CN112175851B - 乳酸杆菌混合高密度发酵及乳酸杆菌复合菌制剂的制备 - Google Patents
乳酸杆菌混合高密度发酵及乳酸杆菌复合菌制剂的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及乳酸杆菌混合高密度发酵及乳酸杆菌复合菌制剂的制备。具体地，本发明提供一种微生物发酵方法，所述的方法包括：(1)将一种或多种不同的种子菌分别接种到改良的MRS液体培养基中，培养，得到一种或多种不同的种子菌液；(2)将所述的一种或多种不同的种子菌液加入到发酵培养基中，发酵，得到发酵液；所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨12‑18g/L、牛肉膏12‑18g/L、酵母膏7‑15g/L、葡萄糖20‑60g/L和水。本发明所述的微生物发酵方法能够同时进行不同的乳酸杆菌混合发酵，且在混合发酵过程中，不同的乳酸杆菌之间不发生相互抑制作用，均能够正常生长。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及乳酸杆菌混合高密度发酵及乳酸杆菌复合菌制剂的制备。
背景技术
乳酸菌作为一种益生菌，已广泛应用在与人类生活密切相关的各个领域。我国传统的泡菜腌制中就富含大量的活性乳酸菌，发挥着重要的代谢功能。各类酸奶制品的生产加工，都需要乳酸菌进行发酵。活性益生菌固体饮料则是直接将乳酸菌冻干粉与可食用辅料混合后包装成品。在农业领域，乳酸菌可作为水产畜禽养殖动物的饲料添加剂，促进动物的肠道健康，也可用来制作发酵饲料，提高营养价值和饲料的利用率。乳酸菌还具有降低富营养水体中氨氮和亚硝酸盐的作用，改善水质。同时，利用乳酸菌发酵液可进行养殖舍臭味的净化，既环保又健康。由此可见，乳酸菌的应用越来越受到广泛的关注。
乳酸菌的应用领域如此之多，伴随着市场应用与需求的不断扩大，它的生产工艺直到近十年来才受到各个企业和科研人员的更多关注。在乳酸菌的发酵工艺技术方面，由于乳酸菌细胞自身比较脆弱的特点，发酵水平一直不高，常规的乳酸菌发酵水平，活菌数一般为108cfu/ml数量级。
由于多种乳酸菌一起发酵时，不同的菌种之间产生相互抑制作用，目前的复合益生菌制剂产品生产工艺一般为单一菌种纯种培养后，再进行复配，这种单一菌种培养再复配首先需要单独的发酵每种乳酸菌，然后不同单独的乳酸菌在复配，导致工业化生产成本加大，而现有技术中，不同菌种的组合一起发酵又常常导致菌种之间相互抑制现象的发生，导致发酵效果变差，然而，市场对复合型的乳酸杆菌需求又在不在的增长。
因此，本领域需要开发一种乳酸杆菌混合发酵工艺技术，通过一次发酵获得复合型乳酸杆菌的方法，从而简化生产工艺，提高生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够同时进行不同的乳酸杆菌混合发酵，且在混合发酵过程中，不同的乳酸杆菌之间不发生相互抑制作用，均能够正常生长的微生物发酵方法。
本发明的第一方面，提供一种微生物发酵方法，所述的方法包括：
(1)将一种或多种不同的种子菌分别接种到改良的MRS液体培养基中，培养，得到一种或多种不同的种子菌液；
(2)将所述的一种或多种不同的种子菌液加入到发酵培养基中，发酵，得到发酵液；
所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L和水。
在另一优选例中，所述的微生物为乳酸菌。
在另一优选例中，所述的微生物为混合乳酸菌。
在另一优选例中，所述的种子菌为乳酸菌，较佳地为乳酸杆菌。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨15g/L、牛肉膏15g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖35g/L和水。
在另一优选例中，所述的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏和葡萄糖的重量比为(2-4)：(2-4)：(1-3)：(6-8)。
在另一优选例中，所述的蛋白胨和牛肉膏的重量比为0.8-1.2：1，较佳地0.9-1.1：1。
在另一优选例中，所述的蛋白胨和酵母膏的重量比为1.2-1.6：1，较佳地1.3-1.7。
在另一优选例中，所述的蛋白胨和葡萄糖的重量比为1：2.0-2.6，较佳地1：2.1-2.5。
在另一优选例中，所述的牛肉膏和酵母膏的重量比为1.2-1.6：1，较佳地1.3-1.7。
在另一优选例中，所述的牛肉膏和葡萄糖的重量比为1：2.0-2.6，较佳地1：2.1-2.5。
在另一优选例中，所述的酵母膏和葡萄糖的重量比为1：3-4，较佳地1：3.2-3.7。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基还包括：柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、吐温800.5-2ml/L、乙酸钠2-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-3g/L和硫酸锰0.05-3g/L。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基还包括：柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温800.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L和硫酸锰0.1-0.5g/L。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基还包括：柠檬酸氢二铵2g/L、吐温801ml/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L和硫酸锰0.25g/L。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L、柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、吐温800.5-2ml/L、乙酸钠2-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-3g/L、硫酸锰0.05-3g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温800.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L、硫酸锰0.1-05g/L和水。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，当发酵液中的菌种数量不在增加时，停止发酵。
