件进行二次响应面回归分析，SS18-5菌株发酵因素交互作用响应面图如图18所示，由方程计算可知，当培养基pH为6.61、培养温度为35.47℃和接种量为3.25％时，SS18-5菌株活菌数的最大估值为10.78lg(CFU/mL)，即6.12×1010CFU/mL。
据此，得到如下多元二次响应面回归方程模型：活菌数lg(CFU/mL)＝10.75+0.037*A+0.081*B+0.13*C+0.03*AB+0.03*AC-0.038BC-0.18*A2-0.19*B2-0.25*C2。
(3)9-79菌株最优发酵条件的验证试验
根据实施例2步骤一的2(1)中的响应面优化发酵试验得到的9-79菌株最优发酵条件调整为pH为6.0、培养温度为37.2℃、发酵时间为18.1h和接种量为3.8％，在此优化条件下采用5L发酵罐进行三批次中试发酵试验，检测发酵液中9-79菌株活菌数的平均值结果为2.29×109CFU/mL，其响应值拟合率为95.41％，说明由回归方程得到的优化中试发酵条件各因素参数准确可靠。
(4)SS18-5菌株最优发酵条件的验证试验
根据实施例2步骤一的2(2)中响应面优化发酵试验得到的SS18-5菌株最优发酵条件调整为pH为6.6、培养温度为35.5℃和接种量为3.3％，在此优化条件下采用5L发酵罐进行三批次中试发酵试验，检测发酵液中SS18-5菌株活菌数的平均值结果为5.84×1010CFU/mL，其响应值拟合率为95.42％，说明由回归方程得到的优化中试发酵条件各因素参数准确可靠。
二、9-79和SS18-5菌株直投式干粉发酵剂的制备及冻干保护剂的优化
1、S23-79和SS18-5菌株高密度中试发酵
(1)9-79菌株发酵液的制备：将甘油保种的罗伊氏乳杆菌9-79菌株活化2～3代后，于MRS培养基中35～37℃培养18～22h后，得到菌株9-79的种子液；将该种子液接种于2LMRS培养基中，采用5L发酵罐控制发酵培养基pH为6.0(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)、发酵温度为37.2℃、发酵时间为18.1h、接种量为3.8％，设置发酵罐的转速为200r/min，得到活菌数为3.62×109CFU/mL的罗伊氏乳杆菌9-79发酵液。
取甘油保种的空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5，活化至10mL MRS培养基试管中，经2～3次传代活化后，再扩大培养至100mL MRS培养基锥形瓶中，35～37℃培养18～22h，作为5L发酵罐种子，于4℃保存备用。
(2)SS18-5菌株发酵液的制备：将甘油保种的植物乳杆菌SS18-5菌株活化2～3代后，于MRS培养基中35～37℃培养18～22h后，得到菌株9-79的种子液；将该种子液接种于2LMRS培养基中，采用5L发酵罐控制发酵培养基pH6.6(以发酵罐自动流加2mol/L的NaOH调节发酵液pH)、发酵温度为35.5℃、发酵时间为18.0h，接种量为3.3％，设置发酵罐的转速为200r/min，得到活菌数为5.84×1010CFU/mL的植物乳杆菌SS18-5发酵液。
2、离心浓缩
分别将罗伊氏乳杆菌9-79发酵液和植物乳杆菌SS18-5发酵液，于4℃条件下以4000r/min离心20min，弃上清液，分别得到9-79菌泥和SS18-5菌泥。
3、冻干保护剂的优化
将9-79菌泥和SS18-5菌泥分别溶于15％脱脂奶粉、15％麦芽糊精、10％麦芽糊精+5％脱脂奶粉、5％麦芽糊精+10％脱脂奶粉、20％脱脂奶粉和20％麦芽糊精6种质量体积百分浓度的灭菌保护剂中(保护剂的用量是离心之前发酵液体积的1/10)，并将菌泥用保护剂洗刷至已灭菌且恒重的50mL离心管中，旋涡振荡1min，充分混匀，进行下一步的活菌计数和冻干试验。(1)冻干前样品活菌计数：于无菌操作台中分别移取1mL样品梯度10倍递增稀释至10-7、10-8、10-9，采用MRS固体培养基梯度稀释平板倾注法进行冻干前活菌计数(CFU/mL)；(2)冻干试验：将上述50mL离心管于无菌操作台中加盖，于-40℃冰箱预冻12～13h后，采用美国LABCONCO真空冷冻干燥机于真空度为0.12～0.16mBar冻干48～60h至粉末状，得到干粉发酵剂；(3)冻干后样品活菌计数：于无菌操作台中分别称量1g冻干菌粉，用无菌生理盐水复原至冻干前水分，采用MRS固体培养基梯度稀释平板倾注法进行冻干后活菌计数(CFU/mL)，计算各保护剂中的9-79和SS18-5菌株的存活率(％)。存活率(％)＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100％。
