CN105886439A - 一种高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法，属于微生物发酵工程领域。本发明在乳酸菌的培养过程中，根据pH值自动添加碱液维持培养体系的中性环境，并将补料泵与补碱泵进行关联，使补料培养基与碱液按照一定比例自动地添加到培养体系中，确保了培养体系中底物浓度的稳定性。本发明不仅保证了菌体对底物的需求，又使底物根据菌体的消耗自动的添加而不过量。本发明方法适用于干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等所有的同型发酵乳杆菌，以及两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌等所有的双歧杆菌。

Description

一种高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法

技术领域

本发明涉及一种高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

乳酸菌通过自身的代谢不仅可以提高发酵食品的品质，改善其风味，还可以改善人类身体健康。乳酸菌被广泛地应用到发酵乳制品、发酵香肠、发酵果蔬、直投式泡菜等发酵食品。近几十年来，乳酸菌的功能性研究也得到广泛的关注，改善肠胃，治疗便秘，拮抗肠炎，提高免疫等的功能性益生菌剂深受广大消费者的喜爱。提高乳酸菌的生产效率，高密度培养乳酸菌对乳酸菌产品的推广非常重要。

多种高密度培养乳酸菌的方法被研究开发，包括优化培养基组分及培养条件、中和培养、透析培养、补料分批培养、连续培养、膜过滤培养等。其中应用最为广泛的是通过补加碱液控制培养过程pH值，解除酸抑制的中和培养。在此基础上为了提高菌体浓度，多种流加补料方式被提出：间歇流加，恒速流加和指数流加。间歇流加需要不定时地取样测定培养基中葡萄糖的含量，当检测不到糖时，向培养基中补加一定浓度的补料培养基。此流加方式不仅需要消耗人力，并且不能准确把握底物的消耗情况。在对数生长期，菌体对葡萄糖的消耗速度很快，在两次对底物的取样测定间期会出现底物不足的情况，影响菌体的生长速率。当补料时，一次性补入的底物浓度较高，会引起培养体系渗透压骤高，同样会影响菌体的生长。恒速流加是固定补料培养基的流加速度，以恒定速度不断地向培养基中添加补料培养基。此方法虽然避免了人力消耗，但是乳酸菌对菌体的消耗并不是一个恒定速率。较低的流加速度会造成底物不足，过高的流加速度会使底物过量不断积累，两者均会抑制菌体的生长。指数流加是根据乳酸菌在对数生长期成指数增殖，对底物的消耗也是以指数方式消减。但是，为了获得较高浓度的乳酸菌菌体浓度，在分批培养的对数期后期依然需要进行补料补碱培养，此时菌体浓度会继续增加，但不是以指数方式增长，指数流加的方式亦不适用。目前，在乳酸菌的高密度培养方面，还未有有效的分批培养流加方式。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法，是将补料系统与补碱系统进行关联，根据补碱量自动补加补料培养基，实现由pH值自动反馈补料，确保了乳酸菌对营养物质和需求和底物浓度的稳定性，显著提高乳酸菌的生产效率。

所述乳酸菌包括：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)等所有的同型发酵乳杆菌，以及两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)等所有的双歧杆菌。

所述补料系统与补碱系统的关联比例为k：1，即补加1mL碱液，自动补加k mL补料培养基。

所述同型发酵乳杆菌培养时碱液瓶中氢氧化钠浓度(C_碱，g/L)和补料瓶中补料培养基的葡萄糖浓度(C_料，g/L)根据以下公式(1)配制：

式(1)中

40，表示氢氧化钠的摩尔分子量，g/mol；

2，表示1分子的葡萄糖产生2分子的乳酸；

90％～100％，表示90％～100％的葡萄糖被同型发酵乳杆菌转化成乳酸；

180，表示葡萄糖的摩尔分子量，g/mol。

所述双歧杆菌培养时碱液瓶中氢氧化钠浓度(C_碱，g/L)和补料瓶中补料培养基的葡萄糖浓度(C_料，g/L)根据以下公式(2)配制：

(2)式中

40，表示氢氧化钠的摩尔分子量，g/mol；

2和5，表示2分子的葡萄糖产生5分子的酸(3分子乙酸和2分子乳酸)；

90％～100％，表示90％～100％的葡萄糖被双歧杆菌转化成酸，优选90％；

180，表示葡萄糖的摩尔分子量，g/mol。

所述同型发酵乳杆菌的补料培养基中营养物质质量比为，葡萄糖：牛肉膏：蛋白胨：酵母粉＝(8～10)：(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～1)。双歧杆菌的补料培养基中营养物质质量比为葡萄糖：酵母粉：牛肉膏：蛋白胨＝(8～10)：(1～4)：(0.5～2)：(0.5～2)。