在另一优选例中，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的OD600值为10-25，较佳地15-20。
在另一优选例中，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的活菌数为20-60亿/ml，较佳地30-50亿/ml。
在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的培养是在20-40℃(优选为37℃)温度下进行培养。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的发酵液是在20-40℃(优选为37℃)温度下进行发酵。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，发酵过程中，所述的发酵液中的pH控制在5.0-8.0，较佳地5.0-7.0，较佳地5.5-6.5，最佳地5.8-6.2。
在另一优选例中，通过添加酸性物质和/或碱性物质控制发酵液中的pH。
在另一优选例中，所述的酸性物质选自下组：盐酸、醋酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的碱性物质选自下组：氨水、氢氧化钠、氢氧化钾，或其组合。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，在发酵过程中，通过添加碳源控制所述的发酵液中的糖浓度为0.05-5g/L，较佳地0.08-4g/L，更佳地0.1-3g/L，最佳地0.2-1g/L。
在另一优选例中，所述的碳源为1-4倍(较佳地1-3倍，更佳地2倍)浓缩的MRS液体培养基和100-600g/L(较佳地200-400g/L，更佳地250-350g/L)葡萄糖水溶液，且葡萄糖水溶液的补料速度控制在2-12L/h，较佳地5-8L/h，浓缩的MRS培养基的补料速度控制0.2-1.5L/h，较佳地0.5-1L/h。
在另一优选例中，所述的MRS液体培养基包括：蛋白胨5-15g/L、牛肉膏5-15g/L、酵母膏1-10g/L、柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、葡萄糖10-30g/L、吐温800.3-3ml/L、乙酸钠1-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-1.5g/L、硫酸锰0.1-1g/L和水。
在另一优选例中，所述的MRS液体培养基包括：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏8-12g/L、酵母膏3-8g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、葡萄糖15-25g/L、吐温800.5-1.5ml/L、乙酸钠2-8g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.3-1g/L、硫酸锰0.1-0.5g/L和水。
在另一优选例中，所述的种子菌选自下组：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，或其组合。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌为干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌为鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液同步或分步加入到发酵培养基中。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液分步加入到发酵培养基中，包括：先将嗜酸乳杆菌种子菌液加入到发酵培养基中，先发酵一段时间(优选为2-8h或嗜酸乳杆菌种子菌液在发酵培养基处于对数生长初期)，再向发酵培养基加入干酪乳杆菌种子菌液。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液分步加入到发酵培养基中，包括：先将嗜酸乳杆菌种子菌液加入到发酵培养基中，先发酵一段时间(优选为2-8h或嗜酸乳杆菌种子菌液在发酵培养基处于对数生长初期)，再向发酵培养基加入鼠李糖乳杆菌种子菌液和短乳杆菌种子菌液。
在另一优选例中，所述的发酵液是在搅拌条件下进行发酵。
在另一优选例中，所述的搅拌速度为50-100rpm。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中，所述的种子菌液与所述发酵培养基的体积比v/v为1:20-60，较佳地1:30-50，更佳地1:35-45。
在另一优选例中，所述的种子菌液的体积为3-20L，较佳地5-15L，更佳地8-12L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基的体积为200-600L，较佳地300-500L，更佳地350-450L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖40-60g/L、玉米淀粉30-50g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母膏10-30g/L、牛肉膏5-25g/L和水。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖45-55g/L、玉米淀粉35-45g/L、蛋白胨15-25g/L、酵母膏15-25g/L、牛肉膏10-20g/L和水。
在另一优选例中，所述的葡萄糖与所述的蛋白胨的重量比为1.5-3.5:1，较佳地2-3:1。
在另一优选例中，所述的葡萄糖与所述的酵母膏的重量比为1.5-3.5:1，较佳地2-3:1。
