CN106978369A - 一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺 - Google Patents
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了这样一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,包括下述步骤:(1)菌株的筛选驯化:取少量屎肠球菌冻干菌粉置于改良MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌,作为种子菌株,做一级种子液菌种;(2)一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中;(3)二级种子液培养:以5%‑10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到二级种子培养液中;(4)固态发酵:以5%‑20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到固态发酵培养基中;(5)烘干粉碎:将发酵产物置于30‑50℃下烘干,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;(6)屎肠球菌检测计数。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物培养方法,尤其涉及一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺。
背景技术
屎肠球菌是我国农业部允许使用的16种可直接饲喂的饲料微生物品种之一。屎肠球菌作为乳酸菌家族成员之一,在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡,提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果,加之其对部分抗生素也具备很好的耐受性。因此,在目前的微生态制剂产业特别是饲料添加剂企业中,是深受众多厂家亲睐的一类乳酸菌产品。
目前,市场上常见的屎肠球菌是以液态发酵所得,产品活菌数虽高(可达200亿/g以上)但由于此类产品售价较高、易失活、保存条件苛刻,从而极大制约其产品在市场推广应用。
中国专利CN105132321A公开了一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法,培养基成分(质量百分比) :麦麸15~25%,豆粕19~29%,甘蔗糖密3~5%,,活性炭2~4%,碳酸钙2~6%,β-环状糊精2~6%和水35~45%。该方法为:将屎肠球菌菌种按2~4%v/v的接种量接种到培养基中,于30-40℃的条件下密闭发酵,再将发酵产物于45-60℃烘干即可。但,该方法培养出来的屎肠球菌含较多的杂菌较多,不易常温贮存。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂菌少,易常温贮存的高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺。
为达到上述目的,本发明一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于该工艺包括下述顺序的步骤:
(1) 菌株的筛选驯化:无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于改良MRS培养基中,划线,37℃培养24h,分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定,待鉴定为屎肠球菌后,选取最优屎肠球菌单菌落,作为种子菌株,做一级种子液菌种;
(2) 一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中,以30-40℃温度在摇床中培养8-24h,培养结束后即得一级种子液,置4℃冰箱中保存备用;
(3) 二级种子液培养:以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到二级种子培养液中,以30-40℃温度在无菌环境下的种子罐培养8-24h获得二级种子液;
(4) 固态发酵:以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到固态发酵培养基中,在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h;
(5)烘干粉碎:发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;
(6)屎肠球菌检测计数:取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释,制成10-8的菌悬液,在灭菌平皿中注入250μL稀释后的菌悬液,再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的屎肠球菌检测用MRS培养基,与菌液混匀,冷却、待凝固后,放入恒温培养箱中培养48h,待长出菌落后,计数。
改良MRS培养基配方(质量百分比):葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,牛肉膏0.5~1.5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,琼脂粉1~3%,碳酸钙0.1~3%,柠檬酸二铵0.1~1%,吐温80 0.01~0.1% ,硫酸镁 0.02~0.1% ,硫酸锰 0.01~0.05%,纯化水85.95~96.36%。
一级种子培养液配方(质量百分比):蔗糖1~2%,葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,牛肉膏0.5~1.5%,硫酸镁0~0.8%,硫酸锰0.1~0.8%,磷酸氢二钾0.8~3.5%,纯化水86~95%。
二级种子液培养基配方(质量百分比):蔗糖2~3%,葡萄糖0~1.5%,蛋白胨0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,牛肉膏0.5~1.5%,硫酸镁0~0.8%,硫酸锰0.1~0.8%,磷酸氢二钾0.8~3.5%,纯化水86~95%。
