CN109234215A - 一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法 - Google Patents

一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基，包括基础培养基和优化培养基，基础培养基包括组分：酵母蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、乳糖、低聚异麦芽糖、L‑苹果酸、硫酸锰，余量为无菌水，pH值6.50～7.00；优化培养基包括组分：酵母蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、乳糖、低聚异麦芽糖、L‑苹果酸、柠檬酸、硫酸锰，余量为无菌水，pH值6.50～7.00。该培养基适于鼠李糖乳杆菌的繁殖培养，发酵液活菌数均能达到109CFU/ml以上。

Description

一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鼠李糖乳杆菌的低盐培养基及培养方法。
背景技术
微生物培养基(Medium)是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，主要为微生物提供生长所需的碳源和氮源等营养物质，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)和水等。不同培养基可根据实际需要，添加一些生长因子。
研究发现，很多现代慢性病如高血压、肾病、上呼吸道感染、心脏病等，都与用盐过多呈正相关。低盐饮食已成为一种健康的生活方式，故高盐是制约鼠李糖乳杆菌及其代谢产物作为原料或添加剂应用于各领域的关键因素之一。常用的鼠李糖乳杆菌培养基(MRS)通常含有较高浓度的无机盐成分，这样会导致菌体、发酵液、离心后清液盐度较高，口感偏咸，从而影响其在农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域的应用。目前未见到鼠李糖乳杆菌低盐培养基的相关报道，本发明降低鼠李糖乳杆菌培养基中的无机盐成分，不仅能够确保鼠李糖乳杆菌的活菌数和发酵产率，而且能够使鼠李糖乳杆菌的发酵终产物盐度降低，还可以降低终排放废液中的金属离子的含量，有利于环境保护。
发明内容
本发明目的是提供一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基及培养方法，适于鼠李糖乳杆菌的繁殖培养，本发明不仅能够有效增殖鼠李糖乳杆菌，还有利于实现大规模工业化生产，从而使得作为低盐食品添加剂的鼠李糖乳杆菌发酵液、冻干菌粉和离心后的上清液具有更宽广的应用领域。
本发明采用的技术方案为：
一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基，包括低盐基础培养基和低盐优化培养基；
所述的低盐基础培养基的配方为：酵母蛋白胨15～25g/L、酵母粉5～15g/L、葡萄糖25～35g/L、乳糖5～15g/L、低聚异麦芽糖2～5g/L、L-苹果酸3～7g/L、硫酸锰0.03～0.07g/L，余量为纯化水，pH值6.5～7.0；
所述的低盐优化培养基的配方为：酵母蛋白胨15～25g/L、酵母粉10～25g/L、葡萄糖25～35g/L、乳糖5～15g/L、低聚异麦芽糖2～5g/L、L-苹果酸3～7g/L、柠檬酸3～7g/L、硫酸锰0.03～0.07g/L，余量为纯化水，pH值6.5～7.0。
采用低盐基础培养基和低盐优化培养基培养鼠李糖乳杆菌的培养方法，包括如下步骤：
1)制备发酵用的菌种
1.1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于低盐基础培养基上分区划线，35～37℃厌氧培养50～60小时；
1.2)一级纯化培养：挑取低盐基础培养基平皿上的单菌落，接种至5mL低盐基础培养基的试管中，密封，35～37℃培养箱恒温静置厌氧培养15～20小时，得一级纯化菌悬液；
1.3)二级纯化培养：按2～6％接种量，将培养好的一级纯化菌悬液接种至装有低盐基础培养基的100mL三角瓶中，装液量60％，密封，35～37℃培养箱恒温静置厌氧培养15～20小时，得二级纯化菌悬液；
1.4)菌泥制备与保存：将二级纯化菌悬液进行离心，10000rpm离心10min得到菌泥，将菌泥溶解于低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，得鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，备用；
2)菌种发酵
2.1)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35～37℃水浴锅内进行菌种复苏，至冻存管内液体全部融化；每支冻存管菌液接种至含10mL低盐基础培养基的试管中，35～37℃静置密封培养20h，得一级培养菌悬液；
2.2)菌种扩大培养：将一级培养菌悬液按照2～6％的接种量接种至装有低盐基础培养基的三角瓶中，装液量为60％，三角瓶密封，35～37℃静置密封培养16～20小时，得二级培养菌悬液；