在另一优选例中，所述的葡萄糖与所述的牛肉膏的重量比为2.5-4:1，较佳地3.0-3.6:1。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖50g/L、玉米淀粉40g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、牛肉膏15g/L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠1-10g/L、柠檬酸铵0.5-3g/L、吐温800.5-2ml/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、七水硫酸镁0.1-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-0.2g/L和碳酸钙0.5-4g/L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠3-7g/L、柠檬酸铵1-2g/L、吐温800.7-1.5ml/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.15-0.25g/L、一水硫酸锰0.02-0.1g/L和碳酸钙1-3g/L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵1.5g/L、吐温801ml/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L和碳酸钙2g/L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖50g/L、玉米淀粉40g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、牛肉膏15g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵1.5g/L、吐温801ml/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L和碳酸钙2g/L和水。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖40-60g/L、玉米淀粉30-50g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母膏10-30g/L、牛肉膏5-25g/L、乙酸钠1-10g/L、柠檬酸铵0.5-3g/L、吐温800.5-2ml/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、七水硫酸镁0.1-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-0.2g/L、碳酸钙0.5-4g/L和水。
在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖45-55g/L、玉米淀粉35-45g/L、蛋白胨15-25g/L、酵母膏15-25g/L、牛肉膏10-20g/L、乙酸钠3-7g/L、柠檬酸铵1-2g/L、吐温800.7-1.5ml/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.15-0.25g/L、一水硫酸锰0.02-0.1g/L、碳酸钙1-3g/L和水。
本发明第二方面，提供一种改良的MRS液体培养基，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L、柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、吐温800.5-2ml/L、乙酸钠2-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-3g/L、硫酸锰0.05-3g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温800.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L、硫酸锰0.1-05g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨15g/L、牛肉膏15g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖35g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、吐温801ml/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L和水。
本发明第三方面，提供一种复合菌制剂的制备方法，包括步骤：
(a)如本发明第一方面所述的方法制备得到发酵液；
(b)对步骤(a)所得的发酵液进行离心，收集菌泥，对所述的菌泥进行冷冻干燥，得到复合菌制剂。
在另一优选例中，向所述的菌泥中加入保护剂成分后进行冷冻干燥。
在另一优选例中，所述的保护成分选自下组：脱脂奶粉、蔗糖、麦芽糊精、氯化钠、维生素C，或其组合。
在另一优选例中，所述的保护成分包括脱脂奶粉5-15wt％、蔗糖5-13wt％、麦芽糊精1-3wt％、氯化钠0.3-0.8wt％和Vc0.3-0.8wt％，以菌泥的重量计算。
本发明第四方面，提供一种复合菌制剂，所述的复合菌制剂通过如本发明第三方面所述的方法制备而得。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而又深入的研究，意外的开发了一种微生物发酵方法，所述的方法能够同时进行不同的乳酸杆菌混合发酵，且在混合发酵过程中，不同的乳酸杆菌之间不发生相互抑制作用，均能够正常生长，因此，本发明所述的方法能够通过一次发酵获得复合型乳酸杆菌的方法，从而简化生产工艺，提高生产效率。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
微生物发酵方法
本发明提供一种微生物发酵方法，所述的方法能够同时进行不同的乳酸杆菌混合发酵，且在混合发酵过程中，不同的乳酸杆菌之间不发生相互抑制作用，均能够正常生长。
典型地，所述微生物发酵方法包括：
(1)将一种或多种不同的种子菌分别接种到改良的MRS液体培养基中，培养，得到一种或多种不同的种子菌液；
(2)将所述的一种或多种不同的种子菌液加入到发酵培养基中，发酵，得到发酵液；
所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L和水。
在一个优选例中，所述的步骤(2)中，发酵过程中，所述的发酵液中的pH控制在5.0-8.0，较佳地5.0-7.0，较佳地5.5-6.5，最佳地5.8-6.2。
在另一优选例中，所述的步骤(2)中，在所述发酵过程中，通过添加碳源控制所述的发酵液中的糖浓度为0.05-5g/L，较佳地0.08-4g/L，更佳地0.1-3g/L，最佳地0.2-1g/L。
在另一优选例中，所述的碳源为1-4倍(较佳地1-3倍，更佳地2倍)浓缩的MRS液体培养基和100-600g/L(较佳地200-400g/L，更佳地250-350g/L)葡萄糖水溶液，且葡萄糖水溶液的补料速度控制在2-12L/h，较佳地5-8L/h，浓缩的MRS培养基的补料速度控制0.2-1.5L/h，较佳地0.5-1L/h。
