CN108102967A - 一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株及其产孢方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株及其产孢方法，所述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的保藏号CGMCC No.9514，具有抑菌性能，可在制备抑菌剂方面进行应用，可应用于平板产孢方法和液体发酵产孢方法，有利于今后生产和应用。

Description

一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株及其产孢方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株及其产孢方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，革兰氏阳性菌，能形成内生孢子，发酵产生L-乳酸，是同型乳酸发酵菌，又称为乳酸芽孢杆菌。是经美国药品食品管理局(FDA)批准的一种“普遍认为安全”的菌种，是目前效果最为确切的益生菌。口服后，凝结芽孢杆菌在动物的盲、结和直肠定植，发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶。
凝结芽孢杆菌经人工胃液(pH1.4)处理2小时后的存活率为95.29％。研究表明凝结芽孢杆菌对人工胃液的酸性条件耐受性极强，其存活不受影响，明显优于其它微生态制剂，能顺利通过胃进入肠道，从而保证药效的正常发挥，将凝结芽孢杆菌密封于塑料瓶内，置于55℃干燥箱内处理60小时后，测定活菌数的结果表明，仍不低于1亿cfu/g，水分含量无明显改变，凝结芽孢杆菌制剂可以在室温保存，有效期可达24个月。
凝结芽孢杆菌的功能特点：(1)有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能；(2)提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料肉比；(3)有效改善断奶仔猪由于应激和过敏反应引起的菌群失调性腹泄；(4)无任何毒副作用，使用安全，并可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体，改善养殖环境。
凝结芽孢杆菌生长缓慢，平板培养24小时，肉眼不能看到菌落，凝结芽孢杆菌在普通YPD平板上不能形成芽孢，菌种容易死亡，复活率低，关于平板形成芽孢的技术方法至今仍没有相关报道，与此同时，液体产孢技术虽有报道但是活菌数和芽孢数都偏低，不能达到生产的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供应用上述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的产孢方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株，保藏号CGMCC No.9514。
上述菌株是从鸡粪便中分离出了一株厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌，该菌革兰氏染色呈阳性，有良好的产乳酸性能，又能产生芽孢，将其命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
上述鸡源凝结芽孢杆菌菌株具有抑菌性能，可在制备抑菌剂方面进行应用。
应用上述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的产孢方法，具体步骤如下：
(1)制备产孢培养基平板，所述产孢培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母浸粉5-10g/L，牛肉膏0.3-0.5g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，琼脂粉15-20g/L，pH6.8-7.0；
(2)制备凝结芽孢杆菌产孢液，其制备方法为：将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌-80℃保藏甘油管快速溶化，直接接种于YPD培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中，装液量25-100ml/250ml，培养方法为温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时；
(3)将凝结芽孢杆菌产孢液划线于产孢培养基平板上培养至生成大量芽孢。
优选的，上述产孢方法，所述步骤(1)中产孢培养基含有葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1 g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L，琼脂粉15g/L，pH 6.8。
优选的，上述产孢方法，所述步骤(3)中培养方法是划线、涂布，使菌落分散开后，倒置于40℃的恒温恒湿培养箱中培养5-7天。
应用上述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的发酵产孢方法，具体步骤如下：
(1)一级种子液制备：取-80℃保存的冷冻甘油管直接接种于YPD培养基中培养；