对9-79和SS18-5菌株采用不同组合保护剂进行冻干后，检测其冻干前、后活菌数，并计算存活率。由表10和表11可知，不同保护剂组合对9-79和SS18-5菌株冻干菌粉活菌数有不同影响，但整体存活率均大于80％。其中9-79菌株在10％脱脂奶粉+5％麦芽糊精组合下活菌数存活率最高为94.93％；SS18-5菌株的总体存活率要高于9-79菌株，在10％脱脂奶粉+5％麦芽糊精组合下活菌数存活率最高为98.67％。
综上所述，9-79和SS18-5菌株较优冻干保护剂组合均为10g/100mL脱脂奶粉+5g/100mL麦芽糊精，冻干后的9-79和SS18-5菌株干粉发酵剂的活菌数分别为3.56×1010CFU/mL和5.95×1011CFU/mL，存活率分别为94.93％和98.67％。
表10、不同组合保护剂对9-79菌株冻干前后活菌数及存活率的影响
Figure BDA0002637680100000171
表11、不同组合保护剂对SS18-5菌株冻干前后活菌数及存活率的影响
Figure BDA0002637680100000172
三、空间诱变复合益生菌酸奶中试发酵工艺流程及其在保质期贮藏过程中营养成分和风味物质含量的变化
1、将20L原料乳加热至60℃预热，经配料、均质、杀菌、冷却和接种S23-79和SS18-5菌株直投式干粉发酵剂后，分装于150mL无菌塑料容器中，于37℃保温发酵，待凝乳后置于4℃条件下冷藏过夜后熟，制得成品复合益生菌酸奶。
(1)原料乳：采用全灭菌伊利百利包240mL袋装纯牛乳。
(2)预热、配料和过滤：将原料乳加热到60℃，加入6％白砂糖(每100mL原料乳加入6g白砂糖)，混匀后过滤。
(3)均质：在8～10MPa压力下对预热的原料乳进行均质。目的是使乳凝固均匀，质地细密平滑，防止脂肪上浮。
(4)杀菌：将原料乳于90℃条件下保温5～10min，得到灭菌乳。
(5)接种复合干粉酸奶发酵剂与发酵：待灭菌乳冷却至37℃，将空间诱变罗伊氏乳杆菌9-79和空间诱变植物乳杆菌SS18-5直投式干粉酸奶发酵剂按照CFU之比为1:10的比例混合，得到复合发酵菌剂，再将复合发酵菌剂以4‰(质量体积千分浓度)的接种量接种于灭菌乳(每毫升所述灭菌乳中添加的所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌含量为4.0×107CFU，植物乳杆菌含量为4.0×108CFU)中，混匀后分装于150mL无菌塑料容器中，于37℃条件下保温发酵3.5～4.5h至凝乳状态。
所述罗伊氏乳杆菌9-79直投式干粉酸奶发酵剂的活菌数为3.56×1010CFU/mL；植物乳杆菌SS18-5直投式干粉酸奶发酵剂的活菌数为5.95×1011CFU/mL。
(6)冷藏与后熟：将凝固好的酸奶置于4℃条件下冷藏过夜后熟，制得成品复合益生菌酸奶。
2、空间诱变复合益生菌酸奶贮藏期间营养成分含量的测定
将实施例2步骤三的1中制备成熟的益生菌酸奶于4℃条件下冷藏，分别在贮藏第1d和第28d，根据表12所示的相关国家标准委托北京市营养源研究所检测对复合益生菌酸奶营养物质含量进行检测。
表12、营养成分含量检测方法
Figure BDA0002637680100000181
Figure BDA0002637680100000191
由表13可见，贮藏第28d的益生菌酸奶中蛋白质含量相比较于第1d时无变化，总氨基酸含量下降了3.19％；贮藏第28d的益生菌酸奶中的脂肪和总脂肪酸含量比第1d分别降低了2.39％和7.58％，这可能是因为部分脂肪被益生乳酸菌分解所致；贮藏第28d的益生菌酸奶中维生素B2、烟酸和泛酸含量分别降低了4.96％、9.09％和10.82％，而维生素B6、维生素B12和叶酸含量分别提高了25.00％、28.57％和24.12％；丙酸和丁酸含量均小于0.005％，乙酸含量提高了46.05％，而乳酸含量下降了21.30％。虽然在37℃酸奶发酵过程中植物乳杆菌SS18-5抑制了罗伊氏乳杆菌9-79的生长繁殖，但是随着4℃贮藏时间的延长，罗伊氏乳杆菌9-79生长繁殖占优势，导致牛乳中的乳糖被益生乳酸菌分泌的β-D-半乳糖苷酶分解为半乳糖和葡萄糖，葡萄糖经过9-79菌株的异型乳酸发酵作用，产生大量的乙酸和少量的乳酸等产物；而植物乳杆菌SS18-5随着4℃贮藏时间的延长生长繁殖并不占优势，致使SS18-5菌株通过同型乳酸发酵产生乳酸的能力降低，最终导致贮藏第28d的益生菌酸奶中的乙酸含量相对升高，而乳酸含量相对降低。由于乙酸含量的升高，导致4℃贮藏的益生菌酸奶pH降低和酸度升高。尽管如此，4℃贮藏至28d的益生菌酸奶的酸度小于90°T，仍可满足酸奶饮用的酸度要求。