固态发酵培养基配制(质量百分比):豆粕10~40%、米糠2~10%,麸皮10~25%,碳酸钙1~10%,酵母浸粉0.1~2%,活性炭1~5%,硫酸镁0~1%,硫酸锰0~1%,纯化水40~75.9%,PH6.0~7.5,混合均匀,灭菌温度为110-121℃,灭菌时间1-30分钟,灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种。
屎肠球菌检测用MRS培养基配方(质量百分比):葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,牛肉膏0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,琼脂粉1~3%,纯化水86~95%。
典型屎肠球菌筛选驯化标准为:菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm,菌落周围有一圈透明溶钙圈,溶钙圈越大越好,菌落大小均一,遗传性能稳定的菌株。
屎肠球菌生理生化鉴定:触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验阴性,革兰氏染色、葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖试验阳性。
摇床转速为120-240r/min。
种子罐转速为200-300r/min。
本发明具有如下优点:
1.杂菌率低,纯度高:≤2%;
2.可在常温中储存,耐贮存,方便运输:常温中保存1年,其活性还有85%,活性高;
3. 耐高温:在40℃下保存,衰减率低;100℃下烘干,死亡率低。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步地描述。
实施例一:
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,包括下述顺序的步骤:
(1) 菌株的筛选驯化:无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,牛肉膏0.5%,酵母浸粉0.2%,氯化钠0.2%,琼脂粉1%,碳酸钙0.1%,柠檬酸二铵0.1%,吐温80 0.01% ,硫酸镁 0.02% ,硫酸锰 0.01%,纯化水96.36%的改良MRS培养基中,划线,37℃培养24h,分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定,待鉴定为屎肠球菌后,选取最优屎肠球菌单菌落,作为种子菌株,做一级种子液菌种;
(2) 一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖1%,葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,碳酸钙1%,酵母浸粉0.2%,氯化钠0.2%,牛肉膏0.5%,硫酸镁0%,硫酸锰0.1%,磷酸氢二钾0.8%,纯化水95%的一级种子培养液中,以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h,培养结束后即得一级种子液,置4℃冰箱中保存备用;
(3) 二级种子液培养:以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖2%,葡萄糖0%,蛋白胨0.5%,碳酸钙1%,酵母浸粉0.2%,氯化钠0.2%,牛肉膏0.5%,硫酸镁0%,硫酸锰0.1%,磷酸氢二钾0.8%,纯化水95%的二级种子培养液中,以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液;
(4) 固态发酵:以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕10%、米糠2%,麸皮10%,碳酸钙1%,酵母浸粉0.1%,活性炭1%,硫酸镁0%,硫酸锰0%,纯化水75.9%的固态发酵培养基中,在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h;固态发酵培养基PH6.0~7.5,配制时需混合均匀,灭菌温度为110-121℃,灭菌时间1-30分钟,灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种;
(5)烘干粉碎:发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;
(6)屎肠球菌检测计数:取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释,制成10-8的菌悬液,在灭菌平皿中注入250μL稀释后的菌悬液,再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1%,蛋白胨0.5%,牛肉膏0.5%,碳酸钙1%,酵母浸粉0.2%,氯化钠0.2%,琼脂粉1%,纯化水95%的屎肠球菌检测用MRS培养基,与菌液混匀,冷却、待凝固后,放入恒温培养箱中培养48h,待长出菌落后,计数。
典型屎肠球菌筛选驯化标准为:菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm,菌落周围有一圈透明溶钙圈,溶钙圈越大越好,菌落大小均一,遗传性能稳定的菌株。
屎肠球菌生理生化鉴定:触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验阴性,革兰氏染色、葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖试验阳性。
实施例二:
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,包括下述顺序的步骤:
(1) 菌株的筛选驯化:无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖2%,蛋白胨1.5%,牛肉膏1.5%,酵母浸粉1%,氯化钠0.8%,琼脂粉3%,碳酸钙3%,柠檬酸二铵1%,吐温800.1% ,硫酸镁0.1% ,硫酸锰0.05%,纯化水85.95%的改良MRS培养基中,划线,37℃培养24h,分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定,待鉴定为屎肠球菌后,选取最优屎肠球菌单菌落,作为种子菌株,做一级种子液菌种;