(2)二级种子液制备：将步骤(1)培养的一级种子液接种于二级种子液培养基中培养，所述二级种子液培养基配方为葡萄糖5-10g/L，蛋白胨 5-10g/L，酵母浸粉3-5g/L，牛肉膏0.5-1g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，pH 6.8-7.0；
(3)发酵：将步骤(2)培养的二级种子液接种到5L发酵罐中发酵，发酵期间调节发酵液pH值，适时补料，至菌体产生大量芽孢为止，其中发酵罐中培养基配方为葡萄糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母浸粉5-10g/L，牛肉膏0.3-0.5g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，pH 6.8-7.0，接种量4-8％，发酵温度40℃，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速 350-500rpm，通风量3-6L/min，当发酵液pH开始降低后，自动补充氨水，发酵后期自动补充磷酸，全程发酵pH维持在6.8，发酵4-7小时后，流加补料 180-200g/L的葡萄糖和100-150g/L的酵母浸粉混合液，补加量为发酵液体积的7-10％，发酵48-52h。
优选的，上述发酵产孢方法，所述步骤(1)中所述一级种子培养是将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌-80℃保藏甘油管快速溶化，直接接种于YPD培养基中，接种量2-4％，装液量50-100ml/250ml，培养温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时，所述YPD培养基配方为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH6.5。
优选的，上述发酵产孢方法，所述步骤(1)中的装液量50-100ml/250ml，培养温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时。
优选的，上述发酵产孢方法，所述步骤(2)中的装液量50-100ml/500ml，接种量4-8％，培养温度40℃，转速160-200rpm，培养时间16-20小时。
优选的，上述发酵产孢方法，所述步骤(2)中二级种子液培养基配方为含有葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠 1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L， pH 6.8；所述步骤(3)中发酵罐中培养基配方为含有葡萄糖12g/L，蛋白胨 10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L， pH 6.8。
本发明的有益效果：
上述鸡源凝结芽孢杆菌菌株，是从鸡粪便中筛选出一株产酸能力强的凝结芽孢杆菌，是一种革兰氏阳性菌，该菌具有抑菌性能，且该菌生长稳定，生成芽孢产量高，保存期长，杂菌污染率低，可应用于平板产孢方法和液体发酵产孢方法以产生芽孢，发酵产乳酸，能抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等常见的致病菌，在特殊的平板上培养5-7天能产生大量芽孢，5升发酵罐发酵活菌数能达到7.5*109CFU/ml，芽孢形成率达到90％以上，有利于今后生产和应用。
附图说明
图1是凝结芽孢杆菌的抑菌性试验结果图；
图2是凝结芽孢杆菌的生长曲线图；
图3是凝结芽孢杆菌的培养液pH值随时间变化图。
保藏信息
分类名词：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
保藏日期：2014年8月15日
保藏号：CGMCC No.9514
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
所述培养基都为高温高压灭菌后使用。
YPD培养基配方为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH6.5 ±0.2。
NA培养基配方为蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L， pH 7.2±0.2。
NB培养基配方为蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，氯化钠5g/L，pH 7.2±0.2。
实施例1凝结芽孢杆菌的抑菌性能试验
将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌平板，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，培养基装液量25ml/250ml，培养温度40℃，转速180rpm，培养时间40 小时，至活菌数10^7CFU/ml。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、厌氧魏氏梭菌的冷冻甘油管，划线到NA培养基上，37℃倒置培养24小时，挑取单菌落接种于NB培养基中，装液量5ml，37℃170r/min培养15小时，适当稀释后平铺到NA培养基上，放置牛津杯，每个培养皿放3个，牛津杯中加入200ul 凝结芽孢杆菌菌液，静置30分钟，放入培养箱中40℃正置培养48小时。产生的抑菌圈如图1所示，经测定，抑菌圈直径平均值分别为金黄色葡萄球菌 21.7mm，大肠杆菌20.3mm，沙门氏菌21mm，魏氏梭菌8mm。
