CN107164274A - 一种乳酸菌复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种乳酸菌复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳酸菌复合菌剂及其制备方法和应用，所述乳酸菌复合菌剂包括罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述乳酸菌复合菌剂的制备方法为：将罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别进行液体深层发酵培养，然后离心收集菌泥，经真空冷冻干燥获得冻干复合菌粉即得所述乳酸菌复合菌剂。本发明提供的乳酸菌复合菌剂产量高、发酵时间短，可应用于乳酸菌固体饮料或乳酸菌饲料添加剂中。本发明提供的乳酸菌复合菌剂的制备方法工艺简单、发酵时间短、产量高、成本低、适合工业化生产，具有较大的推广应用价值。

Description

一种乳酸菌复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生态制剂领域，更具体地，涉及一种乳酸菌复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
微生态制剂是一种肠道菌群调节剂，其具有防治动物疾病、调节免疫功能、改善养殖环境等多种功能。目前应用于微生态制剂的益生菌种主要有乳酸菌类、芽孢杆菌和酵母菌等。乳酸菌是人和动物消化道微生态区系中的优势菌群。研究表明，乳酸菌能产生有机酸、过氧化氢、细菌素等生物活性物质，能抑制动物肠道病原菌生长，促进消化吸收，维护肠道微生态平衡，增强免疫功能。我国对微生态制剂的研究始于20世纪80年代，但直到最近几年才在生产中应用。
由于饲用抗生素的滥用导致的内源性感染，耐药菌株增加，禽畜免疫力降低，肠道正常菌群的破坏及其在畜产品和环境中的残留等问题在我国更为突出，农业部禁止使用的抗生素品种越来越多。今后养殖业的发展趋势是抗生素的全面禁止，因此抗生素替代品的研制需求越来越迫切。微生态制剂安全无毒，具有提高生产性能、防治动物疾病、调节免疫功能、改善养殖环境和提高饲料转化率等多种功能,克服了应用抗生素造成的菌群失调、出现耐药性菌株及药物的不良反应，不仅可以防病治病，而且可以降低污染及改善环境，在实际生产中推广应用有着良好的经济效益和社会效益，有效促进我国养殖业的健康发展。在国外，微生态制剂在畜牧业上的作用日益明显，并且应用领域逐渐扩大，在水产养殖上也得到推广应用。
目前，单一微生态制剂在养殖业中应用报道较多，关于复合微生态制剂尤其是不同菌株协同配比在养殖中的效果研究较少。研究表明，单一微生态制剂存在着作用单一、质量不稳定、成本高、杀菌效果不如抗生素等缺陷，复合微生态制剂对动物的促生长效果更好。因此，研究一种发酵工艺简单、发酵时间短、产量高、适合工业化生产的可替代抗生素的复合微生态制剂显得极为迫切。
发明内容
本发明的目的在于克服以上单一微生态制剂作用单一、产量低、发酵时间长等缺陷，提供一种乳酸菌复合菌剂，本发明提供的乳酸菌复合菌剂产量高、发酵时间短，可应用于乳酸菌固体饮料或乳酸菌饲料添加剂中。
本发明的另一目的在于提供上述乳酸菌复合菌剂在乳酸菌固体饮料或乳酸菌饲料添加剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种乳酸菌复合菌剂，所述乳酸菌复合菌剂包括罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述乳酸菌复合菌剂的制备方法为：将罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别进行液体深层发酵培养，然后离心收集菌泥，经真空冷冻干燥获得冻干复合菌粉即得所述乳酸菌复合菌剂；
其中，所述液体深层发酵培养阶段中：
所述罗伊氏乳杆菌的种子培养基为：葡萄糖8～12g/L、蔗糖40～60g/L、酵母提取物15～20g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5-1.5mL/L；所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖8～12g/L、蔗糖60～80g/L、酵母提取物30～50g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5～1.5 mL/L；
所述植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的种子培养基为MRS液体培养基，其组成为：蛋白胨5～15g/L、牛肉浸膏5～15g/L、酵母提取物4～6g/L、葡萄糖15～20g/L、乙酸钠4～6g/L、吐温-80 0.5-1.5mL/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L；
所述植物乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖30～50g/L、酵母浸膏40～60g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3 g/L、吐温-800.5～1.5 mL/L；