表13、复合益生菌酸奶贮藏第1d和28d营养成分检测结果
营养成分 贮藏第1d酸奶 贮藏第28d酸奶 单位
蛋白质 3.40 3.40 g/100g
脂肪 3.76 3.67 g/100g
维生素B1 ＜0.03 ＜0.03 mg/100g
维生素B2 0.141 0.134 mg/100g
维生素B6 0.06 0.08 mg/100g
维生素B12 ＜0.1 0.14 μg/100g
烟酸 0.22 0.20 mg/100g
泛酸 0.379 0.338 mg/100g
叶酸 17.3 22.8 μg/100g
乳酸 1.08 0.850 ％
乙酸 0.0498 0.0923 ％
丙酸 ＜0.005 ＜0.005 ％
丁酸 ＜0.005 ＜0.005 ％
总氨基酸 3.45 3.34 g/100g
总脂肪酸 3.43 3.17 g/100g
3、空间诱变复合益生菌酸奶贮藏期间风味物质含量的测定
将实施例2步骤三的1中制备成熟的益生菌酸奶于4℃条件下冷藏，分别在贮藏第1d和第28d委托山东海能科学仪器有限公司G.A.S.事业部对复合益生菌酸奶风味物质含量进行检测。具体方法如下：利用
Figure BDA0002637680100000202
气相色谱离子迁移谱仪(型号：FlavourSpec，德国G.A.S.公司)测定贮藏第1d和28d复合益生菌酸奶风味物质含量。①样品处理：取样品1mL置于20mL顶空瓶中待分析。②气相-离子迁移谱单元分析条件：分析时间30min；色谱柱类型FS-SE-54-CB-1 15m ID:0.53mm；柱温60℃；载气/漂移气N2；IMS温度45℃。③自动顶空进样单元分析条件：孵化温度40℃；孵化时间15min；进样体积500μL；进样针温度85℃；孵化转速500r/min。④分析软件：仪器配套的分析软件包括LAV(Laboratory AnalyticalViewer)和三款插件(Dynamic PCA插件、Reporter插件、Gallery Plot插件)以及GC×IMSLibrary Search，可以分别从不同角度进行样品分析。⑤测量三次取平均值，并进行数据处理与分析。
由表14可知，复合益生菌酸奶贮藏第28d后，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、2,3-戊二酮、2-戊酮、乙酸丙酯、苯甲醛、苯乙酮等风味物质相较于第1d时具有显著提高。其中，乙醇具有辛辣味，其含量提高了1.24倍；丙酮具有辛辣味，其含量提高了2.44倍；乙酸乙酯具有果香味，其含量提高了12.67倍；2,3-戊二酮具有甜白脱、奶油和焦糖香气，其含量提高了2.51倍；2-戊酮具有辛辣味，其含量提高了7.58倍；乙酸丙酯具有特殊的水果香味，其含量提高了5.14倍；2-庚酮具有芳香味，其含量提高了1.21倍；苯甲醛具有特殊的杏仁气味，其含量提高了3.52倍；苯乙酮具有水果香味，其含量提高了1.42倍。而1-丙醇、乙酸戊酯和正壬醛的含量有所降低。从总体来讲，这些风味物质均为空间诱变复合益生菌酸奶提供了令人愉悦的水果香、奶油香和芳香等风味，在贮存期间其风味有所提升。
表14、复合益生菌酸奶贮藏第1d和28d风味物质检测结果
Figure BDA0002637680100000201
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)或其发酵产物与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或其发酵产物在如下A1)-A3)任一种中的应用：
A1)制备发酵乳制品；
A2)制备益生菌酸奶；
A3)制备复合发酵菌剂。
2.一种复合菌，其由罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成。
3.一种复合发酵菌剂，其活性成分为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌剂和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合发酵菌剂，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌剂和所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌剂的CFU之比为1:(5-15)。