(2) 一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖2%,葡萄糖2%,蛋白胨1.5%,碳酸钙5%,酵母浸粉1%,氯化钠0.8%,牛肉膏1.5%,硫酸镁0.8%,硫酸锰0.8%,磷酸氢二钾3.5%,纯化水86%的一级种子培养液中,以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h,培养结束后即得一级种子液,置4℃冰箱中保存备用;
(3) 二级种子液培养:以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖3%,葡萄糖1.5%,蛋白胨1.5%,碳酸钙5%,酵母浸粉1%,氯化钠0.8%,牛肉膏1.5%,硫酸镁0.8%,硫酸锰0.8%,磷酸氢二钾3.5%,纯化水86%的二级种子培养液中,以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液;
(4) 固态发酵:以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕40%、米糠10%,麸皮25%,碳酸钙10%,酵母浸粉2%,活性炭5%,硫酸镁1%,硫酸锰1%,纯化水40%的固态发酵培养基中,在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h;固态发酵培养基配制需混合均匀,灭菌温度为110-121℃,灭菌时间1-30分钟,灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种;
(5)烘干粉碎:发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;
(6)屎肠球菌检测计数:取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释,制成10-8的菌悬液,在灭菌平皿中注入250μL稀释后的菌悬液,再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖2%,蛋白胨1.5%,牛肉膏1.5%,碳酸钙5%,酵母浸粉1%,氯化钠0.8%,琼脂粉3%,纯化水86%的屎肠球菌检测用MRS培养基,与菌液混匀,冷却、待凝固后,放入恒温培养箱中培养48h,待长出菌落后,计数。
实施例三
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,包括下述顺序的步骤:
(1) 菌株的筛选驯化:无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖1.5%,蛋白胨1%,牛肉膏1%,酵母浸粉0.6%,氯化钠0.5%,琼脂粉2%,碳酸钙2%,柠檬酸二铵0.5%,吐温800.05% ,硫酸镁 0.06% ,硫酸锰 0.025%,纯化水90%的改良MRS培养基中,划线,37℃培养24h,分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定,待鉴定为屎肠球菌后,选取最优屎肠球菌单菌落,作为种子菌株,做一级种子液菌种;
(2) 一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖1.5%,葡萄糖1.5%,蛋白胨1%,碳酸钙3%,酵母浸粉0.6%,氯化钠0.5%,牛肉膏1%,硫酸镁0.4%,硫酸锰0.35%,磷酸氢二钾2%,纯化水90%的一级种子培养液中,以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h,培养结束后即得一级种子液,置4℃冰箱中保存备用;
(3) 二级种子液培养:以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖2.5%,葡萄糖0.5%,蛋白胨1%,碳酸钙3%,酵母浸粉0.6%,氯化钠0.5%,牛肉膏1%,硫酸镁0.4%,硫酸锰0.35%,磷酸氢二钾2%,纯化水90%的二级种子培养液中,以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液;
(4) 固态发酵:以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕25%、米糠6%,麸皮12.5%,碳酸钙6%,酵母浸粉1%,活性炭3%,硫酸镁0.5%,硫酸锰0.5%,纯化水55%的固态发酵培养基中,在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h;固态发酵培养基配制需混合均匀,灭菌温度为110-121℃,灭菌时间1-30分钟,灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种;
(5)烘干粉碎:发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;
(6)屎肠球菌检测计数:取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释,制成10-8的菌悬液,在灭菌平皿中注入250μL稀释后的菌悬液,再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1.5%,蛋白胨1%,牛肉膏1%,碳酸钙3%,酵母浸粉0.6%,氯化钠0.5%,琼脂粉2%,纯化水90%的屎肠球菌检测用MRS培养基,与菌液混匀,冷却、待凝固后,放入恒温培养箱中培养48h,待长出菌落后,计数。
以上实施例效果:
由于屎肠球菌在培养过程中分泌乳酸将培养基中的碳酸钙溶解,使得菌落的周围形成一个透明圈,因此,在计数时有透明圈的菌落即为屎肠球菌,而无透明圈的菌落为杂菌。每克粉碎产品活菌数计算公式:同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×108×4 单位:cfu/g
1.常温下储存衰减实验
实验方法:实验选取3个不同生产批次的屎肠球菌产品,用铝箔袋封口,放置于室内避光常温条件下存储(说明:该存放地为福建龙岩,夏季室内最高温度达35℃,冬季室内温度最低在5℃以上),每天早晚记录室内温湿度,每隔3个月取样做平皿活菌计数,观察统计衰减情况。
表1.常温下保存1年衰减情况统计
实验结果:实验中3个样品都是在2-3月陆续开始,实验结果表明存放3个月本发明屎肠球菌产品衰减在0-2%之间,在存放6个月、9个月衰减最严重在5-12%之间(夏季高温乳酸菌衰减加剧有关),最后三个月衰减率为2%-3%之间(冬季温度较低乳酸菌衰减缓慢)。说明本专利产品在经过一年常温条件下保存,衰亡损失率≤15%。
2.高温衰减试验:
实验方法1:从市场上挑取不同厂家生产的固态、液态屎肠球菌与本发明产品做40℃高温保存对比实验。实验结果如下表:
表2.40℃恒温培养箱中保存7天衰减情况统计
实验结果:从上表可以得出本发明专利产品屎肠球菌在40℃高温环境下保存7天其衰减率远低于上述固态发酵和液态发酵屎肠球菌。
实验方法2:从市场上挑取不同厂家生产的固态、液态屎肠球菌与本发明产品做100℃高温抗逆性对比实验。实验结果如下表:
表3.100℃高温抗逆性对比情况统计
实验结果:从上表可以得出本发明专利产品屎肠球菌在100℃高温环境下抗逆性远高于上述固态发酵和液态发酵屎肠球菌。
Claims (10)
1.一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于该工艺包括下述顺序的步骤:
(1) 菌株的筛选驯化:无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于改良MRS培养基中,划线,37℃培养24h,分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线MRS培养基中,连续纯化传代复壮3次,最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定,待鉴定为屎肠球菌后,选取最优屎肠球菌单菌落,作为种子菌株,做一级种子液菌种;
(2) 一级种子液培养:无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中,以30-40℃温度在摇床中培养8-24h,培养结束后即得一级种子液,置4℃冰箱中保存备用;
(3) 二级种子液培养:以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到二级种子培养液中,以30-40℃温度在无菌环境下的种子罐培养8-24h获得二级种子液;
(4) 固态发酵:以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到固态发酵培养基中,在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h;
(5)烘干粉碎:发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h,再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品;
(6)屎肠球菌检测计数:取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释,制成10-8的菌悬液,在灭菌平皿中注入250μL稀释后的菌悬液,再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的屎肠球菌检测用MRS培养基,与菌液混匀,冷却、待凝固后,放入恒温培养箱中培养48h,待长出菌落后,计数。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于改良MRS培养基配方(质量百分比):葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,牛肉膏0.5~1.5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,琼脂粉1~3%,碳酸钙0.1~3%,柠檬酸二铵0.1~1%,吐温800.01~0.1% ,硫酸镁 0.02~0.1% ,硫酸锰 0.01~0.05%,纯化水85.95~96.36%。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于一级种子培养液配方(质量百分比):蔗糖1~2%,葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,牛肉膏0.5~1.5%,硫酸镁0~0.8%,硫酸锰0.1~0.8%,磷酸氢二钾0.8~3.5%,纯化水86~95%。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于二级种子液培养基配方(质量百分比):蔗糖2~3%,葡萄糖0~1.5%,蛋白胨0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,牛肉膏0.5~1.5%,硫酸镁0~0.8%,硫酸锰0.1~0.8%,磷酸氢二钾0.8~3.5%,纯化水86~95%。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于固态发酵培养基配制(质量百分比):豆粕10~40%、米糠2~10%,麸皮10~25%,碳酸钙1~10%,酵母浸粉0.1~2%,活性炭1~5%,硫酸镁0~1%,硫酸锰0~1%,纯化水40~75.9%,PH6.0~7.5,混合均匀,灭菌温度为110-121℃,灭菌时间1-30分钟,灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于屎肠球菌检测用MRS培养基配方(质量百分比):葡萄糖1~2%,蛋白胨0.5~1.5%,牛肉膏0.5~1.5%,碳酸钙1~5%,酵母浸粉0.2~1%,氯化钠0.2~0.8%,琼脂粉1~3%,纯化水86~95%。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于典型屎肠球菌筛选驯化标准为:菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm,菌落周围有一圈透明溶钙圈,菌落大小均一,遗传性能稳定的菌株。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于屎肠球菌生理生化鉴定:触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验阴性,革兰氏染色、葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖试验阳性。
9.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于摇床转速为120-240r/min。
10.根据权利要求1所述的一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺,其特征在于种子罐转速为200-300r/min。
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