优选地，所述的MRS液体培养基包括(但不限于)：蛋白胨5-15g/L、牛肉膏5-15g/L、酵母膏1-10g/L、柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、葡萄糖10-30g/L、吐温800.3-3ml/L、乙酸钠1-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-1.5g/L、硫酸锰0.1-1g/L和水。
优选地，所述的MRS液体培养基包括(但不限于)：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏8-12g/L、酵母膏3-8g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、葡萄糖15-25g/L、吐温800.5-1.5ml/L、乙酸钠2-8g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.3-1g/L、硫酸锰0.1-0.5g/L和水。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液同步或分步加入到发酵培养基中。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液分步加入到发酵培养基中，包括：先将嗜酸乳杆菌种子菌液加入到发酵培养基中，先发酵一段时间(优选为2-8h或嗜酸乳杆菌种子菌液在发酵培养基处于对数生长初期)，再向发酵培养基加入干酪乳杆菌种子菌液。
在另一优选例中，所述的多种不同的种子菌液分步加入到发酵培养基中，包括：先将嗜酸乳杆菌种子菌液加入到发酵培养基中，先发酵一段时间(优选为2-8h或嗜酸乳杆菌种子菌液在发酵培养基处于对数生长初期)，再向发酵培养基加入鼠李糖乳杆菌种子菌液和短乳杆菌种子菌液。
改良的MRS液体培养基
在本发明中，提供一种改良的MRS液体培养基用于培养一种或多种不同的种子菌，从而得到一种或多种不同的种子菌液。
与常规的MRS液体培养基相比，具体特定组分和比例的改良的MRS液体培养能够用于不同乳酸杆菌的组合发酵或培养，在组合发酵或培养过程中，每种菌种都可以正常生长，且每种菌种的数量都维持在与单独培养相似的水平，不同的菌种之间能够协同生长，不存在相互拮抗，协同生长性能较好。
典型地，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L和水。
在一个优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基还包括：柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、吐温800.5-2ml/L、乙酸钠2-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-3g/L、硫酸锰0.05-3g/L。
优选地，所述的改良的MRS液体培养基还包括：柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温800.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L、硫酸锰0.1-05g/L。
典型地，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨12-18g/L、牛肉膏12-18g/L、酵母膏7-15g/L、葡萄糖20-60g/L、柠檬酸氢二铵0.5-5g/L、吐温800.5-2ml/L、乙酸钠2-10g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、硫酸镁0.1-3g/L、硫酸锰0.05-3g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温800.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L、硫酸锰0.1-05g/L和水。
在另一优选例中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨15g/L、牛肉膏15g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖35g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、吐温801ml/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L和水。
发酵培养基
在本发明中，提供一种发酵培养基，所述的一种或多种不同的种子菌液加入到发酵培养基中进行发酵，从而得到发酵液。
典型地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖40-60g/L、玉米淀粉30-50g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母膏10-30g/L、牛肉膏5-25g/L和水。
优选地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖45-55g/L、玉米淀粉35-45g/L、蛋白胨15-25g/L、酵母膏15-25g/L、牛肉膏10-20g/L和水。
代表性地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖50g/L、玉米淀粉40g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、牛肉膏15g/L。
在另一优选例中，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠1-10g/L、柠檬酸铵0.5-3g/L、吐温800.5-2ml/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、七水硫酸镁0.1-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-0.2g/L、碳酸钙0.5-4g/L。
优选地，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠3-7g/L、柠檬酸铵1-2g/L、吐温800.7-1.5ml/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.15-0.25g/L、一水硫酸锰0.02-0.1g/L、碳酸钙1-3g/L。