所述鼠李糖乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖30～50g/L、蛋白胨30～50g/L、酵母浸膏10～15g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3 g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5～1.5 mL/L；
各乳杆菌在种子培养基中的培养时间为7～8h，在发酵培养基中的培养时间为8～10h。
罗伊氏乳杆菌是目前已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌，可稳定定殖于动物肠道中，分泌罗伊氏菌素等抑菌物质，抑制多种病原微生物的增殖，并通过激活免疫系统，增加抗炎细胞因子，降低炎症因子来提高动物免疫力。我国卫生部于2003年批准了罗伊氏乳杆菌可作为人类保健品的微生物菌种，该菌被认为是唯一能够对寄主产生广谱抗菌作用的肠道乳杆菌。罗伊氏乳杆菌可通过与其他乳杆菌复配应用于乳酸菌固体饮料或饲料添加剂中，如罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌可通过提高抗体和淋巴细胞水平来预防仔猪腹泻，降低料肉比，提高生产性能；罗伊氏乳杆菌还可促进儿童肠道蠕动，促进消化改善便秘，对儿童轮状病毒腹泻有良好的治疗效果。罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，可以通过下调患者神经性膀胱炎中炎症反应细胞因子而使患者膀胱炎的症状得以减轻。
本发明通过将罗伊氏乳杆菌植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌复配制备得到一种乳酸菌复合菌剂，该乳酸菌复合菌剂可发挥出三种乳酸菌的作用，具有质量稳定，杀菌效果强的优点。本发明提供的乳酸菌复合菌剂应用于人体和动物肠道微生态体系时，既可调节胃肠道微生态平衡、改善肠道环境、提高人体免疫性能、降低腹泻发生、增强人体健康，又可作为饲料中抗生素替代品、提高断奶仔猪的成活率、改善猪只肠道健康、降低料肉比和残次发生率，减少仔猪腹泻，具有一定的推广应用价值。
本发明通过对上述三种乳杆菌的种子培养基和发酵培养基的组分及含量进行优化，可在较短的时间内制备高产量的乳酸菌复合菌剂。另外，本发明提供的乳酸菌复合菌剂的制备方法工艺简单、成本低、适合工业化生产。
作为一种优选地技术方案，所述罗伊氏乳杆菌的种子培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
作为一种优选地技术方案，所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖80 g/L、酵母提取物40 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
作为一种优选地技术方案，所述植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的种子培养基为：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
作为一种优选地技术方案，所述植物乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、酵母浸膏50 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
作为一种优选地技术方案，所述鼠李糖乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、蛋白胨40 g/L、酵母浸膏10 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
在本发明中，所述培养基的pH为6.2～6.4。
在本发明中，所述罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的液体深层发酵培养阶段的具体操作为：
甘油管保藏菌种以2%接种量接种至三角瓶中，装液量为60%，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。24 h后，以2%～3%的接种量接种至二级种子瓶中，装液量为80%，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。培养约7h～8h后，以3%的接种量接种至发酵罐中。
发酵培养条件为：温度37℃，转速30～50rpm，压力0.04～0.06MPa，pH值5.5～6.5，装液量80%，待发酵液OD600值和pH值趋于稳定后开始放罐，培养时间约10～12 h，放罐时罐温降至20℃左右。
在本发明中，所述菌泥在真空冷冻干燥过程中使用冻干保护剂进行保护，所述冻干保护剂可以为本领域常规的冻干保护剂。
优选地，所述冻干保护剂由脱脂奶粉、乳糖、海藻糖、抗结块剂按质量比为12:7:5:1的配比组成；所述菌泥与所述冻干保护剂质量比为1:1。