实施例2凝结芽孢杆菌抑制大肠杆菌生长试验
1、凝结芽孢杆菌菌液制备：
取凝结芽孢杆菌平板，挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，装液量 25ml/250ml，培养条件：温度40℃，转速180rpm，时间40小时，至活菌数 10^7CFU/ml；
2、大肠杆菌菌液制备：
取大肠杆菌平板，挑取单菌落接种于NB培养基中，装液量25ml/250ml，培养条件：温度37℃，转速180rpm，时间15小时，至活菌数10^9CFU/ml；
3、共培养试验
凝结芽孢杆菌和大肠杆菌分别用无菌水稀释到菌液活菌数数量级一致，接种到NB培养基中，37℃180rpm培养，每隔一段时间取样计数，具体接种方法见表1。
表1凝结芽孢杆菌抑制大肠杆菌生长试验方案
名称 大肠杆菌接种量 凝结芽孢杆菌接种量 无菌水加入量
对照组1 5％ 0 5％
对照组2 0 5％ 5％
实验组 5％ 5％ 0
4、计数结果见表2：
表2试验结果
大肠杆菌和凝结芽孢杆菌共培养，凝结芽孢杆菌生长起来，大肠杆菌的生长受到抑制，活菌数没有增加。
实施例3凝结芽孢杆菌的生长特性
将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌平板培养的单菌落，接种于YPD液体培养基中，培养温度40℃，转速180rpm，培养时间60小时，期间每隔2小时取样测 600nm处的吸光度和pH值，以时间为横坐标，培养液OD值为纵坐标，绘制菌株生长曲线，如图2所示。以时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制培养液pH 值随时间变化图，如图3所示。
实施例4凝结芽孢杆菌的平板产孢方法
将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌-80℃保藏甘油管快速溶化，直接接种于 YPD培养基中，培养温度40℃，转速180rpm，培养时间20小时，取该菌液划线、涂布于产孢培养基平板上，使菌落分散开后，倒置于40℃的恒温恒湿培养箱中培养5-7天。
培养基配方为葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L，琼脂粉15g/L，pH 6.8。
实施例5凝结芽孢杆菌的发酵产孢方法
具体的产孢方法，包括如下的步骤：
1、凝结芽孢杆菌的一级种子液培养：
取一只-80℃保存的冷冻甘油管，快速溶化后，直接接种于YPD培养基中，装液量100ml/250ml，培养条件：温度40℃，转速180rpm，时间18小时；
2、凝结芽孢杆菌的二级种子液培养：
将步骤1培养的一级凝结芽孢杆菌种子液接种于二级培养液中，装液量 100ml/500ml，接种量4％，培养条件：温度40℃，转速180rpm，时间21小时；
所述的二级种子液培养基配方为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH 6.8；
3、凝结芽孢杆菌的液体发酵：
发酵培养基配方为：葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L，pH6.8，培养基配好后121℃20 分钟灭菌；灭菌结束后通冷却水保温至40℃，接入步骤2中的种子液，接种量7％，调节pH至6.8，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速350rpm，通风量4L/min，发酵开始，设定自动补充酸碱，维持pH6.8。
发酵7小时开始补充葡萄糖和酵母浸粉混合水溶液，补充体积200ml，补料浓度葡萄糖180g/L，酵母浸粉100g/L。发酵48小时，活菌数7.5*109CFU/ml，芽孢数7.1*109CFU/ml。
实施例6-10根据凝结芽孢杆菌的发酵产孢方法生产的发酵液B1-B5
表3根据凝结芽孢杆菌的发酵产孢方法生产的发酵液B1-B5
发酵液 发酵时间(h) 活菌数(CFU/ml) 芽孢数(CFU/ml)
B1 49 6.5*109 6.0*109
B2 48 7.0*109 6.5*109
B3 49 7.3*109 7.0*109
B4 50 7.1*109 6.8*109
B5 54 7.4*109 7.0*109
实施例11凝结芽孢杆菌的保存期
1、样品分装：
将凝结芽孢杆菌发酵液混匀后无菌分装在5ml离心管中，每管装3ml。
2、保存：
将离心管放置在室温中，每隔一段时间取出一管做活菌计数和芽孢计数。芽孢计数方法：80℃水浴10分钟。
3、计数结果见表4。
表4凝结芽孢杆菌的保存试验结果
保存时间(天) 活菌数(CFU/ml) 芽孢数(CFU/ml)
0 7.3*109 7.0*109
180 7.1*109 6.8*109
360 6.9*109 6.7*109
540 6.8*109 6.5*109
720 6.5*109 6.2*109
实施例12凝结芽孢杆菌发酵液的杂菌污染检测试验
1、样品分装：
将凝结芽孢杆菌发酵液混匀后无菌分装在5ml离心管中，每管装3ml。
2、将防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠无菌配制成10％水溶液，测pH。
3、无菌将步骤2中的液体分别加入到不同管发酵液中，记为山梨酸钾组、苯甲酸钠组，混匀，添加量为0.5％，同时做空白对照组。
4、将对照组、山梨酸钾组、苯甲酸钠组放置于室温中，记为第0天，每隔一段时间各取出一组管做杂菌计数，结果见表5。
表5杂菌污染检测结果