代表性的，所述的发酵培养基还包括：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵1.5g/L、吐温801ml/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙2g/L。
典型地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖40-60g/L、玉米淀粉30-50g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母膏10-30g/L、牛肉膏5-25g/L、乙酸钠1-10g/L、柠檬酸铵0.5-3g/L、吐温800.5-2ml/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、七水硫酸镁0.1-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-0.2g/L、碳酸钙0.5-4g/L和水。
典型地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖45-55g/L、玉米淀粉35-45g/L、蛋白胨15-25g/L、酵母膏15-25g/L、牛肉膏10-20g/L、乙酸钠3-7g/L、柠檬酸铵1-2g/L、吐温800.7-1.5ml/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.15-0.25g/L、一水硫酸锰0.02-0.1g/L、碳酸钙1-3g/L和水。
典型地，所述的发酵培养基包括：葡萄糖50g/L、玉米淀粉40g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、牛肉膏15g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵1.5g/L、吐温801ml/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙2g/L和水。
种子菌
在本发明中，所述的种子菌为发酵提供菌种，优选地，所述的种子菌为乳酸菌，较佳地为乳酸杆菌。
优选地，所述的种子菌包括(但不限于)：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，或其组合。
代表性的，所述的多种不同的种子菌为植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
代表性的，所述的多种不同的种子菌为干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
代表性的，所述的多种不同的种子菌为鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌。
代表性的，所述的多种不同的种子菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌。
复合菌制剂的制备方法
本发明还提供一种复合菌制剂的制备方法，包括步骤：
(a)如本发明所述的微生物发酵方法制备发酵液；
(b)对步骤(a)所得的发酵液进行离心，收集菌泥，对所述的菌泥进行冷冻干燥，得到复合菌制剂。
在另一优选例中，向所述的菌泥中加入保护剂成分后进行冷冻干燥。
在另一优选例中，所述的保护成分包括(但不限于)：脱脂奶粉、蔗糖、麦芽糊精、氯化钠、维生素C，或其组合。
在另一优选例中，所述的保护成分包括(但不限于)脱脂奶粉5-15wt％、蔗糖5-13wt％、麦芽糊精1-3wt％、氯化钠0.3-0.8wt％、Vc0.3-0.8wt％，以菌泥的重量计算。
复合菌制剂
本发明还提供一种复合制剂，所述的复合菌制剂通过本发明所述的复合菌制剂的制备方法制备。
本发明的主要优点包括：
1、本发明意外的开发了一种微生物发酵方法，所述的方法能够同时进行不同的乳酸杆菌混合发酵，且在混合发酵过程中，不同的乳酸杆菌之间不发生相互抑制作用，均能够正常生长，因此，本发明所述的方法能够通过一次发酵获得复合型乳酸杆菌的方法，从而简化生产工艺，提高生产效率。
2、本发明的高密度发酵补料控制工艺技术，最终冻干粉活菌数量高，可达上万亿/g，稳定性好，储存周期长。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
材料和通用方法：
MRS液体培养基配方
蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、葡萄糖20g/L、吐温801ml/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L和水。
在MRS液体培养基中加入20g/L琼脂，即为MRS固体培养基。
改良的MRS液体培养基配方
蛋白胨15g/L、牛肉膏15g/L、酵母膏10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、葡萄糖35g/L、吐温801ml/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L和水。
发酵培养基配方
葡萄糖50g/L、玉米淀粉40g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、牛肉膏15g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵1.5g/L、吐温801ml/L、磷酸氢二钾1.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、一水硫酸锰0.05g/L、碳酸钙2g/L和水。
活菌计数方法
取1ml发酵液或1g冻干菌粉加入至9ml无菌水中稀释10倍，为一级稀释10-1梯度，再取一级稀释液1ml至9ml无菌水中再稀释10倍，为二级稀释10-2梯度，依此类推稀释至10-6，10-7，10-8，10-9后取1ml加入至MRS固体培养基平板中培养，分别统计各自平板菌落总数，只统计平板上30-300个菌数的平板，每个样品做3个平行，计算平均数。
发酵液或冻干菌粉活菌数cuf/ml(cuf/g)＝菌落平均数×稀释倍数
OD600
OD600表示菌浓度，采用分光光度计600nm波长测量的吸光度值，以改良的MRS液体培养基做空白对照，测量培养一定时间的乳酸杆菌培养液在600nm波长下的吸光度值。
不同乳酸杆菌形态区分