作为一种优选地技术方案，所述乳酸菌复合菌剂中，所述罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活菌制剂的质量比为1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5。
更为优选地，所述罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活菌制剂的质量比为2：1：1。按照此质量比复配得到的乳酸菌复合菌剂，可应用于人体和动物肠道微生态体系，发挥出三种乳酸菌的作用，并且质量稳定、杀菌效果强。
上述乳酸菌复合菌剂在乳酸菌固体饮料或乳酸菌饲料添加剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述乳酸菌复合菌剂在乳酸菌固体饮料中的添加量为6～10%。
优选地 ，所述乳酸菌复合菌剂在乳酸菌饲料添加剂中的添加量为15～20%。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌进行复配，得到了一种乳酸菌复合菌剂，本发明通过对这三种乳杆菌的种子培养基和发酵培养基的组分及含量进行优化，可在较短的时间内制备高产量的乳酸菌复合菌剂。另外，本发明提供的乳酸菌复合菌剂的制备方法工艺简单、成本低、适合工业化生产。
本发明提供的乳酸菌复合菌剂可发挥罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌三种乳酸菌的作用，具有质量稳定、杀菌效果强的优点；还具有调节胃肠道微生态平衡、改善肠道环境、提高人体免疫性能、降低腹泻发生、增强人体健康的作用，可应用于乳酸菌固体饮料中。另外，本发明提供的乳酸菌复合菌剂还可以提高断奶仔猪的成活率、改善猪只肠道健康、降低料肉比和残次发生率、减少仔猪腹泻，作为抗生素的替代品被应用于乳酸菌饲料添加剂中。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例中所述的罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌为商业化购买的菌种，例如可以广东省微生物种质资源库购买。
实施例1 罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备
1. 液体深层发酵培养
将罗伊氏乳杆菌甘油管保藏菌种以2%接种量接种至用250mL三角瓶装着的150mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。24 h后，以3%的接种量接种至用1L三角瓶装着的800mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。培养约7h后，以3%的接种量接种至200mL发酵罐中，内装160mL发酵培养基。
发酵培养条件为：温度37℃，转速50rpm，压力0.05MPa，通风量1.5L/H，发酵过程中pH值用30%的氢氧化钾溶液控制在5.5～6.5之间，待发酵液OD600值和pH值趋于稳定后开始放罐，培养时间约8 h，放罐时罐温降至20℃左右，罗伊氏乳杆菌发酵液放罐活菌数为1010cfu/mL。
在本实施例中，罗伊氏乳杆菌的种子培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25g/L、吐温-80 1 mL/L，pH =6.2～6.4。
罗伊氏乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖80 g/L、酵母提取物40 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1mL/L，pH=6.2～6.4。
2. 冻干菌剂的制备
待罗伊氏乳杆菌发酵液温度降至20℃左右时，离心收集菌泥，离心菌体管道注意降温冷却，离心结束后收得菌泥4Kg，加入脱脂奶粉1.92 Kg，乳糖1.12 Kg，海藻糖0.8Kg，抗结块剂0.16Kg作为冻干保护剂，用11L无菌水溶解混匀。然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冻干。
冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，这是干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。冻干结束后，菌剂应为饼状，收集冻干菌体，过100目筛，粉碎后，收集菌粉重量为4.5Kg，将菌粉置于-20℃冰箱保存。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为2×1011cfu/g。
实施例2 植物乳杆菌冻干菌粉的制备
1. 液体深层发酵培养
将植物乳杆菌甘油管保藏菌种以2%接种量接种至用250mL三角瓶装着的150mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。24 h后，以3%的接种量接种至用1L三角瓶装着的800mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。培养约7h后，以3%的接种量接种至200mL发酵罐中，内装160mL发酵培养基。