在本发明的一种实施方式中，所述分批高密度培养乳酸菌的自动反馈补料方法采用以下 步骤：

(1)种子培养；

(2)补料分批发酵：将种子液接种于发酵培养基中进行补料分批发酵培养，发酵条件为：发酵温度为各菌株的最适生长温度，搅拌转速150-200r/min，pH值由发酵罐控制单元控制。补碱泵与补料泵进行1：k的转速关联，实现补碱1mL自动补加k mL补料培养基的控制。在发酵过程中，向培养体系中自动补加碱液和补料培养基，满足菌体生长和底物浓度的稳定性，待菌体浓度停止增长时终止发酵。

在本发明的一种实施方式中，同型发酵乳杆菌的发酵培养基为碳源和氮源浓度减半的MRS培养基；双歧杆菌的发酵培养基为碳源和氮源浓度减半的含1g/L L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。

在本发明的一种实施方式中，当发酵液的pH值小于6.9时，系统自动补加碱液使培养体系pH值维持中性。

在本发明的一种实施方式中，所述的碱液为氢氧化钠溶液。

在本发明的一种实施方式中，在发酵整个阶段，通过补碱系统的自动控制实现补料培养基适时适量地加入培养体系，使培养体系中葡萄糖浓度维持在8～10g/L。

申请人发现同型发酵乳杆菌和双歧杆菌在培养过程中，可将超过90％的葡萄糖转化成酸。一分子的酸(乳酸或乙酸)需要一分子的氢氧化钠来中和，通过补碱量即可得知葡萄糖的消耗量。将补料系统与控碱系统关联，使葡萄糖的添加根据补碱的量自动添加，可实现补料培养基根据底物的消耗自动地流加。本发明方法(1)自动化程度高，整个发酵过程不需要消耗人力去测定底物浓度；(2)既可以减除代谢酸对乳酸菌的抑制，又可以消除底物抑制；(3)高密度培养时间短，生产效率高，整个培养过程实现了底物根据消耗量进行补加，确保了底物浓度的稳定性，避免了补料不足或补料过量的现象。

附图说明

图1是自动反馈补料高密度培养干酪乳杆菌。

图2是自动反馈补料高密度培养植物乳杆菌。

图3是自动反馈补料高密度培养青春双歧杆菌。

图4是自动反馈补料高密度培养长双歧杆菌。

具体实施方式

MRS培养基组成如下：1000mL蒸馏水、10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g乙酸钠、20g葡萄糖、0.58g MgSO₄·7H₂O、0.25g MnSO₄·H₂O、2g柠檬酸二铵、2g K₂HPO₄ 与1g吐温80，pH 6.2～6.4。

实施例1自动反馈补料高密度培养干酪乳杆菌

(1)种子液制备

从甘油保藏管中吸取200μL干酪乳杆菌接入10mL MRS液体培养基中，42℃恒温培养18h进行活化，然后以5％(v/v)的接种量转入100mL MRS液体培养基中进行二次活化，42℃恒温培养12h即得种子液。

(2)接种前准备及接种过程

配制碳源和氮源浓度减半的MRS液体培养基600mL倒入1L发酵罐中，发酵罐罐体121℃高温灭菌后水浴冷却至42℃，并保持温度恒定。开始接种时，在酒精火焰圈上方，将种子液以5％(v/v)的接种量倒入发酵罐中，以150-200r/min速度搅拌，42℃恒温培养。

(3)补料系统与补碱系统的关联设置

将补料系统与补碱系统进行关联，设置补碱量与补料量的补加比例为1：2.5，即流加1mL碱液时，补料泵自动补加2.5mL补料培养基。k的值不是计算的，是设备参数，由k和葡萄糖浓度，计算碱浓度或由k和碱浓度计算葡萄糖浓度。

(4)碱液和补料培养基的准备

准备配制400g/L的氢氧化钠溶液，并在121℃高温下灭菌。根据发明内容中的方法，选择90％计算葡萄糖浓度，分别配制葡萄糖溶液和酵母粉、牛肉膏、蛋白胨溶液，高温灭菌后混合，使葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉的终浓度分别为400g/L、50g/L、50g/L、25g/L。

(5)自动反馈补料控制

培养过程中当pH值低于6.9时，补碱系统自动补加碱液使培养体系pH值保持在7.0左右。因补料系统与补碱系统的关联，实现了补料培养基的自动补加。确保了底物浓度既满足菌体生长的需求，又不会过量补加。

(6)最终活菌浓度

培养时间20h后，干酪乳杆菌的OD₆₂₀停止增长，菌体浓度达到最高值，此时菌体OD₆₂₀达到21.5，菌浓达到1.4±0.1×10¹⁰cfu/mL。

实施例2自动反馈补料高密度培养青春双歧杆菌

(1)种子液制备

从甘油保藏管中吸取200μL青春双歧杆菌接入10mL MRS液体培养基(添加1g/L的半胱氨酸盐酸盐)，放入厌氧工作站37℃恒温培养24h，然后以5％(v/v)的接种量转入100mL液体培养基中进行二次活化，37℃恒温厌氧培养15h即得种子液。