由于是乳酸杆菌的混合发酵，因此需要通过MRS平板上长出的不同菌种形态来区分，再统计活菌数量。主要有三种不同形态区分：第一，嗜酸乳杆菌在MRS固体平板表面菌落较小，白色小点，表面不光滑，边界非纯圆形；第二，短乳杆菌在MRS固体平板表面整个菌落中间为白色小点，四周被半透明菌体包围；第三，干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌四种在MRS固体平板表面菌落形态都相似，菌落较大，乳白色，表面光滑，呈现圆形。因此，为了能够最终统计出不同类型乳酸杆菌的活菌数量，发酵时主要将这三种类型的乳酸杆菌进行不同组合混合发酵，最终制备成可以分别统计出活菌数量的混合型复合菌剂。
实施例1不同的乳酸杆菌甘油管菌种的制备
首先将嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和短乳杆菌分别在MRS固体培养基上活化培养48小时，然后再转接至MRS液体培养基中培养24小时，OD600约为15-20，或活菌数量约20-50亿/ml，离心收集菌泥，用PBS缓冲液洗涤一次，再加入1/10体积的20％甘油混合均匀，制备成批量的甘油管冻存在-80度，可供后续发酵工艺优化直接使用。
实施例2乳酸杆菌基础培养基成份的优化
MRS液体培养基培养
分别从-80度冰箱取出实施例1制备的不同的乳酸杆菌甘油管菌种，接种(接种量相同)在5L摇瓶中，使用MRS液体培养基分别进行植物乳杆菌，干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养，37℃静置24小时，检测活菌数量，见下表1：
表1 MRS液体培养基培养的不同乳酸杆菌活菌数量
由上表1可以看出，5L摇瓶静置培养24小时，嗜酸乳杆菌的活菌数量在10亿/ml以下，其它乳杆菌活菌数量相对要高，20-40亿/ml。
改良的MRS液体培养基配方
分别从-80度冰箱取出实施例1制备的乳酸杆菌甘油管菌种，接种(接种量相同)在5L摇瓶中，使用改良的MRS液体培养基分别进行植物乳杆菌，干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌，罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养，37℃静置24小时，检测活菌数量，见下表2：
表2改良的MRS液体培养基培养的不同乳酸杆菌活菌数量
由上表2可以看出，改良后的MRS培养基配方，乳酸杆菌的活菌数量都有不同程度的增加，尤其是嗜酸乳杆菌的增幅显著提高，因此，改良后的MRS液体培养基能够明显提高不同乳酸杆菌活菌数量。
此外，利用改良的MRS液体培养基，在5L摇瓶中，进行不同乳酸杆菌的组合培养。将嗜酸乳杆菌分别和植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌进行组合培养，每组接种量相同，37℃静置24小时，检测活菌数量，见下表3：
表3改良的MRS液体培养基进行不同乳酸杆菌的组合培养
从表3中可以看出，用改良的MRS液体培养基对不同乳酸杆菌的组合培养，各组中的每种菌种都可以正常生长，且每种菌种的数量都维持在与单独培养相似的水平，不同的菌种之间能够协同生长，不存在相互拮抗，协同生长性能较好，这为发酵罐上扩大生产做混合培养奠定的基础。
实施例3考察不同乳酸杆菌单独工业化高密度发酵
鼠李糖乳酸杆菌的单独工业化高密度发酵
取-80度冰箱保存的实施例1制备的鼠李糖乳酸杆菌甘油管菌种，按照2％接种量分别接种至2个5L改良后的MRS液体培养基中，37℃静置培养24小时后，待OD600为15-20，鼠李糖乳杆菌活菌数约30-50亿/ml，将2个种子培养液共计10L全部接种至500L发酵罐，其中，500L发酵罐中含有400L的发酵培养基。
发酵过程中用氨水调控发酵液的pH为6.0，发酵过程中，不断搅拌，搅拌速度为100rpm，控制发酵罐内的罐压为0.05MPa，在发酵过程中检测糖浓度，通过流动添加300g/L的葡萄糖和2倍浓缩的MRS培养基(调节葡萄糖补料速度控制5-8L/h，MRS培养基补料速度0.5-1L/h)，控制发酵液中的糖浓度为0.2-1g/L，。
在发酵期间，每隔1小时取样，进行OD600测菌浓度，直到菌浓度不再增加，发酵结束，取样检测发酵液中鼠李糖乳杆菌活菌数为180亿/ml。
其它乳酸杆菌的单独工业化高密度发酵
采用与上述相同的发酵方法，分别对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌和嗜酸乳杆菌进行单独发酵，发酵结束后，活菌数量如下表4所示：
表4不同乳酸杆菌采用实施例3所述的发酵方法进行单独发酵后的，活菌数量
实施例4嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌同步接种组合的工业化联合高密度发酵
分别取-80度冰箱保存的实施例1制备的嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌甘油管菌种，按照2％接种量分别接种至5L改良后的MRS培养基中，37℃静置培养24小时后，待嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的OD600分别为18和20，将两种乳酸杆菌的种子培养液共计10L全部接种至500L发酵罐，其中，500L发酵罐中含有400L的发酵培养基。
发酵过程中用氨水调控发酵液的pH为6.0，不断搅拌，搅拌速度为100rpm，控制发酵罐内的罐压为0.05MPa，在发酵过程中检测糖浓度，通过流动添加300g/L的葡萄糖水溶液和2倍浓缩MRS培养基(调节葡萄糖水溶液补料速度控制5-8L/h，浓缩的MRS培养基补料速度0.5-1L/h)，控制发酵液中的糖浓度为0.2-1g/L。
发酵期间，每隔1小时取样，进行OD600测菌浓，直到菌浓度不再增加，大约24小时左右，发酵结束，取样检测发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数42亿/ml，干酪乳杆菌120亿/ml。
结果表明，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌同步接种到发酵罐中都能够正常生长，活菌数量都维持在与单独培养相似的水平，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在同步接种的组合发酵过程中能够协同生长，不存在相互拮抗。
实施例5嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分步接种组合的工业化联合高密度发酵