2.3)菌种一级发酵：按照2～6％接种量，将二级培养菌悬液接种至装有低盐基础培养基的发酵罐中，装液量为60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35～37℃恒温培养10～12小时，得三级培养菌悬液；
2.4)菌种二级发酵：按照2～6％接种量，将三级培养菌悬液接种至装有低盐优化培养基的发酵罐中，装液量为60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35～37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.60±0.1，培养至9～11小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌液做降温处理。
所述的培养方法，步骤1.4)所述的低盐基础培养基与50％甘油溶液的体积比为4:6；低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液与离心前的二级纯化菌悬液的体积比为1:10。
本发明具有以下优点：
1、较现在应用于鼠李糖乳杆菌培养常用的MRS培养基，本发明针对鼠李糖乳杆菌纯化培养和菌种发酵分别采用了不同的更适于菌体不同生长阶段的基础培养基和优化培养基，并且在两种培养基中均减少了无机盐组分，即未添加柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、乙酸钠和硫酸镁，这样在能够保证有效增殖培养鼠李糖乳杆菌的同时，还能够使得作为低盐食品添加剂的鼠李糖乳杆菌发酵液、冻干菌粉和离心后清液的生产大规模工业化，从而扩大其在农牧业、食品和医药等领域的应用。
表1常用MRS培养基与低盐培养基成分明细列表
2、本发明中用于鼠李糖乳杆菌的培养基采用的组分原料均为食品级，通过低盐培养基培养得到的菌体发酵后的发酵液、发酵液离心后得到的菌体以及制备的冻干菌粉、发酵液离心后得到的上清液均可以制成低盐的制剂，作为原料或者添加剂应用于药品、食品、化妆品、饲料和环境等领域，避免了高盐培养基对其应用的限制。
3、在本发明中，采用低盐培养基发酵的发酵液无机盐含量低，可降低终排放的发酵废液对环境的影响。
4、通过低盐培养基得到的最终发酵液活菌数能达到109CFU/ml以上，并且菌种稳定，变异、退化少。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌在MRS培养基中菌体的镜检图；
图2为鼠李糖乳杆菌在本发明低盐培养基中菌体的镜检图。
具体实施方式
实施例1一种鼠李糖乳杆菌培养基及培养方法
(一)一种鼠李糖乳杆菌培养基，包括：低盐基础培养基和低盐优化培养基；
鼠李糖乳杆菌低盐基础培养基的配方和制备，配方：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、硫酸锰0.06g/L，余量为纯化水，pH值6.8；按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，115℃下灭菌30min。
鼠李糖乳杆菌低盐优化培养基的配方和制备，配方：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸6g/L、硫酸锰0.06g/L，余量为纯化水，pH值6.8；按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，115℃下灭菌30min。
(二)一种鼠李糖乳杆菌的培养方法：
采用上述(一)中的鼠李糖乳杆菌培养基，具体包括如下步骤：
1)制备发酵用的菌种
1.1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于平皿中低盐基础培养基上分区划线，37℃厌氧培养60小时；
1.2)一级纯化培养：挑取低盐基础培养基平皿上的单菌落，接种至装有5mL低盐基础培养基的试管中，密封，37℃培养箱恒温静置厌氧培养20小时，得一级纯化菌悬液；
1.3)二级纯化培养：按3％接种量，将培养好的一级低盐菌悬液接种至装有150mL低盐基础培养基的250mL三角瓶中，密封，37℃培养箱恒温静置厌氧培养20小时，得二级纯化菌悬液；
1.4)菌泥制备与保存：将二级纯化菌悬液进行离心，10000rpm离心10min得到菌泥，将菌泥溶解于低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液(其中低盐基础培养基与50％甘油溶液的体积比为4:6；低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液与离心前二级纯化菌悬液的体积比为1:10)中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，得鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，备用；
2)菌种发酵
