CN115181707A - 一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生态领域，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌新菌株，其保藏编号为CGMCC NO.25499，本发明的枯草芽孢杆菌具有良好的产酶和抑菌特性。本发明还提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法。本发明通过优化芽孢杆菌发酵培养基配方，显著提升了枯草芽孢杆菌的有效活菌数。本发明通过液体深层发酵，得到液体发酵产物，将液体发酵产物接种于固体发酵培养基中，进行固体发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵物；将枯草芽孢杆菌发酵物烘干后粉碎即得枯草芽孢杆菌菌剂。本发明利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数，降低菌剂的原料与后处理成本。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方法
技术领域
本发明属于微生态领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方法。
背景技术
随着集约化养殖业的发展，抗生素在畜禽饲料中的用量越来越大，抗生素的药物残留和抗药性对人类健康的影响带来许多不良影响。饲用益生菌是近年来出现的一类新型饲料添加剂，它可直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防疾病、促进动物生长和提高饲料利用率的目的，其中芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生菌，因为芽孢杆菌以孢子形式存在，具有耐热、耐酸、耐胆盐的特性，在饲料制粒过程中损失较少，进入肠道后可以萌发为具有新陈代谢作用的益生菌群。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有很强的抑菌作用。枯草芽孢杆菌作为益生菌，在发酵过程中能产生抑菌活性肽和淀粉酶、蛋白酶等，其发酵产物对抑制肠道有害菌、促进营养物质消化吸收有重要作用。目前，枯草芽孢杆菌主要用于抑菌植物性病原菌，防止病害、调节生长；对于金葡、大肠、沙门等动物性病原菌，枯草芽孢杆菌多数呈窄谱抑菌。
当前，国内外生产芽孢菌剂方法主要包括液体深层发酵与纯固体发酵。其中，液体深层发酵存在生产成本高、难以得到高密度的活菌与芽孢、代谢物不能充分利用、后续处理复杂(如发酵液真空浓缩，固态粉剂载体的吸附，干燥等)、有废液排放等弊端，而纯固体发酵由于多级固体扩种增加染菌风险且工艺复杂、发酵周期长，因此不适合推广使用。如何在保证有效活菌数的同时兼顾生产成本，成为困扰芽孢菌剂实际工业生产的瓶颈问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌新菌株。本发明还提出一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法旨在利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数，降低菌剂的原料与后处理成本，为建立规模化的发酵工艺提供参考依据。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
首先，本发明提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株，该菌株在LB培养基上的菌落形态为菌落乳白色，表面粗糙、边缘不规则。经16S rRNA分析鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌BS-ZPW，并于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.25499。
其次，本发明还提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，包括以下步骤：
(1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养：取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落，接种于一级种子培养基中，装液量50mL/150mL，37℃培养18小时，得到一级种子液；
(2)所述枯草芽孢杆菌二级种子液培养：将步骤1培养的所述枯草芽孢杆菌一级种子液接种于二级种子培养基中装液量100mL/250mL，接种量3％，37℃培养8～10h，得到二级种子液；
(3)所述枯草芽孢杆菌液体发酵：液体发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量3％，搅拌速度180rpm，维持pH 7.0，通气量为0.5～1.5vvm，发酵时间为24h；
(4)所述枯草芽孢杆菌固体发酵：将液体发酵后的产物接种于已灭菌的固体发酵培养基中，接种量10％(v/m)，堆料厚度3～5cm，37℃培养72h，每隔24h翻动一次培养基；
(5)将所述固体发酵后的发酵物烘干粉碎后即得所述枯草芽孢杆菌菌剂。
进一步，所述步骤(1)和步骤(2)的种子培养基为LB培养基。
进一步，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5～10g/L,蔗糖4～8g/L，豆粕8～24g/L，硫酸亚铁0.125～0.5g/L，硫酸锰0.125～0.5g/L，碳酸钙0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，硫酸镁1.25～5g/L。