分别取-80度冰箱保存的实施例1制备的嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌甘油管菌种，按照2％接种量接种分别接种至5L改良后的MRS培养基中，37℃静置培养。其中嗜酸乳杆菌培养15小时后(嗜酸乳杆菌种子菌液OD600为16)，5L培养种子菌液全部接种至含有400L的发酵培养基的500L发酵罐，先发酵5小时进入对数生长初期，然后再接入培养20小时的5L干酪乳杆菌种子菌液(干酪乳杆菌种子菌液的OD600为18)。
发酵过程中用氨水调控发酵液的pH为6.0，不断搅拌，搅拌速度为100rpm，控制发酵罐内的罐压为0.05MPa，在发酵过程中检测糖浓度，通过流动添加300g/L的葡萄糖和2倍浓缩MRS培养基(调节葡萄糖补料速度控制5-8L/h，MRS培养基补料速度0.5-1L/h)，控制发酵液中的糖浓度为0.2-1g/L。
发酵期间，每隔1小时取样，进行OD600测菌浓，直到菌浓度不再增加，发酵结束，取样检测发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数59亿/ml，干酪乳杆菌230亿/ml。
结果表明，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分步接种到发酵罐中都能够正常生长，且活菌数量都维持高于与单独培养的水平，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在分步接种的组合发酵过程中能够协同生长，不存在相互拮抗。
复合菌制剂的制备方法
实施例5发酵结束后，对所得的发酵液进行冷冻干燥，得到复合菌制剂，具体方法如下：
将实施例5得到嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌混合发酵液低温高速离心后，收集菌泥，加入保护剂成份：脱脂奶粉10％，蔗糖8％，麦芽糊精2％，氯化钠0.5％，Vc(维生素C)0.5％，混合均匀后，-65℃预冻10小时，然后放入冻干机，设置冻干机真空度0.01mba，隔板加温，冷冻干燥40小时左右，得到嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的复合菌制剂。取1g复合菌剂进行活菌计数检测，干酪乳杆菌活菌数量10500亿/g，嗜酸乳杆菌活菌数1100亿/g。
实施例6嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌分步接种组合的工业化联合高密度发酵
500L发酵罐乳酸杆菌分步接种的混合发酵技术及复合菌制剂的制备
嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌的混合发酵
分别取-80度冰箱保存的实施例1制备的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌甘油管菌种，按照2％接种量接种分别接种至5L改良后的MRS培养基中，37℃静置培养。其中嗜酸乳杆菌培养20小时后(嗜酸乳杆菌种子菌液的OD600为18)，5L培养种子菌液全部接种至含有400L的发酵培养基的500L发酵罐，先发酵4小时进入对数生长初期，然后再同时接入培养约24小时的5L鼠李糖乳杆菌和5L短乳杆菌种子菌液(鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌种子菌液OD600约18左右)。
发酵过程中用氨水调控发酵液的pH为6.0，不断搅拌，搅拌速度为100rpm，控制发酵罐内的罐压为0.05MPa，在发酵过程中检测糖浓度，通过流动添加300g/L的葡萄糖和2倍浓缩MRS培养基，控制发酵液中的糖浓度为0.2-1g/L，调节葡萄糖补料速度控制5-8L/h，MRS培养基补料速度0.5-1L/h。
发酵期间，每隔1小时取样，进行OD600测菌浓，直到菌浓度不再增加，发酵结束，取样检测发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数79亿/ml,鼠李糖乳杆菌210亿/ml，短乳杆菌130亿/ml。
结果表明，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌分步接种到发酵罐中都能够正常生长，且活菌数量都维持高于与单独培养的水平，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌分步接种的组合发酵过程中能够协同生长，不存在相互拮抗。
实施例6发酵结束后，对所得的发酵液进行冷冻干燥，得到复合菌制剂，具体方法如下：
将实施例6得到嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌混合发酵液低温高速离心后，收集菌泥，加入保护剂成份：脱脂奶粉10wt％、蔗糖8wt％、麦芽糊精2wt％、氯化钠0.5wt％、Vc(维生素C)0.5wt％，以菌泥的重量计算，混合均匀后，-65℃预冻10小时，然后放入冻干机，设置冻干机真空度0.01mba，隔板加温，冷冻干燥40小时左右，得到嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短乳杆菌的复合菌制剂。取1g复合菌剂进行活菌计数检测，鼠李糖乳杆菌活菌数量14300亿/g，短乳杆菌活菌数6500亿/ml，嗜酸乳杆菌活菌数1900亿/g。
对比例1
嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的不补料混合发酵
分别取-80度冰箱保存的实施例1制备的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌甘油管菌种，按照2％接种量接种分别接种至5L改良后的MRS培养基中，37℃静置培养。其中嗜酸乳杆菌培养20小时后(嗜酸乳杆菌菌液的OD600为18)，5L培养嗜酸乳杆菌种子菌液全部接种至含有400L的发酵培养基的500L发酵罐，先发酵4小时进入对数生长初期，然后再接入培养约24小时5L鼠李糖乳杆菌种子菌液(鼠李糖乳杆菌菌液OD600为18)。
发酵过程中用氨水调控发酵液的pH为6.0，不断搅拌，搅拌速度为100rpm，控制发酵罐内的罐压为0.05MPa，整个发酵过程中不进行补充碳源来控制糖浓度，检测发酵液菌体湿重，当达到35g/L时，不再增加，大约20小时，发酵结束。取样检测发酵液中嗜酸乳杆菌活菌数17亿/ml，鼠李糖乳杆菌65亿/ml。
结果表明，发酵过程中，通过单独控制PH，不进行补充碳源来控制糖浓度，最终发酵液中的嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的菌数量显著小于各自菌种单独培养的菌数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (21)
1.一种微生物发酵方法，其特征在于，所述的微生物为乳酸菌，所述的方法包括：