2.1)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，至冻存管内液体全部融化；每支冻存管菌液接种至含10mL低盐基础培养基的试管中，37℃静置密封培养20h，得一级培养菌悬液；
2.2)菌种扩大培养：将一级培养菌悬液按照3％的接种量接种至装有150ml低盐基础培养基的250mL三角瓶中，三角瓶密封，37℃静置密封培养20小时，得二级培养菌悬液；
2.3)菌种一级发酵：按照4％接种量，将二级培养菌悬液接种至装有7.2L低盐基础培养基的12L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养10小时，得三级培养菌悬液；
2.4)菌种二级发酵：按照5％接种量，将三级培养菌悬液接种至装有120L低盐优化培养基的200L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.60±0.1，培养至9小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌液做降温处理。
实施例2低盐基础培养基组分的单因素筛选实验
目前应用于鼠李糖乳杆菌培养的培养基最多的是MRS培养基，为达到低盐培养及鼠李糖乳杆菌大量生长的目的，寻找适于鼠李糖乳杆菌增殖的低盐培养基，应用于大规模工业化生产作为食品添加剂的鼠李糖乳杆菌冻干粉，对MRS培养基进行低盐改良实验。
提高MRS培养基中的氮源与碳源含量，降低无机盐的含量，针对MRS培养基配方中柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰组分，进行单因素实验，考察每个组分对培养鼠李糖乳杆菌的活菌数的影响。
鼠李糖乳杆菌的低盐基础培养基与MRS培养基相比，增加了氮源酵母蛋白胨、酵母粉以及碳源葡萄糖、低聚异麦芽糖的含量，减少了无机盐的种类和含量，并去掉吐温80。按照以下各组培养基配方配制培养基，并在相同的培养条件下培养鼠李糖乳杆菌，检测发酵液的活菌数，以及将发酵液离心后上清液的电导率。
MRS培养基配方：酵母蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、吐温80 1mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L，余量为纯化水。
配方Ⅰ：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸氢二铵0.06g/L，余量为纯化水。
配方Ⅱ：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、磷酸二氢钾0.06g/L，余量为纯化水。
配方Ⅲ：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、硫酸镁0.06g/L，余量为纯化水。
配方Ⅳ(实施例1)：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、硫酸锰0.06g/L，余量为纯化水。
表2单因素实验鼠李糖乳杆菌基础培养基配方检测结果
表2的结果显示，低盐基础培养基配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组与MRS培养基相比，发酵液离心后上清液的电导率值均大幅降低，发酵液的活菌数略有下降。配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的电导率值相差不大，但配方Ⅳ组即实施例1其发酵液活菌数高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，且与MRS培养基的发酵液活菌数相差不大。因此，配方Ⅳ组即实施例1既能保证较高的活菌数，又能降低电导率。
实施例3低盐优化培养基组分的单因素筛选实验
选取实施例2中配方Ⅳ的基础培养基培养的菌液，按照5％接种量，将三级培养菌悬液接种至装有120L低盐优化培养基的200L发酵罐中，进行菌种二级发酵。其中鼠李糖乳杆菌的低盐优化培养基与MRS培养基相比，增加了氮源和碳源的含量，减少了无机盐的种类和含量，并去掉吐温80。按照以下各组培养基配方配制培养基，并在相同的培养条件下培养鼠李糖乳杆菌，检测发酵液的活菌数，以及将发酵液离心后上清液的电导率。
MRS培养基配方：酵母蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、吐温80 1mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L，余量为纯化水。
配方1：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L，余量为纯化水。
配方2：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸6g/L，余量为纯化水。
配方3：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸6g/L、大豆低聚糖0.3g/L，余量为纯化水。