优选的，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5g/L，蔗糖8g/L，豆粕24g/L，硫酸亚铁0.125g/L，硫酸锰0.5g/L，碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3.75g/L。
进一步，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：麦麸45％，葡萄糖5％，稻壳粉20％，玉米粉20％，海藻糖5％，豆粕5％或花生饼粉53％，麦麸35％，棉粕12％。
进一步，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉10％，麦麸60％，稻壳粉20％，蔗糖5％，豆粕5％，料液比为60％。
进一步，所述步骤(5)具体为：将所述枯草芽孢杆菌固体发酵物在温度不高于50℃的条件下烘干至含水量10％，粉碎后即得枯草芽孢杆菌菌剂。
本发明还提供了含有所述枯草芽孢杆菌菌株的微生态制剂。
本发明还提供了含有所述的枯草芽孢杆菌菌株的饲料。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的枯草芽孢杆菌BS-ZPW具有良好的产酶和抑菌特性，且易培养，发酵，是一株值得开发的新型益生菌株。其次，本发明提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，首先利用液体发酵快速生产大量的菌体作为固体发酵的接种体，然后将液体菌液按10％的接种量混合到固体基质中，迅速形成优势菌落，并产生大量芽孢，从而缩短了发酵周期，提高了产率，减少了杂菌污染几率，节约了资源。同时发酵过程中的生防代谢产物也得以保留，克服了液体发酵代谢物不能充分利用，有废液排放等弊端。具有工艺简单，生产成本较低，节省动力，易于控制管理，活菌产量高，后处理简单等优势，有利于微生物菌剂的应用与推广。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌BS-ZPW与不同菌株产蛋白酶情况，其中左上为枯草芽孢杆菌BS-ZPW，左下为解淀粉芽孢杆菌rsc，右上为凝结芽孢杆菌NJ，右下为地衣芽孢杆菌H；
图2为枯草芽孢杆菌BS-ZPW与不同菌株产淀粉酶情况，其中左上为凝结芽孢杆菌NJ，左下为地衣芽孢杆菌H，右上为枯草芽孢杆菌BS-ZPW，右下为解淀粉芽孢杆菌rsc；
图3为枯草芽孢杆菌BS-ZPW液体发酵培养基优化情况，其中图3-1为不同氮源对BS-ZPW液体发酵的影响；图3-2为不同碳源对BS-ZPW液体发酵的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1枯草芽孢杆菌BS-ZPW分离鉴定
分离培养基1：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L。
分离培养基2：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L琼脂20g/L，121℃灭菌15min，制备平皿备用。
无菌条件下，用接种环挑取新鲜大酱放入分离培养基1中，37℃，180rpm培养24h。
无菌操作下，用接种环挑取培养24h的培养液，在分离培养基2的平皿上划线，共制备3个平皿。37℃，培养24h。选择单菌落呈乳白色、表面粗糙、表面不规则，再进行平皿划线，37℃，培养24h。按以上步骤，平皿划线3次，分得的单菌落进行编号。
16Sr RNA提取：用无菌牙签挑取带编号的单菌落，放入微量离心管管底，加入100μLddH2O，开水煮8-10min，取出迅速放入-80℃冰箱冷冻1min，重复上述步骤，再用开水煮8-10min，12000rpm离心1min，加入PCR反应体系：50μLPCRmix、2.5μL27F引物、2.5μL1492R引物、10μL菌液、35μLddH2O。PCR扩增，条件设计：95℃预变性，5min，1个循环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃无限。PCR扩增结束后，取产物进行凝胶电泳检测。样品送擎科生物技术公司测序。
序列同源性比对分析鉴定该菌株为枯草芽孢，命名为枯草芽孢杆菌BS-ZPW。该菌株于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.25499。
实施例2枯草芽孢杆菌BS-ZPW产酶和抑菌试验
1.产酶试验
对照菌株：凝结芽孢杆菌NJ，解淀粉芽孢杆菌rsc，地衣芽孢杆菌H。
1.1产蛋白酶实验
将脱脂奶粉培养基经115℃灭菌20min后，无菌条件下倒平板(脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉15g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL)。将BS-ZPW菌液稀释到适宜浓度(每毫升活菌数在100cfu/mL以下)，吸取100μL于脱脂奶粉培养基平板中，涂布均匀，倒置放于培养箱中37℃条件下培养24h。观察菌落生长情况，溶解圈大小可初步判断水解蛋白酶能力的强弱。结果见图1，与各菌株相比，BS-ZPW溶解圈最大，蛋白酶活力最高。按照国标法检测，枯草芽孢杆菌BS-ZPW蛋白酶活性为215.23U/mL，凝结芽孢杆菌NJ蛋白酶活性为146.24U/mL。
1.2产淀粉酶实验