(1)将多种不同的种子菌分别接种到改良的MRS液体培养基中，培养，得到多种不同的种子菌液；
(2)将所述的多种不同的种子菌液加入到发酵培养基中，发酵，得到发酵液；
其中，所述的种子菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)；
所述的步骤(2)中，发酵过程中，通过添加氨水控制发酵液中的pH在5.0-7.0，通过添加碳源控制所述的发酵液中的糖浓度为0.08-3g/L；
所述的碳源为1-4倍浓缩的MRS液体培养基和100-600g/L葡萄糖水溶液，且葡萄糖水溶液的补料速度控制在2-12L/h，浓缩的MRS培养基的补料速度控制0.2-1.5L/h；
其中，所述的改良的MRS液体培养基包括：蛋白胨13-17g/L、牛肉膏13-17g/L、酵母膏8-12g/L、葡萄糖25-45g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、吐温80 0.7-1.5ml/L、乙酸钠3-7g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.2-1g/L和硫酸锰0.1-0.5g/L和水；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖40-60g/L、玉米淀粉30-50g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母膏10-30g/L、牛肉膏5-25g/L、乙酸钠1-10g/L、柠檬酸铵0.5-3g/L、吐温80 0.5-2ml/L、磷酸氢二钾0.5-2.5g/L、七水硫酸镁0.1-0.3g/L、一水硫酸锰0.01-0.2g/L、碳酸钙0.5-4g/L和水。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的OD600值为10-25。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的OD600值为15-20。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的活菌数为20-60亿/ml。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，每个种子菌液的活菌数为30-50亿/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的培养是在20-40℃温度下进行培养。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，所述的发酵液是在20-40℃温度下进行发酵。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，发酵过程中，所述的发酵液中的pH控制在5.5-6.5。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，发酵过程中，所述的发酵液中的pH控制在5.8-6.2。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，在发酵过程中，通过添加碳源控制所述的发酵液中的糖浓度为0.1-3g/L。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，在发酵过程中，通过添加碳源控制所述的发酵液中的糖浓度为0.2-1g/L。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳源为1-3倍浓缩的MRS液体培养基和200-400g/L葡萄糖水溶液，且葡萄糖水溶液的补料速度控制在5-8L/h，浓缩的MRS培养基的补料速度控制在0.5-1L/h。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的碳源为1-2倍浓缩的MRS液体培养基和250-350g/L葡萄糖水溶液。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多种不同的种子菌液同步或分步加入到发酵培养基中。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的种子菌液与所述发酵培养基的体积比v/v为1:20-60。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的种子菌液与所述发酵培养基的体积比v/v为1:30-50。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的种子菌液与所述发酵培养基的体积比v/v为1:35-45。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：葡萄糖45-55g/L、玉米淀粉35-45g/L、蛋白胨15-25g/L、酵母膏15-25g/L、牛肉膏10-20g/L、乙酸钠3-7g/L、柠檬酸铵1-2g/L、吐温80 0.7-1.5ml/L、磷酸氢二钾1-2g/L、七水硫酸镁0.15-0.25g/L、一水硫酸锰0.02-0.1g/L、碳酸钙1-3g/L和水。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的多种不同的种子菌液分步加入到发酵培养基中，包括：先将嗜酸乳杆菌种子菌液加入到发酵培养基中，先发酵一段时间，使得嗜酸乳杆菌种子菌液在发酵培养基处于对数生长初期，再向发酵培养基加入鼠李糖乳杆菌种子菌液和短乳杆菌种子菌液。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳源中的MRS液体培养基包括：蛋白胨8-12g/L、牛肉膏8-12g/L、酵母膏3-8g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、葡萄糖15-25g/L、吐温800.5-1.5ml/L、乙酸钠2-8g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸镁0.3-1g/L、硫酸锰0.1-0.5g/L和水。
21.一种复合菌制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)使用如权利要求1所述的方法制备得到发酵液；
(b)对步骤(a)所得的发酵液进行离心，收集菌泥，对所述的菌泥进行冷冻干燥，得到复合菌制剂。
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