发酵培养条件为：温度37℃，转速80rpm，压力0.05MPa，通风量0 L/H，发酵液初始pH值为5.8，发酵过程中pH值用氨水控制在5.8左右，带发酵液OD600值和pH值趋于稳定后开始放罐，培养时间约10 h，放罐时罐温降至20℃左右，植物乳杆菌发酵液放罐活菌数为1.26×1010cfu/mL。
本实施例中，植物乳杆菌的种子培养基为：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
植物乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、酵母浸膏50 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
2. 冻干菌剂的制备
待植物乳杆菌发酵液温度降至20℃左右时，离心收集菌泥，离心菌体管道注意降温冷却，离心结束后收得菌泥5Kg，加入脱脂奶粉2.4 Kg，乳糖1.4 Kg，海藻糖1Kg，抗结块剂0.2Kg作为冻干保护剂，用13.75L无菌水溶解混匀。然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冻干。
冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，这是干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。冻干结束后，菌剂应为饼状，收集冻干菌体，过100目筛，粉碎后，收集菌粉重量为6.5Kg左右，置于-20℃冰箱保存。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为4×1011cfu/g。
实施例3 鼠李糖乳杆菌冻干菌粉的制备
1. 液体深层发酵培养
将鼠李糖乳杆菌甘油管保藏菌种以2%接种量接种至用250mL三角瓶装着的150mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。24 h后，以3%的接种量接种至用1L三角瓶装着的800mL种子培养基中，于37℃，5%的CO2培养箱中静置培养。培养约7h后，以3%的接种量接种至200mL发酵罐中，内装160mL发酵培养基。
发酵培养条件为：温度37℃，转速80rpm，压力0.05MPa，通风量0 L/H，发酵液初始pH值为5.8，发酵过程中pH值用氨水控制在5.8左右，带发酵液OD600值和pH值趋于稳定后开始放罐，培养时间约10 h，放罐时罐温降至20℃左右，鼠李糖乳杆菌发酵液放罐活菌数为6×109cfu/mL。
本实施例中，鼠李糖乳杆菌的种子培养基为：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
鼠李糖乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、蛋白胨40 g/L、酵母浸膏10 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1mL/L。
2. 冻干菌剂的制备
待植物乳杆菌发酵液温度降至20℃左右时，离心收集菌泥，离心菌体管道注意降温冷却，离心结束后应收得菌泥3Kg，加入脱脂奶粉1.44 Kg，乳糖0.84 Kg，海藻糖0.6Kg，抗结块剂0.120Kg作为冻干保护剂，用8.25L无菌水溶解混匀。然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冻干。冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，这是干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。冻干结束后，冻干菌剂应为饼状，收集冻干菌粉，过100目筛，粉碎后，收集菌粉重量为3.75Kg左右，置于-20℃冰箱保存。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为3×1011cfu/g。
实施例4 一种乳酸菌复合菌剂
一种乳酸菌复合菌剂，所述乳酸菌复合菌剂由如下组分组成：
实施例1制备得到的罗伊氏乳杆菌冻干菌粉4 Kg、实施例2制备得到的植物乳杆菌冻干菌粉2Kg、实施例3制备得到的鼠李糖乳杆菌冻干菌粉2Kg。
将上述各菌粉混合即得所述乳酸菌复合菌剂。
对照例1 罗伊氏乳杆菌冻干菌粉的制备
本对照例中的罗伊氏乳杆菌的种子培养基为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。种子培养基中培养的时间为8h。
发酵培养基为为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。发酵培养基中培养的时间为16h，罗伊氏乳杆菌发酵液放罐活菌数为2×109cfu/mL。
本对照例中其它步骤均与实施例1相同。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为1.6×1011cfu/g，产量为1Kg。
表1为实施例1及对照例1的产量表。
表1 实施例1及对照例1的产量表