5.权利要求3或4所述的复合发酵菌剂的制备方法，为如下C1)或C2)：
C1)将罗伊氏乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到罗伊氏乳杆菌液态发酵剂；
将植物乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到植物乳杆菌液态发酵剂；
所述复合发酵菌剂由所述罗伊氏乳杆菌液态发酵剂和所述植物乳杆菌液态发酵剂组成；
C2)将罗伊氏乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到罗伊氏乳杆菌发酵液，将所述罗伊氏乳杆菌发酵液离心，弃上清液，得到罗伊氏乳杆菌菌泥；将所述罗伊氏乳杆菌菌泥和冻干保护剂混匀，冻干，制成罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂；
将植物乳杆菌接种至培养基中进行发酵培养，得到植物乳杆菌发酵液，将所述植物乳杆菌发酵液离心，弃上清液，得到植物乳杆菌菌泥；将所述植物乳杆菌菌泥和冻干保护剂混匀，冻干，制成植物乳杆菌干粉发酵剂；
所述复合发酵菌剂由所述罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂和所述植物乳杆菌干粉发酵剂组成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述C1)中，所述罗伊氏乳杆菌液态发酵剂和所述植物乳杆菌液态发酵剂的CFU之比为1:(5-15)；
或，所述C1)中，所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养条件如下：培养基初始pH为6.5、发酵温度为37℃、发酵时间为22h、接种量为4％；
或，所述C1)中，所述植物乳杆菌的发酵培养条件如下：培养基初始pH为7.0、发酵温度为35℃、发酵时间为18h、接种量为4％；
或，所述C2)中，所述罗伊氏乳杆菌干粉发酵剂和所述植物乳杆菌干粉发酵剂的CFU之比为1:(5-15)；
或，所述C2)中，所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养条件如下：控制培养基pH为6.0、发酵温度为37.2℃、发酵时间为18.1h、接种量为3.8％；
或，所述C2)中，所述植物乳杆菌的发酵培养条件如下：控制培养基pH为6.6、发酵温度为35.5℃、发酵时间为18.0h、接种量为3.3％；
或，所述C2)中，所述冻干保护剂为10％脱脂奶粉+5％麦芽糊精。
7.权利要求2所述的复合菌或权利要求3或4所述的复合发酵菌剂或按照权利要求5或6所述方法制备的复合发酵菌剂在制备发酵乳制品或益生菌酸奶中的应用。
8.一种发酵乳制品或益生菌酸奶的生产方法，包括以牛乳或羊乳或其乳粉为原料乳，白砂糖为辅料，利用权利要求2所述的复合菌或权利要求3或4所述的复合发酵菌剂或按照权利要求5或6所述方法制备的复合发酵菌剂进行发酵生产的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述原料乳为牛乳；
或，所述白砂糖的加入量为6％；
或，每毫升所述灭菌乳中添加的权利要求5中C1)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量不低于4.0×106CFU，植物乳杆菌的含量不低于4.0×107CFU；
或，每毫升所述灭菌乳中添加的权利要求5中C2)所述复合发酵菌剂中的罗伊氏乳杆菌的含量不低于4.0×107CFU，植物乳杆菌的含量不低于4.0×108CFU；
或，所述复合发酵菌剂的接种量为4‰-4％；
或，所述发酵生产的条件如下：37℃发酵至凝乳状态。
10.根据权利要求1所述的应用或权利要求2所述的复合菌或权利要求3或4所述的复合发酵菌剂或按照权利要求5或6所述方法制备的复合发酵菌剂或权利要求7所述的应用或权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)Fullarton-9-79CGMCC No.14943；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Fullarton-SS18-5 CGMCC No.14917。
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