上述参照实施例对该一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株及其产孢方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸡源凝结芽孢杆菌菌株，其特征在于：保藏号CGMCC No.9514。
2.权利要求1所述鸡源凝结芽孢杆菌菌株在制备抑菌剂方面的应用。
3.应用权利要求1所述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的产孢方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)制备产孢培养基平板，所述产孢培养基的配方为：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母浸粉5-10g/L，牛肉膏0.3-0.5g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾1-2g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，琼脂粉15-20g/L，pH 6.8-7.0；
(2)制备凝结芽孢杆菌产孢液，其制备方法为：将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌-80℃保藏甘油管快速溶化，直接接种于YPD培养基中，装液量25-100ml/250ml，培养方法为温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时；
(3)将凝结芽孢杆菌产孢液划线于产孢培养基平板上培养至生成大量芽孢。
4.根据权利要求3所述的产孢方法，其特征在于：所述步骤(1)中产孢培养基含有葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L，琼脂粉15g/L，pH 6.8。
5.根据权利要求3所述的产孢方法，其特征在于：所述步骤(3)中培养方法是划线、涂布，使菌落分散开后，倒置于40℃的恒温恒湿培养箱中培养5-7天。
6.应用权利要求1所述鸡源凝结芽孢杆菌菌株的发酵产孢方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)一级种子液制备：取-80℃保存的冷冻甘油管直接接种于YPD培养基中培养；
(2)二级种子液制备：将步骤(1)培养的一级种子液接种于二级种子液培养基中培养，所述二级种子液培养基配方为葡萄糖5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母浸粉3-5g/L，牛肉膏0.5-1g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，pH 6.8-7.0；
(3)发酵：将步骤(2)培养的二级种子液接种到5L发酵罐中发酵，发酵期间调节发酵液pH值，适时补料，至菌体产生大量芽孢为止，其中发酵罐中培养基配方为葡萄糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母浸粉5-10g/L，牛肉膏0.3-0.5g/L，氯化钠1-2g/L，碳酸钙1-2g/L，硫酸镁0.5-1g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，硫酸锰0.05-0.2g/L，pH6.8-7.0，接种量4-8％，发酵温度40℃，罐压0.02-0.1MPa，搅拌转速350-500rpm，通风量3-6L/min，当发酵液pH开始降低后，自动补充氨水，发酵后期自动补充磷酸，全程发酵pH维持在6.8，发酵4-7小时后，流加补料180-200g/L的葡萄糖和100-150g/L的酵母浸粉混合液，补加量为发酵液体积的7-10％，发酵48-52h。
7.根据权利要求5所述的发酵产孢方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述一级种子培养是将筛选出的鸡源凝结芽孢杆菌-80℃保藏甘油管快速溶化，直接接种于YPD培养基中，接种量2-4％，装液量50-100m l/250m l，培养温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时，所述YPD培养基配方为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，pH6.5。
8.根据权利要求5所述的发酵产孢方法，其特征在于：所述步骤(1)中的装液量50-100ml/250m l，培养温度40℃，转速160-180rpm，培养时间16-20小时。
9.根据权利要求5所述的发酵产孢方法，其特征在于：所述步骤(2)中的装液量50-100ml/500m l，接种量4-8％，培养温度40℃，转速160-200rpm，培养时间16-20小时。
10.根据权利要求5所述的发酵产孢方法，其特征在于：所述步骤(2)中二级种子液培养基配方为含有葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH 6.8；所述步骤(3)中发酵罐中培养基配方为含有葡萄糖12g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉10g/L，牛肉膏0.5g/L，氯化钠1g/L，碳酸钙1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.2g/L，pH6.8。
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