总产量（cfu）=菌粉活菌数（cfu/g）*产量（Kg）
由表1可知，实施例1中乳酸菌的菌粉活菌总产量远大于对照例1中的菌粉活菌总产量，这表明本发明提供的罗伊氏乳杆菌的种子培养基和发酵培养基能够在较短的时间内制备出高产量的罗伊氏乳杆菌。
对照例2 植物乳杆菌冻干菌粉的制备
本对照例中的植物乳杆菌的种子培养基为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。种子培养基中培养的时间为8h。
发酵培养基为为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。发酵培养基中培养的时间为16h，植物乳杆菌发酵液放罐活菌数为4×109cfu/mL。
本对照例中其它步骤均与实施例1相同。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为3.6×1011cfu/g，产量为2.3Kg。
表2为实施例2及对照例2的产量表。
表2 实施例2及对照例2的产量表
总产量（cfu）=菌粉活菌数（cfu/g）*产量（Kg）
由上表2可知，实施例2中乳酸菌的菌粉活菌总产量远大于对照例2中的菌粉活菌总产量，这表明本发明提供的植物乳杆菌的种子培养基和发酵培养基能够在较短的时间内制备出高产量的植物乳杆菌。
对照例3 鼠李糖乳杆菌冻干菌粉的制备
本对照例中的鼠李糖乳杆菌的种子培养基为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。种子培养基中培养的时间为8h。
发酵培养基为为常规的MRS培养基，配方为蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.2～6.4。发酵培养基中培养的时间为16h，鼠李糖乳杆菌发酵液放罐活菌数为3×109cfu/mL。
本对照例中其它步骤均与实施例3相同。
取冻干粉碎后的粉状活菌制剂，按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数为2.5×1011cfu/g，产量为1.8Kg。
表3为实施例3及对照例3的产量表。
表3 实施例3及对照例3的产量表
总产量（cfu）=菌粉活菌数（cfu/g）*产量（Kg）
由上表3可知，实施例3中鼠李糖乳杆菌的菌粉活菌总产量均远大于对照例3中的菌粉活菌总产量，这表明本发明提供的鼠李糖乳杆菌的种子培养基和发酵培养基能够在较短的时间内制备出高产量的鼠李糖乳杆菌。
应用试验例1 乳酸菌复合菌剂在乳酸菌固体饮料中的应用
一种乳酸菌固体饮料，所述固体饮料由如下质量的组分组成：
实施例4制备得到的乳酸菌复合菌剂8 Kg、脱脂奶粉24 Kg、葡萄糖62.67 Kg、乳糖37.33 Kg、低聚果糖1.33Kg。
将上述各原料用混料机混合均匀后即得乳酸菌固体饮料。
抽样按企标Q/GZWSW 0001S-2016《乳酸菌固体饮料》方法测定菌粉活菌数，测定用此方法生产的乳酸菌固体饮料成品活菌数为2×1010cfu/g，水分含量为2.67%。
对上述乳酸菌固体饮料的性能进行测试，测试方法为：选取青少年中年老年人共30人，每天晚饭后，用37℃温开水冲服一袋上述乳酸菌固体饮料，1g/袋，活菌数为2×1010cfu/g，乳酸菌固体饮料不得与抗生素同时服用，试验期6个月。
试验结果如下：有25人表明服用1周后，食欲明显增加，30人均状态良好，胃肠道未有不适症状；24人表明身体状况良好，服用期间未有腹泻发生，与之前相比，腹泻率显著下降；6人表明，感冒服用抗生素后，停药，再服用乳酸菌固体饮料，没有腹泻及食欲不振情况发生，身体状况良好。这表明本试验例制备得到的乳酸菌固体饮料可调节胃肠道微生态平衡，改善肠道环境，提高人体免疫性能，降低腹泻发生，增强人体健康。
应用试验例2 乳酸菌复合菌剂在乳酸菌饲料添加剂中的应用
一种乳酸菌饲料添加剂，所述乳酸菌饲料添加剂由如下质量的组分组成：
实施例4制备得到的乳酸菌复合菌剂8 Kg、玉米淀粉8 Kg、麦芽糊精4 Kg、碳酸钙2 Kg。
将上述各原料用混料机混合均匀后即得乳酸菌饲料添加剂。
抽样按国标GB 4789.35-2010方法测定乳酸菌饲料添加剂成品活菌数，用此方法生产的菌粉活菌数应为1.3×1011cfu/g，水分含量为2.43%。
对上述乳酸菌复合菌剂的性能进行测试，测试方法为：随机选取60头30日龄断奶仔猪，大白×大长×杜络克三元杂交猪，平均重约10Kg，从中挑选20头体型外貌较差的作为弱仔组，其它40头随机分为两组，分别为对照组和实验组，其中对照组饲喂基础日粮，实验组饲喂含0.01%的实施例5所述罗伊氏乳杆菌饲料添加剂的基础日粮，弱仔组饲喂含0.02%的罗伊氏乳杆菌饲料添加剂的基础日粮，对照组和实验组随机分栏，每栏10头，弱仔组单栏饲养，试验期30天，试验开始前，对猪舍进行彻底清洁消毒，仔猪自由采食饮水，按猪场常规饲养管理方式进行。
测定指标包括日增重、料肉比、腹泻率，测试结果见下表4。
表4 罗伊氏乳杆菌饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响
注：*代表与对照组相比差异显著，**代表与对照组相比差异极显著。