(2)接种前准备及接种过程

配制碳源和氮源浓度减半的MRS液体培养基(添加1g/L的半胱氨酸盐酸盐)600mL倒入1L发酵罐中，发酵罐罐体121℃高温灭菌后水浴冷却至37℃，并保持温度恒定。开始接种时，在酒精火焰圈上方，将种子液以5％(v/v)的接种量倒入发酵罐中，以150～200r/min速度搅拌，以0.8mL/min流量持续通入无菌氮气保持培养体系的厌氧环境，37℃恒温培养。

(3)补料系统与补碱系统的关联设置

将补料系统与补碱系统进行关联，设置补碱量与补料量的补加比例为1：2.5，即流加1mL碱液时，补料泵自动补加2.5mL补料培养基。

(4)碱液和补料培养基的准备

准备配制400g/L的氢氧化钠溶液，并在121℃高温下灭菌。根据发明内容中的方法，选择90％计算葡萄糖浓度，分别配制葡萄糖溶液和酵母粉、牛肉膏、蛋白胨溶液，高温灭菌后混合，使葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨的终浓度分别为320g/L、160g/L、80g/L、80g/L。

(5)自动反馈补料控制

培养过程中当pH值低于6.9时，补碱系统自动补加碱液使培养体系pH值保持在7.0左右。因补料系统与补碱系统的关联，实现了补料培养基的自动补加。确保了底物浓度既满足菌体生长的需求，又不会过量补加。发酵过程菌体浓度及葡萄糖浓度变化情况如图3所示。

(6)最终活菌浓度

培养时间20h后，青春双歧杆菌的OD₆₂₀停止增长，菌体浓度达到最高值，此时菌体OD₆₂₀达到12.1，菌浓达到3.5±0.1×10⁹cfu/mL。

实施例3自动反馈补料高密度培养植物杆菌

植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌等其他同型发酵乳杆菌的自动反馈补料培养同实施例1，培养温度为各菌株的最适生长温度。如图2所示，植物乳杆菌培养16h后达到最终活菌浓度1.3±0.1×10¹⁰cfu/mL。

实施例4自动反馈补料高密度培养长双歧杆菌

两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌等其他双歧杆菌的自动反馈补料培养同实施例2，培养温度为各菌株的最适生长温度。如图4所示，长双歧的最终活菌浓度可达到4.1±0.2×10⁹cfu/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高密度培养乳酸菌的方法，其特征在于，是将补料系统与补碱系统进行关联，根据补碱量自动补加补料培养基，实现由pH值自动反馈补料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌包括同型发酵乳杆菌以及双歧杆菌；所述同型发酵乳杆菌包括：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)；所述双歧杆菌包括歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述同型发酵乳杆菌培养时碱液瓶中氢氧化钠浓度(C_碱，g/L)和补料瓶中补料培养基的葡萄糖浓度(C_料，g/L)根据以下公式(1)配制：

式(1)中：

40表示氢氧化钠的摩尔分子量，g/mol；

2表示1分子的葡萄糖产生2分子的乳酸；

90％～100％表示90％～100％的葡萄糖被同型发酵乳杆菌转化成乳酸；

180表示葡萄糖的摩尔分子量，g/mol。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述同型发酵乳杆菌的补料培养基中营养物质质量比为葡萄糖：牛肉膏：蛋白胨：酵母粉＝(8～10)：(0.5～2)：(0.5～2)：(0.5～1)。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌培养时碱液瓶中氢氧化钠浓度(C_碱，g/L)和补料瓶中补料培养基的葡萄糖浓度(C_料，g/L)根据以下公式(2)配制：

(2)式中：

40表示氢氧化钠的摩尔分子量，g/mol；

2和5表示2分子的葡萄糖产生5分子的酸；

90％～100％表示90％～100％的葡萄糖被双歧杆菌转化成酸，优选90％；

180表示葡萄糖的摩尔分子量，g/mol。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，双歧杆菌的补料培养基中营养物质质量比为葡萄糖：酵母粉：牛肉膏：蛋白胨＝(8～10)：(1～4)：(0.5～2)：(0.5～2)。

7.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，补料系统与补碱系统的关联比例为k：1，即补加1mL碱液，自动补加k mL补料培养基。

8.根据权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子培养；

(2)补料分批发酵：将种子液接种于发酵培养基中进行补料分批发酵培养，发酵条件为：发酵温度为各菌株的最适生长温度，搅拌转速150-200r/min，pH值由发酵罐控制单元控制；补碱泵与补料泵进行1：k的转速关联，实现补碱1mL自动补加k mL补料培养基的控制；在发酵过程中，向培养体系中自动补加碱液和补料培养基，满足菌体生长和底物浓度的稳定性，待菌体浓度停止增长时终止发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，同型发酵乳杆菌的发酵培养基为碳源和氮源浓度减半的MRS培养基；双歧杆菌的发酵培养基为碳源和氮源浓度减半的含1g/L L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当发酵液的pH值小于6.9时，系统自动补加碱液使培养体系pH值维持中性；在整个发酵阶段，通过补碱系统的自动控制实现补料培养基适时适量地加入培养体系，使培养体系中葡萄糖浓度维持在8～10g/L。