将淀粉培养基灭菌经121℃灭菌30min后，无菌条件下倒平板(淀粉培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL)。将BS-ZPW菌液稀释到适宜浓度(每毫升活菌数在100cfu/mL以下)，吸取100μL于淀粉培养基平板中，涂布均匀，倒置放于培养箱中37℃条件下培养24h。观察菌落生长情况，滴入少量碘溶液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满平板，菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，透明圈大小可初步判断水解淀粉能力的强弱。结果见图2，与各菌株相比，BS-ZPW透明圈最大，淀粉酶活力最高。经检测，枯草芽孢杆菌BS-ZPW淀粉酶活性为1226.62U/mL，凝结芽孢杆菌NJ为440.68U/mL，解淀粉芽孢杆菌rsc为739.49U/mL。
2.抑菌实验
对照菌株：凝结芽孢杆菌CGMCC.No.12196，解淀粉芽孢杆菌rsc，地衣芽孢杆菌H、枯草芽孢杆菌CGMCC.No.4628。
致病菌：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌K88、K99。
粗酶液制备：挑取BS-ZPW与各对照菌株单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养16h，按2％接种量转接至LB液体培养基中，37℃培养12h，培养结束后，10000rpm离心10min，过0.22μm滤膜，即为粗酶液。
抑菌试验：将活化好的致病菌加入LB固体培养基中，摇匀，倒入事先放置有牛津杯的平板中，静置，待培养基凝固后取出牛津杯。吸取200μL粗酶液加入牛津杯孔中，37℃培养24h，观察抑菌情况，游标卡尺测量直径。结果见表1，结果表明，与专利菌株凝结芽孢杆菌CGMCC.No.12196相比较，BS-ZPW对金葡、大肠具有明显的抑菌作用，与专利菌株枯草芽孢杆菌CGMCC.No.4628比较，BS-ZPW对大肠杆菌K88、K99抑菌作用显著。
表1不同菌株抑菌试验对比
Figure BDA0003808709320000081
注：抑菌圈直径>10mm表示有抑菌作用，显著性分析用不同字母表示，-表示无抑菌作用。
实施例3枯草芽孢杆菌BS-ZPW液体发酵
1.培养基配制：
(1)种子培养基为LB培养基，组成成分及含量为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L。
(2)基础发酵培养基：玉米粉5g/L，豆粕10g/L，蔗糖4g/L，鱼粉6g/L，碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2.5g/L，硫酸亚铁0.25g/L，硫酸锰0.25g/L，pH7.0。
2.培养基优化
(1)一级种子液
取BS-ZPW平板单菌落，接种于种子培养基中，装液量50mL/150mL，37℃培养18h，得到一级种子液。
(2)二级种子液
将步骤1培养的BS-ZPW一级种子液接种于种子培养基中装液量100mL/250mL，接种量3％，37℃培养8-10h，得到二级种子液。
(3)液体深层发酵培养基优化
氮源：豆粕+鱼粉、豆粕、鱼粉、硫酸铵、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨
碳源：玉米粉+蔗糖、蔗糖、玉米粉、葡萄糖、麦芽糖、小麦粉、马铃薯淀粉
不同培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量3％，调节pH至7.0，搅拌速度180rpm，发酵开始，设定自动补充磷酸，维持pH7.0，通气量为0.5～1.5vvm，发酵时间为24h。
氮源优化结果见图3-1，豆粕为氮源时，活菌数最高，为8.8×108CFU/mL。因此，最佳氮源为豆粕。
碳源优化结果见图3-2，碳源为玉米粉+蔗糖、蔗糖、马铃薯淀粉时，活菌数最高，且三者不相上下，其中玉米粉价格相对较为便宜，出于对原料成本的考虑，碳源选择为玉米粉+蔗糖。
碳氮比优化
确定最佳的氮源和碳源后，采用正交试验，确定最佳的碳氮比。
表2因素水平表(g/L)
Figure BDA0003808709320000091
表3正交试验表
Figure BDA0003808709320000101
由正交试验结果可知，碳氮源的最佳配比为：玉米粉：5g/L，蔗糖：8g/L，豆粕：24g/L。各因素的显著性顺序为：C＞B＞A。
无机盐优化
采用正交试验，确定无机盐比例。
表4因素水平表(g/L)
Figure BDA0003808709320000111
表5正交实验表
Figure BDA0003808709320000112
Figure BDA0003808709320000121
Figure BDA0003808709320000131
由正交试验结果可知，最优组合为A2B1C2D3E4，活菌数为2.1×109CFU/mL，因此无机盐应选择：碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3.75g/L，硫酸亚铁0.125g/L，硫酸锰0.5g/L。
综上可知，枯草芽孢杆菌BS-ZPW的最优发酵培养基成分为：玉米粉：5g/L，蔗糖：8g/L，豆粕：24g/L，碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3.75g/L，硫酸亚铁0.125g/L，硫酸锰0.5g/L。在此条件下发酵液的活菌数可达20亿cfu/mL左右。
实施例4枯草芽孢杆菌BS-ZPW固体发酵
枯草芽孢杆菌BS-ZPW液体深层发酵方法同实施例3，其中，固体发酵培养基分别为：
A：麦麸45％，葡萄糖5％，稻壳粉20％，玉米粉20％，海藻糖5％，豆粕5％，料液比为60％；