由上表4可知，在饲料中不添加抗生素的前提下，本应用试验例所制备的乳酸菌复合菌剂可提高断奶仔猪的成活率，改善猪只肠道健康，降低料肉比和残次发生率、减少仔猪腹泻，并且与对照组差异显著。

Claims (10)

1.一种乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述乳酸菌复合菌剂包括罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，所述乳酸菌复合菌剂的制备方法为：将罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别进行液体深层发酵培养，然后离心收集菌泥，经真空冷冻干燥获得冻干复合菌粉即得所述乳酸菌复合菌剂；
其中，所述液体深层发酵培养阶段中：
所述罗伊氏乳杆菌的种子培养基为：葡萄糖8～12g/L、蔗糖40～60g/L、酵母提取物15～20g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5～1.5mL/L；所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖8～12g/L、蔗糖60～80g/L、酵母提取物30～50g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5～1.5 mL/L；
所述植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的种子培养基为MRS液体培养基，其组成为：蛋白胨5～15g/L、牛肉浸膏5～15g/L、酵母提取物4～6g/L、葡萄糖15～20g/L、乙酸钠4～6g/L、吐温-80 0.5-1.5mL/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L；
所述植物乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖30～50g/L、酵母浸膏40～60g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3 g/L、吐温-800.5～1.5 mL/L；
所述鼠李糖乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖30～50g/L、蛋白胨30～50g/L、酵母浸膏10～15g/L、乙酸钠4～6g/L、柠檬酸氢二铵1～3 g/L、七水硫酸镁0.4～0.6 g/L、一水硫酸锰0.1～0.3g/L、吐温-80 0.5～1.5 mL/L；
各乳杆菌在种子培养基中的培养时间为7～8h，在发酵培养基中的培养时间为8～10h。
2.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的种子培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖50 g/L、酵母提取物20 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
3.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖80 g/L、酵母提取物40 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
4.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的种子培养基为：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
5.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、酵母浸膏50 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
6.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌的发酵培养基为：葡萄糖40 g/L、蛋白胨40 g/L、酵母浸膏10 g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 1 mL/L。
7.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述培养基的pH为6.2～6.4。
8.根据权利要求1所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述乳酸菌复合菌剂中，所述罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活菌制剂的质量比为1.5～2.5：0.5～1.5：0.5～1.5。
9.根据权利要求8所述乳酸菌复合菌剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的活菌制剂的质量比为2：1：1。
10.权利要求1～9任一所述乳酸菌复合菌剂在乳酸菌固体饮料或乳酸菌饲料添加剂中的应用。
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