配方4：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸6g/L、菊粉0.1g/L，余量为纯化水。
配方5(实施例1)：酵母蛋白胨22g/L、酵母粉11g/L、葡萄糖32g/L、乳糖11g/L、低聚异麦芽糖3g/L、L-苹果酸6g/L、柠檬酸6g/L、硫酸锰0.06g/L，余量为纯化水。
表3单因素实验鼠李糖乳杆菌优化培养基配方检测结果
表3的结果显示，低盐优化培养基配方1、2、3、4、5组与MRS培养基相比，发酵液离心后上清液的电导率值均低于MRS培养基组，5组发酵液的活菌数与MRS培养基组基本一致，且明显高于1、2、3、4组发酵液的活菌数。因此，配方5组即实施例1既能保证发酵液较高的活菌数，又能降低电导率。
实施例4菌体镜检比对实验
取实施例1中的鼠李糖乳杆菌菌泥，分别采用MRS培养基和本发明低盐培养基进行培养，培养方法同实施例1，分别取两种培养基培养的最终菌液进行菌体镜检比对实验，观察菌体形态是否一致，从而判断低盐培养基是否对菌体的形态有影响。
低盐培养基培养的鼠李糖乳杆菌符合其特征形态：革兰氏阳性，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐；细胞呈短杆状，常3-5个成链排列。详见图1和图2对比所示，说明本发明的低盐培养基对菌体的形态无显著影响。

Claims (4)

1.一种鼠李糖乳杆菌低盐培养基，其特征在于，包括低盐基础培养基和低盐优化培养基；
所述的低盐基础培养基的配方为：酵母蛋白胨15～25g/L、酵母粉5～15g/L、葡萄糖25～35g/L、乳糖5～15g/L、低聚异麦芽糖2～5g/L、L-苹果酸3～7g/L、硫酸锰0.03～0.07g/L，余量为纯化水，pH值6.5～7.0；
所述的低盐优化培养基的配方为：酵母蛋白胨15～25g/L、酵母粉10～25g/L、葡萄糖25～35g/L、乳糖5～15g/L、低聚异麦芽糖2～5g/L、L-苹果酸3～7g/L、柠檬酸3～7g/L、硫酸锰0.03～0.07g/L，余量为纯化水，pH值6.5～7.0。
2.一种鼠李糖乳杆菌低盐培养方法，其特征在于，采用如权要求1所述的鼠李糖乳杆菌低盐培养基进行培养，包括如下步骤：
1)制备发酵用的菌种
1.1)划线培养：鼠李糖乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于低盐基础培养基上分区划线，35～37℃厌氧培养50～60小时；
1.2)一级纯化培养：挑取低盐基础培养基平皿上的单菌落，接种至5mL低盐基础培养基的试管中，密封，35～37℃培养箱恒温静置厌氧培养15～20小时，得一级纯化菌悬液；
1.3)二级纯化培养：按2～6％接种量，将培养好的一级纯化菌悬液接种至装有低盐基础培养基的100mL三角瓶中，装液量60％，密封，35～37℃培养箱恒温静置厌氧培养15～20小时，得二级纯化菌悬液；
1.4)菌泥制备与保存：将二级纯化菌悬液进行离心，10000rpm离心10min得到菌泥，将菌泥溶解于低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，得鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，备用；
2)菌种发酵
2.1)冻存菌泥复苏：取存于低温冰箱内的鼠李糖乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35～37℃水浴锅内进行菌种复苏，至冻存管内液体全部融化；每支冻存管菌液接种至含10mL低盐基础培养基的试管中，35～37℃静置密封培养20h，得一级培养菌悬液；
2.2)菌种扩大培养：将一级培养菌悬液按照2～6％的接种量接种至装有低盐基础培养基的三角瓶中，装液量为60％，三角瓶密封，35～37℃静置密封培养16～20小时，得二级培养菌悬液；
2.3)菌种一级发酵：按照2～6％接种量，将二级培养菌悬液接种至装有低盐基础培养基的发酵罐中，装液量为60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35～37℃恒温培养10～12小时，得三级培养菌悬液；
2.4)菌种二级发酵：按照2～6％接种量，将三级培养菌悬液接种至装有低盐优化培养基的发酵罐中，装液量为60％，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35～37℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.60±0.1，培养至9～11小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵，并对菌液做降温处理。
3.如权利要求2所述的一种鼠李糖乳杆菌低盐培养方法，其特征在于，步骤1.4)所述的低盐基础培养基与50％甘油溶液的体积比为4:6。
4.如权利要求2所述的一种鼠李糖乳杆菌低盐培养方法，其特征在于，低盐基础培养基与50％甘油溶液组成的混合液与离心前的二级纯化菌悬液的体积比为1:10。
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