B：花生饼粉53％，麦麸35％，棉粕12％，料液比为60％；
C：玉米粉10％，麦麸60％，稻壳粉20％，蔗糖5％，豆粕5％，料液比为60％；
D:玉米粉70％，豆粕15％，麸皮15％，料液比为60％。
在无菌操作台中，将固体培养基用无菌不锈多孔钢盘分装，堆料厚度约3-5cm，同时将液体发酵产物按10％(v/m)的接种量接种于已灭菌的固体发酵培养基中并混匀，然后将接种后的固体培养基置于培养箱中，37℃发酵培养72h，在培养过程中每隔24h翻动一次培养基，发酵结束后，分别计数。结果见表6，固体培养基A发酵得到的发酵培养物活菌数最高，为5.2×109CFU/g(显著性分析用不同字母表示)。
表6不同固体培养基发酵产物活菌数比较
培养基 菌数(CFU/g)
A 5.2×10<sup>9a</sup>
B 2.8×10<sup>9bc</sup>
C 3.4×10<sup>9b</sup>
D 2.5×10<sup>9c</sup>
发酵后处理：固体发酵结束后，将固体发酵产物在温度不高于50℃的条件下烘干，使含水量控制在10％左右，粉碎即得枯草芽孢杆菌BS-ZPW菌剂，所得菌剂中有效活菌数达7.8×109cfu/g。
对比例1
枯草芽孢杆菌BS-ZPW采用本发明实施例3中的液体发酵培养基进行液体发酵，发酵24h后发酵液中的活菌数仅为2.1×109cfu/mL。
枯草芽孢杆菌BS-ZPW只进行固体发酵，即按照摇瓶种子-固体发酵培养步骤进行发酵培养，此固体发酵培养基均为本发明中所述的固体发酵培养基。固体发酵条件均参照本发明实施例4，发酵72h后发酵产物活菌数低于5.2×109CFU/g。
对比例2
对照菌株：凝结芽孢菌CGMCC.No.12196，酿酒酵母CGMCC.No.21678，屎肠球菌CGMCC.No.12851，罗伊氏乳杆菌CGMCC.No.19491。
采用本发明实施例3和实施例4液固结合发酵培养，不同菌株最终发酵活菌数见表7，由表7可知，发酵活菌数均能达到108-9CFU/g(显著性分析用不同字母表示)。
表7不同菌株发酵产物活菌数比较
菌数(CFU/g)
凝结芽孢菌CGMCC.No.12196 6.85×10<sup>8d</sup>
酿酒酵母CGMCC.No.21678 8.5×10<sup>8d</sup>
屎肠球菌CGMCC.No.12851 2.66×10<sup>9b</sup>
罗伊氏乳杆菌CGMCC.No.19491 1.38×10<sup>9c</sup>
BS-ZPW 8.1×10<sup>9a</sup>
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC NO.25499。
2.一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养：取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落，接种于一级种子培养基中，装液量50mL/150mL，37℃培养18小时，得到一级种子液；
(2)所述枯草芽孢杆菌二级种子液培养：将步骤1培养的所述枯草芽孢杆菌一级种子液接种于二级种子培养基中装液量100mL/250mL，接种量3％，37℃培养8～10h，得到二级种子液；
(3)所述枯草芽孢杆菌液体发酵：液体发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量3％，搅拌速度180rpm，维持pH 7.0，通气量为0.5～1.5vvm，发酵时间为24h；
(4)所述枯草芽孢杆菌固体发酵：将液体发酵后的产物接种于已灭菌的固体发酵培养基中，接种量10％(v/m)，堆料厚度3～5cm，37℃培养72h，每隔24h翻动一次培养基；
(5)将所述固体发酵后的发酵物烘干粉碎后即得所述枯草芽孢杆菌菌剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)的种子培养基为LB培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5～10g/L,蔗糖4～8g/L，豆粕8～24g/L，硫酸亚铁0.125～0.5g/L，硫酸锰0.125～0.5g/L，碳酸钙0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，硫酸镁1.25～5g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5g/L，蔗糖8g/L，豆粕24g/L，硫酸亚铁0.125g/L，硫酸锰0.5g/L，碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3.75g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：麦麸45％，葡萄糖5％，稻壳粉20％，玉米粉20％，海藻糖5％，豆粕5％。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉10％，麦麸60％，稻壳粉20％，蔗糖5％，豆粕5％，料液比为60％。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为：将所述枯草芽孢杆菌固体发酵物在温度不高于50℃的条件下烘干至含水量10％，粉碎后即得枯草芽孢杆菌菌剂。
9.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株的微生态制剂。
10.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株的饲料。
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